i trình t
ủ
ậ tr c ti p s n ph m PCR thu nh n ẩ
ự ự
ằ
ậ
ỹ
ể ị c t ượ ừ ử
ệ
ệ Ph m Hùng Vân*
(1), Bành Vũ Đi nề (2), Võ Đ c Xuyên An
ạ
ế ả ặ (3), Nguy n Th Minh Th ị Đ Th Thanh Th y
Xác đ nh ki u gen c a HCV b ng k thu t gi ả th nghi m RT real-time PCR dùng m i và taqman probe đ c hi u vùng 5’ NC đ ồ ư(3), Lê Th Phi Y n ị ứ ủ (1), Hòang Hi u Ng c
ế (3), ọ (1)
ễ ị
ế
ỗ
ệ
ể
ể
ượ
ượ
ị ặ
ả ề
ặ ấ ề Đ có th tiên đóan đ
ạ
ễ
ủ
c hi u qu đi u tr đ c hi u và quy t đ nh đ ị ặ ề
ớ
ệ
ể
ệ
ướ
ể ự
ế ị ả ử
ệ ị ầ c đây, xét nghi m xác đ nh ki u gen HCV ph i đ ả ượ ị
ẩ
ả
ệ
ử
ụ
ẫ ự
ự ự ế ả
ệ
ươ ặ
đã xây d ng đ
ươ
ừ ầ
i trình t ủ ả
ượ
ể
ứ T đ u năm 2006, các tác gi i trình t
ỹ
ả
ậ
ử ụ ồ ng pháp nghiên c u: ằ
ể ị ự tr c ti p s n ph m PCR thu nh n t ẩ
ồ
ặ
ủ ng pháp xác đ nh ki u gen c a c ph ị ươ th nghi m RT real-time PCR dùng m i và ệ ể c a trong m t th vi n các ki u ự ủ
ậ ừ ử ớ
ư ệ
ộ
ể
đã áp d ng ph
ng pháp này đ
ươ
ế
ả
ả
ố
ng h p co k t qu th nghi m RT real-time PCR d
ụ ươ
ợ
ị
ả
ấ
ộ
ộ
ố ể
ư
ế
ế
ấ
ậ
ả
ở
ki u gen HCV trên các ng
ườ
ể
ạ
c nghiên c u có th đa s đ
ố ượ ấ ừ
ứ
ệ
ủ l ố ỷ ệ ể c l y t ố
ệ ị ấ ạ
ậ ự ể ề
ệ
ể
ề
ệ
ề
ị
ự ự ế ả
ể
ằ
ậ
ỹ
ị
tr c ti p s n ph m PCR thu nh n đ ẩ ấ
i trình t ệ
th ể
ế
ợ
c khi bác sĩ quy t đ nh cho ch đ nh đi u tr đ c hi u.
tắ Tóm t ệ Đ t v n đ : c th i gian đi u tr đ c hi u ờ ề cho b nh nhân viêm gan m n tính do nhi m HCV, các nhà đi u tr c n ph i có thông tin v ki u gen c a HCV trên ề ể ệ b nh nhân. Tr c g i sang Singapore đ th c hi n v i giá ệ thành khá cao: trên 180USD/m u th . ử M c tiêu nghiên c u: tr c ti p s n ph m PCR c a th ngi m RT real-time ng pháp gi ứ Xây d ng ph ủ PCR s d ng m i và taqman probe đ c hi u vùng 5’NC c a virus đ đ nh genotype HCV. Ph HCV b ng k thu t gi ự ự ế ả taqman probe đ c hi u vùng 5’NC c a HCV r i sau đó so sánh v i các trình t ồ ủ ệ c ki u gene c a HCV. gen HCV đ xác đ nh đ ị ủ ượ ể ể ứ T tháng cu i 5/2006 đ n cu i tháng 9/2006, các tác gi K t qu nghiên c u: ố ế ừ ế ng tính HCV-RNA, k t xác đ nh ki u gen HCV cho 234 tr ả ử ệ ế ườ ể qu ghi nh n đ c cho th y có đ n 55% các m u là thu c genotype 1b, 20% thu c genotype 6a, 9% genotype 2, ộ ẫ ế ượ ậ 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và <1% là thu c genotype ả genotype 1b và 6a, nh ng các tác gi cho là k t qu 2b. Tuy k t qu cho th y đa s ki u gen c a HCV t p trung ả ẫ t Nam vì các m u này ch a th ph n nh th t s phân b t i nhi m HCV t i Vi ư ệ ễ ả ả các b nh nhân đang trong quá trình đi u tr đ c hi u ch không th đ ứ ử ượ ị ặ ề ph i tr ị c khi b t đ u đi u tr , và trong s các b nh nhân này có th có nhi u b nh nhân đã b th t b i đi u tr ắ ầ ả ướ đ c hi u. ệ ặ ậ ượ ừ ử c t ậ Xác đ nh ki u gen c a HCV b ng k thu t gi K t lu n: ả ủ ế nghi m RT real-time PCR dùng m i và taqman probe đ c hi u vùng 5’ NC là ti p c n thích h p nh t có th áp ặ ệ d ng trong ch n đóan lâm sàng nhi m HCV tr ụ
ế ị
ị ặ
ồ ễ
ậ ề
ướ
ệ
ẩ
ỉ
ị
Abstract Genotyping of HCV by direct sequencing the PCR product coming from the RT realtime PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC of the virus. Background: In order to predict the effect of the specific treatment as well as to decide the duration of the specific treatment given on the chronic hepatitis patients causing by HCV infection, the physicians need to have in hand the information about the genotype of HCV in the patients’ sera. In the past, such required tests had be done in Singapore with the high cost: more than 180USD/test. Objectives: Set-up the method to do the direct sequencing of the PCR product coming from the RT realtime PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC of the virus for genotyping of HCV Methods: Started from 2006, the authors have developed the direct sequencing of the PCR product coming from the RT real-time PCR using primer and taqman probe targetted the 5’NC of the viral genome and align the detected sequence to the library of HCV genotype sequences to get the result of HCV genotyping. Results: From end of 5/2006 to end of 9/2006, the authors applied this approach to do the genotype of 234 sera samples that were HCV-RNA positive detected by RT real-time PCR, and the received results