Tiểu luận: Vi sinh vật chỉ thị

Ặ Ấ Ề Đ T V N Đ

ữ ậ ậ ướ ấ ắ ỏ ườ Vi sinh v t là nh ng sinh v t có kích th c r t nh mà m t th ng không th ể

ấ ượ ể ỉ ể ể nhìn th y đ c, nó ch có th quan sát đ ượ ướ c d i kính hi n vi và nó có th phân b ố

ắ ơ ườ ướ ả ườ ậ kh p n i trong môi tr ấ ng đ t, n c, không khí và c môi tr ng sinh v t, hàng hóa,

ố ữ ự ự ữ ậ ậ ẩ ươ l ự ng th c, th c ph m. Trong s nh ng vi sinh v t này có nh ng vi sinh v t mà s có

ặ ủ ườ ộ ố ượ ớ ồ ộ m t c a chúng trong môi tr ng v i m t s l ấ ị ng, n ng đ nh t đ nh gây cho môi

ườ ề ặ ễ ậ ị tr ng b ô nhi m v m t vi sinh v t.

ừ ể ả ậ Tuy nhiên chúng ta không th kh o sát t ng nhóm vi sinh v t xem môi tr ườ ng

ặ ấ ề ặ ễ ệ ề ậ ị có b ô nhi m v m t vi sinh v t hay không vì vi c này g p r t nhi u khó khăn v ề

ặ ế ư ể ả ả ườ ệ m t kinh t cũng nh đ đ m b o an toàn cho ng ậ ấ ề i làm vi c vì nhi u vi sinh v t r t

ể ỏ ườ ố ớ ứ nguy hi m đ i v i s c kh e con ng i.

ể ể ế ậ ườ ề ặ ễ ậ ị V y làm th nào đ ki m tra môi tr ng có b ô nhi m v m t vi sinh v t hay

ậ ậ ậ ờ ỉ ỉ ị ữ ị không? Đó là nh vào các vi sinh v t ch th . V y vi sinh v t ch th là gì? Nó có nh ng

ữ ể ể ồ ị ặ đ c đi m nào? Bao g m nh ng nhóm nào đi n hình và cách xác đ nh nó ra sao? Đó là

ề ấ ậ ữ ậ ấ ọ ỉ nh ng v n đ r t đáng quan tâm, vì v y tôi ch n ch đ “ ị” làm ủ ề Vi sinh v t ch th

ể ậ ề đ tài bài ti u lu n.

Ộ N I DUNG

ệ ậ ỉ ị

1. Khái ni m vi sinh v t ch th

ố ượ ữ ậ ỉ ị ấ ị ậ ầ Vi sinh v t ch th là nh ng đ i t ề ề ng vi sinh v t có yêu c u nh t đ nh v đi u

ệ ế ầ ưỡ ượ ư ả ki n sinh thái liên quan đ n nhu c u dinh d ng, hàm l ng oxy, cũng nh kh năng

ộ ố ị ượ ấ ị ế ố ộ ạ ườ ố ch ng ch u m t hàm l ng nh t đ nh các y u t đ c h i trong môi tr ng s ng và do

ệ ủ ự ệ ề ề ị ộ ể ệ ạ đó s hi n di n c a chúng bi u th m t tình tr ng v đi u ki n sinh thái môi tr ườ ng

ằ ớ ạ ố ượ ủ ầ ả ố ị ố s ng n m trong gi i h n nhu c u và kh năng ch ng ch u c a đ i t ậ ng vi sinh v t

đó.

ủ ể ặ ậ ỉ ị

2. Đ c đi m c a vi sinh v t ch th

ủ ể ậ ặ ỉ ị ườ ặ Đ c đi m c a vi sinh v t ch th là nhóm th ng xuyên có m t trong phân

ườ ậ ộ ướ ấ ượ ự ả ng i, đ ng v t máu nóng, n ẩ c th i, th c ph m kém ch t l ệ ng,…, không hi n

ệ ở ẫ ạ ị ườ ậ ỉ ố ượ ẫ ớ ơ di n m u s ch. Vi sinh v t ch th th ng có s l ễ ng l n h n trong m u ô nhi m

ệ ơ ở ườ ả ậ ớ l n h n các vi sinh v t gây b nh khác, khi môi tr ả ng ngoài ph i không sinh s n

ố ượ ệ ả ễ ệ ề ả ả tăng s l ặ ng. Đ c bi ố t là chúng ph i d phát hi n và kh năng đ kháng ph i gi ng

ệ ậ ớ v i vi sinh v t gây b nh.

ậ ỉ ị

3. Các nhóm vi sinh v t ch th

ữ ậ ồ ỉ ị Vi sinh v t ch th bao g m nh ng nhóm sau:

ư ặ Escherichia coli (E. coli).

Nhóm Coliforms đ c tr ng là

ư ặ Staphylococcus aureus (S. aureus).

Nhóm Staphylococcus đ c tr ng là

ư ặ Streptococcus faecalis (S. faecalis).

Nhóm Streptococcus đ c tr ng là

ư ặ Clostridium perfringens (C. perfringents).

