BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO

(Pseudapocryptes elongatus)

Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Cần Thơ, 2015

Công trình được hoàn thành tại: Khoa Thủy Sản, Trường Đại

học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGs.TS Đặng Thị Hoàng Oanh Phản biện 1:…………………………………………………………... Phản biện 2:…………………………………………………………... Phản biện 3:…………………………………………………………... Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại………………………………………………………………... Vào ……..giờ………, ngày………tháng……..năm……………….

Có thể tìm luận án tại: 1. Trung tâm học liệu Trường Đại học Cần Thơ 2. Thư viện Quốc gia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Cần Thơ, 2015

Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN

1.1 Giới thiệu Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Cá bống kèo được nuôi tập trung ở các tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, tuy nhiên trong thời gian gần đây cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng.

Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển hình như Streptococcus agalactiae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis sp.) (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013), trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Vi khuẩn S. iniae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) (Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng, 2011), cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999). Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae ở cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii) (Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009).

Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài vi khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống và cá mú thịt, (Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012).

Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)” được thực hiện.

1.2 Mục tiêu tổng quát của luận án Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả.

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Thông tin từ kết quả khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phòng trị bệnh sẽ góp phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá

1

bống kèo mang lại hiệu quả về năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi.

1.4 Những điểm mới của luận án Xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo là vi khuẩn S. dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao.

Thực hiện và chuẩn hóa qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp PCR. Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã nêu và phân tích những vấn đề liên quan đến tình hình nuôi cá bống kèo cũng như tình hình nghiên cứu về một số loại vi khuẩn gây bệnh trên cá với những nội dung chính: - Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước. - Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo. - Tổng quan bệnh xuất huyết ở cá. - Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá. - Tổng quan về tình hình vi khuẩn Streptococcus gây bệnh trên cá nước lợ, mặn.

- Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết. - Chẩn đoán bệnh xuất huyết. - Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá. Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2011 đến tháng 12/2014 3.2 Đối tượng nghiên cứu: Cá bống kèo 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Điều tra phỏng vấn 3.3.1.1 Số liệu thứ cấp Thu thập từ báo cáo của các cơ quan chức năng tỉnh Bạc Liêu. Số liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi trồng thủy sản và tình hình nuôi thương phẩm cá bống kèo trong tỉnh Bạc Liêu.

3.3.1.2 Số liệu sơ cấp Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm ở thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu. Số liệu sơ

2

cấp gồm: Thông tin cơ bản, kinh nghiệm, kỹ thuật nuôi, thông tin về bệnh trên cá nuôi và cách phòng trị khi cá bống kèo bệnh của người nuôi.

3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá - Mẫu cá: thu 254 con cá bống kèo còn sống trong 34 ao nuôi (11 ao cá khỏe, 23 ao cá đang có biểu hiện cá bị xuất huyết).

- Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai đoạn cá nuôi được 2 - 3 tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con. Thời gian thu mẫu là 7 - 8 giờ sáng.

3.3.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng Số lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng là 120 mẫu cá ở 12 ao gồm 04 đợt thu mẫu, mỗi đợt 03 ao, mỗi ao 10 con. Kiểm tra da, mang và ruột cá.

Mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng được tính: Tỷ lệ cảm nhiễm = (Số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu đã kiểm tra) x 100 Cường độ cảm nhiễm = (Số trùng/Con cá, cơ quan, lame, thị trường) 3.3.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 3.3.4.1 Phương pháp nhuộm Giemsa Phết mẫu thận lên lame. Mẫu được cố định qua dung dịch Methanol trong 1 phút. Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 trích dẫn bởi Rowley, 1990. Đọc kết quả dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.

3.3.4.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn - Dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận. Đặt que cấy vào, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên đĩa agar. Ủ các đĩa môi trường này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C. Sau 24 – 48 giờ, đọc kết quả.

- Kiểm tra tính ròng của vi khuẩn, phản ứng oxidase, catalase, O/F, khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường TSB (+ 6,5%NaCl), khả năng tan huyết của vi khuẩn. d. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep (Biomérieux, Pháp) Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập vi khuẩn được thu qua 06 lần thu mẫu bằng kit API 20 Strep.

3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự 3.3.5.1 Phương pháp chiết tách DNA vi khuẩn Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp của Bartie et al. (2006). Vi khuẩn được nuôi tăng sinh từ 16 - 18 giờ trong 5 ml môi trường NB (+ 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28ºC, ly trích DNA bằng cách cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với 100 µl 10 mM Tris- HCL, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20ºC cho đến khi sử dụng.

3

3.3.5.2 Phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

10 mẫu vi khuẩn được chọn từ kết quả phân lập được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT; B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4; A1F6; A1F9; A5F4. Sản phẩm PCR mẫu được gởi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA. Sản phẩm giải trình tự được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillar. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI.

3.3.6 Phương pháp mô bệnh học Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá. Lấy mẫu mô ở mang, gan, thận của cá bệnh và cá khỏe. Mẫu được cắt với độ dày từ 5 – 7 mm, sau đó xử lý bằng máy xử lý tự động qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Đúc khối và cắt mẫu với độ dày 4-6 μm, nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematocyline và Eosin (H&E). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi, đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006) (trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011). 3.3.7 Phương pháp huyết học 3.3.7.1 Phương pháp phân tích mẫu máu cá Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá. Máu được lấy ở động mạch chủ ở đuôi cá (Houston, 1990). Phết mẫu máu. Mẫu máu sau được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990).

