TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 8475:2010
ISO 23065:2009
CHẤT BÉO SỮA TỪ CÁC SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO OMEGA-3
VÀ OMEGA-6 BẰNG SẮC KÝ KHÍ-LỎNG
Milk fat from enriched dairy products - Determination of omega-3 and omega-6 fatty acid content
by gas-liquid chromatography
Lời nói đầu
TCVN 8475:2010 hoàn toàn tương đương với ISO 23065:2009/IDF 211:2009;
TCVN 8475:2010 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng
cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
CHẤT BÉO SỮA TỪ CÁC SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO OMEGA-3
VÀ OMEGA-6 BẰNG SẮC KÝ KHÍ-LỎNG
Milk fat from enriched dairy products - Determination of omega-3 and omega-6 fatty acid
content by gas-liquid chromatography
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng axit béo omega-3 (
-3) và omega-6
(
- 6) trong chất béo sữa dạng khan được tách chiết từ các sản phẩm sữa có bổ sung hoặc
được làm giàu một cách tự nhiên các thành phần này.
Quy trình quy định này cho phép đánh giá các axit béo
- 3 và
- 6 quan trọng nhất.
CHÚ THÍCH Các ký hiệu “omega-3”, “
-3 và “
3” là không đúng, nhưng trong sử dụng thông
thường thì tương đương với “
- 3”. Điều này cũng đúng với “omega-6”, “
-6” và “
6”, tương
đương với “
- 6”.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện
dẫn khi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi
năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8103 (ISO 14156), Sữa và sản phẩm sữa – Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa
tan trong lipit
ISO 15884/IDF 182, Milk fat – Preparation of fatty acid methyl esters (Chất béo sữa – Chuẩn bị
các metyl este của axit béo)
3. Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1.
axit béo
- 3 (
- 3 fatty acid)
axit béo omega 3 (omega-3 fatty acid)
axit béo omega-3 [(omega-3 fatty acid (deprecated)]
axit béo
-3 [(
-3 fatty acid (deprecated)]
axit béo
3 [(
3 fatty acid (deprecated)]
axit không béo bão hòa đa có liên kết đôi đầu tiên ở vị trí cacbon thứ ba từ nhóm metyl cuối
cùng.
3.2.
axit béo
- 6 (
- 6 fatty acid)
axit béo omega 6 (omega-6 fatty acid)
axit béo omega-6 [(omega-6 fatty acid (deprecated)]
axit béo
-6 [(
-6 fatty acid (deprecated)]
axit béo
6 [(
6 fatty acid (deprecated)]
axit không béo bão hòa đa có liên kết đôi đầu tiên ở vị trí cacbon thứ sáu từ nhóm metyl cuối
cùng.
3.3.
hàm lượng axit béo
- 3 và
- 6 (
- 3 and
- 6 fatty acid content)
phần khối lượng của các chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
CHÚ THÍCH Hàm lượng axit báo
- 3 và
- 6 được biểu thị bằng phần khối lượng tính bằng
miligam trên 100 g chất béo của các axit béo được liệt kê trong Bảng 1.
Bảng 1 – Các thành phần của hàm lượng axit béo
- 3 và axit béo
- 6
Chiều dài mạch và tên
gọi theo liên kết đôi
Tên hệ thống Tên thông thường
và/hoặc chữ viết tắt
C18: 2
- 6 axit (9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoic axit linoleic, LA
C18: 3
- 3 axit (9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-9,12,15-
trienoic axit -linolenic, -LNA
C18: 4
- 3 axit (6Z, 9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-6,9,12,15-
tetraenoic
axit stearidonic
C20: 5
- 3 axit (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)-eicosa-
5,8,11,14,17-pentaenoic
EPA
C22: 5
- 3 axit (7Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-docosa-7, 10,
13,16,19-pentaenoic
DPA
C22: 6
- 3 axit (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosa-
4,7,10,13,16,19-hexaenoic
DHA
4. Nguyên tắc
Chất chuẩn nội được bổ sung vào chất béo sữa dạng khan. Các metyl este của axit béo (FAME)
được tạo thành do este hóa. Các FAME được tách ra và được xác định bằng sắc kí khí mao
quản. Các axit béo
- 3 và
- 6 được định lượng dựa trên chất chuẩn nội.
5. Thuốc thử
Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử
khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
5.1. n-hexan [CH3(CH2)4CH3].
5.2. FAME C23:0 (tricosanoic), có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.
5.3. Dung dịch chuẩn FAME C23:0
Cân chính xác khoảng 25 mg C23:0 (5.2) cho vào bình định mức một vạch 25 ml (6.3). Pha loãng
bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn. Dung dịch chuẩn C23:0 có thể bền trong một tháng khi
được bảo quản trong tủ lạnh.
5.4. FAME EPA C20:5
- 3, có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.
5.5. Dung dịch chuẩn FAME C20:5
- 3
Cân chính xác khoảng 10 mg C20:5
- 3 (5.4) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha
loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.