revealed that 55% were belong to genotype 1b, 20% to genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, and <1% were belong to genotype 2b. Although the received results have demonstrated that the majority of the samples were belong to HCV genotype 1b and 6a, the authors have believed that this does not reflect the real distribution of the incidence of the genotype of HCV among the HCV infected patients in Viet Nam since the studied samples may be mostly collected from treated patients, not from new patients, and among these treated patients there were many failure with the treatment. Conclusions: Genotyping HCV by direct sequencing the PCR products of the RT real-time PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC is the most appropriate approach that can be applied in clinical diagnosis of HCV infection prior the specific treatment prescription
ề
ị ế
ị ặ
ề
ệ
ỉ
ị ề
ờ
ị
ị
tr ti n hành cho ch đ nh đi u tr đ c hi u viêm gan C vì th i gian đi u tr kéo dài bao lâu là tuỳ thu c vào type virus viêm gan C mà b nh nhân
ệ
ộ
m t ch đ nh r t c n thi
Đ t v n đ ặ ấ Xác đ nh genotype virus viêm gan C (HCV) là ề c khi bác sĩ đi u ộ
t tr ế ướ
ấ ầ
ỉ
ị
1*Tác gi
chính,
()Đ i H c Y D c,
ả
ượ (2)B nh Vi n Ch R y,
ợ ẫ (3)Công ty Nam Khoa
ệ
ệ
ạ
ọ
1
m u HCV cDNA chu n đ
ớ
ế
ẩ
ượ
ừ ẫ
Khoa Sinh, tr
ươ
ườ
ộ
ư
ề
ễ
ể
ậ
ượ
ồ ử ả
ặ
ạ
ạ
ậ
i trình t
ệ ng pháp gi
ả
ộ
ạ
ử
ả ả
ả
t Nam t
l
c đi n di và đ nh l
ị
ỉ
ạ
ồ
ệ
ả ị
ự
ả
ả ứ
ị
ẩ ộ ở
ệ ề
ủ
ng có nhi m HCV) ễ ố ượ ả ượ ễ
ế
khá cao b x gan và ung th gan (4%)
ị ể ẫ ư
ị ơ
ệ ươ
ề
ể
ể ị
ơ
ế ế ả ạ
ủ
ộ ỹ
ễ ị
ế
ẩ c làm t a và tinh s ch b ng ph ệ
i trình t
ậ
ả
ả
ả
ẫ
ầ
ậ ả ử ụ ỹ ậ ạ ộ ấ ầ
ụ
đang nhi mễ [1]. Hi n nay, trên th gi i có 2 ệ ự ph ng pháp xác đ nh genotype viêm gan C d a ị vào phân tích m t vùng đ c tr ng trên vùng ặ c nhi u nhà nghiên 5’NC c a b gen HCV đã đ ượ ủ ộ ự c th c c u cũng nh lâm sàng ch p nh n và đ ấ ư ứ hi n t i các phòng thí nghi m lâm sàng, đó là ệ ệ ạ ng pháp lai trên v ch dò đ c hi u genotype ph ươ C (HCV-InoLIPA)[2] và ph ự ươ trên máy Trugene[3]. Tuy nhiên vì hai ph ngươ pháp này có giá thành khá cao nên khó có thể l u i Vi đ ỷ ệ ư c ch đ nh r ng rãi dù t ệ ộ ượ i (5-8% ng hành HCV là khá cao trên th gi ườ i ế ớ [4,5] và dĩ nhiên đi bình th ườ ng b nh nhân b viêm gan kèm theo đó là s l c đi u tr và theo dõi đi u m n tính c n ph i đ ề ạ ầ tr khá cao do nhi m HCV có th d n đ n m t t ộ ỷ ị [6]. Để l ệ có th giúp các nhà lâm sàng có th cho ch đ nh ỉ ị xác đ nh genotype HCV d dàng h n, vi c tìm ệ ki m m t k thu t xác đ nh genotype HCV mà ự ủ c a không ph i s d ng k thu t gi ỹ ấ Trugene và k thu t InoLIPA v i giá thành th p ớ h n mà v n đ t đ chính xác và nh y c m cao là ơ ạ ả m t vi c làm r t c n thi t và đây cũng m c tiêu ế ộ chính c a đ tài nghiên c u này c a chúng tôi. ứ
ệ ủ ề
ủ
ể
ư
ể
ề ệ t o đ có đ ượ ể
ủ ớ ự ạ
ậ ệ Các m u huy t thanh đ
V t li u và ph ươ ế ẫ
ấ c cung c p pha t ng Royal Holloway, Đ i H c ọ t ạ ừ ng ng và s d ng đ ườ Luân Đôn) v i chu kỳ ng ử ụ ưỡ ớ c n ng đ ban đ u bi u di n này đ tính đ ầ ộ ượ ể ẫ ả c a HCV cDNA có trong m u th . Các m u s n ẫ ủ ph m real-time PCR cho k t qu real-time PCR ế ẩ c làm tinh s ch đ thu nh n s n ph m [+] đ ẩ ượ ể PCR v i b th nghi m tinh s ch s n ph m ẩ ệ ớ ấ PCR (PCR clean-up kit) do Promega s n xu t (Cat. #A9281). S n ph m PCR sau khi tinh s ch ạ ẩ ng n ng đ DNA b ng đ ằ ộ ượ ượ ệ máy Gentquant c a Pharmacia. Sau đó, th c hi n ủ s n ph m PCR đã tinh ph n ng gi i trình t ự ả s ch và xác đ nh n ng đ trên v i PCR ớ ồ ị ạ sequencing mix c a Becman (DTCS: Dye Terminator Cycle Sequencing) v i primer m t ộ ớ ủ chi u đ c hi u t ng thích do phòng R&D c a ặ t k . S n ph m gi công ty Nam Khoa thi i trình ả ng pháp t đ ằ ự ượ ươ t a v i ethanol. Cu i cùng th c hi n gi i trình ả ự ố ớ ủ trên máy sequencer CEQ8000 c a Becman t ủ ự c phân tích đ Coulter. K t qu gi i trình t ự ượ ế c a i trình t trên ph n m m phân tích gi ự ủ ả ề CEQ8000. Cu i cùng, đăng nh p trình t ự ả i gi ậ ố ớ c lên NCBI blast qua internet đ so sánh v i đ ượ ễ gene bank và lên local blast c a phân m m mi n phí bio-edit đ so sánh v i th vi n HCV genotype mà chúng tôi t ế c k t qu genotype.
