BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH -------------------
NGUYỄN VIỆT TẤN
NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 9540104
HÀ NỘI - 10/2022
Công trình được hoàn thành tại:
VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh 2. PGS.TS Nguyễn Duy Lâm Phản biện 1: GS.TS. Hoàng Đình Hoà Phản biện 2: PGS.TS. Bùi Quang Thuật Phản biện 3: PGS.TS. Trần Văn Lộc Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp tại …………….……………………………………….. vào hồi giờ ngày tháng năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc Gia Việt Nam 2. Thư viện Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch 3. Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết
Cây chè được trồng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam và người Việt rất ưa chuộng thưởng thức chè. Hiện nay, Việt Nam chế biến và xuất khẩu chủ yếu là chè đen, trong khi ở trong nước người dân thích dùng chè xanh hơn. Chè chứa nhiều hợp chất hóa học chẳng hạn catechin, alkaloid, polysaccharid, axit amin, vitamin, khoáng, tinh dầu. Trong số đó, axit amin có vai trò đặc biệt quan trọng vì không những tạo ra hương vị của nước chè mà còn có rất nhiều lợi ích cho sức khỏe. Gama-Aminobutyric Axid (GABA) chính là một axit amin tự do 4 carbon được tìm thấy đáng kể trong lá chè tươi và tất cả các sản phẩm chè. GABA là hoạt chất sinh học được tạo ra bởi quá trình decarboxy hóa axít L-glutamic được xúc tác bởi enzym glutamate decarboxylase (GAD). GABA được phát hiện có vai trò và chức năng sinh lý trong điều tiết các chức năng tim mạch và tuần hoàn mạch máu não, ức chế dẫn truyền thần kinh, tăng cường trí nhớ, làm giảm các rối loạn tâm trạng và chống mất ngủ. Tất cả các loại chè đều có chứa GABA với hàm lượng khác nhau và thường ở mức cao hơn một số nông sản thực phẩm khác, nhưng GABA cao hơn nhiều ở sản phẩm gọi là chè GABA hay chè Gabaron.
Nhật Bản sản xuất chè giàu GABA bằng một kỹ thuật đặc biệt là lên men lá chè tươi trong khí nitơ. Gần đây, các nhà khoa học ở Trung Quốc đã phát triển kỹ thuật tạo chè GABA bằng phương pháp lên men vi sinh vật. Nếu như các chủng nấm mốc Aspergillus là chủ đạo trong lên men sản xuất chè lên men Phổ Nhĩ thì các nhà khoa học Trung Quốc cho biết các chủng vi khuẩn Lactobacillus lên men lactic có khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp GABA trên chè.
Tại Việt Nam, trong thời gian qua đã có một số nghiên cứu và sản xuất thực phẩm giàu GABA như hạt nảy mầm, thực phẩm lên men giàu GABA. Tuy nhiên, các nghiên cứu và sản xuất chè lên men và chè giàu GABA còn rất hạn chế, nhất là nghiên cứu về chè giàu GABA.
1
Nhận thức rõ về vai trò của hợp chất GABA đối với sức khỏe con người, nghiên cứu sinh tiến hành nghiên cứu đề tài luận án tiến sĩ “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu Gama-Amino-Butyric Axít bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định và thiết lập được một số thông số của quá trình cải tiến hệ thống chế biến chè đen Việt Nam thành chè đen giàu GABA, bao gồm các chủng giống vi khuẩn Lactobacillus thúc đẩy sinh tổng hợp GABA, các giống chè thích hợp, xác định và tối ưu hóa các thông số về qui trình lên men yếm khí có và không có bổ sung vi khuẩn, sản xuất thử thành công ở quy mô thực nghiệm tạo chè đen giàu GABA có chất lượng cảm quan tốt và thương mại hóa được. 3. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho quá trình lên men yếm khí lá chè; nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hóa, tối ưu hóa quá trình nuôi cấy và định danh chủng vi khuẩn lựa chọn được. - Nghiên cứu lựa chọn giống chè Việt Nam phù hợp làm nguyên liệu cho sản xuất chè giàu GABA. - Khảo sát khả năng tích lũy GABA trong chè đen khi bổ sung công đoạn lên men yếm khí (không bổ sung vi sinh vật). - Khảo sát khả năng tích lũy GABA trong chè đen khi bổ sung công đoạn lên men yếm khí có bổ sung vi sinh vật lên men. - Phân tích, so sánh, đánh giá chất lượng toàn diện sản phẩm chè giàu GABA. - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất thực nghiệm
chè giàu GABA và sản xuất thử nghiệm quy mô pilot. - Nghiên cứu bảo quản sản phẩm chè giàu GABA. 4. Những đóng góp mới của luận án
a) Đề xuất đưa thêm công đoạn lên men yếm khí trong quy trình sản xuất chè đen truyền thống tạo ra các sản phẩm chè đen có hàm lượng GABA cao.