R = C x 10 x 5 x 200 3.3.7.2 Định lượng hồng cầu Hồng cầu được đếm qua buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X. Công thức tính mật độ hồng cầu: Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3); C: tổng số hồng cầu trên 5

vùng đếm; 10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm; 5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2; 200: độ pha loãng hồng cầu.

3.3.7.3 Định tính và định lượng bạch cầu Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu được nhuộm theo phương pháp Wright’s & Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn bởi Rowley, 1990). Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (Supranee et al., 1991). Tổng bạch cầu (TBC)= (Bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/ Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm. Mật độ từng loại (tb/mm3) = Số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC/200

3.3.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết 3.3.8.1 Phương pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.3.5.1)

4

3.2.8.2 Phương pháp chiết tách DNA từ mô thận cá Dựa trên phương pháp chiết tách Phenol chloroform của Taggart et al. (1992) (được điều chỉnh bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy, 2009) để chiết tách DNA thận cá.

3.3.8.3 Phương pháp khuếch đại DNA Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thực hiện dựa theo qui trình của Nunan et al. (2003). Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát hiện là 1500 bp. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thiết kế bởi Zinniel et al., (2002) mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’,

mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’. 3.3.8.4 Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo Hassan et al. (2003): STRD-DyI: “5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′”

dys-16S–23S-2: “5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′” Thực hiện qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa trên phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là có ký hiệu B2-5G.

3.3.8.5 Phương pháp điện di Sử dụng 10 l sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5% agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệm  1 TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0,1 mM EDTA). 3.3.8.6 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae

Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với các mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng và 3.200 ng được dùng cho phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để xác định độ nhạy của qui trình. 3.3.8.7 Phương pháp xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S. dysgalactiae

Dùng cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để phát hiện 5 loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare. Đối chứng dương sử dụng là S. dysgalactiae đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S có ký hiệu B2-5G. 3.3.8.8 Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae Khả năng ứng dụng của qui trình ở nhiều dòng vi khuẩn S. dysgalactiae khác nhau và trực tiếp trên thận cá.

5

3.3.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp lập kháng sinh đồ theo Geert Huy, 2002. 3.3.9.1 Phương pháp phục hồi vi khuẩn Vi khuẩn trữ ở -80oC được phục hồi trên môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl và ủ sau 48 giờ ở 30oC.

3.3.9.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Dùng pipet hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA (+ 1,5% NaCl) và trãi đều, dùng pen lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri dán 4 đĩa kháng sinh. Đặt đĩa vào tủ ấm ở 30oC. Đọc kết quả sau 48 giờ. 3.3.9.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002).

3.3.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.3.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm Các dụng cụ thí nghiệm như: bể nhựa 500 L, xô nhựa 60 L, ống sục khí, vợt, đá bọt... được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí. Cấp nước vào 1/3 xô nhựa thí nghiệm. Nguồn nước sử dụng là nước máy có độ mặn 10‰.

3.3.10.2 Nguồn cá thí nghiệm Cá bống kèo đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng, trọng lượng khoảng 15 - 20 g/con. Cá được nuôi dưỡng trong bể nhựa 500 L, có sục khí khoảng 1 tuần. Kiểm tra sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm.

3.3.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Vi khuẩn trữ được phục hồi trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl (TSA+), ủ ở 28oC. Nuôi tăng sinh vi khuẩn, sau đó, vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Đếm mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml + 9 ml nước muối sinh lý) để được các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml.

3.3.10.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật độ tiêm là 108 CFU/cá và tiêm nước muối sinh lý ở nghiệm thức đối chứng. Cá được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục

6

trong 7 ngày. Kết thúc thí nghiệm, ở mỗi nghiệm thức tiến hành thu mẫu mô (3 con/nghiệm thức) ở các cơ quan mang, gan và thận.

3.3.10.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định LD50 Thí nghiệm xác định LD50 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 20 con cá/bể. Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: cá được tiêm vi khuẩn với mật độ 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 CFU/cá.

Nghiệm thức 8: nghiệm thức đối chứng cá tiêm nước muối sinh lý. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày. Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định

theo công thức của Reed và Muench (1938): LD50 = 10 a – p.d

Trong đó: p.d = (L% - 50%) / (L% - H%) a: Số lũy thừ a mà ta ̣i đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%) H%: Tỷ lê ̣ cá chết cao nhất (dướ i 50%); L%: Tỷ lê ̣ cá chết thấp nhất (trên 50%). 3.3.10.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh xuất huyết ở qui mô phòng thí nghiệm

- Vi khuẩn gây cảm nhiễm là B1-6T, mật độ tiêm là 104 CFU/cá. - Thuốc kháng sinh: DO và FFC sử dụng trong thí nghiệm là thuốc kháng sinh của công ty UV trong đó: DO và FFC ở dạng nguyên liệu; DO thành phẩm có tên thương mại là Rydoxyne và FFC thành phẩm có tên thương mại là UV-Flo. - Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, hàm lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá. Cho cá ăn theo nhu cầu.

- Thí nghiệm phòng trị gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 30 con, lặp lại 3 lần: Cá ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4 được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn liên tục trong 5 ngày.