Nhóm Clostridium đ c tr ng là

3.1. Nhóm Coliforms

ừ ượ ư ộ ề ợ ỉ ị Coliforms t lâu đã đ ấ ậ c xem nh m t vi sinh v t ch th thích h p v ch t

ướ ượ ệ ộ ị ượ ượ l ng n c, chúng đ ễ c dùng r ng rãi vì d phát hi n và đ nh l ng. Chúng đ ượ c

ể ỉ ậ ả ị ướ ỉ ố Coliforms ặ ủ dùng đ ch th kh năng có m t c a các vi sinh v t khác trong n c. Ch s

ệ ủ ự ệ ệ ậ cao thì s hi n di n c a các vi sinh v t gây b nh cũng cao.

ồ ố

Ngu n g c.

ữ ố ượ ả Klebsiella pneumoniae và Vào cu i nh ng năm 1800 khi Von Fritsch đ c mô t

ậ ặ ư ư ượ ấ Klebsiella rhinoscleromatis nh là vi sinh v t đ c tr ng đ c tìm th y trong phân con

ườ ng i (Geldreich 1978).

ầ ườ ệ Năm 1885 Percy và Grace Frankland đ u tiên th ẩ ng xuyên xét nghi m vi khu n

ử ụ ấ ắ ấ ằ ươ trong n ướ ở c London. Robert Kouch s d ng ch t keo r n n u b ng ph ệ ng ti n

ể ế ề ẩ ố truy n th ng đ đ m vi khu n (Hutchinson và Ridgway 1977).

ự ắ ằ ầ ậ ặ ủ coliforms Đ u th p niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho r ng s v ng m t c a

ộ ấ ư ệ ệ ệ ấ ẩ ấ nh là m t d u hi u cho th y không xu t hi n b nh do vi khu n gây nên, và sau khi

ố ớ ệ ấ ớ ệ ố ệ ả s n xu t khí đ t v i vi c gi i thi u ng Durham (Durham năm 1893) thì khái ni m v ề

ẩ ạ ượ ử ụ nhóm vi khu n ẩ Coliforms và các vi khu n khác d ng coli đ c s d ng ở ướ n c Anh

năm 1901.

ủ ị ẩ Năm 1908 Bergey và deehan xác đ nh có 256 loài khác nhau c a nhóm vi khu n

Coliforms.

ủ ậ ẩ Năm 1909 MacConkey công nh n 128 loài khác nhau c a nhóm vi khu n

Coliforms.

ự ế ầ ậ ệ ủ ượ Đ n đ u th p niên 1920, s khác bi ạ t c a các d ng vi khu n ẩ coli đ c đem ra

ấ ườ ỏ ả s n xu t indole, hóa l ng gelatin, lên men đ ằ ng sucrose và Voges – Proskauer nh m

ự ễ ị xác đ nh s ô nhi m faecal (Hendricks 1978).

ữ ớ ỉ ử ể ệ Năm 1938 Parr có nh ng phát minh lên t i đ nh đi m trong th nghi m IMVIC

ố ủ ử ệ ệ ỏ (Indole, Methyl đ , voges – Proskauer và mu i c a acid Citric). Vi c th nghi m cho

ấ ự ệ ủ ạ ẩ th y s khác bi ạ t c a các d ng vi khu n ấ ẩ Coliforms phân, các d ng vi khu n trong đ t

ượ ử ụ và trung gian, và nó đ ế c s d ng cho đ n ngày hôm nay.

ể ặ

Đ c đi m.

ữ ự ẩ ậ ử Coliforms là nh ng tr c khu n Gram âm, hình g y, không sinh bào t ả , có ph n

β ứ ể ệ ủ ạ ả ng oxidase âm tính và th hi n ho t tính c a ơ galactosidase có kh năng sinh h i,

ườ ệ ộ acid và aldehyde do lên men đ ng lactose trong vòng 24 – 48 gi ờ ở nhi t đ 36 ± 2

oC.

ể ả ườ ậ ặ ấ ạ ố Coliforms có kh năng phát tri n trên môi tr ng mu i m t ho c các ch t ho t tính b ề

ấ ứ ế ươ ặ m t khác có tính ch t c ch t ng t ự .

ồ Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Nhóm Coliforms g m 4 chi:

ươ ạ ấ ớ ồ Tuy nhiên , theo các ph ng pháp phân lo i m i thì nhóm này không đ ng nh t. Nhóm

ả ẩ ồ ư Escherichia cloacae, này bao g m các vi khu n có kh năng lên men lactose nh

ể ấ ườ ướ Citrobacter freundii có th tìm th y trong phân và ngoài môi tr ng n ấ c giàu ch t

ưỡ ự ư ậ ấ ướ ố ộ dinh d ng, đ t và xác th c v t cũng nh trong n ồ c u ng có n ng đ dinh d ưỡ ng

ố ồ ư Seratia fonticola, ươ t ng đ i cao. Ngoài ra, nhóm này còn bao g m các loài nh

ể ấ ấ ế Rabnella aqualiris, Buttiaxella agrestis hi m th y trong phân và có th th y trong n ướ c

ấ ượ ố ố u ng có ch t l ng t t.

(cid:0) ị ẩ ị ệ ữ Coliforms ch u nhi t: ệ Vi khu n coliforms ch u nhi t là nh ng coliforms có kh ả

ườ ở năng lên men đ ng lactose 44 45

oC; nhóm này bao g m ồ Escherichia, Kiebsiella,

ớ ị ệ ể Enterobacter, Citrobacter. Khác v i E.Coli, coliforms ch u nhi t có th xu t x t ấ ứ ừ

ướ ư ướ ơ ệ ừ ả ự ồ ngu n n ấ ữ c giàu ch t h u c nh n c th i công nghi p t ố ữ ậ xác th c v t th i r a

ặ ấ ho c đ t.

