B NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔNỘ Ệ Ể
10TCN TIÊU CHU N NGÀNHẨ
10TCN 835:2006
TH C ĂN CHĂN NUÔI - XÁC Đ NH HÀM L NGỨ Ị ƯỢ
MONENSIN B NG PH NG PHÁP S C KÝ L NGẰ ƯƠ Ắ Ỏ
HI U NĂNG CAOỆ
Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by
high - performance liquid chromatographic method
HÀ N I - 2006Ộ
TIÊU CHU N NGÀNHẨ 10 TCN 835 : 2006
TH C ĂN CHĂN NUÔI - XÁC Đ NH HÀM L NGỨ Ị ƯỢ
MONENSIN B NG PH NG PHÁP S C KÝ L NGẰ ƯƠ Ắ Ỏ
HI U NĂNG CAOỆ
Animal feeding stuffs - Determination of monensin content by
high - performance liquid chromatographic method
(Ban hành kèm theo Quy t đ nh s QĐ/BNN-KHCNế ị ố
ngày tháng 12 năm 2006 c a B tr ng B Nông nghi p và Phát tri n nông thôn)ủ ộ ưở ộ ệ ể
1. Ph¹m vi ¸p dông
Tiªu chuÈn nµy ¸p dông ®Ó ph©n tÝch hµm lîng kh¸ng
sinh monensin trong thøc ¨n ch¨n nu«i b»ng ph¬ng ph¸p
s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). Giíi h¹n ph¸t hiÖn
cña ph¬ng ph¸p lµ 40mg/kg.
2. Tµi liÖu viÖn dÉn
C¸c tµi liÖu viÖn dÉn sau ®©y rÊt cÇn thiÕt cho viÖc
¸p dông tiªu chuÈn. §èi víi c¸c tµi liÖu viÖn dÉn ghi
n¨m ban hµnh th× ¸p dông phiªn b¶n ®îc nªu. §èi víi
c¸c tµi liÖu viÖn dÉn kh«ng ghi n¨m ban hµnh th× ¸p
dông phiªn b¶n míi nhÊt, bao gåm c¶ c¸c söa ®æi:
TCVN 4851 (ISO 3696). Níc dïng ®Ó ph©n tÝch trong
phßng thÝ nghiÖm. Yªu cÇu kü thuËt vµ ph¬ng ph¸p thö.
ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs - Sampling.
3. Nguyªn t¾c
Monensin trong mÉu thøc ¨n ch¨n nu«i ®îc t¸ch chiÕt
b»ng metanol, sau ®ã t¹o dÉn xuÊt b»ng 2,4
dinitrophenylhydrazine (DNP) trong m«i trêng axit ë
55oC, t¸ch vµ ®Þnh lîng trªn hÖ thèng s¾c ký láng hiÖu
n¨ng cao víi detector UV ë bíc sãng 392nm.
4. ThiÕt bÞ, dông cô
4.1. M¸y nghiÒn mÉu phßng thÝ nghiÖm.
4.2. Sµng phßng thÝ nghiÖm, cã kÝch thíc lç sµng 1,00
mm vµ 3,00 mm.
4.3. C©n ph©n tÝch cã ®é chÝnh x¸c 0,0001 g.
4.4. C©n kü thuËt cã ®é chÝnh x¸c 0,01 g.
2
4.5. M¸y ly t©m l¹nh cã tèc ®é 3000 vßng/phót, sö
dông èng ly t©m dung tÝch 30 ml.
4.6. èng ly t©m, dung tÝch 30 ml b»ng polypropylen
hoÆc b»ng thuû tinh, cã n¾p ®Ëy.
4.7. Tñ Êm, cã kh¶ n¨ng duy tr× nhiÖt ®é æn ®Þnh ë
55oC ± 1oC.
4.8. M¸y l¾c trßn hoÆc m¸y l¾c ngang cã thÓ ®¹t tèc
®é 250 vßng/phót.
4.9. èng nghiÖm dung tÝch 10ml cã nót xo¸y.
4.10. B×nh ®Þnh møc dung tÝch 10, 100, 1000 ml.
4.11. Pipet tù ®éng ®iÒu chØnh ®îc tõ 1ml ®Õn 30 ml.
4.12. Micropipet dung tÝch tõ 10µl ®Õn 100 µl vµ tõ
200µl ®Õn 1000 µl.
4.13. Hót dung m«i tù ®éng 2 ml, 10 ml, 20 ml.
4.14. M¸y l¾c èng nghiÖm (Vortex mixer).
4.15. èng ®ong 1000ml.
4.16. BÓ siªu ©m.
4.17. B¬m hót ch©n kh«ng.
4.18. Mµng läc syranh cã kÝch thíc 0,45 µm.
4.19. B×nh nãn dung tÝch 125ml.
4.20. Lä nhá ®ùng dÞch mÉu chuyªn dông cho HPLC, cã
n¾p vÆn PTFE .
4.21. ThiÕt bÞ trén mÉu phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart
Model C 100 T hoÆc t¬ng ®¬ng.
4.22. ThiÕt bÞ chia mÉu:
ThiÕt bÞ chia ®«i hoÆc chia t mÉu: vÝ dô nh thiÕt bÞ
chia t h×nh nãn, thiÕt bÞ chia nhiÒu ng¨n cã hÖ thèng
ph©n h¹t hoÆc c¸c thiÕt bÞ chia kh¸c ®¶m b¶o ph©n
chia mÉu thÝ nghiÖm thµnh mÉu thö ®ång nhÊt.