5.6. FAME DHA C22:6
- 3, có độ tinh khiết 99 % phần khối lượng.
5.7. Dung dịch chuyển FAME C22:6
- 3
Cân chính xác khoảng 10 mg C22:6 - 3 (5.6) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha
loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.
5.8. FAME LA C18:2 - 6, có độ 99 % phần khối lượng.
5.9. Dung dịch chuẩn FAME C18:2 - 6
Cân chính xác khoảng 10 mg C18:2 - 6 (5.8) trong bình định mức một vạch 10 ml (6.3). Pha
loãng bằng n-hexan (5.1) đến vạch và trộn.
5.10. Hỗn hợp đối chứng, gồm các metyl este của axit béo - 3 và - 6, để định tính dựa vào
thời gian lưu.
Hỗn hợp đối chứng cần chứa các FAME của các axit được liêt kê trong Bảng 1 cùng với chất
chuẩn nội C23:0 metyl este (5.2). Hỗn hợp này có thể thu được bằng cách trộn 1 ml của bốn
dung dịch chuẩn (5.3, 5.5, 5.7 và 5.9) với 1 ml của ba dung dịch khác được chuẩn bị bằng cách
cân -linolenic, stearidonic và FAM DPA (độ tinh khiết ít nhất 80 % phần khối lượng) ở nồng độ
tương tự n-hexan (1 mg/ml).
Do giá của một số các FAME - 3 cao, nên có thể dùng các hỗn hợp có bán sẵn trên thị trường
(kể cả các FAME khác) để thay thế hỗn hợp đối chứng. Nếu sử dụng hỗn hợp FAME chưa bão
hòa đa có bán sẵn, thì cần tính đến nồng độ của chúng, chỉnh bằng n-hexan, nếu cần. Nếu
không có sẵn, thì thêm một lượng thích hợp của dung dịch chuẩn FAME C23:0 (5.3).
6. Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể
sau:
6.1. Cân phân tích, có khả năng đọc được đến 0,1 mg.
6.2. Tủ sấy, có khả năng duy trì được nhiệt độ ở 60 oC 2 oC.
6.3. Bình định mức một vạch, dung tích 10 ml, 25 ml và 50 ml, loại A được quy định trong
TCVN 7153 (ISO 1042)(4).
6.4. Pipet một vạch, dung tích 1 ml và 5 ml, loại A được quy định trong TCVN 7151 (ISO 648)[1].
6.5. Pipet chia độ, dung tích 5 ml, loại A được quy định trong TCVN 7150 (ISO 835)[3].
6.6. Ống nghiệm, dung tích 10 ml, có nắp vặn bằng polytetraflouroethylen có lớp lót.
6.7. Máy sắc kí khí-lỏng, có gắn detector ion hóa ngọn lửa và hệ thống bơm phân dòng mao
quản hoặc bơm lên cột.
6.7.1. Khí mang, hydro hoặc heli có độ tinh khiết ít nhất là 99,999 % phần khối lượng.
6.7.2. Các loại khí khác, không được có chất nhiễm bẩn hữu cơ kể cả dạng vết (hàm lượng
hydrocacbon nhỏ hơn 1 mg/kg), nitơ và hydro, độ tinh khiết ít nhất 99,995 % phần khối lượng và
không khí tổng hợp.
6.7.3. Cột mao quản, có pha tĩnh tách được tốt các FAME.
Nên sử dụng các cột mao quản pha tĩnh polyetylen glycol có chiều dài 25 m, 30 m hoặc 60 m,
đường kính trong 0,25 mm hoặc 0,32 mm và chiều dày màng phim 0,12 m hoặc 0,25 m. Các
cột này được rửa giải các FAME trước, tiếp theo chiều dài mạch cacbon và sau đó là số lượng
các liên kết đôi. Có thể sử dụng các pha phân cực lớn hơn, như pha tĩnh cyanosilicon, nhưng
trong trường hợp này, cần chú ý đặc biệt khi nhận dạng pic, ngoài ra, với tính phân cực càng
tăng thì việc tách giữa FAME 23:0 được dùng làm chất chuẩn nội và FAME C20:5
- 3 thu được
càng khó.
6.7.4. Điều kiện sắc kí khí: Nhiệt độ lò và tốc độ dòng khí mang phụ thuộc vào các cột được
chọn và khí mang được chọn. Trong mọi trường hợp, các điều kiện được chọn phải tạo ra sự
tách biệt giữa C18:4
- 3 và C18:2 liên hợp axit linoleic (CLA) và giữa DPA (xem Hình A.1 và
Hình A.2).
Xem Ví dụ 1 và Ví dụ 2 về các điều kiện.
VÍ DỤ 1: Sử dụng khí heli làm khí mang và các điều kiện lò đẳng nhiệt, các điều kiện được áp
dụng cho việc tách tốt FAME
- 3 và
- 6 là:
Khí mang: Heli ở tốc độ dòng 1,8 ml/min
Áp suất đầu cột: 120 kPa
Cột mao quản silica nung chảy
Cột: Chiều dài 30 m
Đường kính trong 0,32 mm
Chiều dày màng 0,25 m
Pha tĩnh: Polyetylen glycol
Nhiệt độ cột: 200 oC
Nhiệt độ cột detector và bộ bơm: 260 oC
Tỷ lệ phân dòng: 100 : 1
Thể tích mẫu được bơm: 1 l.