ị ệ ệ ố ố ướ ể Coliforms ch u nhi t không tái phát tri n trong h th ng phân ph i n ạ c ngo i

ừ ướ ứ ủ ấ ưỡ ẩ ơ tr khi n c ch a đ ch t dinh d ễ ng do nhi m b n, nhi ệ ộ ủ ướ t đ c a n c cao h n 13

oC

ướ ừ và n c không có chlor th a.

ạ ố ườ ợ ị ệ Trong đ i đa s các tr ậ ng h p, đ m đ c a ộ ủ Coliforms ch u nhi t có liên quan

ệ ử ụ ự ế ộ ủ ế ể ậ ạ ẩ ậ tr c ti p đ n đ m đ c a E.Coli. Vì v y, vi c s d ng d ng vi khu n này đ đánh giá

ấ ượ ậ ấ ch t l ng n ướ ượ c đ c ch p nh n.

(cid:0) ị ệ ả Coliforms phân: là nhóm Coliforms ch u nhi t có kh năng lên men sinh indol khi

ệ ộ ờ ồ ủ ở nhi t đ 44

oC kho ng 24 gi ả

trong canh trypton. Ngu n g c c a ố ủ Coliforms t ừ ộ ru t

ườ ế ặ ậ ộ ủ c a ng i và các đ ng v t máu nóng. Do đó, n u có m t nhóm Coliforms phân nghĩa là

ườ ậ ườ ễ ị ộ môi tr ng b nhi m vi sinh v t đ ng ru t.

(cid:0) ượ ượ ủ ứ ầ E. coli đ c Bucher tìm ra năm 1885 và đ c Escherich nghiên c u đ y đ năm

ườ ố ộ ộ 1886. E. coli bình th ế ng s ng trong ru t già. Trong ti ng Latin ru t già là colum. Vì

ọ ọ ườ ữ ộ ữ ấ tôn tr ng nhà khoa h c nên ng i ta l y tên ông ghép vào ch ru t già theo ng pháp

ế ạ ẩ ượ ở ữ s h u cách ti ng Latin, nên lo i vi khu n này đ ọ c g i là ư ậ Escherichia coli. Nh v y

ặ ủ ẩ ở ườ ứ ỏ ườ ự s có m t c a vi khu n này môi tr ng bên ngoài ch ng t môi tr ng đó có kh ả

ễ ừ năng ô nhi m t phân.

ọ ượ ư ặ ấ ủ E. coli là thành viên c a h Enterobacteriace đ ở c đ c tr ng b i tính ch t có

β β ể ở ệ ộ enzyme – galactosidase và – glucoronidase. Nó phát tri n nhi t đ 44 – 45

oC trên

ườ ổ ợ ơ môi tr ng t ng h p, lên men lactose và mannitol có sinh h i và sinh acid, sinh indol t ừ

ể ở ể ệ ộ ộ ố ủ tryptophan. Tuy nhiên m t s ch ng cũng có th phát tri n nhi t đ 37

oC ch không ứ

ể ở ộ ố phát tri n 44 – 45

oC và m t s thì không sinh h i.

ơ E. coli không sinh oxidase ho cặ

ủ phân h y urea.

ặ ấ ề ườ ậ ộ E. coli có m t r t nhi u trong phân ng ậ ộ ủ i và đ ng v t máu nóng. M t đ c a

ế ẩ ẩ ượ ể ể chúng có th lên đ n 10

9 vi khu n/gam. Vi khu n này đ

c dùng đ đánh giá m c đ ứ ộ

ễ ở ườ ẩ ạ ạ ộ ô nhi m phân, b i vì nó th ng t o khu n l c trên thành ru t và nó không gây nguy

ứ ể ỏ hi m cho s c kh e.

3.2. Nhóm staphylococcus

ẩ ầ ươ ạ ử ườ Staphylococcus là các c u khu n Gram d ng không t o bào t , có đ ng kính

ọ ướ ế ắ ả ườ ụ ạ ộ kho ng 1µm, không di đ ng và s p x p theo m i h ng, th ng t o thành c m trông

ổ ế ư ữ ẩ ấ ộ ố gi ng nh chùm nho. Là m trong nh ng vi khu n n i ti ng nh t do t ỷ ệ l ệ gây b nh

ư ề ề ệ ặ ấ ạ ả ấ r t cao, có kh năng gây nhi u b nh n ng cũng nh đ kháng kháng sinh r t m nh.

ư ề ẩ ọ Các nhà vi khu n h c lùng danh nh Robert Kouch và Louis Pasteur đ u quan tâm

ứ ạ ẩ nghiên c u d ng vi khu n này.

ươ ệ ệ ụ ầ ẩ ượ Trên ph ng di n gây b nh, t c u khu n đ c chia thành 2 nhóm chính là t ụ

ẩ ụ ầ ẩ ầ c u khu n có men coagulase và t c u khu n không có men coagulase.

ụ ầ ẩ ườ ấ

T c u khu n có men cosgulase: nuôi trên môi tr

ẩ ng nuôi c y có máu, khu n

ọ ụ ầ ạ l c màu vàng nên hay còn g i là t c u vàng.