+ Nghiệm thức 1: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng nguyên liệu. + Nghiệm thức 2: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng thành phẩm. + Nghiệm thức 3: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng nguyên liệu. + Nghiệm thức 4: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng thành phẩm. + Nghiệm thức 5: đối chứng 1: cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn không trộn thuốc. + Nghiệm thức 6: đối chứng 2: cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc. + Nghiệm thức 7: đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

7

- Thời gian thí nghiệm là 21 ngày. Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày, ghi nhận và chụp hình dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong. Kết thúc thí nghiệm tiến hành thu mẫu vi khuẩn, mô học (3 cá/nghiệm thức). - Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng

tỉ lệ sinh tồn tương đối (RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1996): % cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc 1- Giá trị RPS (%) = % cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương x 100

4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu luận án được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, phần mềm thống kê SPSS version 20. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI trực tuyến. Luận án được trình bày bằng phần mềm Microsoft Word.

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm

Kinh nghiệm nuôi (năm) 1 2 3 4 5 6 7

Số hộ 8 21 18 18 12 11 2

Tỷ lệ (%) 8,9 23,3 20 20 13,3 12,2 2,3

4.1.1 Điều tra tình hình nuôi và khảo sát hiện trạng bệnh trên cá 4.1.1.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo Các hộ nuôi được điều tra có kinh nghiệm nuôi cá bống kèo thương phẩm tập trung ở 2 năm (chiếm 23,3%) và 3, 4 năm (20%) (Bảng 4.1). Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo

Diện tích nuôi (m2)

Số hộ 31 25 12 11 11

Tỷ lệ (%) 34,5 27,8 13,3 12,2 12,2

4.1.1.2 Diện tích nuôi Diện tích nuôi phổ biến từ 1.000 - 5.000 m2 (chiếm 34,5%). Số hộ nuôi có diện tích lớn chiếm tỷ lệ khá cao cho thấy người nuôi có xu hướng mở rộng diện tích nuôi (Bảng 4.2). Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo

≤ 5.000 ≤ 10.000 ≤ 15.000 ≤ 20.000 > 20.000

8

Phơi ao

Bón vôi

Bón phân

Diệt cá dữ

Diệt khuẩn

Lọc nước

4.1.1.3 Mùa vụ nuôi và thời gian nuôi Mùa vụ nuôi cá bắt đầu từ tháng 6 kéo dài đến tháng 2, 3 năm sau. 4.1.1.4 Kỹ thuật nuôi a. Chuẩn bị và cải tạo ao Đa số hộ cải tạo ao bằng cách phơi khô ao (86,7%), còn lại cải tạo ao bằng cách để một ít nước trong ao và tiến hành bón vôi (13,3%) (Bảng 4.3).

Số hộ 78 12 64 26 7 83 55 35 45 45 15 75

Tỷ lệ (%) 86,67 23,33 71,11 28,89 7,78 92,22 61,11 38,89 50 50 16,67 83,33

Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao Các bước chuẩn bị ao Có Không Có Không Có Không Có Không Có Không Có Không

Mật độ nuôi (con/m2) < 100 100 - 150 > 150

Số hộ 5 74 11

Tỷ lệ (%) 5,56 82,22 12,22

b. Nguồn giống và mật độ thả nuôi Nguồn cá bống kèo giống hiện nay phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn cá giống tự nhiên. Mật độ thả nuôi từ 50 – 200 con/m2, đa số các hộ thả nuôi ở mật độ từ 100 - 150 con/m2 (chiếm 82,2%) (Bảng 4.4). Bảng 4.4 Mật độ thả giống

Hình 4.1. Tần suất cho ăn

c. Thức ăn và cách cho ăn Tần suất cho ăn dao động từ 2 - 5 lần/ngày. Có 56,7% hộ điều tra cho cá ăn 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát. Lượng thức ăn cho cá ăn phụ thuộc vào nhu cầu của cá, nên có hộ cho cá ăn liên tục trong ngày (cách khoảng 2 đến 3 giờ cho ăn một lần) (chiếm 8,89%)(Hình 4.1).

d. Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi cá bống kèo Tất cả (100%) các hộ nuôi cá bống kèo được phỏng vấn không sử dụng hệ thống ao lắng, các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước (96,7%), xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi.

9

e. Quản lý sức khỏe cá nuôi Số hộ sử dụng kháng sinh phòng trị bệnh cho cá bằng cách trộn vào thức ăn và cho cá ăn liên tục trong suốt thời gian nuôi, trong đó số hộ nuôi sử dụng thuốc kháng sinh amoxicillin chiếm 81,1%, các hộ còn lại (3,3%) sử dụng các loại kháng sinh khác (Hình 4.2).

Hình 4.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu

4.1.1.5 Tình hình bệnh ở cá bống kèo nuôi thương phẩm Cá bị bệnh tập trung ở giai đoạn 2 tháng tuổi và thường mắc các bệnh

Hình 4.3. Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm Tỷ lệ chết ở các ao nuôi trung bình là 18,04±12,17 (%) (Bảng 4.5). Bảng 4.5. Tỷ lệ cá chết

Tỷ lệ cá chết (%) ≤ 10 10 – 20 20 – 30 ≥30 Không xác định

Số hộ 25 35 17 12 1

Tỷ lệ (%) 27,78 38,89 18,89 13,33 1,11

xuất huyết (78,9%), lở loét và chướng bụng (50%), gan (25,6%). (Hình 4.3).

