Tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu tạp D (Ramipril diketopiperazin) của Ramipril

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020

Nghiên cứu

B – Khoa học Dược

107

TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TP D

(RAMIPRIL DIKETOPIPERAZIN) CỦA RAMIPRIL

Nguyễn Trần Thiên Thanh*, Ngô Thị Thanh Diệp*

TÓM TẮT

M đầu: Ramipril là thuốc ức chế men chuyển angiotensin (ACE) được sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết

áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim và các bệnh về thận. Ramipril diketopiperazin (tạp D trong USP 41 và BP 2018)

là tạp phi kiểm tra trong c nguyên liệu lẫn thành phẩm của ramipril. Tuy nhiên, chuẩn tạp này đang được bn

vi gi rt đt v chưa c trong ngân hng cht đối chiếu Việt nam, điều ny gây kh khăn, bị động thiết cho công

tc kiểm nghiệm nguyên liệu v thnh phẩm của ramipril. Tại Việt Nam hiện vẫn chưa c công trình công bố về

nghiên cứu tổng hợp tạp D. Do đ, việc tổng hợp tạp D c độ tinh khiết cao lm cơ sở cho việc thiết lập cht đối

chiếu là cần thiết.

Đi tưng nghiên cu: Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril).

Phương pháp nghiên cu: Ramipril diketopiperazin được tổng hợp từ nguyên liệu ramipril bng phn ứng

đng vng trong môi trưng toluen. Sn phẩm sau khi tổng hợp v tinh chế được xc định cu trúc bng các k

thuật phổ nghiệm như IR, MS, NMR, được xc định độ tinh khiết bng phương php HPLC qui về 100% diện

tch pic v được thiết lập cht đối chiếu.

Kết quả: Tạp D đ được tổng hợp thnh công vi hiệu sut toàn qui trình 57,5%. Sn phẩm thu được đạt

độ tinh khiết sc k trên 99%, đủ điều kiện thiết lập cht đối chiếu. Tạp D c gi trị n định l 99,27% tnh theo

nguyên trạng.

Kết luận: Đ tổng hợp v tinh chế thành công tạp D. Tạp D được đnh gi v thiết lập làm cht đối chiếu.

Từ khóa: ramipril diketopiperazin, ramipril, tạp D

ABSTRACT

SYNTHESIS AND ESTABLISHMENT OF RAMIPRIL DIKETOPIPERAZINE

(IMPURITY D) REFERENCE STANDARD OF RAMIPRIL

Nguyen Tran Thien Thanh, Ngo Thi Thanh Diep

* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 107 - 113

Background - Objectives: Ramipril is an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor, used to treat

high blood pressure, heart failure, and diabetic kidney diseases. The BP 2018 and USP 41 require conducting

ramipril diketopiperazine (as related compound D) impurity test in ramipril pharmaceutical substances and

corresponding finished products. However, this related compound is costly with limited accessibility that affects

implementation of this impurity test. There have been no published local studies on chemical synthesis of ramipril

diketopiperazine so far. Therefore, this study was conducted with aim of synthesis of ramipril diketopiperazine

with high purity that conforms to establish reference standard.

Method: Impurity D was synthesized from ramipril by cyclization reaction in toluene media. The obtained

product was determined chemical structure from its IR, MS, NMR spectroscopic data, purified by HPLC and

established as reference standard.

Results: Ramipril diketopiperazine was successfully synthesized with 57.7% yield. By using HPLC-PDA,

its chromatographic purity was determined over 99% on the basic of peak area normalization method and

*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Tác gi liên lạc: PGS.TS. Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 Email: ngothithanhdiep@ump.edu.vn

Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020

108

conformed to establish reference standard. The assigned value of impurity D is 99.27%.

Conclusion: Ramipril diketopiperazine (impurity D) was successfully synthesized and standardized as

reference standard.

Key words: ramipril diketopiperazine, ramipril, impurity D

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng huyết áp là tình trạng bệnh lý mãn tính

có thể gây ra biến chứng tim mạch như: tai biến

mạch máu não, suy tim, bệnh tim mạch vành,

nhồi máu cơ tim... Nhóm thuốc đối kháng thụ

thể angiotensin, trong đó có ramipril được sử

dụng ph biến để điều trị tăng huyết áp. Theo

USP 41(1) v BP 2018(2), ramipril có 4 tạp chất liên

quan cần phải được kiểm soát, trong đó, ramipril

diketopiperazin (tạp D theo BP 2018 và USP 41)

là tạp bắt buộc phải kiểm tra trong nguyên liệu

và thành phẩm của ramipril. Hiện nay trong hệ

thống ngân hàng chất đối chiếu của Viện Kiểm

nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh và Viện

Kiểm nghiệm thuốc Trung ương vẫn chưa có

chất đối chiếu tạp D. Điều ny gây khó khăn

trong việc thực hiện công tác kiểm nghiệm tạp

chất liên quan của nguyên liệu và chế phẩm

chứa ramipril vì phải mua với giá cao từ nước

ngoi. Do đó, việc tng hợp, thiết lập chất đối

chiếu tạp D là cần thiết.

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril):

ethyl(2S)-2-[(3S,5aS,8aS,9aS)-3-methyl-l,4-

dioxodecahydro-2H-cyclopenta[4,5]pyrrolo[1,2-a]

pyrazin-2-yl]-4-phenyIbutanoat.

Nguyên liu, dung môi, hóa chất, trang thiết bị

Nguyên liệu

Ramipril đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ

(USP 41). Nh sản xuất: Trung Quốc. Số lô:

5654 – 19 -122M. Hạn dng: 4 – 2022.

Dung môi, hóa chất: Nước cất, acetonitril

(ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng.

Toluen, cloroform (CF), dicloromethan (DCM),

ethyl acetat (EA), methanol (MeOH) đạt tiêu

chuẩn phân tch.

Trang thiết bị

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters

Alliance e2695 kết nối với đầu dò Waters PDA

2998, buồng soi UV Vilber Loumart CN-15LC,

máy khuấy từ gia nhiệt IKA C-Mag HS 10, máy

đo nhiệt độ nóng chảy Stuart SMP-10, tủ sấy

Memmert WM500CO, bản mỏng silica gel F254

Merck, máy quang ph hồng ngoại Shimadzu

00556, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

Advance II.

Phương pháp nghiên cứu

Tạp D được tng hợp từ ramipril bng phản

ứng đóng vng trong môi trưng toluen theo

Hình 1.

Hình 1. Quy trình tổng hợp tạp D của ramipril

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020

Nghiên cứu

B – Khoa học Dược

109

Ramipril nguyên liệu (1g; 2,40 mmol) được

cho vào bình cầu dung tch 100 ml, thêm vào

bnh cầu 50 ml toluen, khuấy từ trong 8 - 12 gi

ở nhiệt độ 120 - 130 oC, sau đó cô quay chân

không hn hợp phản ứng ở nhiệt độ 45 - 50 oC

để loại hết dung môi, thu được cắn khô. Sản

phẩm được bảo quản lạnh trong chai thủy tinh

mu, tránh ánh sáng.

Tinh chế

Sản phẩm tng hợp được tinh chế bng kỹ

thuật kết tinh lại trong MeOH ở nhiệt độ thấp,

2 - 8 oC.

Th sơ b tinh khiết sản phm tinh chế

Sản phẩm sau khi tinh chế được sơ bộ kiểm

tra độ tinh khiết bng nhiệt độ nóng chảy v sắc

k lớp mỏng với 3 hệ dung môi có độ phân cực

khác nhau.

Sắc k lớp mỏng: bản mỏng silica gel F254

(Merck). Ba hệ dung môi được sử dụng lần lượt l

CF – EA (4:6); DCM – EA (4:6); ACN – H2O (1 : 1).

Mẫu thử được pha trong CF với nồng độ

1mg/ml.

Xác định cu trc

Sản phẩm sau khi tinh chế v thử sơ bộ tinh

khiết được xác định cấu trúc bng các phương

pháp ph nghiệm IR, MS và NMR, đồng thi so

sánh kết quả ph nghiệm với ti liệu tham khảo.

Xác định đ tinh khiết bng HPLC-PDA

Độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế được

xác định bng phương pháp HPLC qui về 100%

diện tch pic. Quy trnh xác định độ tinh khiết

tạp D bng kỹ thuật HPLC-PDA được thẩm

định theo hướng dẫn của ICH(3).

Điều kiện sc kí

Cột sắc ký Eurospher II 100- 5 C18 (150 x 4,6

mm; 5 µm).

-Nhiệt độ cột: 40 oC, bước sóng phát hiện

210 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm

mẫu: 10 µl. Thi gian sắc ký: 20 phút.

Mẫu thử được pha trong ACN – H2O (50:50)

với nồng độ 300 ppm.

Bảng 1. Chương trình gradient xc định độ tinh

khiết của tạp D

Thời gian

Acetonitril

Nước

0 – 5

5 – 9

9 – 17

17 – 19

19 – 20

Quy trình chạy sắc kí lỏng với điều kiện trên

cng được sử dụng để xác định giá trị ấn định

về độ tinh khiết sắc k khi thiết lập chất đối

chiếu tạp D tại 3 phng th nghiệm thuộc Viện

Kiểm Nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh.

Đánh giá tp D

Tạp D được đánh giá theo các ch tiêu cảm

quan, độ tan, điểm chảy, định tnh bng các

phương pháp ph nghiệm v độ tinh khiết.

Thiết lập cht đi chiếu tp D

Đnh giá độ đồng nht của qu trình đóng lọ

Các mẫu được lấy ngẫu nhiên theo công

thức trong đó N là tng số lọ. Việc xác

định độ tinh khiết của tạp D trong từng lọ được

tiến hành theo phương pháp HPLC đã xây dựng

và thẩm định, mi lọ được xác định 2 lần. Việc

đánh giá độ đồng nhất của quá trnh đóng lọ

được dựa trên hướng dẫn của ISO 34:2009(4).

Đnh gi độ đồng nht lọ liên phòng thí nghiệm

Tạp D sau khi được đóng gói v đánh giá

đồng nhất lọ đạt yêu cầu sẽ được lấy mẫu ngẫu

nhiên và tiến hnh xác định độ tinh khiết tại ba

phòng thí nghiệm độc lập. Các phòng thí

nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt GLP

hoặc ISO/IEC 17025. Mi phòng thí nghiệm sẽ

nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo qui

trình phân tích và các tài liệu liên quan. Trước

khi phân tích, mi phòng thí nghiệm sẽ kiểm tra

tính phù hợp của hệ thống với yêu cầu hệ số bất

đối của pic tạp D nm trong khoảng 0,8 – 1,5 và

RSD giữa 6 lần đo lặp lại không được quá 2%.

Nếu đạt yêu cầu, sẽ tiến hành xác định độ tinh

khiết tạp D trên 6 mẫu đã nhận, mi mẫu được

Nghiên cứu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020

110

xác định 2 lần. Các phòng thí nghiệm được lựa

chọn để gửi mẫu là Khoa Thiết lập chất chuẩn &

chất đối chiếu (PTN1), Khoa Kiểm nghiệm mỹ

phẩm (PTN2), Khoa Nghiên cứu và Phát triển

(PTN3) thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ

Chí Minh. Việc đánh giá độ đồng nhất lọ liên

phòng thí nghiệm sẽ được thực hiện bng phép

phân tch phương sai một yếu tố ANOVA.

Xc định giá trị n định v độ không đm bo đo

Việc xác định giá trị ấn định trên phiếu kiểm

nghiệm tạp D v độ không đảm bảo đo được

thực hiện theo hướng dẫn của ISO 13528:2005(5),

dựa theo 18 kết quả xác định độ tinh khiết của

tạp D tại 3 phòng thí nghiệm.

KẾT QUẢ

Tổng hợp

Sản phẩm sau khi tng hợp thu được 0,84 g

(2,11 mmol) bột có màu trắng ngà, có mùi nhẹ.

Hiệu suất tng hợp là 87,9%.

Tinh chế

Sản phẩm tng hợp được đem tinh chế bng

phương pháp kết tinh lại trong MeOH. Hiệu

suất quá trnh tinh chế l 65,4%.

Kết quả từ 1,0 g (2,40 mmol) nguyên liệu

ramipril tiến hnh tng hợp theo sơ đồ 1 và tinh

chế bng phương pháp kết tinh lại trong MeOH

thu được khoảng 0,55 g (1,38 mmol) sản phẩm l

tinh thể mu trắng. Hiệu suất toàn quá trình

tng hợp v tinh chế l 57,5%.

Thử sơ b tinh khiết sn phm tinh chế

Sản phẩm tinh chế được đo nhiệt độ nóng

chảy 3 lần. Khoảng nhiệt độ nóng chảy đo được

l 121 – 122 oC, ph hợp với nhiệt độ nóng chảy

của tạp D trong ti liệu tham khảo(6). Kết quả

khai triển SKLM trên ba hệ dung môi có độ phân

cực khác nhau cho thấy sản phẩm ch cho một

vết duy nhất. Sơ bộ kết luận sản phẩm tinh chế

đạt tinh khiết trên SKLM.