ụ ầ ấ ẩ ườ ấ

T c u khu n không có men coagulase: nuôi c y trên môi tr

ng nuôi c y có

ẩ ạ ắ ọ ụ ầ ắ máu, khu n l c màu tr ng ngà nên hay còn g i là t c u tr ng.

ượ ủ ế ừ ậ ầ ủ ấ ườ Staphylococcus đ c phân l p ch y u t da và ch t nh y c a ng ộ i và đ ng

ể ử ụ ể ể ẩ ậ v t máu nóng. Do đó, có th s d ng nhóm vi khu n này đ ki m tra xem môi tr ườ ng

ự ệ ệ ễ ả ả ẫ ẩ ậ hay các m u th c ph m có nhi m vi sinh v t gây b nh hay không, có đ m b o v an

ự ẩ toàn th c ph m hay không.

ụ ầ ẩ ượ ị ấ ậ ỉ Staphylococcus aureus là t c u khu n đ c dùng làm vi sinh v t ch th r t ph ổ

ẩ ươ ế ặ ỵ bi n. ế Staphylococcus aureus là vi khu n Gram d ng, hi u khí ho c k khí tùy ý, khi

ấ ườ ộ ố ẩ ạ ạ nuôi c y trên môi tr ng th ch máu, m t s dòng vi khu n làm tan máu, t o s c t ắ ố

ấ ở ệ ộ vàng sau 1 – 2 ngày nuôi c y nhi t đ phòng.

3.3. Nhóm Streptococcus

ẩ ươ ế ạ ữ Streptococcus là nh ng vi khu n Gram d ầ ng, d ng hình c u hay ovan, x p

ỗ ừ ế ỗ ế ặ ườ ạ thành chu i t 4 – 6 t bào ho c thành 2 chu i t bào. Trên môi tr ng th ch máu vi

ẩ ạ ỏ ặ ể ẩ ệ ẩ khu n phát tri n thành các khu n l c nh , đ c bi ế t là gây dung huy t. Vi khu n lên

ườ men đ ng mannitol, sorbitol, melibinose,…

ố ộ ự ườ Vi khu n ẩ Streptococcus phân b r ng rãi trong t nhiên và trong đ ng tiêu hóa,

ầ ướ ố ủ ơ ể ườ ấ ậ ộ hô h p ph n d i ng tiêu hóa và trên da c a c th ng i, đ ng v t.

ố ừ ữ ẩ ồ ỵ ầ Streptococcus phân là nh ng liên c u khu n k khí tùy ý có ngu n g c t phân.

ươ ườ ụ ắ ỗ Chúng có hình ovan, Gram d ng, th ng t thành đôi hay chu i ng n, không sinh bào

ẩ ạ ộ ố ỏ ậ ế ầ ả ồ ỏ ử t , m t s dòng có kh năng sinh v nh y. Khu n l c có màu h ng đ n đ đ m do s ự

ả ứ ử ể ớ kh triphenyl tetrazolium chloride. Chúng âm tính v i ph n ng catalase, có th phát

ể ườ ứ ố ệ ộ tri n trên môi tr ng ch a 6,4% mu i NaCl, pH = 9,6 và nhi t đ 45

oC.

ể ỉ ố ồ ị Ch s ễ ỉ ố Coliforms phân và Streptococcus phân dùng đ ch th ngu n g c ô nhi m

ườ ậ ộ ỷ ố ướ ễ ừ ộ ừ t con ng i hay đ ng v t. Khi t s này d i 0,7 nghĩa là ô nhi m t ậ đ ng v t, còn

ừ ườ ơ ớ l n h n 4 là t con ng i.

3.4. Nhóm Clostridium

ẩ ươ ử Clotridium là vi khu n Gram d ỵ ng, hình que, k khí, sinh bào t ố , đa s có kh ả

ủ ả ạ ẩ ộ năng di đ ng. Chúng là vi khu n ho i sinh có kh năng phân h y protein và saccharide

ượ ợ ế ộ ố ể đ sinh năng l ổ ng và t ng h p t ể bào. M t s loài chuy n hóa không hoàn toàn

protein gây ra mùi khó ch u.ị

ộ ố ệ ệ ệ ườ ậ ộ ấ Clotridium hi n di n trong đ t, m t s loài gây b nh cho ng i, đ ng v t và

ộ ố ự ượ ị ư ỏ m t s loài gây h h ng th c ph m. ẩ Clotridium đ ậ ộ ằ c xác đ nh m t đ b ng cách nuôi

ườ trên môi tr ng ferri amonium citrate và disodium sulfite ủ ở 37

oC trong 1 – 2 ngày.

ả ứ ữ ắ Khu n l c c a ẩ ạ ủ Clotridium màu đen do ph n ng gi a ion sulfite (S

2) và ion s t (Fe

2+)

ườ có trong môi tr ng.

ế ạ ắ ộ ỵ ử Clotridium perfringens là loài k khí không b t bu c, hi m khi t o ào t trong

ườ ể ượ ư ạ ở ườ ườ môi tr ng nhân t o, nh ng có th đ c quan sát môi tr ng Ellner, môi tr ng b ổ

ộ ố ủ ạ ử ẻ ậ ố sung mu i m t và bicarbonate hay quinoline. Đ c t c a chúng có th gây ho i t và

ộ ộ ự ẩ ặ ử ế ề ạ ớ ng đ c th c ph m. M c dù sinh bào t khi n chúng đ kháng m nh v i môi tr ườ ng

ố ượ ư ữ ệ ậ ị ẩ nh ng vi khu n này là đ i t ể ng đáng tin c y cho vi c xác đ nh nh ng vùng bi n

ễ nhi m phân.