ả
ng đ
ị
ẫ
ng pháp nghiên c u ượ ư ị
ỹ
ằ
K t quế
ả
ạ
ủ
ậ ệ
ẫ
ớ ế
ừ
ồ
ạ
ệ
ề
ẫ
ế ươ
ớ
ệ
ủ
ự
ệ ặ
ệ
ị ượ
ượ ẫ
ệ
ồ
ượ
ủ
ng tính này cũng đã đ ị
ứ
ế ị
ộ
ấ
ồ
ộ
t RNA t
ng d
ẫ
đăng kí ch t l
ng:
ượ
ố
ướ
ế
ộ ừ
ớ
ồ
ứ ố
ế
ệ
ị
ế
ằ
ươ ự ự
ị ả
ế
ẩ
ủ
ộ
ấ ượ
ố
c đ nh y cao t ạ
ự
ng ph
ượ
ệ
ể
ệ
ng theo h
ướ
ủ
d ng r ng rãi t ộ
ử ụ
ề
ạ
ướ
ị
ươ
ứ c đ a vào nghiên c u ứ ượ c là các m u đã xác đ nh và đ nh l ượ ự HCV-RNA b ng k thu t real-time PCR th c i phòng thí nghi m R&D c a công ty hi n t ệ Nam Khoa v i k t qu [+]. Các m u này đ ượ c ả ử i TP. H Chí Minh g i nhi u phòng thí nghi m t đ n phòng thí nghi m R&D c a công ty v i yêu ế ể ng HCV-RNA. Đ c u phát hi n và đ nh l ượ ệ ầ phát hi n và đ nh l c HCV-RNA, phòng ng đ ượ ị thí nghi m s d ng b th nghi m RT TQ real- ộ ử ử ụ ệ time PCR (reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman probe) do công ty Nam Khoa s nả xu t. B th nghi m này bao g m m t b ộ ệ ử ế các m u huy t RNAPREP đ trích bi ẫ ừ ệ ể ng pháp Chomzynski và Sacchi thanh theo ph ươ 03200/2001/CBTC- (s ấ TĐC), b cDNA synthesis hai b ợ c đ t ng h p ể ổ RNA v i m i ng u nhiên, và b TQ cDNA t ộ ẫ ượ real-time PCR mix đ phát hi n và đ nh l ng ể ng pháp real-time PCR HCV cDNA b ng ph ươ ộ ọ dùng taqman probe và m i đ c hi u m t đ an ệ ồ ặ vùng 5’NC c a b gen đích 240-245bp n m ằ ở ng: 03201/2001/CBTC- HCV (s đăng kí ch t l ự c th c TĐC). Th nghi m real-time PCR đ ử ng pháp đ nh hi n trên máy IQ5 c a Biorad. Ph ị ủ ệ ươ ng d n c a b th nghi m. Có l ộ ử ượ ệ ẫ ự c h t xây d ng t nh sau: là tr th tóm t ư ể ế ắ ng chu n v m i liên h tuy n tính gi a các đ ề ố ườ ữ ế ệ ẩ ượ c n ng đ ban đ u c a HCV cDNA chu n (đ ủ ầ ồ
ẩ
ộ
24/05/06 đ n 30/09/06, có Trong th i gian t ờ ng tính HCV- t t c 234 m u huy t thanh d ế ấ ả RNA qua xét nghi m RT realtime PCR dùng m i ồ ệ và taqman probe đ c hi u 5’NC đ c th c hi n ệ v i qui trình trên. T t c 234 m u HCV-RNA ấ ả ớ ờ c chúng tôi đ ng th i d ươ ng xác đ nh genotype c a HCV. K t qu đ nh l ượ ả ị c t ượ ng ng v i k t qu xác đ nh genotype đ ả ươ ớ ế . Phân tích các k t quế trình bày trong b ng 1 ả ả chúng ta th y 100% các trình bày trong b ng 1 ấ ả ng m u cho k t qu phát hi n và đ nh l ươ ượ ệ ị ả ế c c k t qu đ nh đ tính HCV-RNA đ u cho đ ượ ượ ế ả ị ề ấ genotype HCV dù k t qu đ nh l ng có th p ượ ả ị i thi u (là 445copies/ml huy t thanh đ n m c t ể ế trong nghiên c u này). K t qu này cho phép ả ứ ng pháp đ nh genotype HCV nh n đ nh là ph ị ậ b ng gi ủ tr c ti p s n ph m PCR c a i trình t ả ằ ph n ng real-time PCR dùng taqman probe mà ả ứ ươ chúng tôi xây d ng đ t đ ng ộ ạ ượ đ ng pháp RT TQ real-time PCR mà ươ ươ công ty Nam Khoa đã phát tri n và hi n đang c s đ i nhi u phòng thí ượ nghi m lâm sàng có trang b real-time PCR. ệ ng pháp RT TQ real-time PCR này, Trong ph ử n ng đ HCV RNA ban đ u có trong m u th ộ ồ
ầ
ẫ
2
: K t qu đ nh genotype so v i k t qu đ nh l
ng
B ng 1ả
ớ ế
ả ị
ả ị
ế
ượ
K t qu đ nh l
Genotype(s m u)
ả ị
ế
ố ẫ
ng ượ copies/ml
Số m uẫ
100 – 999
1b(1)
1.000 – 9.999
1* 14
1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1)
10.000 – 99.999
57
1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11)
123
100.000 – 999.999
1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30)