4.23. Hép ®ùng mÉu cã n¾p kÝn.
4.24. HÖ thèng HPLC gåm cã:
4.24.1. M¸y s¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao, b×nh chøa dung
m«i, hÖ thèng b¬m mÉu, detector UV ®Æt ®îc ë bíc sãng
392nm, m¸y ghi hoÆc bé tÝch ph©n.
3
4.24.2. Cét ph©n tÝch HPLC pha ®¶o cã kÌm cét b¶o vÖ
ChiÒu dµi 150mm
§êng kÝnh trong 4,6mm
H¹t nhåi C 18; 5µm
hoÆc t¬ng ®¬ng
5. Hãa chÊt vµ thuèc thö
5.1. Ho¸ chÊt
ChØ sö dông ho¸ chÊt ®îc c«ng nhËn ®¹t chÊt lîng tinh
khiÕt ph©n tÝch vµ níc cÊt cÊp h¹ng 1 theo TCVN 4851
(ISO 3696). C¸c dung m«i ph¶i ®¹t chÊt lîng ®Ó dïng
cho ph©n tÝch HPLC.
5.1.1. Metanol.
5.1.2. Axit acetic (100%).
5.1.3. Acetonitrile
5.1.4. ChÊt chuÈn monensin, d¹ng muèi natri monensin,
lo¹i tinh khiÕt, cã kÌm theo giÊy chøng nhËn hµm l-
îng.
5.2. Thuèc thö
5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dÞch 500mg/ml.
C©n 50g TCA chÝnh x¸c ®Õn 0,01g cho vµo b×nh ®Þnh møc
100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc b»ng níc cÊt. L¾c kü dung
dÞch.
5.2.2. Thuèc thö DNP, dung dÞch 1mg/ml trong metanol.
C©n 100mg DNP chÝnh x¸c ®Õn 1mg vµo b×nh ®Þnh møc
100ml, hßa tan vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch b»ng metanol. L¾c
kü dung dÞch.
5.2.3. Pha ®éng cho HPLC.
Hçn hîp metanol: dung dÞch axit acetic 1,5% tØ lÖ
90:10 theo thÓ tÝch (v/v).
5.2.3.1. Dung dÞch axit acetic 1,5% trong níc, theo
tØ lÖ thÓ tÝch (v/v).
Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vµo b×nh ®Þnh møc
1000ml. Thªm níc cÊt ®Õn v¹ch ®Þnh møc. L¾c ®Òu dung
dÞch.
5.2.3.2. Hçn hîp pha ®éng.
4
Cho 900ml metanol vµo èng ®ong dung tÝch 1000ml. Thªm
tiÕp 100ml dung dÞch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau
®ã läc hçn hîp dung m«i thu ®îc qua phÔu hót ch©n
kh«ng víi mµng läc cã kÝch thíc lç 0,45 µm, siªu ©m
®uæi khÝ ë nhiÖt ®é thêng trong 30 phót.
5.2.4. Dung dÞch chuÈn
5.2.4.1. Dung dÞch chuÈn gèc 1000µg/ml
Tïy theo hµm lîng monensin ghi trong giÊy chøng nhËn
(5.1.4), c©n mét lîng nhÊt ®Þnh chÊt chuÈn natri
monensin chÝnh x¸c ®Õn 0,1mg cho vµo b×nh ®Þnh møc
dung tÝch 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc b»ng metanol
®Ó sao cho thu ®îc dung dÞch gèc cã nång ®é
1000µg/ml. Dung dÞch chuÈn gèc ®îc b¶o qu¶n trong lä
n©u ë 40C, cã thÓ sö dông ®îc trong vßng 2 tuÇn.
5.2.4.2. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc 100µg/ml.
Hót chÝnh x¸c 10ml dung dÞch chuÈn gèc(5.2.4.1) vµo
b×nh ®Þnh møc 100ml, pha lo·ng vµ ®Þnh møc ®Õn v¹ch
b»ng metanol. L¾c ®Òu.
6. LÊy mÉu vµ chuÈn bÞ mÉu
6.1. LÊy mÉu
Ph¬ng ph¸p lÊy mÉu kh«ng quy ®Þnh trong tiªu chuÈn
nµy, nªn lÊy mÉu theo ISO 6497:2002. §iÒu quan träng
lµ mÉu göi ®Õn phßng thÝ nghiÖm ph¶i lµ mÉu trung
thùc vµ cã tÝnh ®¹i diÖn, kh«ng bÞ h h¹i hoÆc bÞ biÕn
®æi thµnh phÇn trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ b¶o
qu¶n. Khèi lîng mÉu ph©n tÝch ph¶i kh«ng ®îc Ýt h¬n
500 gam.
6.2. ChuÈn bÞ mÉu
6.2.1. MÉu ë d¹ng bét mÞn
NÕu mÉu thÝ nghiÖm ë d¹ng bét lät hoµn toµn qua sµng
cã kÝch thíc lç sµng 1,00 mm th× trén thËt ®Òu mÉu
(500 gam) b»ng m¸y trén phßng thÝ nghiÖm lo¹i Hobart
(hoÆc t¬ng ®¬ng) trong vßng 10 phót. Sau ®ã chia hçn
hîp b»ng thiÕt bÞ chia ®«i hoÆc thiÕt bÞ chia t cho
®Õn khi thu ®îc lîng mÉu thö kh«ng díi 100 gam.
6.2.2. MÉu cã kÝch thíc h¹t võa
5