4.

ộ ố ươ ậ ị ỉ M t s ph ị ng pháp xác đ nh vi sinh v t ch th

4.1.

ươ ế Ph ẩ ạ ng pháp đ m khu n l c

ườ

4.1.1. Môi tr

ấ ng và hóa ch t

ườ ử ụ Môi tr ng s d ng là Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2. Môi tr ườ ng

ế ệ ố ố ượ đ ấ ủ c pha ch , phân ph i vào trong các bình th y tinh hay trong các ng nghi m và h p

ử ở ặ ố ứ ệ ườ kh trùng 121

oC trong 15 phút. Các bình ho c ng nghi m ch a môi tr

ư ng ch a

ượ ả ủ ạ ướ ử ụ ượ ử ụ đ c s d ng đ ả c b o qu n trong t l nh 2 – 8

oC. Tr

c khi s d ng môi tr ườ ng

ả ượ ả ộ ể ề ệ ườ ph i đ c đun ch y và làm ngu i 45

oC trong b đi u nhi

t. Ngoài môi tr ng trên,

ể ử ụ ả ườ ư còn có th s d ng c môi tr ng khác nh Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar.

ị ướ ố Dung d ch n ứ c mu i pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng pha loãng ch a

ướ ượ ứ 8,5g NaCl và 1g peptone trong 100ml n ị c. Dung d ch này đ c ch a trong các bình

ứ ử ấ ượ ố ch a 0,5 – 1,0 lít, h p kh trùng và đ ể c pân ph i thành các th tích chính xác 9 ml vào

ệ ố trong các ng nghi m vô trùng.

4.1.2. Quy trình phân tích

ị ẫ ẩ ướ

Chu n b m u tr

c khi phân tích:

ướ ự ư ế ệ ệ ấ ẫ ồ Tr ố ớ c khi ti n hành phân tích, th c hi n vi c đ ng nh t m u nh sau: đ i v i

ụ ư ẹ ẫ ạ ắ ượ ử ụ m u d ng r n dùng các d ng c nh kéo, k p đã đ c kh trùng cân chính xác 10g

ả ế ấ ả ề ầ ẫ ệ ế m u vào trong bao PE. T t c các thao tác ti p theo c n ph i ti n hành trong đi u ki n

ượ ự ệ ẫ ị vô trùng. Thêm vào l ệ ng m u này 90ml dung d ch pha loãng SPW. Th c hi n vi c

ụ ẫ ậ ẫ ấ ẫ ằ ậ ờ ộ ấ ơ ồ đ ng nh t m u b ng máy d p m u. Th i gian d p m u ph thu c vào tính ch t c lý

ư ẫ ườ ậ ẫ ợ ủ c a m u, nh ng không quá 2,5 phút. Trong tr ự ng h p không có máy d p m u th c

ư ệ ề ệ ẫ ấ ồ ễ hi n thao tác đ ng nh t nh sau: xát nhuy n m u trong đi u ki n vô trùng. Cân chính

ề ệ ướ ượ ử ề ấ ắ xác trong đi u ki n vô trùng n c SPW đã đ ộ c h p kh trùng. L c đ u trong m t

ố ớ ấ ị ứ ẫ ạ ờ ỏ th i gian nh t đ nh. Đ i v i m u d ng l ng, hút 10ml cho vào bình tam giác ch a 90ml

ượ ử ề ấ ượ ấ ằ ồ ướ n c SPW đã đ ắ c h p kh trùng, l c đ u. Sau khi đ ộ c làm đ ng nh t b ng m t

ươ ị ượ ằ ầ ồ ộ trong các ph ng pháp trên, dung d ch thu đ c có n ng đ pha loãng b ng 10 l n so

ầ ớ v i ban đ u.

ấ ượ ẫ ị ế ụ ậ ằ ồ D ch m u đ ng nh t đ c ti p t c pha loãng theo dãy th p phân b ng cách

ớ ầ ể ặ ị ố dùng pipet vô trùng (ho c pipetman v i đ u tip vô trùng) chuy n 1ml d ch vào ng

ứ ệ ệ ẫ ố ồ ị ấ ộ nghi m ch a 9ml dung d ch pha loãng. Tr n m u trong ng nghi m cho đ ng nh t

ả ẫ ầ ố ị ằ b ng máy rung (vortex) hay dùng pipet hút đ o d ch m u lên xu ng 5 – 10 l n. Dung

ẫ ộ ử ụ ầ ị d ch m u này có đ pha loãng là 10

2. Sau đó s d ng pipetman có đ u tip vô trùng

ứ ứ ể ệ ẫ ố ị ị chuy n 1ml d ch m u này vào ng nghi m th 2 ch a dung d ch pha loãng và thao tác

ự ể ớ ộ ẫ ị ế ụ ệ ươ ự ự ể ươ t ng t đ có d ch m u v i đ pha loãng 10

3. Ti p t c th c hi n t

ng t đ có các

ầ ế ặ ầ ơ ị ư ế ộ đ pha loãng c n thi ễ t. L u ý n u dùng pipet ho c đ u tip pipetman nguy c b nhi m

ệ ạ ặ ặ ạ ố trong quá trình thao tác (ch m tay, ch m m t ngoài ng nghi m, m t ngoài bình

ặ ầ ứ ầ ả ch a,..), c n ph i thay pipet ho c đ u tip vô trùng khác.