1.000.000 – 9.999.999
1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4)
10.000.000 – 99.999.999
1(1), 1b(1)
37 2** 234
T ng c ng
1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46)
ổ
ộ
ng th p nh t là 445copies/ml huy t thanh.
ng là 13.792.596 copies/ml.
*m u có k t qu đ nh l ế
ả ị
ẫ
ượ
ế
ấ
ấ
ượ
(A) **m u cao nh t có k t qu đ nh l ấ
ả ị
ế
ẫ
ng nh qui chi u chu kỳ ng
ờ
c đ nh l ượ ị ẫ
ử
ưỡ ng ễ ng bi u di n ể
ườ
đ ế ượ c a các m u th lên trên đ ủ chu n. ẩ
trình bày t
Bi u đ 1
ể
ồ
l ỷ ệ ẫ
ầ ế
ủ
ph n trăm các ử genotype HCV c a 234 m u huy t thanh th ẫ nghi m. K t qu cho th y có đ n 55% các m u ấ
ế
ệ
ế
ả
(B)
Bi u đ 2
ể ồ :
ưỡ
(A) trình bày đ ườ ủ
ễ ộ
ẩ
ườ ớ ồ
ệ ữ
ề ố
ễ
ng bi u di n khu ch đ i ế ạ ể ng (Ct) c a các n ng đ ban đ u c a và chu kỳ ng ầ ủ ồ các HCV cDNA chu n. (B) trình bày đ ng bi u ể di n chu n v m i quan h gi a Ct v i n ng đ ộ ban đ u c a HCV cDNA
ẩ ầ ủ
Bi u đ 1
ồ :
ể
ể
ồ
ấ ẫ
% các Bi u đ cho th y các t l ỷ ệ genotype HCV trong 234 m u huy t thanh th ử ế nghi mệ
ộ
ộ
là thu c genotype 1b, 20% thu c genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và <1% là thu c genotype 2b.
ộ
ườ
ồ 2 trình bày đ ễ ể ườ ưỡ
ng bi u di n chu n v m i quan h ẩ ớ
ả
ẩ
ế
ộ ấ
ẫ
ệ
ẩ
ể
ọ
ỏ ộ ế ưỡ
ể ồ : Bi u đ 3
ạ
ệ đính kèm tính tóan n ng đ
ả
ẫ
ế ề
ử ớ b ng 2 ầ
ư
ạ ủ
ễ
ề
Trình bày đ ng bi u di n khu ch đ i và Ct ễ ể ườ ng n n (baseline ng ng c a 13 m u. L u là đ ưỡ ườ ư ẫ ủ c đi u ch nh đ đ t 199.73 nh là threshold đã đ ỉ ể ạ ề ượ ng ng bi u di n khu ch đ i c a các ng n n c a đ ề ủ ườ ế ể ưỡ m u chu n (bi u đ 2-A) ể ẩ ẫ
ồ
ư ề
ng đ
ế ưỡ
ạ ề
ườ
ể
ng bi u di n khu ch ế Bi u để ể ễ ệ đ i và đ ề ố ạ ng (Ct) v i n ng đ HCV gi a chu kỳ ng ồ ữ ử cDNA chu n ban đ u, k t qu cho th y th ầ nghi m TQ real-time PCR trên các m u HCV ể ệ cDNA chu n đ t đ chính xác khá cao th hi n ạ ộ qua R ‡ 0.99 và hi u qu PCR trong kh ang 90% ả ệ ồ minh h a m t k t qu TQ - 105%. Bi u đ 3 ả ng c a các real-time PCR phát hi n chu kỳ ng ủ ộ m u th v i ồ HCV RNA ban đ u có trong các m u th đó. ử ẫ ng L u í là chúng tôi luôn đi u ch nh đ ng ưỡ ể ỉ ễ ng bi u di n n n (baseline threshold) đ ể ườ ng v i khu ch đ i trong các m u luôn t ớ ươ ươ ẫ ng n n c a đ ng ạ ng bi u di n khu ch đ i ế ễ ủ c a m u chu n. ẩ ẫ ủ
3
i trình t
ả
ỉ
ế ầ
Trong k thu t gi ỹ ẩ ả ẩ
ả ả ệ ấ
ế ạ ộ ố
ứ
ỏ
ệ ấ
ượ
ả
ẫ
ỉ đ ự ượ
ả
: Trình bày Ct c a 13 m u và n ng d HCV-RNA ban đ u có trong các m u. N ng đ này đ
c tính tóan d a trên các thông s slope và Int
B ng 2ả
ủ
ả tr c ti p s n ự ự ế ậ t khi có s n ph m PCR, k t qu ch có th t ả ể ố ấ , không b các s n ph m ph m PCR thu n nh t ẩ ị ủ ph . ụ Hình 1 minh h a các k t qu đi n di c a ọ s n ph m PCR sau khi tinh s ch r t là rõ nét, dù ẩ ả ấ n ng đ HCV trong m t s m u là khá th p. ồ ẫ ộ qui trình RT real-time PCR Đi u này ch ng t ề ộ mà chúng tôi xây d ng trên n n t ng dùng b ề ả ự th nghi m RT TQ real-time PCR phát hi n và ệ ử đ nh l ng HCV-RNA do chúng tôi s n xu t là ị i u và hòan ch nh. T t c các m u mà chúng t ấ ả ố ư c phân tích trên i trình t tôi gi c đ u đ ề ượ c a CEQ8000. i trình t ph n m m phân tích gi ự ủ ề ầ Đa s các tr c có i đ gi ự ả ượ ườ ố ố ự ẫ ầ
ả ng h p các trình t ồ
ợ ộ
ượ
ộ trên
c a đ ủ ườ