Kết quả điều tra cho thấy đa phần cá chết tập trung ở tỷ lệ từ 10% - 20% (chiếm 38,9%), tuy nhiên tỷ lệ cá chết trên 30% cũng chiếm tỷ lệ khá cao, chiếm 13,33%. Kháng sinh được trộn vào thức ăn cho cá ăn định kỳ. Có 81,1% các hộ điều tra chọn kháng sinh amoxicillin trộn vào thức ăn (2 – 4 g/kg thức ăn) cho cá ăn định kỳ. Khi cá phát bệnh thì tăng lượng thuốc (3 – 5 g/kg thức ăn) cho ăn liên tục từ 3-5 ngày.

4.1.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo Qua các đợt thu mẫu cho thấy thành phần giống loài ký sinh trùng xuất hiện ít, chủ yếu là các ký sinh trùng thuộc ngoại ký sinh (bảng 4.6).

10

Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá kèo qua các đợt thu mẫu

Da

Mang

Ký Sinh Trùng

Chilodonella Epistylis Trichodina Ergasilus

CĐN (Trùng/lame) 8 8 2

CĐN (Trùng/lame) 6 2

TLN (%) 33,81 20

TLN (%) 27,24 33,33 20 Có 04 loài ký sinh trùng được tìm thấy có hình thái, cấu tạo phù hợp với mô tả của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) đó là Chilodonella, Epistylis, Trichodina và Ergasilus. Các loài ký sinh trùng này hiện diện trên cơ thể cá với cường độ cảm nhiễm (2 – 8 trùng/lame) và tỷ lệ cảm nhiễm rất thấp (20% – 33,81%). Với kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của ký sinh trùng không ảnh hưởng đến tình hình sức khỏe cá trong ao nuôi.

Thu mẫu

Tổng cộng

Đợt 2 13 17 12 42

Đợt 5 26 30 6 62

Đợt 1 13 15 6 34

Đợt 4 11 0 0 11

Đợt 6 27 23 36 86

4.1.3 Phân lập vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết 4.1.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Kết quả phân lập đã thu được số mẫu khuẩn lạc trong những lần phân lập là 252, tỷ lệ khuẩn lạc thu được từ các cơ quan tập trung nhiều ở thận của cá chiếm 38,1% (Bảng 4.7)

Tỷ lệ (%) 38,1 35,7 26,2 100

Số lượng 96 90 66 252

Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan Đợt 3 6 5 6 17

Cơ quan Thận Gan Tỳ tạng Tổng cộng 4.1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa Các chủng vi khuẩn có hình tròn, màu trắng đục, kích thước dao động từ 0,4 – 0,8 µm/khuẩn lạc. Đa số bắt màu Gram (+), có dạng hình cầu, ghép với nhau tạo thành chuỗi dài có dạng song cầu, liên cầu (Hình 4.4). Trong 252 chủng vi khuẩn thu được có 249 chủng vi khuẩn có hình cầu, gram (+), không di động, đa số vi khuẩn âm tính với oxidase (231/249 chủng) và catalase (174/249 chủng).

Hình 4.4 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X)

Kết quả kiểm tra cho thấy 15/15 chủng vi khuẩn không gây tan huyết, 15/15 chủng vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl (TSB+) (Hình 4.5).

11

Hình 4.5 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển trong TSB+ A: Vi khuẩn không gây tan huyết trên môi trường chứa 5% máu cừu B: Vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl)

4.1.3.3 Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep Kết quả định danh cho thấy các chủng dương tính 100% với Alkaline phosphatase, Leucine AminoPeptidase, Ribose, Trehalose, hầu hết dương tính với Amygdalin (90,6%), Arginine Dihydrolase (chiếm 93,7%), β- glucuronidase (chiếm 93,7%), âm tính với các chỉ tiêu còn lại (Hình 4.6).

Hình 4.6 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G 4.1.4 Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự Vi khuẩn sau khi giải mã tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI, dựa vào mức độ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA ở các chủng cho thấy, cả 10 chủng vi khuẩn đều trùng khớp với chủng vi khuẩn được xác định là S. dysgalactiae. (Bảng 4.8). Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự của các chủng vi khuẩn với các loài vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI

STT

Kí hiệu chủng

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

B1-6T B2-5G B6-9TT B2-3TT A1F1 A1F2 A1F4 A1F6 A1F9 A5F4

Các loài vi khuẩn từ ngân hàng dữ liệu gen NCBI S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae S. dysgalactiae

Mã số lưu trữ trong NCBI KM077497.1 KM077497.1 KM077497.1 KM077497.1 NR043661.1 NR043661.1 NR043661.1 HE858529.1 NR043661.1 NR043661.1

Mức độ tương đồng 99% 100% 99% 99% 99% 98% 99% 99% 99% 97%

Tỉ lệ nucleotide tương đồng 1003/1004 1005/1005 996/997 971/972 618/624 537/546 608/612 597/602 573/575 336/345

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

4.2 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

4.2.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá 4.2.1.1 Dấu hiệu bệnh lý Cá bị xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động.

12

Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài của cá bệnh xuất huyết như màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, ở vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra. (Hình 4.7).

(A) cá bống kèo tấp mé (B) (C): Cá bống kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân

Hình 4.7. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết

Dấu hiệu bệnh lý bên trong được ghi nhận là xoang bụng cá chứa đầy dịch nhờn, gan bị xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn (Hình 4.8).

Hình 4.8: Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết (A) Cá bống kèo khỏe. (B) Tỳ tạng sưng to và xuất huyết. (C) Gan cá sưng to và xuất huyết. (D) Gan cá xuất huyết, tỳ tạng sưng to, thận bị nhũn.

4.2.1.2 Kết quả quan sát tiêu bản mẫu tươi thận phết kính Kết quả quan sát cho thấy vi khuẩn tấn công phá vỡ màng tế bào hồng cầu, tập trung chung quanh vách tế bào hồng cầu (Hình 4.9).

(A): Mẫu thận cá khỏe. (B): Vi khuẩn phá vở tế bào, tập trung thành cụm; (C): Mẫu đại thực bào. (D): Vi khuẩn bao quanh và phá vỡ màng tế bào hồng cầu

Hình 4.9. Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X)

Trên mẫu cá khỏe không có hoặc có rất ít vi khuẩn khi tiến hành quan sát mẫu thận phết kính.

4.2.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo 4.2.2.1 Biến đổi cấu trúc mô học ở mang Kết quả quan sát cho thấy có 127/127 mẫu mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết có hiện tượng phình to tơ mang và sự dính lại của các sợi mang. Tơ mang phình to và bị xuất huyết, các sợi mang bị dính lại hoặc mất cấu trúc cả phiến mang, sợi mang ngắn lại hoặc thoái hóa, động mạch vào mang bị xuất huyết và có hiện tượng bị nhiễm khuẩn. (Hình 4.10)

13

Hình 4.10 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A) Mang cá bống kèo khỏe: tơ mang (), sợi mang (); (B) Sợi mang phình to, có hiện tượng tăng sinh biểu mô (), động mạch vào sợi mang bị nhiễm khuẩn (); (C) Sợi mang dính lại và mất cấu trúc phiến mang (), các tế bào biểu mô tăng kích thước (). (D) Mang bị mất cấu trúc 4.2.2.2 Biến đổi cấu trúc mô học ở thận Quan sát mô thận cá bệnh cho thấy chủ yếu là hiện tượng xuất huyết, sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống thận xơ hóa và lòng ống giãn nở, quản cầu thận phình to kèm theo biến đổi cấu trúc, và hoại tử. Hiện tượng sung huyết ở mô thận cá được ghi nhận ở hầu hết các mẫu cá bị bệnh, ngoài ra hiện tượng xuất huyết và hoại tử hạt hay hoại tử hóa lỏng cũng được tìm thấy trên mẫu mô thận của cá bệnh (Hình 4.11).

Hình 4.11 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A): Thận cá bống kèo khỏe, ống thận (↓); (B) Mô thận bị xuất huyết (↓), trung tâm đại thực bào sắc tố (↓); (C): Mô thận bị hoại tử (↓), biến đổi cấu trúc; (D): Mô thận bị nhiễm khuẩn (↓); (E): Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓) (100X); (F): Mô thận có hiện tượng sung huyết (↓), Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓)

4.2.2.3 Biến đổi cấu trúc mô học ở gan Kết quả quan sát các mẫu mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy gan có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.12E), tĩnh mạch gan bị sung huyết (Hình 4.12C), không bào lipid phình to, không đồng nhất tạo nên vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (Hình 4.12E & F). Gan hoại tử gần như hóa lỏng, những vùng sung huyết tế bào máu phân hủy thành dịch viêm, tế bào chất trở nên đồng nhất bắt màu Eosin (Hình 4.12B & D).

14

Hình 4.12 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E) (40X) (A): Gan cá khỏe, tĩnh mạch gan (↓), không bào lipid (↓); (B) Dịch viêm giữa các tế bào (↓); (C): Tĩnh mạch gan bị sung huyết (↓); (D): Vùng tế bào gan bị sung huyết (↓); (E): Gan bị nhiễm khuẩn (↓), không bào lipid phình to (↓), biến đổi cấu trúc tế bào gan (↓); (F): Vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (↓)

4.2.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh 4.2.3.1 Hình thái tế bào Quan sát máu cá bống kèo cho thấy tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Bốn loại bạch cầu cũng được tìm thấy gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu.

Hình 4.13. Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) (A): Hồng cầu (↓), (B): Tiểu cầu (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tiểu cầu (↓), Bạch cầu trung tính (↓), Tế bào Lympho (↓), (D): Bạch cầu đơn nhân (↓)

Kết quả quan sát tế bào máu trên mẫu phết kính ở cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn trong máu cá và tế bào máu bị biến đổi hình dạng (Hình 4.14). Vi khuẩn tấn công làm màng tế bào hồng cầu bị phá vỡ, bên trong tế bào chất có nhiều khoảng không bào hay không còn tế bào chất. Bên cạnh đó các loại tế bào bạch cầu cũng thay đổi hình dạng, cá bệnh cũng tìm thấy bốn loại tế bào bạch cầu.

15

(A): Vi khuẩn hình cầu tấn công màng tế bào hồng cầu (↓); (B): vi khuẩn tấn công

màng tế bào (↓) và tạo khoảng không bào trong tế bào chất (↓)

Hình 4.14 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X)

4.2.3.2 Huyết học Số lượng hồng cầu trong máu cá dao động từ 6,8 x 106 CFU/ml đến 28,6 x 106 CFU/ml, có sự khác biệt về số lượng hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết, ở những mẫu cá bệnh số lượng hồng cầu giảm so với cá khỏe, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.9). Bảng 4.9 So sánh mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh

Ao

Mật độ hồng cầu (tế bào x 106/ml)

Ao cá bình thường

Ao cá bệnh

Ao 4 Ao 5 Ao 8 Ao 1 Ao 2 Ao 3 Ao 6 Ao 7 Ao 9 Ao 10 Ao 11

21,45 ± 2,79b 19,49 ± 0,56b 19,80 ± 0,37b 17,06 ± 4,49ab 14,89 ± 1,57a 16,99 ± 3,04ab 14,42 ± 1,74a 12,73 ± 3,21a 13,16 ± 2,93a 14,23 ± 1,92a 16,23 ± 3,61a

Các giá trị trong cùng một cột (a, b) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê

(P<0,05) và ngược lại.

4.2.3.3 Bạch cầu Kết quả quan sát được 4 loại tế bào bạch cầu ở cá bống kèo là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.15).

Hình 4.15 Các loại bạch cầu (A): Tiểu cầu (↓); (B): Bạch cầu trung tính (↓);(C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tế bào lympho (↓)

a. Số lượng tổng bạch cầu Số lượng bạch cầu trong máu cá dao động từ 290.000 – 990.000 tế bào/ml. Đối với ao cá khỏe có tổng số lượng bạch cầu trung bình 34,2 x 104 tế bào/ml thấp so với các ao nuôi cá đang có dấu hiệu bệnh xuất huyết có tổng lượng bạch cầu cao trung bình 81,8 x 104 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu

16

ở các ao nuôi cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với các ao nuôi bình thường (Bảng 4.10). Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bống kèo bệnh xuất huyết

Ao

Ao cá bình thường

Ao cá bệnh

Ao 4 Ao 5 Ao 8 Ao 1 Ao 2 Ao 3 Ao 6 Ao 7 Ao 9 Ao 10 Ao 11

Mật độ bạch cầu (tế bào x 104/ml) 45,8 ± 8,97c 50,25 ± 6,27c 34,28 ± 5,05d 82,5 ± 7,25ae 73,4 ± 11,64b 76,7 ± 9,09ab 82,9 ± 5,93ae 84,9 ± 6,33e 85,42 ± 5,74e 84,4 ± 6,39e 85,5 ± 7,42e

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

Mật độ các loại bạch cầu (tế bào x 104/ml)

Ao

Ao cá bình thường Ao cá bệnh

BC Đơn nhân 6,18 ± 2,66cd 8,21 ± 4,61abcd 3,16 ± 1,07d 13,25 ± 4,53a 8,94 ± 6,35abcd 9,84 ± 7,05abcd 15,29 ± 5,26a 12,06 ± 2,75a 10,79 ± 2,97ac 8,80 ± 2,98ac 10,43 ± 3,92ac

4 5 8 1 2 3 6 7 9 10 11

BC Trung tính 11,23 ± 6,11bc 7,80 ± 4,38b 3,28 ± 2,31b 36,27 ± 5,22a 27,7 ± 13,35acd 19,07 ± 11,88bd 27,74 ± 7,12ad 30,54 ± 6,43ad 23,14 ± 6,34cd 24,89 ± 6,53d 24,39 ± 11,86d

Tiểu cầu 15,98 ± 3,47b 14,61 ± 2,32b 11,25 ± 1,21ab 17,32 ± 7,94ab 12,85 ± 4,13ab 13,50 ± 6,73ab 16,62 ± 4,52b 9,81 ± 1,65a 11,04 ± 1,12a 11,09 ± 4,08ab 14,50 ± 5,96ab

Lympho 12,40 ± 8,51a 19,61 ± 7,06ac 16,58 ± 2,43a 15,66 ± 6,90a 23,88 ± 14,87ab 34,28 ± 10,91bc 23,23 ± 7,58ad 32,47 ± 5,37bd 40,44 ± 5,75b 39,60 ± 6,46b 36,15 ± 6,46b

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

b. Bạch cầu đơn nhân Kết quả định lượng cho thấy, bạch cầu đơn nhân trong các ao nuôi cá bống kèo dao động từ 10.800 – 211.500 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu đơn nhân ở các ao nuôi có dấu hiệu bệnh cao hơn so với ao nuôi cá khỏe và có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.11). Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bống kèo bị bệnh xuất huyết

c. Bạch cầu trung tính Kết quả phân tích, mật độ bạch cầu trung tính của cá bống kèo dao động khoảng 0,61x104 tb/ml đến 54 x104 tb/ml. Số lượng bạch cầu trung tính ở ao cá khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh (Bảng 4.11).

17

d. Tế bào lympho Qua Bảng 4.11 cho thấy, tế bào lympho ở các ao dao động từ 2,2 x 104 đến 47,5 x 104 tế bào/ml, kết quả các tế bào lympho ở các ao cá khỏe (4,5 và 8) khác biệt so với các ao cá bệnh (3, 7, 9, 10 và 11) ở mức ý nghĩa P<0,05.

e. Tiểu cầu Kết quả định lượng cho thấy, hai ao cá khỏe 4 và 5 khác biệt so với hai ao cá bệnh 7 và 9 (p<0,05) (Bảng 4.11). Ở ao cá khỏe có mật độ tế bào tiểu cầu thấp hơn so với các ao cá có dấu hiệu bệnh. 4.3 Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp sinh học phân tử

4.3.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá Kết quả chiết tách, đo hàm lượng DNA và độ tinh sạch DNA từ 16 mẫu thận cá cho thấy độ tinh sạch ở bước sóng 260 nm là 1,57 – 1,78 và hàm lượng DNA thận cá nằm trong khoảng 1.675 – 3385 ng/µl.

4.3.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn Kết quả chiết tách cho thấy hàm lượng DNA chiết tách từ vi khuẩn dao động từ 2.765 - 4.855 ng/µl và độ tinh sạch dao động từ 1,7 - 2 ng/µl. 4.3.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae

Kết quả điện di sản phẩm PCR dương tính, phát hiện S. dysgalactiae khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 ở vị trí 259 bp thể hiện qua Hình 4.16.

Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm phát hiện Streptococcus dysgalactiae bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 (M: thang DNA; 1: B1-6T; (+): đối chứng dương (B2-5G); (-): đối chứng âm) 4.3.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae 4.3.4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae

Kết quả cho thấy, qui trình khuếch đại chỉ hiện vạch đặc hiệu ở 259 bp của vi khuẩn S. dysgalactiae mà không hiện vạch sản phẩm đối với các chủng vi khuẩn khác thể hiện tính đặc hiệu của qui trình (Hình 4.17).

18

Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu (M): thang DNA, (1): Vibrio parahaemolyticus; (2): Streptococcus dysgalactiae; (3): Edwardsiella ictaluri; (4): Aeromonas hydrophilla; (5): Streptococcus agalactiae; (6): Flavobacterium columnare 4.3.4.2 Kiểm tra độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae Kết quả xác định độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là 50 ng DNA vi khuẩn/0,5g mô thận. (Hình 4.18).

Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình (M): thang DNA, (1): 25 ng; (2): 50 ng, (3): 100 ng, (4): 200 ng, (5): 400 ng, (6): 800 ng, (7): 1.600 ng, (8): 3.200 ng 4.3.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae 4.3.5.1 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu vi khuẩn Kết quả cho thấy cả 10/10 chủng (100%) nhạy với cặp mồi STRD- DyI/ dys-16S–23S-2 ở 259 bp (Hình 4.19).

(M): thang DNA; (+): đối chứng dương; (1): A1F1-T; (2): A2F3-G; (3): B3K1F2-T; (4): B1K2F1-G; (5): B3F2-T; (6): F7-T; (7): B1-10TT; (8): B5-8T; (9): B4-6G; (10): B5-3T; (-): đối chứng âm.

Hình 4.19 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn

4.3.5.2 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu thận cá bống kèo bệnh Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho vi khuẩn S. dysgalactiae có kích thước 259 bp không xuất hiện ở các mẫu DNA thận cá (Hình 4.20).

19

Hình 4.20 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết M: thang DNA; (-): đối chứng âm; (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9): mẫu thận cá; (+): đối chứng dương

Như vậy, qui trình PCR chẩn đoán S. dysgalactiae chưa thể ứng dụng để phát hiện trực tiếp loài vi khuẩn này trên mẫu cá bệnh. Trong một số kết quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004), Nomoto et al. (2008) và Abdelsalam et al. (2009) đều sử dụng trực tiếp DNA của vi khuẩn phân lập được, chưa có kết quả nào được đưa ra về khả năng phát hiện vi khuẩn này trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm. 4.4 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm

4.4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

4.4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ Kết quả cho thấy, 8/12 loại kháng sinh nhạy với 4 chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó có 4 loại kháng sinh có tính nhạy cao gồm có FFC, DO, TE và SXT với tỷ lệ 75%. Tuy nhiên FFC, TE và SXT đều có tỷ lệ kháng là 25%, còn DO không có tỷ lệ kháng ở 4 chủng khảo sát.

Kết quả MIC (ppm)

Vi khuẩn

Điểm tới hạn CLSI, 2012 (M100-S22)

Kháng sinh

AML FFC DO

B1.6T 256 4 4

B6.9TT 256 4 8

B2.3TT 128 4 4

R ≥ 32 ≥ 8 ≥ 16

S ≤ 8 ≤ 2 ≤ 4

4.4.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Kết quả cho thấy, có 2 chủ ng B1-6T và B6-9TT thể hiê ̣n tính kháng ma ̣nh vớ i AML (256 ppm). Riêng B1-6T kháng vớ i FFC (4 ppm), DO vớ i nồng đô ̣ (4 ppm) đã ứ c chế đươ ̣c vi khuẩn (Bảng 4.12). Bảng 4.12 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S.dysgalactiae trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML

B2.5G 128 4 4 Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng 4.4.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm Chủng vi khuẩn B2-5G cho tỷ lê ̣ cá chết cao nhất là 86,7%; kế đến là chủ ng B1-6T có tỷ lê ̣ cá chết là 76,7%; chủ ng B2-3TT và chủng B6-9TT có tỷ lê ̣ chết bằng nhau 73,3%; (Bảng 4.13 và Hình 4.21).

20

Bảng 4.13: Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae ở thí nghiệm cảm nhiễm

STT 1 2 3 4 5

Tỉ lệ chết (%) 76,7 73,3 86,7 73,3 13,3

Chủng vi khuẩn B1-6T B2-3TT B2-5G B6-9TT ĐC

Hình 4.21 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Tỉ lệ gây chết (%)

Chủng B1-6T Chủng B2-5G

Đối chứng

11,67

38,3 48,3 50 73,3 78,3 81,7 90

4,25 x 104

48,3 58,3 63,3 71,7 75 81,7 88,3 3,5 x 103,17

Mật độ Vi khuẩn vi khuẩn (CFU/ml) 102 103 104 105 106 107 108 LD50

4.4.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 Kết quả thí nghiệm cho thấy, vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết thấp nhất (38,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 102 CFU/ml và gây tỉ lệ chết cao nhất (88,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 108 CFU/ml. Tương tự ở chủng B2-5G, tỷ lệ gây chết thấp nhất ở mật độ vi khuẩn 3,5 x 102 CFU/ml là 48,3% và 3,5 x 108 CFU/ml là 90% (Bảng 4.14 và Hình 4.22). Bảng 4.14 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G

Qua kết quả thí nghiệm xác định được nồng độ gây chết của chủng vi khuẩn B1-6T là LD50 = 4,25 x 104 CFU/ml và chủng B2-5G = 3,5 x 103,71CFU/ml.

