Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Hoàng Lộc

Chia sẻ: Năm Tháng Tĩnh Lặng | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:128

Thêm vào BST

Báo xấu

289
lượt xem 57
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp giới thiệu tới các bạn một số nội dung chính sau: Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử, điện di gel, khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR),... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung chi tiết cảu bài giảng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp - Nguyễn Hoàng Lộc

Đại học Huế Bài giảng Công nghệ DNA tái tổ hợp Nguyễn Hoàng Lộc Huế 2007
Chương 1 Các enzyme dùng trong tạo dòng phân tử I. ENZYME HẠN CHẾ (RE)  Các RE cắt DNA ở các vị trí nhận biết đặc hiệu của chúng gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, có khả năng tạo ra các đoạn DNA có đầu tận cùng đầu bằng hay đầu so le.  Ví dụ: enzyme EcoRI nhận biết chuỗi 6 nucleotide, enzyme HaeIII nhận biết chuỗi 4 nucleotide: EcoRI đầu so le HaeIII đầu bằng
1. Gắn các đầu tận cùng được enzyme hạn chế cắt DNA ligase DNA ligase
2. Isochizomer  Là trường hợp những enzyme được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau nhưng lại cắt trong một trình tự, các enzyme đó được gọi là isochizomer.
II. DNA POLYMERASE (DNA-DEPENDENT-DNA POLYMERASE) 1. DNA polymerase I của E. coli  Chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 109.000 Da.  Có 3 hoạt tính:
2. Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E. coli  Khối lượng phân tử 76.000 Da.  Là DNA polymerase I nhưng thiếu hoạt tính exonuclease 5’→ 3’.
3. DNA polymerase của bacteriophage T4 (T4-infected E. coli)  Khối lượng phân tử 114.000 Da.  Hoạt tính exonuclease của DNA polymerase phage T4 lớn hơn của DNA polymerase I của E. coli đến 200 lần.  DNA polymerase phage T4 không cần có primer vẫn tổng hợp được DNA.
4. Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus)  Khối lượng phân tử 65.000 Da.  Taq DNA polymerase là một loại DNA polymerase chịu nhiệt lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
III. ENZYME PHIÊN MÃ NGƯỢC (REVERSE TRASNCRIPTASE)  Enzyme tổng hợp DNA từ khuôn mẫu RNA.  Có ở trong các retrovirus.  Có các hoạt tính:
IV. LIGASE 1. Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli)  Khối lượng phân tử 68.000 Da.  Enzyme xúc tác tạo liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH đầu 5’-PO4 trong DNA sợi đôi.
2. RNA ligase T4 (Bacteriophage T4-infected E. coli)  Enzyme xúc tác tạo liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH đầu 5’-PO4 trong RNA hoặc DNA sợi đơn.
V. CÁC LOẠI ENZYME KHÁC 1. Terminal transferase  Enzyme xúc tác tạo đuôi homopolymer ở đầu 3’ của DNA sợi đôi làm cho lồi ra một đầu ở cuối. 2. DNA-dependent RNA polymerase (Bacteriophage SP6-infected Salmonella typhimurium LT2, bacteriophage T7 hoặc T3-infected E. coli)  Enzyme xúc tác tổng hợp RNA trên khuôn mẫu DNA sợi đôi có mang promoter đặc trưng của bacteriophage.
3. Bacteriophage T4 polynucleotide kinase (Bacteriophage T4-infected E. coli)  Enzyme xúc tác chuyển nhóm γ-phosphate của ATP tới đầu 5’ của DNA hoặc RNA.  Hai loại phản ứng thường xảy ra là:
4. Alkaline phosphatase (E. coli và ruột bê)  Cả hai enzyme alkaline của vi khuẩn (bacteria alkaline phosphatase, BAP) và ruột bê (calff intestinal alkaline phosphatase, CIP) đều xúc tác loại bỏ nhóm 5’ phosphate khỏi DNA và RNA.
5. Nuclease S1  Enzyme cắt DNA sợi đơn hoặc RNA để tạo ra đầu 5’-monophosphate hoặc các oligonucleotide.
VI. CÁC PROTEIN LIÊN KẾT DNA SỢI ĐƠN (SINGLE STRANDED DNA-BINDING PROTEINS)  Có khả năng phá vỡ sự ổn định của các cấu trúc thứ cấp bên trong sợi nucleotide.  Tăng nhanh sự tái ủ của các polynucleotide bổ sung.  Tăng hoạt tính của các enzyme DNA polymerase.
Chương 2 Điện di gel I. ĐiỆN DI AGAROSE GEL  Điện di agarose gel được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA.  Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần chính của agar chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Cấu trúc phân tử của agarose
1. Các thông số ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di  Kích thước của phân tử DNA  Nồng độ agarose  Cấu hình của DNA  Thành phần base và nhiệt độ.
0,7% 1,0% 1,5% 1000 bp 1000 bp 1000 bp Điện di DNA ở các nồng độ agarose khác nhau.