Bài 4:
Ị
XÁC Đ NH HO T TÍNH ENZYM Ạ AMYLASE
c ho t tính enzym α-amylase b ng ph
ng pháp Smith & Rose
ạ
ằ
ượ
ươ
ạ
ể
ả
ị
50
ượ
ố ơ ộ
ả ứ
1. M c đích ụ Xác đ nh đ ị 2. Nguyên t c, nguyên lý ắ a - amylase bi u th kh năng c a enzyme amylase xúc tác ph n ng ả ứ Ho t tính ủ oC và đ ị c bi u hi n b ng s đ n v ằ ộ ế ng tinh b t còn c so màu b ng máy so ằ
ể ộ ả ượ
ư ượ
ớ
ẫ ủ ẽ ạ c sóng 620nm.
c phân h y s t o ph n ng màu v i iode và đ ả ứ b ọ ở ướ
th y phân tinh b t đ n dextrin trong 1 phút ệ ở ủ c a enzyme trong 1g m u. Khi ph n ng th y phân tinh b t x y ra, l ượ ủ ủ l i ch a đ ạ màu quang h c 3. Hoá ch tấ
và 5g KI trong n
c thành 200ml
1. Dung d ch tinh b t 1% ị ộ 2. Dung d ch HCl 1N ị 3. Dung d ch NaCl 3% ị 4. Thu c th Lugol 0,5g ử
ố
ướ
4. D ng cụ
ụ
ố
1. 1 cân phân tích 2. 1 máy quang phổ 3. 2 Cuvet 4. 2 becher 250 ml 5. 2 erlen 250 ml 6. 1 pipet 20 ml 7. 1 c i chày ố 8. 1 ph u thu tinh ỷ ễ 9. 3 ng nghi m ệ 10. 1 bóp cao su 11. 1 ng đong
ố
5. Cách ti n hành
ế
Ti n hành thí nghi m theo b ng sau: ệ
ế
ả
Dung d ch hóa ch t ấ
ị
Ố Ố
Ố
t enzyme amylase (ml)
ộ
ng nghi m ệ ng th (t) ử 0 1 1 1 0.5 0
ng chu n (0) ẩ 1 0 1 1 0.5 1
0C trong 30 phút
1 5.5 0.05
5.5 0.05
N c c t (ml) ướ ấ D ch chi ế ị Dung d ch đ m (ml) ị ệ Dung d ch tinh b t 1% (ml) ị Dung d ch NaCl 3% (ml) ị Dung d ch HCl 1N (ml) ị Đem 50 ủ ở Dung d ch HCl 1N (ml) ị N c c t (ml) ướ ấ Thu c th Lugol (ml) ử ố
L c đ u h n h p trong ng nghi m r i mang đi so màu
c sóng 620nm.
ệ
ồ
b ở ướ
ắ ề ỗ ợ 6. K t qu thí nghi m ả
ố ệ
ế
ng tinh b t ban đ u tham gia ph n ng.
ả ứ
ủ ố ủ ố ộ ả ứ
V i:ớ : m t đ quang c a ng chu n. ẩ : m t đ quang c a ng th . ử C : l ầ T : th i gian ph n ng (phút). L : h s pha loãng m u enzyme
ậ ộ ậ ộ ượ ờ ệ ố
ẫ
ng nghi m 1
ng nghi m 2
ệ
ệ
Ố 0.623 0,029
Ố 0,719 0,031
M t đ quang c a ng chu n trung bình là:
ậ ộ
ủ ố
ẩ
M t đ quang c a ng th trung bình là:
ậ ộ
ủ ố
ử
Nh v y: ư ậ
7. Tr l
ả ờ
i câu h i ỏ
ủ
ấ
t c thu c tính lý hóa c a protein. Đa s
Câu 1 Trình bày tính ch t chung c a Enzym Enzyme có b n ch t là protein nên có t ấ ả ấ
ả
ủ
ộ
ạ
ướ ớ
ấ
ầ
ướ
ữ ơ ướ
ệ ộ
ự ủ
ụ
enzyme có d ng hình c u và không đi qua màng bán th m do có kích th trong n không phân c c. Không bên d i tác d ng c a nhi ự ng acid, bazo cũng làm enzyme m t kh năng ho t đ ng. tính. Môi tr ườ
ố c l n. Tan c và các dung môi h u c phân c c khác, không tan trong ete và các dung môi ị ế t đ cao thì enzyme b bi n ạ ộ
t đ , nhi ệ ộ ả
ấ
ng tính tùy pH c a môi tr
ng mà t n t
i
các d ng: cation,
ưỡ
ủ
ườ
ồ ạ ở
ạ
- Enzyme có tính l anion hay trung hòa đi nệ C ng l c xúc tác ự
ườ
ọ
ấ ủ
ộ
ng
ạ
ự
Enzim là ch t xúc tác sinh h c , nó có đ y đ các tính ch t c a m t ch t xúc tác. ầ ủ ơ
ề
ớ
ệ
ấ ấ ng l c xúc tác m nh h n nhi u so v i xúc tác thông th Tuy nhiên enzim có c ườ ườ Tính đ c hi u ệ ặ ể
ả ứ
ể
ể
ỗ
ỉ
ch t nh t đ nh.
