Vector chuyển gen là plasmid
Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi
nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi
khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi
khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn.
Tùy các kiểu của plasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau.
Một số plasmid chỉ có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần
trong mổi lần phân bào. Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được
nhiều lần trong mỗi chu kỳ phân bào. Những plasmid có từ 10 đến 100 bản
sao trong tế bào chủ được xem như plasmid có bản sao cao. Plasmid khác có
từ 1 đến 4 bản sao trong tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp.
Trong sinh vật eucaryote, plasmid chỉ có trong tế bào nấm men.
Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng tự
tái bản DNA. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, DNA không
thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector
chuyển gen để nhân dòng DNA cần thiết.
Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính
chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid
không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho
việc tạo dòng.
Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo
ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.
1. Các plasmid thế hệ thứ nhất
Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101 (Stalay-
Cohen), ColE1 đã góp phần đầu tiên vào lịch sử tạo dòng. Tuy vậy các
plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã
tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính
quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất.
2. Plasmid thế hệ thứ hai
pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân
dòng trong tế bào E. Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar
Rodrigues.
Các plasmid thế hệ thứ 2 được cấu tạo phức tạp hơn bắt nguồn từ plasmid
nhỏ và được cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí.
Cấu tạo plasmid pBR322
pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen kháng thuốc, một chống chịu được
ampicilline (ampR) và một chống chịu được tetracycline (tetR)
Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều
điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh.
Ví dụ, gen kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn
chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận biết là:
EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI.
Việc cài DNA lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc. Nếu chỉ còn
một gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn
cài. Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp.
Một ứng dụng nữa của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho
thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có
thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
3. Các plasmid thế hệ ba
Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác
nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành
một đoạn dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào
vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn.
Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:
- Dãy pUC như: pUC18 , pUC19 (Hình 5-3)
- Dãy Gemini: Plasmid pGEM3 , Plasmid pCR 2.1
- Nhóm các plasmid Bluescript
Dãy pUC:
pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số
đặc trưng sau:
- Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với
pUC dùng để tổng hợp enzyme β-galactosidase.
- Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt
hạn chế.
- Ở pUC18 , vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI,
XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).
- Ở pUC19 , vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III
.....EcoRI).
- Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein
(enzyme) vốn được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh
chất của vi khuẩn.
Cấu tạo plasmid pUC
Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát
các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid.
Sự có mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy
trên môi trường có ampicilline.
Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker
cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng
đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn.
Plasmid pGEM3 :
Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini)