99
Ureaplasma urealyticum Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Xác định sự có m t DNA c a Ureaplasma urealyticum trong bệnh phẩm c a
người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ
ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại
học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- T an toàn sinh học cấp 2
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy Real-time PCR
- Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml
- Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl
- T lạnh thường
- T âm sâu (200C) ho c (-700C) (nếu có)
- Bộ lưu điện
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
1
Dụng cụ lấy bệnh phẩm
Cái
2
Găng không bột tal
cái
100
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
3
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
4
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Test
5
Sinh phẩm chẩn đoán
Test
6
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất
lượng
Test
7
Kit tách chiết DNA
Test
9
Ống Falcon 50 ml
Cái
10
Eppendorf 1,7 ml
Tube
11
Eppendorf 0,2 ml
Tube
12
Đầu côn 10 µl có lọc
Cái
13
Đầu côn 30 µl
Cái
14
Đầu côn 200 µl có lọc
Cái
15
Đầu côn 1ml có lọc
Cái
16
Water-DEPC treated
ml
17
Giấy thấm
Cuộn
18
Giấy xét nghiệm
Tờ
19
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Tờ
20
Bút viết kính
Cái
21
Bút bi
Cái
22
M
Cái
23
Khẩu trang
Cái
24
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
25
Quần áo bảo hộ
Bộ
26
Dung dịch xà phòng rửa tay
ml
27
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
28
Dung dịch khử trùng
ml
29
Khăn lau tay
Cái
30
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*
* Ghi chú: - Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo
Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật
tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
101
3. Bệnh phẩm
M ho c dịch niệu đạo, âm đạo, dịch ngoáy họng.
4. Phiếu xét nghiệm
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật: VD sinh phẩm hóa chất vật tư tiêu hao Ureaplasma
urealyticum rPCR kít ho c tương đương
2.1. Tách chiết DNA
2.2. Cho một lượng mẫu DNA tách chiết được vào các ống phản ứng PCR có
chứa các thành phần cần thiết c a kit
2.3. Chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt thích hợp trên máy Real-time
PCR 2.4. Đọc kết quả
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm
- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM:
mẫu không bị ngoại nhiễm.
- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị
ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.
Bước 2: Kiểm tra độ nhạy
- Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX
- Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR
không bị ức chế.
- Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại ho c tín hiệu thấp với
kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại
ho c pha loãng DNA trước khi chạy PCR.
Bước 3: Xác định mẫu dương tính
- Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu
dương tính
- Các mẫu có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt:
pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix
Bước 4: Xác định mẫu âm tính
- Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu
HEX, thì kết quả là mẫu bệnh phẩm âm tính
- Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương
tính với màu HEX, thì kết quả dưới ngưỡng phát hiện
- Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu
102
HEX mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng ho c tách
chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét
nghiệm.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân th ch t chẽ quy trình kỹ thuật.