ồ ẫ ng bi u di n chu n ẩ ở ễ
ể
Type
Ident.
Ct
Type
Ident.
Ct
ộ
ồ
ộ
ồ
N ng đ HCV-RNA (copies/ml)
N ng đ HCV-RNA (copies/ml)
Unkn
4492
25.38
409,173
Unkn
4483
30.75
13,027
Unkn
4488
N/A
Unkn
4482
N/A
Unkn
4487
31.82
6,554
Unkn
4490
27.61
97,773
Unkn
4486
30.2
18,542
Unkn
4480
N/A
Unkn
4485
N/A
Unkn
4494
30.79
12,696
Unkn
4484
26.95
149,353
Unkn
4491
29.91
22,336
Unkn
4493
27.18
128,853
ợ
ề
ừ
ậ ượ ư ệ
ờ
i trình t
ờ
ế ế
ễ
ề
ươ ầ
ả ị ả ớ
ế
ư
c, k t qu nh trình bày trong ế
ề
Bi n lu n ề ậ ố ỹ ậ ự ệ ể ỹ ậ ệ ươ ị ủ ỹ ề ậ ự ự ủ ạ
ẩ ệ ng pháp đ ượ ả ặ ươ ể ậ
ề ả i trình t ể ươ ườ ụ ắ ượ ể ả
ự chi u dài phù h p v i chi u dài mà chúng tôi d ớ ề Hình 2 minh h aọ 190bp đ n <200bp. đóan, là t ế c máy ghi nh n và trình m t bi u đ tín hi u đ ệ ượ ộ ồ ể gi c a các base. T trình t t c, đăng i đ ự ả ừ ự ủ nh p lên NCBI blast đ so sánh v i th vi n Los ớ ể ậ ủ c k t qu genotype c a Alamos và nh đó có đ ả ượ ế ự HCV. Hình 3 minh h a m t k t qu gi ộ ế ả ả ọ c a HCV nh đăng nh p lên NCBI genotype. ậ ủ Chúng tôi cũng đã th so sánh k t qu đ nh ử ng pháp này v i k t qu local genotype ph ớ ư blast dùng ph n m m mi n phí bio-edit v i th vi n genotype HCV mà chúng tôi thành l p ậ ệ hình 4 cho đ ả ượ ả ố ng pháp đ u cho k t qu gi ng th y c hai ph ươ ấ ả h t nhau. ệ ng đ i khó v m t k thu t, do v y ậ t ặ ươ ượ c InoLIPA có th tri n khai th c hi n đ ể i b t kỳ các phòng thí nghi m lâm sàng nào t ạ ấ có trang b ph ng ti n cho k thu t PCR. ậ ỹ ệ Tuy nhiên, vì InoLIPA ph i th c hi n trên ả ệ ự s n ph m PCR là k t qu c a ph n ng ả ứ ả ủ ế ả nested PCR nên kh năng b ng ai nhi m là ễ ọ ị ượ khá cao và đây chính là lí do gi c i thích đ ả ng h p InoLIPA có i sao có khá nhi u tr t ườ ợ ạ ượ c xác đ nh đ không th k t qu ể ị ế genotype[7,8]. Đ có th kh c ph c đ c ượ ể ể ứ nh c đi m này, chúng tôi đã nghiên c u thành công m t qui trình th c hi n RT-PCR
ự ệ ộ ệ Đ nh genotype HCV b ng k thu t gi ả i ị ằ c a Trugene hay k thu t InoLIPA trình t ộ lai trên v ch c a Bayer đ u d a trên m t đ an nucleotide đ c hi u trên vùng 5’NC. ọ Đây là c hai ph c FDA và y ả h c ch p nh n đ dùng trong các phòng thí ọ ấ ng pháp InoLIPA tuy nghi m lâm sàng. Ph ươ ệ ể ng pháp gi kém h n ph vì có th ơ ự ả ệ t ng h p không th phân bi có nhi u tr ợ ề c các subtype, nh ng InoLIPA có l i đ ợ ượ ư ế ị ả t b gi t ph i có thi đi m là không c n thi i ế ể c xem là khá đ t ti n và v n đ trình t ề ắ ầ ượ ự ố
4
ả ạ ự ỉ ầ ủ ứ ư ệ ệ ọ ả ễ ẩ ứ ố ạ ả ế Ph ị ể ế ươ c t ượ ừ ng pháp gi ả ụ ạ ể ả i Vi ạ i Vi ệ ử ụ ự ự ờ ộ ộ ả ớ ỏ ẫ c a nhi u b nh nhân cũng nh ệ ế ủ ồ ệ ả ng t ọ ệ ươ ả ề ươ ả ệ ệ i trình t ế ả ả ủ ẩ ả ệ ự ở ộ ủ ả ẫ ấ ắ ủ đích c a ph ủ ự ớ ử đích c a ph ọ ầ ự ở ợ ứ ử i trình t ậ ờ ả ằ t Nam khó có th th p d ạ ệ ứ ệ ờ ộ ử ng thích cho th ệ ứ ằ ỹ ộ ộ ử ặ ớ ồ c a Trugene ả ươ ị ệ i trình t ự ủ ứ ệ ớ ệ ố ệ ấ ử ụ ượ ệ ị ờ ệ ụ ệ ỉ ộ ướ ứ ệ ệ ẫ ậ ộ i Vi ở ể ượ ể ế ệ ộ ả ẩ ạ ộ ệ ố ể ầ ủ ế ể ả ỉ r t quan tr ng đ gi m đ ọ ị ượ ằ ứ ệ ự ầ ể ể ế
