Bài giảng Sắc ký sinh học tinh sạch Protein

Chia sẻ: Năm Tháng Tĩnh Lặng | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:136

Thêm vào BST

Báo xấu

145
lượt xem 23
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng này giúp bạn hiểu được một số vấn đề về sắc ký sinh học như: Tại sao người ta lại sử dụng sắc ký sinh học tinh sạch Protein? Sắc ký sinh học tinh sạch Protein được sử dụng như thế nào và sử dụng trong trường hợp nào? Các phương pháp sắc ký thông dụng,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Sắc ký sinh học tinh sạch Protein

Biochromatography SAÉC KYÙ SINH HOÏC TINH SAÏCH PROTEIN
Biochromatography
Muïc ñích cuûa moân hoïc  Giuùp baïn hieåu ñöôïc veà saéc kyù sinh hoïc ‟ Taïi sao ngöôøi ta phaûi söû duïng, Hoï söû duïng nhö theá naøo vaø hoï söû duïng trong caùc tröôøng hôïp naøo? ‟ Caùc phöông phaùp saéc kyù thoâng duïng. ‟ Thaûo luaän
Saéc kyù sinh hoïc laø gì?  Laø kyõ thuaät tinh saïch protein  Laø phöông phaùp “nheï nhaøng” ñeå thuïc hieän vôùi caùc phaân töû sinh hoïc vaø duy trì hoaït tính cuûa chuùng.  AÙp duïng cho phaân tích cuõng nhö cho chuaån bò maãu  Saéc kyù loûng ‟ HPLC/FPLC duøng trong phaân tích vaø chuaån bò maãu (Ñoä phaân giaûi cao) ‟ LPLC duøng trong quy moâ nhoû vaø quy moâ lôùn (saûn xuaát)
Chromatography Maãu Coät saéc kyù ñöôïc chuaån bò vôùi moâi tröôøng/resin/ matrix/gel Phaân taùch Taùch ra caùc thaønh phaàn rieâng bieät
Saéc kyù phoå Base line separation, good These peaks are not separated resolution, the peaks are so well. They are a bit broad completely separated, best case and run into each other First peak, the void peak, Vo Ve Vt goes straight the column without interacting with it. This is the unbound material Sometimes you have an axis on this side too, showing the gradient Amount of protein, concentration as read by a UV monitor, is usually on the y-axis Baseline Time or volume are always Volume on the x-axis
Saéc kyù sinh hoïc deã daøng theo naêm böôùc  Chuaån bò coät saéc kyù  Moät soá maãu bò caûn laïi vôùi gel vaø caân baèng coät trong coät. Chuùng ñaõ vôùi buffer. bò phaân ñoaïn.  Bôm maãu vaøo cuøng vôùi  Röûa coät vaø caân baèng buffer qua coät. laïi coät baèng buffer.  Tieáp tuïc bôm buffer qua coät.
Chromatography Terms
Caùc loaïi saéc kyù khaùc nhau  Trong phaân tích (HPLC/FPLC) ‟ Loaïi haït 5-10 µm (Bio-Scale, UNO, Bio-Silect, Bio-Prep SE) ‟ Coät 1-20 ml ‟ Vaän haønh ôû aùp suaát cao, (>80 psi)  Chuaån bò baùn thoâ (Semi-preparative - medium pressure) ‟ Loaïi haït 15-30 µm (Macro-Prep 25, CHT 20 micron) ‟ Coät 20-500 ml ‟ Vaän haønh ôû aùp suaát trung bình (30-100 psi)  Chuaån bò thoâ (low pressure) ‟ Haït 40-200 µm (Macro-Prep high Q, high S, 40 & 80 micron CHT) ‟ 20 ml-1000 liters ‟ AÙp suaát thaáp ñeá trung bình (5-50 psi)