ẫ ấ

C y m u:

ự ế ứ ế ộ ọ ế Ch n 2 hay 3 đ pha loãng liên ti p d ki n ch a 25 – 250 t ậ bào vi sinh v t

ớ ầ ể ấ ặ trong 1ml đ c y lên đĩa petri. Dùng pipet vô trùng ho c pipetman v i đ u tip vô trùng

ữ ể ẫ ọ ị ươ ứ chuy n 1ml d ch m u pha loãng đã ch n vào gi a đĩa petri vô trùng. T ớ ng ng v i

ỗ ồ ấ ấ ấ ộ ổ ỗ m i n ng đ pha loãng c y ít nh t 2 3 đĩa. Sau khi c y đ vào m i đĩa 10 – 15ml môi

ườ ượ ả ổ ị ở ề ẫ ộ ớ ị tr ng PCA đã đ c đun ch y và n đ nh 45

oC. Tr n đ u d ch m u v i môi tr

ườ ng

ượ ề ề ỗ ồ ằ b ng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ng ầ ồ c chi u kim đ ng h , m i chi u 3 – 5 l n

ổ ườ ặ ẳ ặ ạ ngay sau khi đ môi tr ặ ng. Đ t các đĩa trên m t ph ng ngang cho th ch đông đ c.

ượ ủ ệ ộ ờ ậ L t ng c và các đĩa trong t ủ ấ ở m nhi t đ 30 ± 10

oC trong vòng 72 gi

. Nhi ệ ộ t đ

ủ ủ ể ẩ ổ ị ờ và th i gian có th thay đ i theo quy đ nh c a tiêu chu n.

ế

ả Cách tính k t qu :

A (CFU/g hay CFU/ml)x R

Trong đó:

ố ế ặ ẫ ơ ị ổ A là t ng s t ẩ ạ bào (đ n v hình thành khu n l c) trong 1g ho c 1ml m u.

ẩ ạ ế ố ổ ượ ọ N là t ng s khu n l c đ m đ c trên các đĩa đã ch n.

ố ượ ấ ượ ọ ạ ộ ứ n1 là s l ng đĩa c y đ c ch n t i đ pha loãng th i.

ể ấ ẫ ỗ ị V là th tích d ch m u (ml) c y vào trong m i đĩa.

ộ ươ ứ fi là đ pha loãng t ng ng.

ẳ ị R là t ỷ ệ l kh ng đ nh.

4.2.

ươ Ph ng pháp MPN (Most Probale Number)

ươ ươ ấ ớ ố ố ấ

ố ượ ể ộ

ự ị

ươ ng pháp này đ nh l ộ ố ấ ớ ế ườ ả ng pháp MPN hay ph ng pháp có s xác xu t l n nh t, s t i kh dùng ậ ị ấ ng vi sinh v t có xác xu t l n nh t trong m t th tích dung d ch ượ ặ ạ ở ộ ả ủ ệ ng d a trên k t qu c a m t lo t thí nghi m l p l i ượ ặ ạ ị ệ c l p l ng, vi c đ nh l i 3 ạ ượ ng này đ

ế ộ Ph ể đ đánh giá s l ẫ m u. Ph ồ các n ng đ pha loãng khác nhau. Thông th ầ ở 3 đ pha loãng khác nhau liên ti p. l n

ươ ư

ứ ườ 3 đ

ệ ộ nhi ố ớ ướ ế ươ

ờ ẳ ệ ị ng tính

ệ ẫ ở ộ ể ng ch n l c thích h p v i m th tích chính xác dung d ch m u ợ ủ ở ể c xác đ nh sang ng nghi m ch a môi tr ệ ộ ợ ờ ố ng pháp này nh sau: cho các ng nghi m có Quy trình th c hi n theo ph ộ ợ ớ ị 1, 102, 103) t đ và th i gian thích h p. Ghi ộ ị c kh ng đ nh, chuy n m t ứ ườ ng ố ố ủ ế , đ m s ng m i đ pha loãng. Đ i v i b ố t đ thích h p. Sau th i gian ệ ự ọ ọ ườ ng là 10 ở ỗ ộ ng tính ươ ở ướ b th i gian và nhi ch a môi tr pha loãng liên ti p (th ậ ố ố nh n s ng d ố ầ ữ ph n nh ng ng d ồ ủ ở ờ ị ẳ kh ng đ nh r i

ố ệ ả ố ậ ượ c trình

ng tính. S d ng s li u và tra b ng Mac Crady đ suy ra s vi sinh v t đ ở ạ ử ụ ả ể ẫ ươ d bày d ng b ng MPN trên 100ml hay MPN trên 1g m u.

ố ằ ấ ở ạ

ễ ả C n l u ý r ng b ng MPN cung c p ở các li u l ưở ả ườ ồ

ộ ộ ả

các dung tích m u 10ml, 1ml và 0,1ml t

ươ ườ ớ ợ ẫ

ườ ẫ ẫ ở ộ đ pha loãng 10 ầ ẫ ậ ộ ệ ố ị ầ ư d ng s MPN trên 100ml dung d ch ệ ử ụ ề ượ ề ể ượ ng 10ml, 1ml và 0,1 ml. Vi c s d ng các li u c dùng đ phân tích đ ưở ả ế ế ượ ng đ n ng và do đó nh h ng đ n n ng đ môi tr l ng khác nhau d gây nh h ả ủ ố ệ ậ ế ng dùng đ pha loãng b c 10. S li u c a b ng k t qu . Do đó, trong phân tích th ươ ở ng đ ng v i MPN/ml MPN trên 100ml 1, 102, 103. Tr ư m u ch a pha loãng khi 1ml m u ng h p m u có ậ m c đ vi sinh v t cao khi pha loãng c n tính thêm h s pha loãng.

ươ ượ ử ụ ị ổ Ph ng pháp MPN đ ổ ế c s d ng ph bi n trong đ nh l ố ượ Coliforms t ng s , ng

ậ Coliforms phân, E. coli và các vi sinh v t khác.

4.3.

ươ Ph ng pháp ELISA

ị ấ ễ ươ Là ph

ệ ắ ủ

ủ ể ơ ng pháp h p thu mi n d ch dùng enzyme. Đây là ph ươ ệ ủ ậ ế

ự ệ ế ế ề ặ ẽ ị ữ ạ

l ể ứ ấ ượ ư ắ ằ

ớ ấ ặ ệ ủ ơ

ự ẽ ẩ ả ổ

ạ ẳ ự ặ ầ ị ả ươ ệ ng pháp hi u qu ử ụ và nhanh chóng trong phát hi n vi sinh v t. Nguyên t c c a ph ng pháp là s d ng kháng th đ n dòng ph bên ngoài đĩa gi ng. N u có s hi n di n c a kháng nguyên ụ i trên b m t gi ng. Các kháng nguyên này sau m c tiêu thì kháng nguyên s b gi ệ đó đ c phát hi n b ng kháng th th c p có g n v i enzyme nh horseradish ổ perosidase hay alkaline phosphatase. Khi b sung c ch t đ c hi u c a enyme vào thì ặ enzyme s xúc tác t o ra s n ph m có màu ho c phát sáng. D a vào s thay đ i màu ượ ị hay ánh sáng mà kh ng đ nh s có m t và đ nh l ự ng kháng nguyên c n tìm.

ệ ươ ượ ộ ạ ng m i hóa d

ờ ậ là có th xác đ nh đ ướ ạ ươ i d ng các b kít. ẫ c vi sinh v t trong m u. Tuy nhiên,

ng pháp ELISA đã đ ị ư ỉ ươ ể ướ ả ứ Hi n nay ph ờ Ch sau th i gian vài gi ph c th ượ c khi đ a vào ph n ng. ầ ng pháp này c n tăng sinh tr

ấ ạ Kháng nguyên s d ng trong ph

ặ ươ ạ ộ do chúng t o ra tùy thu c vào thi

ươ ạ ị ầ ể ng pháp ELISA r t d ng có th là môt ph n ươ ệ ế ế t k . Hi n nay ph ng E.coli, Staphylococcus, ng m i trong đ nh danh

ử ụ ộ ố ậ ủ c a vi sinh v t ho c đ c t ộ pháp ELISA đã có các b kít th Salmonella.

4.4.

ươ ử Ph ng pháp lai phân t

ự ử ượ đ

ạ ấ ủ ấ ố

ỡ ế ươ ự ằ bào vi sinh v t đ

ặ ắ ẫ

ư ầ ệ ộ ượ ư ạ ạ ệ ộ i nhi t đ đ

ự ẫ ớ ị

ệ ị ặ ồ ự ươ ệ c th c hi n d a trên tính ch t c a DNA: tách ng pháp lai phân t Ph ượ ệ ộ ả ắ ệ ộ ở t đ cao và l p ráp khi nhi nhi m ch khi c t đ gi m xu ng. Tính ch t này cũng đ ậ ể ệ ấ ở tìm th y ng pháp này th c hi n b ng cách phá v t RNA. Ph ậ ữ thu nh n rRNA. Sau đó, đ a đ u dò là nh ng đo n DNA đ c thù có g ng m u dò và ạ ủ ướ ố ị t đ tách m ch c a DNA, thì đo n c đ a xu ng d dung d ch, khi nhi ả ứ ấ ị ặ DNA đ c thù s g n vào v trí nh t đ nh trên rRNA. Th c hi n ph n ng v i m u dò ả ứ ộ ị ẽ s xác đ nh đ ẽ ắ ượ ự c s có m t là n ng đ rRNA có trong dung d ch ph n ng.

ệ ậ ằ ộ ng pháp lai

ệ ượ ố ượ ệ ươ Hi n nay đã có các b kít phát hi n nhanh vi sinh v t b ng ph ử E.coli, staphylococcus, salmonella. c là . Các đ i t ng phát hi n đ phân t

4.5.

ươ ế ợ ệ Ph ng pháp PCR k t h p đi n di

ươ ự Ph

ể ổ ả ệ ờ

ợ ng pháp PCR là ph ng pháp invitro đ t ng h p DNA d a trên khuôn là ầ đích DNA ban đ u thành hàng tri u b n sao nh enzyme polymerase và ộ ượ ươ ự ồ ệ ậ ỹ môt trình t ộ ặ m t c p m i. K thu t nay đ ự c Karl Mullis và c ng s phát hi n năm 1985.