ả ộ ể i trình t ồ ự ả ị ị c xây d ng s n và ng i dùng có th ư ệ ẵ ự ủ ệ ậ ẫ i trình t ườ ả ủ ả ư ệ ư ẽ ả ủ ố ứ ượ ư ế ượ ệ ự ộ ể các máy gi ượ i trình t v i PCR mix c c kỳ nh y c m ch c n dùng ớ m i vòng trong c a HCV-InoLIPA và có ồ ả thêm kh năng ch ng đ c ng ai nhi m s n ượ ph m khu ch đ i nh có ch a dUTP và ờ ế UNG; và chính nh c i ti n quan tr ng, ọ ờ ả ượ HCV-InoLIPA có kh năng áp d ng đ c ả [8]. Tuy v y kh năng r ng rãi t t Nam ậ ộ ệ t tri n khai s d ng HCV-InoLIPA t Nam cũng còn khá xa v i vì giá thành hãy còn khá cao (#100USD/m u) so v i đi u ề ki n kinh t ư ề ệ kh năng tài chính c aa các b nh vi n hi n ủ ự ủ ng pháp gi nay. V ph c a Trugene, các nhà s n xu t khuy n cáo nên ấ th c hi n trên s n ph m PCR c a Roche ủ ng i khá Amplicor, và đây chính là m t tr ạ l n vì giá thành c a Roche Amplicor dành ớ cho HCV r t đ t (trên 120 USD/m u th ). ử ậ Ngòai giá thành c a Roche Amplicor, các v t li u tiêu hao khác đi kèm v i th nghi m ệ ệ cũng ph i đ n trên 60USD n a, gi ữ ả ế ả do v y giá thành c a m t th nghi m ệ ộ ủ ự ủ c a i trình t genotype HCV b ng gi ướ Trugene t i i Vi ể ấ 180USD. Trong th i gian qua, chúng tôi đã ệ nghiên c u thành công m t b th nghi m RT-PCR v i PCR mix dùng c p m i hòan ờ tòan t ng thích v i h th ng Trugene nh v y mà phòng thí nghi m không nh t thi ế t ậ d ng Roche Amplicor làm RT- ph i s ả PCR[8,9]. Chính nh áp d ng thành công này mà hi n nay giá xét nghi m HCV genotype i trung tâm Medic ch còn không qua t ạ 120USD/m t m u th . Tuy v y, giá thành ử ỉ này cũng hãy còn khá cao đ có th đ c ch đ nh r ng rãi cho các b nh nhân. Ngòai ra, ị ỉ Trugene là m t h th ng hòan tòan kín, ch c dùng đ đáp ng yêu c u đ nh đ ị ứ ượ ả genotype HCV c a lâm sàng do v y k t qu ậ ch có th hi n th đ c trên màn hình và in ể ể ị ượ ra gi y, do v y nhà nghiên c u không th có ậ ấ c k t qu trên m t t p tin vi tính đ có đ ượ ộ ậ ả th làm blast search hay nghiên c u ứ ể phylogenetic. Th vi n HCV là m t th vi n ư ệ ể đ ượ c p nh t thêm các k t qu c a mình (th c ự ậ ế c a hi n trên chính máy gi ự ủ ệ ể Trugene) vào th vi n này, nh ng không th ư l y th vi n này ra bên ngòai cũng nh ệ ấ không th đăng nh p đ có khác đ search c t đ ể ượ ừ c m t trình t ự ậ ả i phân ph i vào các genotype khác nh ộ ấ ệ trên th vi n này. Đây chính là m t b t ti n ố t cho các nhà nghiên c u khi mu n đ c bi ặ nghiên c u sâu thêm v HCV genotype trên ề ứ các ngu n khác nhau. các k t qu có đ ồ đ đ nh i trình t ự genotype HCV do chúng tôi phát tri n và ể trình bày trong công trình nghiên c u này ứ c th c hi n trên m t trình t dài không đ ệ ượ quá 200bp c a m t s n ph m PCR dài ẩ ủ ệ kh ang 240-250bp, k t qu t th nghi m ả ừ ử ế RT real-time PCR dùng m i và taqman probe ự ủ đ c hi u m t đ an đích t c a ộ ặ Trugene và InoLIPA trên vùng 5’NC. Chính ế đi u này đ m b o tính chính xác c a k t ề qu đ nh genotype HCV do chúng tôi phát ả ị tri n không khác gì k t qu đ nh genotype ả ị ế ể c a Trugene vì i trình t b ng k thu t gi ậ ự ủ ỹ ằ ng pháp c a đ an trình t ủ ươ ủ ự ọ ươ ng chúng tôi và đ an trình t pháp Trugen g n nh phù h p nhau hòan ư tòan. S dĩ chúng tôi nghiên c u thành công c công trình này là nh chúng tôi có đ ượ ế t c các thành công trong nghiên c u thi đ ượ c m i đ ch t o b th nghi m RT- k đ ồ ể ế ạ ế ượ ử PCR phát hi n HCV t ươ ậ nghi m đ nh genotype HCVb ng k thu t [8,9,10]. Ngòai ra, vi cệ gi nghiên c u thành công b th nghi m RT ộ ử real-time PCR dùng m i và taqman probe đ ể ồ ộ ng HCV-RNA trên m t phát hi n và đ nh l đ an đích đ n 240-250bp mà chúng tôi đã ế ọ i khá nhi u phòng nghiên c u và áp d ng t ề ạ ụ [11] là m t b t Nam thí nghi m t c đi ạ đ t phá (phá v qui lu t là real-time PCR ậ ộ ả ố ư dùng taqman probe ch cho k t qu t i u ỉ khi s n ph m khu ch đ i không quá 150bp, ế ch ng minh qua các k t qu trình bày trong ứ ả ế bi u đ 1-B ) và chính nh v y đã góp nên ờ ậ ồ ể c giá m t y u t ộ ế ố ấ thành c a xét nghi m đ nh genotype b ng k ỹ ủ i trình t ế t này vì không c n thi thu t gi ả ậ ả ph i th c hi n m t RT-PCR đ có s n ả ộ ệ ự ph m PCR dành riêng cho gi . Giá ẩ thành đ nh genotype HCV bao g m c đ nh l ng HCV-RNA hi n nay c a chúng tôi có ượ kh năng s không quá 50USD/m u. ả K t qu c a công trình nghiên c u cho ế ử th y đa s các m u huy t thanh đ c g i ẫ ấ đ n xét nghi m đ nh l ng HCV-RNA là ị ế thu c genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% ộ ư còn l ạ ố
5
ộ ả ụ ộ ờ ượ ỉ ệ ầ l ỷ ệ ị ỉ ị ệ ầ ả ằ ố ư ượ ườ i Vi t Nam mà ch nói lên đ ệ ướ ẫ ễ c t n s ượ ầ ắ mà v n ít hay ch a có h ư ư ự ế ệ ị ặ ề ệ c m t kh năng ng d ng r ng rãi m ra đ ứ ở không ch nh giá thành xét nghi m th p ấ ạ giúp cho các bác sĩ đi u tr không ng n ng i ề khi cho ch đ nh xét nghi m cho b nh nhân, ệ ề mà còn có th tri n khai đ i nhi u c t ạ ể ể i trình phòng thí nhi m hi n đang có máy gi ả ệ ệ ụ t ng ng d ng ứ ự hi n nay chúng ta trong y h c nh th c t v n th ẫ ọ ng g p. ặ ườ
ậ
ạ
Ả
ị b nh vi n Ch R y. M ng y khoa net ở ệ
ợ ẩ
ệ
2. 3. 4. D. T. T Thuy (2000). Lu n văn Th c Sĩ 5. Tr nh Kim nh và CS. Tình hình viêm gan virus B & C ạ 6. Alter MJ, Semin Liver Dis (1995). Management of Hepatitis C NIH Consensus Statement 1997; March 24- 26:15(3).
ệ ấ ỷ ệ ớ ứ ớ ế ị ừ genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype 2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b (1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (<1%). Chúng tôi không cho r ng t này ph n ánh th t s đúng t n s l u hành các ậ ự i nhi m HCV genotype HCV trong các ng ố t ỉ ạ genotype trong các b nh nhân s p, đang và ệ đã đi u tr đ c hi u b nh viêm gan m n tính ạ ệ ứ ng nghiên c u do HCV. Chính trên đ i t ố ượ genotype 1b (là này nên chúng ta th y t l ệ genotype đáp ng kém v i đi u tr đ c hi u) ị ặ ề ng là đ n 55% v i đa s có giá tr đ nh l ượ ị ố HCV-RNA khá cao (t ế 100.000 đ n 10.000.000 copies/ml) Tài li u tham kh o ả 1 National Institute of Health Consensus (2002). Development Conference Statement: Management of Hepatitis C: 2002 June 10-12. Final Statement Revisions made September 12, 2002 Versant HCV Genotyping Assay (LiPA) Trugene HCV Genotyping Assay (Sequencing) ế ự ả ế ả ả ủ ự ệ ế
8.
ạ
ể t đ ệ ượ ơ t h n là d a trên vùng 5’-NC t đ ượ
7. Nguyen Bao Toan (2005). HCV genotyping by LIPA kit and by Trugene sequencer. Why we need and how we can apply effectively and economically in the clinical laboratory The Viet Nam National Conference on laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005 Ph m Hùng Vân et al. (2005). LiPA and Trugene HCV genotyping system - Why we need it and how we can apply it economically and effectively in the clinical laboratories in Vietnam?. Bayer’ s customer meeting in TsingTao, China.
9. Ho Tan Dat (2005) Genotyping the Hepatitis C virus based on the sequencing of the 5’ non – coding of the virus genome The Viet Nam National Conference on laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005
10. Ph m Hùng Vân et al.
ạ
(2005). Direct sequencing the PCR product for genotyping of HCV and HPV. Becman Coulter’ s customer meeting in Singapore.
ễ
ệ
ở
ậ
ị
háng 4/2000.
11. Nguyen Thanh Tong (2005). The complete solution using molecular biology tool kits for diagnosis and monitoring HBV & HCV infection. ANCLS ả Nguy n Thanh H o conference 26-28 Oct. 20056. t Nam. Vi và CS (2000). Genotýp virút viêm gan C H i ngh chuyên đ b nh gan m t. H i gan m t Hà ậ ộ ề ệ ộ N i. Tộ
ứ ư ậ ả ế ộ ự ể gi ả ề ệ ệ ử ư ử ả ớ ệ c nhi u ng ề ượ ậ ậ ả ẫ
12. Syria Laperche, Jean-Jacques Lefrère et al (2005). Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’ Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter Study. Journal of Clinical Microbiology, 43(2); 733-739
ả ứ
Có m t s nhà nghiên c u cho là n u đ nh ứ ộ ố ị ẽ i trình t genotype b ng gi vùng 5’NC s ằ i ả không cho k t qu chính xác mà ph i gi ở vùng NS5B trên b gen c a HCV. S trình t ộ ư dĩ các nhà nghiên c u này quan ni m nh ứ ớ v y vì đã có m t s y văn trên th gi i ộ ố ậ ch ng minh là n u đ nh genotype HCV trên ế ị ứ c các vùng NS5B thì s có th phân bi ẽ [12], subtype t ự ố cũng nh là phân bi ớ c type 6 v i ệ ư subtype 1b[13] hay 1a và 1b chính xác h nơ [14]. Tuy nhiên các nghiên c u nh v y hãy còn ạ khá ít, và k t qu chính xác hay không l i còn tuỳ thu c vào th vi n gen mà chúng ta ư ệ ượ [15]. c dùng đ phân tích trình t i đ ệ Ngoài ra, dù hi n nay đã có nhi u c i thi n ả trong th nghi m RT-PCR phát hi n HCV ệ d a trên vùng NS5B, nh ng hãy còn kém ự nh y c m xa so v i th nghi m trên vùng ạ ườ 5’NC, do v y quan ni m đ i ệ th a nh n nh t hi n nay là: đ nh genotype ệ ấ ị ừ vùng 5’NC v n là thích i trình t d a trên gi ự ự ộ h p và h u d ng nh t cho lâm sàng vì đ ợ ấ ụ ữ nh y c m cao, còn vùng NS5B ch nên dùng ỉ ạ h c v s phân cho các nghiên c u d ch t ề ự ễ ọ ị ệ t b các genotype HCV vì kh năng phân bi ả ố các subtype cao[12, 16-19].
13. Chinchai, T., J. Labout, S. Noppornpanth, A. Theamboonlers, B. L. Haagmans, A. D. Osterhaus, and Y. Poovorawan. 2003. Comparative study of different methods to genotype hepatitis C virus type 6 variants. J. Virol. Methods 109:195–201.
ậ
K t lu n ế B ng ph ằ ả ươ
14. Chen, Z., and K. E. Weck. (2002). Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J. Clin. Microbiol. 40:3127–3134.
15. Joseph D.C. Yao (2003). Evaluation of the TRUGENE HCV 5_NC Genotyping Kit with the New GeneLibrarian Module 3.1.2 for Genotyping of Hepatitis C Virus from
ệ ồ ủ ị
m t đ an i trình t ng pháp gi ự ộ ọ ẩ DNA đích dài d i 200bp c a s n ph m ả ủ ướ th nghi m RT-PCR dùng PCR k t qu t ả ừ ử ế m i và Taqman probe đ c hi u vùng 5’ NC, ệ ặ c genotype c a HCV chúng tôi đã đ nh đ ượ trong huy t thanh c a b nh nhân b viêm gan ị ủ ệ ế m n tính do nhi m HCV. Nghiên c u này đã ứ ễ ạ
6
Clinical Specimens. Journal of clinical microbiology. 4855–4857
generated with the Amplicor HCV test. J. Clin. Microbiol. 37:2625– 2630.
18. Sandres-Saune, K., P. Deny, C. Pasquier, V. Thibaut, G. Duverlie, and J. Izopet. 2003. Determining hepatitis C genotype by analyzing the sequence of the NS5b region. J. Virol. Methods 109:187–193.
16. Cantaloube, J., H. Venault, J. Zappitelli, P. Gallian, M. Touinssi, H. Attoui, P. Biagini, X. de Lamballerie, and P. de Micco. 2000. Molecular analysis of HCV type 1 to 5 envelope gene: application to investigations of posttransfusion transmission of HCV. Transfusion 40:712–717.
17. Germer, J. J., P. N. Rys, J. N. Thorvilson, and D. H. Persing. 1999. Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products
19. Tamalet, C., P. Colson, H. Tissot-Dupont, M. Henry, C. Tourres, N. Tivoli, D. Botta, I. Ravaux, I. Poizot-Martin, and N. Yahi. 2003. Genomic and phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolates: a survey of 535 strains circulating in southern France. J. Med. Virol. 71:391– 398.