Coâng suaát Haït coù kích vs  Haït caàu raén thöôùc loå lôùn Neàn lieân tuïc
Mass Transfer UNO - Proteins Mono beads - pumped to Proteins diffuse to binding site binding site
Kích thöôùc loå haït vaø ñoä phaân giaûi Haït nhoû seõ laøm taêng aùp suaát cao nhöng Haït lôùn taïo aùp suaát thaáp coù ñoä phaân giaûi toát, thöôøng duøng trong nhöng ñoä phaân giaûi khoâng phaân tích vaø trong caùc thí nghieäm quy cao, thöôøng söû duïng trong caùc moâ nhoû. coâng vieäc chuaån bò trong coät coù kích thöôùc lôùn. Chuù yù raèng söï choïn loïc laø nhö nhau. Caùc peaks taùch ra ôû caùc vò trí nhö nhau, chuùng chæ lôùn hôn khi duøng haït coù kích thöôùc lôùn hôn.
Söû duïng saéc kyù sinh hoïc ôû ñaâu?  Haàu heát caùc nghieân cöùu lyù thuyeát vaø öùng duïng cuûa khoa hoïc ñôøi soáng. ‟ Sinh hoùa, sinh hoïc phaân töû…. „ Caùc nghieân cöùu veà hoaït tính „ Caùc nghieân cöùu veà caáu truùc  Tinh saïch caùc phaân töû sinh hoïc töø quy moâ phoøng thí nghieäm ñeán quy moâ saûn xuaát.
Nghieân cöùu Coâng nghieäp: Khaùm phaù caùc phaân töû coù hoaït Saûn xuaát tính sinh hoïc phuïc Phaùt trieån caùc Saûn xuaát döôïc vuï cho caùc lieäu quy trình phaåm theo nhu phaùp AÙp duïng nghieân caàu thò tröôøng cöùu vaøo saûn xuaát Khoa hoïc: Tìm hieåu caùc cô cheá cuûa söï soáng
Caùc kyõ thuaät saéc kyù  Ion Exchange (IEX) – Trao ñoåi ion ‟ Döïa treân ñieän tích, Coù theå söû duïng baát kyø luùc naøo trong suoát quy trình, giöõ laïi taïi giai ñoaïn ñaàu, phaân ñoaïn, tinh saïch sau cuøng  Size Exclusion (SEC) – Loïc gel ‟ Döïa treân kích thöôùc, duøng ñeå phaân ñoaïn, loaïi muoái, trao ñoåi buffer, tinh saïch sau cuøng.  Ceramic Hydroxyapatite (CHT) ‟ Cô cheá duy nhaát, cuõng nhö trao ñoåi ion,coù theå duøng baát kyø luùc naøo.  Hydrophobic Interaction (HIC) – Töông taùc kî nöôùc ‟ Döïa treân tính kî nöôùc, töông töï nhö CHT vaø IEX  Affinity (AC) – AÙi löïc ‟ Döïa treân caùc töông taùc sinh hoïc, thöôøng söû duïng ôû caùc giai ñoaïn sau vì ñaét tieàn, nhöng haàu heát moïi ngöôøi thích söû duïng ôû caùc giai ñoaïn tröôùc cuûa quaù trình tinh saïch.
Size Exclusion Chromatography
Giôùi thieäu veà Size Exclusion „ - Coøn ñöôïc goïi laø Loïc Gel (Gel filtration) „ - Taùch caùc phaân töû theo kích thöôùc „ - Kích thöôùc ñöôïc theå hieän qua troïng löôïng phaân töû. ‟ Daltons (d or Da) or KiloDaltons (kd, or kDa) „ - Traät töï taùch ra khoûi gel: lôùn nhaát ---> nhoû nhaát „ - Töø aùp suaát thaáp ñeán cao „ Macro-Prep SE, Bio-Gel P-Gels, Bio-Gel A Gels, „ Bio-Prep SE „ Bio-Sil & Bio-Select Columns
Cô cheá „ Quaù trình taùch xaûy ra khi ‟ Caùc phaân töû ñöôïc “baét” hay “loai” khoûi gel „ Caùc phaân töû bò loaïi thoaùt ra khoûi gel nhanh choùng. „ Caùc phaân töû bò “baét” di chuyeån chaäm raõi qua gel vaø ñi ra sau.
Caùc loaïi phaân taùch „ Coù hai loaïi ‟ Phaân ñoaïn ‟ Taùch theo nhoùm