21

Hình 4.22 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G 4.4.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí

nghiệm Kết quả theo dõi cho thấy, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi gây cảm nhiễm, đến ngày thứ 13 sau khi tiêm cảm nhiễm vi khuẩn cá ở các nghiệm thức ngừng chết và tỉ lệ sống của các nghiệm thức lần lượt là 65,56%; 71,11%; 67,78% và 70%. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng 6 và 7 tỷ lệ sống là 96,67% và 97,78% (Hình 4.23). Giá trị RPS (%) được xác định lần lượt là 45,27%; 61,16%; 56,72% và 59,7%.

Hình 4.23: Tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức NT1: nghiệm thức dùng thuốc DO nguyên liệu; NT2: nghiệm thức dùng thuốc DO thành phẩm; NT3: nghiệm thức dùng thuốc FFC nguyên liệu; NT4: nghiệm thức dùng thuốc FFC thành phẩm; NT5: Đối chứng 1, cá cảm nhiễm, không dùng thuốc; NT6: Đối chứng 2, cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc; NT7: Đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc Khi tiến hành so sánh tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức cho thấy sự sai khác mang ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 4.15). Bảng 4.15: Tỷ lệ sống (%) của cá ở các nghiệm thức

Tỷ lệ sống (%)

Stt 1 2 3 4 5 6 7

Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7

65,56 ± 1,93a 71,11 ± 1,93b 67,78 ± 1,93ab 70 ± 3,33b 25,55 ± 3,85c 96,67 ± 0,00d 97,78 ± 1,93d

Giá trị thể hiện là số trung bình và sai số chuẩn. Các số liệu cùng nằm trong một cột có mang chữ cái giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa thống kê P<0,05.

22

Kết quả so sánh thống kê ở Bảng 4.15 cho thấy, đối với các nghiệm thức cá được gây cảm nhiễm, tỷ lệ sống của cá ở nghiệm thức cá được cho thức ăn không trộn thuốc khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) đối với tỷ lệ sống ở các nghiệm thức cá được cho ăn thức ăn có trộn thuốc kháng sinh, thể hiện hiệu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong việc điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm. Với kết quả thử nghiệm thành công trong thí nghiệm đã xác định được DO và FFC điều trị thành công bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận - Thời gian cá bống kèo xuất hiện bệnh tập trung ở giai đoạn cá đạt 2 tháng tuổi. Một số bệnh xuất hiện trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là bệnh xuất huyết (chiếm 78,89%), bệnh lở loét (50%), bệnh chướng bụng (50%), bệnh gan (25,56%). Amoxicillin là loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong các ao nuôi cá bống kèo.

- Vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae với đặc điểm bệnh lý là cá bị xuất huyết trên thân và các vi; nội quan của cá với tình trạng gan, thận và tỳ tạng bị sưng to, xuất huyết đôi khi xuất hiện tình trạng dịch hôi trong xoang bụng và thận bị nhũn. - Mô gan, mang và thận của cá khi bệnh xuất huyết có nhiều biến đổi cấu trúc, xuất hiện nhiều vùng sung huyết và hoại tử.

- Tế bào hồng cầu ở cá bống kèo có dấu hiệu bệnh lý có biến động theo chiều hướng giảm so với cá khỏe. Ngược lại, các loại tế bào bạch cầu ở cá bệnh lại có chiều hướng biến động tăng so với cá khỏe.

- Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác 100% vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo thương phẩm. - Kết quả LD50 của 2 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với giá trị lần lượt là 4,25 x 104 CFU/ml và 3,5 x 103,17 CFU/ml.

- Vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nhạy với các loại kháng sinh như FFC, DO và kháng cao với kháng sinh AML và AMP. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của AML cao nhất và dao động từ 128 ppm – 256 ppm và FFC có nồng độ thấp nhất (4 ppm).

- Kết quả điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo bằng FFC và DO cả với dạng nguyên liệu và thành phẩm cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỷ lệ sống

23

đạt dao động từ 65,56% - 71,11%. Giá trị RPS (%) dao động từ 45,27% - 61,16%.

5.2 Đề xuất - Nghiên cứu chuẩn hóa qui trình chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae trực tiếp trên mẫu cá. - Tiếp tục nghiên cứu điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ngoài ao nuôi thương phẩm.

24

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

lý dịch bệnh

1. Nguyễn Thu Dung và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2013. Hiện trong ao nuôi cá bống kèo trạng về quản (Pseudapocryptes lanceolatus) ở tỉnh Bạc Liêu. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, số 27: 169-177.

2. Nguyễn Thu Dung và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2013. Xác trên cá bống kèo định tác nhân gây bệnh xuất huyết (Pseudapocryptes elongatus) nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn số 16 (2015).