ượ ệ ộ ự ệ Ph n ng PCR đ t đ tách m ch DNA. Sau đó h

c th c hi n d a vào nhi ồ ạ ẽ ắ ữ ố ị

ả ứ ả ổ

ạ ế ố ượ ế ế ầ ạ ự ả ứ ấ ặ ạ ệ ộ t đ xu ng thì m i là nh ng đo n olygonucleotide s g n vào các v trí đ c th p nhi ễ ợ ệ hi u đ đ m b o cho các ph n ng t ng h p di n ra do enzyme polymerase. Quá trình ặ ạ ng DNA c n thi l p l ể ả i cho đ n khi đ t đ n s l t.

ả ứ ỳ ồ ỳ ố ề ồ ỗ ướ Ph n ng PCA g m nhi u chu k n i nhau. M i chu k g m 3 b c:

ướ ữ ầ ầ ị

ả ứ B c bi n tính: dung d ch ph n ng g m nh ng thành ph n c n thi ử ở ượ ủ ế ơ ồ ệ ộ t đ cao h n Tm c a phân t c bi n tính nhi ự ế t cho s ạ . M ch đôi

DNA đ ờ ế ử sao chép, phân t DNA tách nhau ra. Th i gian kéo dài tù 30 – 60s.

ắ ặ ữ ồ

B c lai: nhi

ạ t đ h th p h n Tm cho phép b t c p x y ra gi a m i và m ch

ệ ộ ạ ấ ừ ộ ệ ộ ờ ả ừ ướ khuôn. Nhi ơ 40 – 70 t đ này dao đ ng t

oC, th i gian kéo dài t

30 – 60s.

ợ ướ ổ ệ ộ ượ t đ đ c tăng lên 72

ướ ự ủ

oC giúp cho enzyme DNApolymerase ầ c a DNA c n

ộ c này tùy thu c vào trình t

ủ ế ừ ạ

B c t ng h p: nhi ạ ộ ờ ố t nh t. Th i gian c a b ho t đ ng t ườ ế khu ch đ i, th

ấ ng t u 30 giây đ n 1 phút.

ạ ẽ ể

ấ ự ệ ắ ủ ị ả ứ Sau khi th c hi n ph n ng PCR xong, DNA đ ươ ng pháp này là các phân t ệ

ẽ ả ộ

ủ ể ằ ộ ị ượ ệ c cho ch y đi n di trong gel ử ệ ề ự đi n di s di chuy n v c c ề ự ươ ộ ể ng. Sau m t ớ ả ế m t v trí trên b n gel. N u nhu m b n gel này v i ượ c v trí c a DNA b ng ta

aragose. Nguyên t c c a ph ệ trái d u trong dung d ch đ m. DNA tích đi n âm s di chuy n v c c d ờ ở ộ ị ẽ ừ ấ ị th i gian nh t đ nh, nó s d ng ư ố tu c nhu m nh Ethydium bromide thì có th quan sát đ UV.

ế ầ Ph ng pháp này cho k t qu nhanh do không c n th i gian tăng sinh, ti n l

ờ ấ ồ ữ ượ ữ ệ ấ

ươ ệ ề ặ ự ệ ợ i c lâu và ít ề ệ , S. Aurius và nhi u loài vi c s d ng trong phát hi n

ả ậ ố ớ đ i v i vi c phát hi n nh ng vi sinh v t kó nuôi c y, hóa ch t t n tr đ ượ ử ụ ố t n kém v m t nhân s . Nó đ ậ sinh v t khác.

Ậ Ế K T LU N

ứ ộ ệ ị ị

ễ ọ Vi sinh v t ch th đóng vai trò quan tr ng trong vi c xác đ nh m c đ ô nhi m ườ ỉ ẩ ự ậ ng, th c ph m. môi tr

ậ ỉ ị Coliforms, Staphylococcus, Streptococcus, Có 4 nhóm vi sinh v t ch th là:

Clostridium.

ị ị ươ ng pháp xác đ nh vi sinh v t ch th là: ph

ử ươ ậ ng pháp ELISA, ph ỉ ươ ng pháp lai phân t ẩ ế ng pháp đ m khu n ươ ng pháp , ph

ộ ố ươ M t s ph ươ ng pháp MPN, ph ế ợ ệ ạ l c, ph PCR k t h p đi n di.

ườ ễ ậ ị

ứ ộ ơ ỉ ơ ể ể ả ơ ố

ườ ệ ộ ể ng m t ỏ cách d dàng h n, ít t n kém h n và gi m thi u nguy c gây nguy hi m s c kh e cho ng Thông qua vi sinh v t ch th ta có th đánh giá m c đ ô nhi m môi tr ứ ễ ể i thao tác ki m nghi m.

ệ ị ị ỉ Vi sinh v t ch th đã tr thành công c đ c l c h tr cho vi c xác đ nh m c đ ứ ộ

ậ ườ ở ư ộ ẩ ễ ụ ắ ự ỗ ợ ự ệ ng cũng nh đ an toàn v sinh th c ph m. ô nhi m môi tr

Ả Ệ TÀI LI U THAM KH O