ấ
ụ
ỉ
+ Đ c hi u ki u ph n ng: m i enzyme ch xúc tác cho các ki u chuy n hóa m t ộ ặ ấ ị + Đ c hi u c ch t: ặ Đ c hi u tuy t đ i: enzyme ch tác d ng trên m t c ch t nh t đ nh. Đ c hi u t
ấ ị ể
ặ ặ
ả
ệ ơ ấ ệ ố ộ ơ ấ ọ ng đ i: enzyme có kh năng tác d ng lên m t ki u liên k t hóa h c ụ ố c ch t mà không ph thu c vào c u t o c a các ph n tham gia ử ơ ấ
ộ ấ ạ ủ
ế ầ
ấ ị
ụ
ộ
ệ ệ ươ nh t đ nh trong phân t t o thành liên k t đó. ạ
ế
ặ
ả
ệ
ụ
ể
ế
ộ
ộ
ệ
ề
ế
ầ
ạ
ả
ệ
ạ
ọ
ớ
ộ
ồ
ỉ
ấ
ấ Đ c hi u nhóm: enzyme có kh năng tác d ng lên m t ki u liên k t hóa h c nh t ọ đ nh v i đi u ki n m t trong hai thành ph n tham gia t o thành liên k t ph i có c u t o ấ ạ ớ ị xác đ nh. ị Đ c hi u quang h c: enzyme ch tác d ng v i m t trong hai d ng đ ng phân ụ ặ quang h c c a ch t. ọ ủ Câu 2: Trình bày tính ch t và ng d ng c a m t vài enzym phân gi
i Protein
ứ
ụ
ủ
ả
ấ
ộ
th
nhiên
ườ
ặ
c chia làm hai lo i endopeptidase và exopeptidase
ạ
ớ ế ạ ị
ng g p trong t ự Proteinase đ ạ ượ - Các đ i di n c a Proteinase: ệ ủ + Pepsin: có trong d ch tiêu hóa d dày lúc m i ti c ho t hóa b i H
t ra + v i pH = 1.5 – 2.0 chúng phân gi ượ ớ ở ạ ả ầ d ng pansinogen ạ i g n 30% m ch
và đ ở peptid và bi n protein thành polypeptide. ạ ế
ế ủ ộ ậ ỉ
ể ờ
+ Chimosin: enzyme này ch có trong múi kh c a đ ng v t non. Nó có tác d ng làm đông vón caseinogen thành casein không hòa tan đ kéo dài th i gian ụ tác đ ng c a pepsin. ủ ộ
t ra d i d ng tripsinogen, ho t đ ng môi + Trypsin: do tuy n t y ti ướ ạ ạ ộ ở ế ụ
tr ng ki m ườ ể ở ộ
+ Chimotrypsin: do tuy n t y ti ế ụ t ra nh trypsin ho t hóa, nó có tác d ng ạ ờ ế ru t non pH = 8 – 9 ế ụ
làm casein đông vón.
+ Catepsin: có trong mô bào nh gan, th n , lách ho t đ ng pH = 4 – 5 ạ ộ ư ở
ụ ủ ế ộ
ự ậ ắ
ậ nên có tác d ng phá h y protein sau khi đ ng v t ch t. ậ + Papain: là proteinase th c v t có nhi u ề ở ng v c a n ươ ệ ắ ờ cây đu đ . Dùng rút ng n th i ủ c m m, làm tăng đ b n c a bia, làm trong ộ ề ủ
gian và c i thi n h ả ị ủ ướ bia và rút ng n th i gian l c ọ ờ ắ
+ Casein có ch a m t s l ứ
ng tác. ng đ i ít Cũng không có c u disulfide ng khá cao c a ế ủ proline d l ư ượ . K t qu là, nó có t ươ ả
ng đ i
ng, mà không ơ ấ ố c c u cượ cướ . Nó đ c g i là "các mixen c a các h t đ t ươ ạ ọ . Nó là t đ i h c ươ tìm th y trong s a nh m t ữ ấ ộ ố ượ ầ ỵ ướ , làm cho nó kém tan trong n ố k n ọ c ư ộ h th ng treo ệ ố ạ ượ ủ
ị ố ỉ ể ế ớ ề ặ
b m t và h có hình c u. ọ
ạ ở ề ặ ấ ủ ộ ả ạ micellae trong m t c m c h n ượ ẳ ụ c. ng d ng ầ Tuy nhiên, trái ng ướ Ứ ậ ầ ư ộ ấ ộ
casein", mà ch hi n th gi ng h n ch v i b m t lo i giác r ngằ aư ph n c trú v i b m t mixen, n i th t c a m t mixen casein là r t ng m n ớ ề ặ trong công ngh làm phomat ệ
ủ ụ
ừ
ặ ộ ổ ợ Câu 3: Trình bày tính ch t và ng d ng c a enzym amilase ứ α – amylase t ạ
ỗ ộ
ượ ế ả ấ
ấ các ngu n khác nhau có thành ph n amino acid khác nhau, ầ ồ h p amiono acid đ c hiêu riêng, α – amylase là m i lo i α – amylase có m t t m t protein giàu Tyrosine, Trytophan, Acid Glutamic và Aspartic. Các Acid ng amino acid c u thành nên Glutamic và Acid Aspartic chi m kho ng phân t ố
ả
u loãng t ng l ổ α – amylase có ít Methionine và có kho ng 7-10 g c Cysteine enzym. ử ng phân t Tr ng l ấ ượ ọ α – amylase d tan trong n ễ ả c a α – amylase n m m c kho ng 45.000-50.000 Da ố ử ủ c, trong dung d ch mu i r ố ượ ướ
ấ ủ ủ ế
đi m đ ng đi n n m trong vùng pH = 4,2-5,7 ệ ể
ằ ộ ố
ị Protein c a các α – amylase có tính acid y u và có tính ch t c a Globuline ẳ ư ỉ ấ amylase là m t metaloenzyme. α – amylase c a n m m c h u nh ch t n ng t n. S n ph m cu i cùng c a th y phân ủ ố ủ ấ ẩ ộ ị ươ ầ ủ ả ổ ữ
công nh ng h t tinh b t b th ạ amylase là glucose và maltose.