Xác định cấu trúc sn phm tinh chế

Ph MS m/z: [M+H]+ tm thấy: 399,2132

([M+H]+ dự kiến: 399,2284).

Ph FT-IR cho các đnh hấp thụ ph hợp với

công thức cấu tạo của ramipril diketopiperazin:

νmax (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 2944 (2945,

C-H sp3), 1735 (1736, -O-C=O), 1659 (1660, -N-

C=O), 1415 (1415, C-O-), 1314 (1314, N-C-H),

1250 (1251, C-N amin bậc 3), 750 v 700 (751 v

701, nhân thơm thế mono).

Ph 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

7,29 – 7,83 (m, 2H, H3, H5); 7,16 – 7,27 (m, 3H, H1,

H2, H6); 4,25 (m, 1H, H28); 4,21 (m, 1H, H25); 4,04 –

4,18 (m, 3H, H24, H33); 3,99 (m, 1H, H30); 2,59 – 2,65

(m, 2H, H7); 2,17 – 2,32 (m, 4H, H8, H18); 1,47 –

1,71 (m, 7H, H19, H20, H21, H29); 1,29 (d, J = 7, 3H,

H27); 1,03 (t, J =7 , 3H, H34); phù hợp dữ liệu ph

1H NMR trong LGC Standard(6).

Ph 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm:

169,99 (C26); 168,21 (C12); 166,27 (C15); 141,31 (C4);

128,30 (C2, C6); 128,1 (C3, C5); 125,83 (C1); 62,25

(C16); 60,23 (C9); 59,20 (C14); 56,34 (C33); 55,71 (C11);

39,00 (C17); 33,11 (C7); 31,45 (C21); 31,67 (C18); 30,87

(C19); 29,7 (C8); 23,13 (C20); 15,19 (C27); 13,83 (C34).

Từ các kết quả trên có thể kết luận sản phẩm

tinh chế chnh l tạp D (ramipril

diketopiperazin), công thức phân tử: C23H30N2O4.

Hình 2. Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril)

Xác định đ tinh khi0ết tp D bng HPLC-PDA

Quy trnh xác định độ tinh khiết tạp D được

thẩm định các ch tiêu: Tnh ph hợp hệ thống,

tnh đặc hiệu, khoảng tuyến tnh, độ lặp lại v

độ chính xác trung gian.

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020

Nghiên cứu

B – Khoa học Dược

111

Tính phù hp hệ thng

Tnh ph hợp hệ thống được xác định bng

cách tiến hnh tiêm lặp lại 6 lần dung dịch tạp D

300 ppm. Kết quả được trình bày trong Bng 2.

Bảng 2. Kết qu kho sát tnh phù hợp hệ thống (n = 6)

Giá trị thống kê

tR (phút)

S (µV x giây)

Trung bình

9,005

4138178

1,3

23398

RSD

0,244

0,764

1,551

RSD của các thông số thi gian lưu (tR), diện

tích pic (S) và số đĩa l thuyết (N) đều nhỏ hơn

2%, hệ số kéo đuôi (T) trong khoảng 0,8 – 1,5,

như vậy quy trnh đạt tính phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu

Kết quả khảo sát tnh đặc hiệu (Hình 3) cho

thấy: sắc k đồ mẫu trắng không xuất hiện pic có

thi gian lưu tương đương với thi gian lưu của

pic tạp D trong sắc k đồ mẫu thử. Sắc k đồ các

mẫu phân hủy bởi HCl 0,1N; NaOH 0,1N; H2O2

3%, sấy 80 oC trong 24h, UV 254 nm và ánh sáng

mặt tri có xuất hiện các pic phân hủy, các pic

ny đều tách hoàn toàn với pic tạp D. Pic tạp D

trong sắc k đồ của các mẫu trước v sau khi

phân hủy đều tinh khiết. Như vậy quy trình xác

định độ tinh khiết tạp D có tnh đặc hiệu cao.

Khoảng tuyến tính

Phương trnh biểu diễn tương quan diện

tích pic theo nồng độ phân tích tạp D ở bước

sóng 210 nm l ŷ = 19426x, hệ số tương quan R

= 0,9999; khoảng tuyến tính 50 – 500 ppm.

Hình 3. Kết quả kho st tnh đặc hiệu

Tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu tạp D (Ramipril diketopiperazin) của Ramipril

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi