Các phương pháp phân tích ADN

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

184
lượt xem 30
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Được phát triển bởi Pål Nyrén và Mostafa Ronaghi tại Royal Institute of Technology, Thụy Điển, năm 1996 Dựa vào phát hiện sự phóng thích pyrophosphate khi nucleotide được gắn vào Thành phần phản ứng: ADN sợi đơn Mồi Các enzym: DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase, Các cơ chất adenosine 5´ phosphosulfate (APS) và luciferin

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Các phương pháp phân tích ADN

Cac phương phap ́ ́ phân tich ADN ́ PGS.TS. Trần Cát Đông
Chiêt tach vât liêu di truyên ́ ́ ̣ ̣ ̀  Nguyên tăc chung: 3 bươc ́ ́ – Pha vơ tê bao: vât ly, hoa hoc ́ ̃ ́ ̀ ̣ ́ ́ ̣ – Chiêt tach acid nucleic: PhenolChloroform ́ ́ – Kêt tua acid nucleic: côn tuyêt đôi ́ ̉ ̀ ̣ ́  Cac trương hơp cu thê: ́ ̀ ̣ ̣ ̉ – Plasmid: muc tiêu loai NST băng sư khac nhau vê câu dang kich thươc ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̣ ́ ́ – ADN thưc khuân: tua phage băng PEG, loai bo capsid ̣ ̉ ̉ ̀ ̣ ̉ – Tê bao Thưc vât: pha tê bao băng cach nghiên ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ – Tê bao Đông vât: pha tê bao băng enzym chât tây ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̉ – ARN: bât hoat RNase, tua băng LiCl 8M, loai ADN băng DNase ́ ̣ ̉ ̀ ̣ ̀ – Tua lương ADN nho: đôn băng tARN ̉ ̣ ̉ ̣ ̀ – Tua băng isopropanol, tertbutanol,… ̉ ̀  Cac ky thuât khac ́ ̃ ̣ ́ – Loai carbohydrat, lipid băng CTAB ̣ ̀ – Thu hôi ADN băng săc ky hâp phụ ̀ ̀ ́ ́ ́ 2
Tinh chê acid nucleic ́  Siêu ly tâm, ly tâm phân đoan ̣ – Gradient liên tục / không liên tuc cua cesium chloride (CsCl) ̣ ̉ – Gradient saccharose  Săc ky ́ ́ – Sắc ký ái lực: sử dụng pha tĩnh là USepharose hay oligodT cellulose để tinh chế mARN. – Sắc ký lọc gel để tách các nucleotid tự do sau khi tạo mẫu dò đánh dấu. – Sắc ký trao đổi ion trên vi cột, áp dụng để thu hồi những lượng ADN rất nhỏ. – Sắc ký lỏng hiệu năng cao: dùng để tinh chế các oligonucletid tổng hợp (độ phân giải là 1 nucleotid), plasmid, phân tách các đoạn ADN.  Điên di: ̣ – Agarose – PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) 3
Đinh tinh đinh lương acid nucleic ̣ ́ ̣ ̣  Quang phô kê: OD260nm ̉ ́ – 50 μg/ml dung dịch ADN (hoặc ARN) sợi đôi – 40 μg/ml dung dịch ARN (hoặc ADN) sợi đơn – 30 μg/ml oligonucleotid (tới 70 base) – Kiêm tra đô tinh khiêt băng ty lê OD260/230 hoăc OD260/280, ̉ ̣ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ OD320nm  Điên di gel: phân tach acid nucleic băng dong điên ̣ ́ ̀ ̀ ̣ trong gel – Đinh tinh theo kich thươc ̣ ́ ́ ́ – Đinh lương băng so sanh vơi chuân ̣ ̣ ̀ ́ ́ ̉ 4
Điên di ̣ 5
Các enzym biến đổi acid nucleic  Enzym cắt hạn chế / methylase – Cắt ADN tại vị trí xác định – Tạo ra đầu dính hoặc đầu tù – Lưu ý tính tương thích khi cắt nối  Polymerase – ADN polymerase phụ thuộc ADN – Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) – ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu – ARN polymerase phụ thuộc ADN  Ligase – Nối hai đoạn ADN Nôi đươc ́ ̣ Nôi đươc ́ ̣ Không đươc ̣ 6
Ky thuât lai acid nucleic ̃ ̣  La sư băt căp bô sung đăc hiêu cua hai phân tư acid ̀ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ nucleic mach đơn ̣ G-T-A-G-T-C-C + T-C-A-G-G-T G-T-A-G-T-C-C T-C-A-G-G-T  Cac yêu tô anh hương ́ ́ ́ ̉ ̉ – Nồng độ ADN và thời gian phản ứng – Nhiệt độ – Độ dài của các trình tự – Lực ion 7
Ky thuât lai acid nucleic ̃ ̣  Southern Blot: lai ADN Chiết tách ADN vi khuẩn Northern Blot: lai ARN Gắn ADN vào màng  ADN đích Màng  Lai tai chỗ (in situ) ̣ B B Lai với đoạn dò đánh dấu bằng biotin Mâu do (probe) Đoạn dò được đánh  ̃ ̀ dấu biotin B B  Hê thông phat hiên ̣ ́ ́ ̣ – Phong xạ ́ Streptavidin – Enzym B B – Huynh quang ̀ AP B Alkaline phosphatase AP AP biotinyl hóa B B AP B B AP AP B B AP B B Cơ chất Alkaline phosphatase Phát quang AP AP B B AP B B AP AP B B AP B B 8
Ky thuât PCR ̃ ̣  Nguyên lý: sao chép ADN in vitro – Trong điều kiện có sẵn nucleotid – Enzym polymerase sẽ kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung nếu đầu 3’OH trống  Kỹ thuật PCR gồm 3 bước: – biến tính dsADN thành các sợi đơn nhơ nhiêt độ, ̀ ̣ – ủ các đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với các ssADN, – enzym kéo dài các đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với khuôn mẫu. Polymerase nucleotid 5’P 3’OH 3’OH 5’P 9
PCR ADN đích 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ ADN đích biến tính 5’ 3’ 3’ 3’ Gắn mồi 3’ 3’ Đoạn Đoạn đích Kéo dài đích quay quay lại lại Biến tính Gắn mồi Kéo dài Biến tính và gắn mồi Kéo dài Tiếp tục biến tính, gắn mồi và kéo dài trong 20-40 chu kỳ 10
PCR Cac yêu tô ky thuât ́ ́ ́ ̃ ̣  Chương trinh PCR ̀ – Biên tinh khơi đâu: 95oC / 510 phut ́ ́ ̉ ̀ ́ – Chu ky nhiêt: gôm 3 bươc lăp lai 2540 lân ̀ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̀  Biên tinh: 9495oC / 30’vai phut ́ ́ ̀ ́  Găn môi: 4070oC (
Ưu nhươc điêm va cac biên thể ̣ ̉ ̀ ́ ́  Ưu – Nhanh, Đơn gian, Nhay, Đăc hiêu ̉ ̣ ̣ ̣  Nhươc ̣ – Phai biêt trinh tư 2 đâu đê thiêt kê môi ̉ ́ ̀ ̣ ̀ ̉ ́ ́ ̀ – Ngoai nhiêm  mât tinh đăc hiêu ̣ ̃ ́ ́ ̣ ̣  Biên thể ́ – Nested PCR (tô): dung 2 bô môi  tăng tinh đăc hiêu, nhay ̉ ̀ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̣ khi khuôn mâu không tôt ̃ ́ – Multiplex PCR: dung nhiêu bô môi cua nhiêu khuôn mâu ̀ ̀ ̣ ̀ ̉ ̀ ̃ trong môt phan ưng ̣ ̉ ́ – RTPCR: khuôn mâu ARN ̃ – RealtimePCR: PCR song song vơi phat hiên san phâm ́ ́ ̣ ̉ ̉ – …… 12
Ưng dung PCR ́ ̣  Tao đoan ADN mong muôn ̣ ̣ ́  Giai trinh tư ̉ ̀ ̣  Gây đôt biên ̣ ́  Chân đoan, Phat hiên va đinh danh sinh vât ̉ ́ ́ ̣ ̀ ̣ ̣  Xac đinh quan hê di truyên ́ ̣ ̣ ̀  Nhân dang tôi pham,… ̣ ̣ ̣ ̣ 13
Phương phap giai trinh tư Sanger ́ ̉ ̀ ̣  Phương phap enzym/dideoxy: dưa vao sư ngưng tông ́ ̣ ̀ ̣ ̀ ̉ hơp ADN khi găp phai dideoxy nucleotid (Frederick ̣ ̣ ̉ Sanger)  Qui trinh: ̀ – Thưc hiên 4 phan ưng PCR riêng biêt vơi 1 môi: ̣ ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̀ 1. A: co dNTP + ddATP ́ 2. T: co dNTP + ddTTP ́ 3. G: co dNTP + ddGTP ́ 4. C: co dNTP + ddCTP ́ – Môi ông san phâm đươc nap vao môt giêng điên di ̃ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̣ – Kêt qua điên di đươc đoc  trinh tư ́ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ 14
Đoc kêt qua Phương phap Sanger ̣ ́ ̉ ́ 5’-GGCCGCGTCTTCGCCGTAG-3’ ddG ddA ddT ddC 3’ 5’ 15
Ky thuât tư đông mơi nhât (Harold Swerdlow) ̃ ̣ ̣ ̣ ́ ́  Cac ddNTP đươc đanh dâu huynh quang vơi cac mau khac nhau ́ ̣ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́  Thưc hiên môt phan ưng PCR duy nhât vơi sư hiên diên cua cac dNTP va ̣ ̣ ̣ ̉ ́ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̉ ́ ̀ ddNTP  Sư dung điên di mao quan đê tach san phâm ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ̉  Đoc kêt qua băng đâu do laser ̣ ́ ̉ ̀ ̀ ̀ 16
Phương phap giai trinh tư Maxam và Gilbert ́ ̉ ̀ ̣  Phương phap hoa hoc: dựa vào sự thủy giải đặc trưng ́ ́ ̣ cua ADN (Allan Maxam va Walter Gilbert) ̉ ̀  Qui trinh: ̀ – Tao ADN sơi đơn tư đoan ADN cân giai trinh tư ̣ ̣ ̀ ̣ ̀ ̉ ̀ ̣ – Đánh dấu các phân tử ADN ở một đầu – Thưc hiên 4 (hoăc 5) ông phan ưng riêng biêt: ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ́ ̣ 1. G: + dimethyl sulphate  Guanine bi methyl hoa ̣ ́ 2. AG: + formic acid  Adenin va Guanine bi methyl hoa ̀ ̣ ́ 3. TC: + Hydrazine  biên đôi Thymin va Cytosin ́ ̉ ̀ 4. C: + Hydrazine + 1,5 M NaCl  biên đôi Cytosin ́ ̉ – Xư ly 4 ông trên vơi piperidine 1M/90oC đê căt ADN ơ liên kêt ̉ ́ ́ ́ ̉ ́ ̉ ́ phosphat kê nucleotid bi biên đôi ́ ̣ ́ ̉ 5. A>C: NaOH 1,2N/90oC căt ADN ơ Adenin > Cytosin ́ ̉ – Môi ông đươc nap vao môt giêng điên di ̃ ́ ̣ ̣ ̀ ̣ ́ ̣ – Kêt qua điên di đươc đoc va biên luân  trinh tư ́ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣ ̣ ̀ ̣ 17
Phương phap giai trinh tư Maxam và Gilbert ́ ̉ ̀ ̣ ADN cân giai trinh tư ̀ ̉ ̀ ̣ Tao sơi ADN đơn ̣ ̣ Đanh dâu băng P32 ́ ́ ̀ Căt tai cac base đăc hiêu ́ ̣ ́ ̣ ̣ Phan ̉ Phan ̉ Phan ̉ Phan ̉ ưng tai ́ ̣ ưng tai ́ ̣ ưng tai ́ ̣ ưng tai ́ ̣ G A/T T/C C 18
Phương phap giai trinh tư Maxam và Gilbert ́ ̉ ̀ ̣ Điên di ̣ Tach theo ́ kich thươc ́ ́ Phong xa ký ́ ̣ Kich thươc cua ́ ́ ̉ san phâm (sô ̉ ̉ ́ 3’ nucleotid) 5’ G A/G T/C C Đoc ̣ trinh tư ̀ ̣ 19
Ưu nhươc điêm cua MaxamGilbert ̣ ̉ ̉  Ưu: – Giai trinh tư không cân môi ̉ ̀ ̣ ̀ ̀  Nhươc: ̣ – Châm ̣ – Đôc hai ̣ ̣ – Năng suât thâp ́ ́ – Không tư đông hoa đươc ̣ ̣ ́ ̣ 20