Sắc đồ thu được trong các điều kiện sắc kí khí lỏng này được nêu trong Hình A.1.
VÍ DỤ 2: Sử dụng khí hydro làm khí mang và các điều kiện của lò được cài đặt chương trình, các
điều kiện được áp dụng cho việc tách dùng FAME
- 3 và
- 6 là:
Khí mang Hydro ở tốc độ dòng không đổi 1,2 ml/min
Áp suất đầu cột: 67 kPa
Cột mao quản silica nung chảy
Cột: Chiều dài 30 m
Đường kính trong 0,32 mm
Chiều dày màng 0,25 m
Pha tĩnh: (50 % cyanopropyl)-metyl polysiloxan 1
Nhiệt độ cột: Nhiệt độ ban đầu 150 oC được duy trì trong 3 min
Tăng với tốc độ 4 oC/min đến 172 oC
Duy trì ở 172 oC trong 1 min
Tăng với tốc độ 8 oC/min đến 210 oC
Nhiệt độ cột detector và bộ bơm: 240 oC
Tỷ lệ phân dòng: 100 : 1
Thể tích mẫu được bơm: 1 l.
Sắc đồ thu được trong các điều kiện sắc kí khí lỏng này được nêu trong Hình A.2.
6.7.5. Detector ion hóa ngọn lửa, có thể được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn 30 oC so với
nhiệt độ cuối cùng của lò cột.
6.7.6. Bơm phân dòng, có thể được làm nóng đến nhiệt độ cao hơn 30 oC so với nhiệt độ cuối
cùng của lò cột.
CHÚ THÍCH Cũng có thể sử dụng tốt hệ thống bơm lên cột cho phép phân tích này. Trong
trường hợp này, tiến hành pha loãng thích hợp với n-hexan trước khi bơm (ví dụ: 1 ml dung dịch
được chuẩn bị trong 9.2 với 9 ml n-hexan).
6.7.7. Xyranh bơm, dung tích 1 l hoặc 5 l.
6.7.8. Hệ thống tích phân, tốt nhất là được vi tính hóa.
7. Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi
trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707)[2].
8. Chuẩn bị mẫu thử
Chất béo sữa dạng khan thu được theo TCVN 8103 (ISO 14156), chú ý để loại bỏ dung môi chiết
càng triệt để càng tốt bằng cách làm nóng chất béo đến nhiệt độ không quá 60 oC để tránh phân
hủy các axit béo không bão hòa đa.
9. Cách tiến hành
9.1. Dung dịch hiệu chuẩn để xác định hệ số phản ứng của LA, EPA và DHA
Dùng pipet (6.4) lấy 1 ml dung dịch chuẩn FAME EPA (5.4), 1 ml dung dịch chuẩn FAME DHA
(5.6), 1 ml dung dịch chuẩn FAME LA (5.8) và 1 ml chất chuẩn nội FAME C23:0 (5.3) cho vào
ống nghiệm (6.6.) và trộn.
9.2. Phần mẫu thử
Làm nóng chảy mẫu thử (Điều 8) ở 50 oC. Lắc mẫu nóng chảy trong 1 min để có được mẫu thử
đồng nhất. Cân 100 mg mẫu đồng nhất, chính xác đến 1 mg, cho vào ống nghiệm (6.6).
Trước khi chuẩn bị FAME theo ISO 15884, dùng pipet (6.4) lấy 1 ml dung dịch chuẩn FAME
C23:0 (5.3). Do đó, chỉ thêm 4 ml n-hexan thay vì 5 ml được quy định trong ISO 15884. Lượng
chất chuẩn nội (FAME C23:0) là khoảng 1 % phần khối lượng của chất béo. Điều này rất hữu ích
để định lượng các axit béo - 3 và - 6 trong khoảng từ 0,5 % đến 4 % phần khối lượng (ví dụ:
các sản phẩm có bổ sung dầu cá).
Nếu nồng độ của một hoặc nhiều axit béo - 3 và - 6 cao hơn 4 % phần khối lượng (nghĩa là
sản phẩm có bổ sung dầu lanh) thì nồng độ của FAME C23:0 sẽ phải tăng lên. Trong trường hợp
này, việc bổ sung 5 ml n-hexan quy định trong ISO 15884 cần được thay thế bằng 5 ml FAME
C23:0 (5.3).
Khi kết thúc quá trình metyl hóa, chuyển 2 ml phần nổi phía trên sang ống nghiệm (6.6), hoặc
trực tiếp vào các lọ lấy mẫu tự động. Dung dịch này được dùng ngay để phân tích sắc kí khí
hoặc có thể được bảo quản trong tủ lạnh đến 2 ngày.
9.3. Xác định chất lượng