ấ ấ ế ủ
ủ ẽ ạ ớ ạ
ộ ử ủ α – amylase c a n m s i không t n công liên k t α – 1,6 glucoside c a i h n phân nhánh. tinh b t do enzyme α – amylase phân c t t o thành ắ ạ
Amylase đ ớ ể ượ ử ụ
ố ầ ạ ệ ề
ủ ế ớ ể ố ợ
ề
ẩ ễ ả ứ ứ ấ
ượ
ộ
ộ ố ạ ố
ẩ
ườ ủ ế ơ
ấ ớ
ng s d ng enzym amylase c a vi ồ ề ậ ử ụ ủ ệ ệ
ẩ
ợ amylopectin, nên khi th y phân nó s t o thành các dextrin t Đây là m t c u trúc phân t ộ ấ i h n phân nhánh dextrin t ớ ạ ng d ng ụ Ứ c s d ng đ ph i h p v i coenzyme A, cytocrom C, ATP, ố ợ carboxylase đ ch thu c đi u tr b nh tim m ch, b nh th n kinh. M t khác ặ ị ệ amylase ph i h p v i enzyme th y phân đ ch a b nh thi u enzyme đ ng tiêu ể ữ ệ ườ ế ố t, có tác d ng ch ng hóa. Trong c th , amylase là hormon tuy n tu ngo i ti ế ỵ ụ ạ ế ơ ể ng ho c sau m . Đi u tr tri u ch ng ph n ng viêm kèm phù n sau ch n th ứ ổ ề ươ ị ệ ặ ấ ng hô h p trên ho c d nhi m khu n đ i. Các s n ph m ch a enzyme alpha- ẩ ả ặ ướ ườ ủ amylase dùng Alpha-amylase là m t lo i enzyme mà s ki m soát l ng calo c a ẽ ể ạ ộ c th . Alpha-amylase là m t men n i sinh có th th y phân tinh b t và các ể ủ ộ ơ ể polysaccharide (ho t tính amylotic) b ng cách t n công vào m i n i a-1,4 ấ ằ glucosidic cho ra các dextrine, oligosaccharide và monosaccharide. Alpha-amylase c l y t ngu n vi khu n Bacillus subtilis. dùng trong Neopeptine viên nang đ ượ ấ ừ Amylase c a vi khu n cho đ n nay có u đi m là b n h n trong môi tr ng acid ể ư ẩ đ ng v t và vi n m. c a d dày so v i diastase (amylase) l y t ấ ừ ộ ủ ạ i ta th Trong công nghi p d t, ng ườ ườ khu n đ t y tinh b t và làm cho v i m m ả ề ộ Vi c s d ng enzyme đ kh m c gi y lo i trên th gi ử ự ể ấ ạ
ể ẩ ệ ử ụ ướ ề ế ớ ố ầ ộ ố ủ
theo nhi u h th y, enzyme α-amylase đang có kh năng thúc đ y quy trình kh m c t ả i đã có thăm dò ng và m t s ch ng vi sinh, theo các công b g n đây nh t cho ấ ử ự ố t. ấ ẩ
ạ ẻ ủ
mang màu bám trên đó, t o thu n l ạ ấ ử ộ ậ ợ
ụ
ấ c ph : ng Tây ch ố ng D ng C a Enzyme Amylase Trong S n Xu t Bia ươ ặ Nguyên lý ho t đ ng c a enzyme là: chúng b gãy các m ch tinh b t trên m t ạ ộ gi y, kéo theo s làm long các phân t i cho ự quá trình tuy n n i kh m c ử ự ổ ể ủ Ứ ệ ả
ướ ộ ề ể ủ
ỗ ở ạ ạ ủ
ầ ơ ở ể ừ ạ ợ
ạ ạ ấ
ả ẽ ủ ầ ộ ờ
ư ậ ỉ ổ ạ ầ ộ
ể ả ắ ề ấ ế ẫ ả ẩ ớ
ạ ả
ể ử ụ ộ ấ ộ ự ệ ạ
ồ ị
ể ộ ươ ắ
ộ ng v cho bia, màu s c, đ c n phù h p cho ng ả ế ể ạ ầ ộ ồ ẩ ạ ổ ị ả ợ ư ẫ ộ
ư ề ặ ả ấ
ủ ế ẩ ấ
ấ ớ ệ ả ấ ở
ả Trong công ngh s n xu t bia truy n th ng, các n ủ ấ y u s d ng enzym amylase c a malt đ th y phân tinh b t trong malt, sau đó ủ ế ử ụ ọ ủ u hóa b i n m men Saccharomyces sp. C s khoa h c c a đ n giai đo n r ở ấ ạ ượ ế ạ vi c s d ng amylase c a malt tr ng thái h t ch , khi đ i m ch chuy n t ệ ử ụ c t ng h p và khi đó sang tr ng thái n y m m (malt), enzym amylase s đ ẽ ượ ổ ạ ng và v t ch t cho enzym này s th y phân tinh b t có trong h t t o ra năng l ậ ượ ộ ng hóa tinh b t trong h t nh enzym c a s t o thành m m. Nh v y vi c đ ủ ạ ự ạ ệ ườ ng enzym amylase v a đ đ phân h y chính nó. Khi đó h t ch t ng h p ra l ủ ừ ủ ể ượ ạ ợ ấ ng tinh b t có trong h t. Nh th c n r t nhi u m m đ i m ch đ s n xu t l ạ ạ ượ ư ế ầ ấ ụ bia qui mô l n, d n đ n chi phí cao cho s n xu t và s n ph m. Đ kh c ph c ả ở đi u này, trong quá trình lên men t o bia thì nhà s n xu t không s d ng hoàn ề ứ tòan 100% nguyên li u là malt đ i m ch mà có s pha tr n theo m t công th c nào đó đ thay th malt và còn b sung ngu n tinh b t cho quá tr nh lên men. Lý i do là m t ph n đ t o h ườ ầ ữ tiêu dùng và m t ph n là làm gi m giá thành cho s n ph m bia nh ng v n gi ế đ c đ c tr ng cho bia. Chính vì đi u này, các nhà s n xu t bia quan tâm đ n ượ vi c s d ng ch ph m enzym amylase cung c p cho quá trình th y phân tinh ệ ử ụ qui mô b t .Enzym này có ý nghĩa r t l n trong vi c làm bia, giúp s n xu t bia ộ công nghi p.ệ
ng D ng C a Enzyme Amylase Trong S n Xu t C n: ả ụ Ứ
ồ ể ả
ấ ồ ỗ ướ ử ụ i ta s d ng nguyên li u t ạ ụ ở ộ ử ụ
ở ướ
ặ ấ
ng hóa và giai đ an r ượ ừ ạ ọ ấ ồ u hóa. Giai đ an đ ọ ườ ắ ộ
ể ử ụ
ượ t s n xu t r i Vi
ế ử ụ u Sake t ừ ạ ấ ườ M , mãi đ n th k XIX khi Takamine ng ở ỹ ể ườ t Nam đã bi ế ỷ
ậ ư ấ ố
ậ
i M ti u.
ủ Đ s n xu t c n t c s d ng các ngu n nguyên li u tinh b t, m i n ệ ấ ồ ừ lo i nguyên li u khác nhau.Ví d , ệ ừ ộ b t M ng ệ ườ ỹ Brazin l ngô đ s n xu t c n, còn c khác s d ng i s d ng khoai mì, các n ử ụ ấ ồ ể ả ạ ử ụ g o ho c t m t g o. Quá trình s n xu t c n tr i qua hai giai đ an: giai đ an ọ ả ạ ả ọ ả đ i ta b t bu c ph i ng hóa, ng ườ ườ ộ ng pháp th y phân tinh b t s d ng enzym amylase (không th s d ng ph ủ ươ ử ụ i Nh t đã bi t s d ng enzym c a n m m c trong quá trình b ng acid). Ng ủ ườ ố ấ ậ ằ cách đây h n 1700 năm. Ng ng hóa đ s n xu t r i Trung đ ườ ơ ấ ượ ể ả ườ u trong s n xu t ng hóa r Qu c thì đã s d ng nhi u lo i n m m c đ đ ấ ố ố ả ề ử ụ g o r ấ ượ ừ ạ u t u cách đây 4000 năm. Còn ng ế ả ệ ượ ườ i cách đây hàng ngàn năm. Riêng ế t s d ng enzym này thay amylase Nh t đ a n m m c Aspergillus sang m i bi ế ử ụ ớ ầ ng pháp Micomalt ( m m c a malt đ s n xu t c n. Chính vì th m i có ph ế ớ ấ ồ ủ ươ Nh t mà u. Nh s du nh p k thu t này t m c) trong s n xu t c n và r ậ ừ ỹ ậ ờ ự ấ ồ ố ng malt kh ng l ng ồ ấ ượ ổ ố ượ ộ ượ ườ ả ể ả ả t ki m đ trong s n xu t r ỹ ế ả ệ ng D ng C a Enzyme Amylase Trong S n Xu t HFCS: ụ Ứ ượ c m t kh i l ủ ấ
ủ
ể
t. ả HFCS (High Fructose Corn Syrup) là m t nhóm b t kì c a siro b p mà tr i ắ c pha tr n ộ ượ ế qua quá trình enzyme đ làm tăng hàm l ượ v i siro b p s ch (100% glucose) đ t o thành d ng s n ph m c n thi ớ ấ ộ ng fructose và sau đó đ ả ắ ạ ể ạ ạ ẩ ầ