2
b) Lựa chọn và xác định được các thông số quan trọng để xây dựng quy trình sản xuất chè đen có GABA cao và chất lượng cảm quan tốt. Cụ thể: (1) Chọn được 2 chủng vi khuẩn Lactobcillus là L. casei VTCC-B-411 và L. plantarum VTCC-B-439 có khả năng sinh tổng hợp GABA cao đưa vào quy trình sản xuất chè đen; (2) Lựa chọn và đề xuất hai giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên làm nguyên liệu để sản xuất chè đen vừa cho GABA cao vừa có giá trị cảm quan tốt; (3) Từ khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa đa yếu tố, đã xác định được
các thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm khí + vi khuẩn lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này, hàm lượng GABA của sản phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở mức hài hòa nhất. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học:
a) Đã cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai trò của lên men yếm khí và vi sinh vật chi Lactobacillus trong sự tăng cường hàm lượng GABA trong quá trình chế biến chè đen của Việt Nam. Những dẫn liệu này là cơ sở khoa học cho việc đề xuất bổ sung hai công đoạn lên mên yếm khí và lên men yếm khí có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình chế biến chè, tạo chè đen giàu GABA thành công.
b) Đã cung cấp những thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm khí + vi khuẩn lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này, hàm lượng GABA của sản phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở mức hài hòa nhất có thể. Những thông số này là những tài liệu khoa học quí phục vụ giảng dạy và nghiên cứu quy trình sản xuất chè đen giàu GABA có chất lượng cảm quan tốt. Ý nghĩa thực tiễn:
a) Đã xây dựng được quy trình công nghệ có tính khả thi cao, được hoàn thiện và kiểm định quy mô pilot để sản xuất chè giàu GABA bằng công nghệ lên men nhằm nâng cao giá trị gia tăng và đa dạng hóa sản phẩm từ một số giống chè Việt Nam; b) Đã đưa ra được một số sản phẩm chè đen giàu GABA thích hợp như là một dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe có thể thương mại hoá;
c) Đã tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot và bước đầu ứng dụng thực tiễn có kết quả quy trình công nghệ này tại Công ty CP Chè Sông Lô và Công ty CP Chè Tân Trào tại tỉnh Tuyên Quang. 6. Cấu trúc của luận án
3
Luận án gồm 136 trang (không kể tài liệu tham khảo và phụ lục), 42 bảng số liệu, 15 hình. Kết cấu của luận án gồm 8 phần chính: Mở đầu (6 trang), tổng quan tài liệu (38 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu
(13 trang), kết quả và thảo luận (77 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang), danh mục tài liệu tham khảo (150 tài liệu), và phần phụ lục (4 phụ lục).
***** Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Những kết luận rút ra từ tổng quan như sau: a) Chè có thành phần hóa học đa dạng, chứa nhiều hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe, trong đó có GABA. Việt Nam có tiềm năng trồng, chế biến và xuất khẩu nhiều sản phẩm chè nhưng hiện nay chế biến chủ yếu là chè xanh và chè đen. Các nghiên cứu, sản xuất sản phẩm chè lên men rất ít; b) Hợp chất GABA có giá trị tốt nhiều mặt cho sức khỏe. GABA có thể được tổng hợp hóa học nhưng vì nhiều hạn chế, kể cả tính an toàn, do đó việc sản xuất chủ yếu dựa vào một số quá trình sinh tổng hợp ở vi sinh vật và thực vật; c) Sản xuất GABA thương mại quy mô công nghiệp dựa vào lên men vi sinh vật. Vi khuẩn lactic là vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi nhất trong định hướng tạo GABA cho các sản phẩm thực phẩm; d) Có một số phương pháp để thu nhận chè giàu GABA nhưng phổ biến, hiệu quả, an toàn, kinh tế nhất là phương pháp lên men nhờ vi sinh vật và lên men yếm khí. Trong phương pháp lên men vi sinh vật để sản xuất GABA, việc chọn vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng và vi khuẩn lên men lactic cũng được sử dụng nhiều hơn cả; đ) Để lên men yếm khí, việc chọn chân không có những ưu thế nhất định so với sử dụng các khí ni tơ hay CO2; e) Mặc dù có một số kết quả nghiên cứu và sản phẩm chè giàu GABA từ công nghệ lên men vi sinh vật hoặc lên men yếm khí, nhưng những nghiên cứu phối hợp cả hai phương pháp công nghệ là rất ít; g) Tại Việt Nam đã có những quan tâm đáng kể về sản xuất thực phẩm giàu GABA, nhưng các nghiên cứu sản xuất chè lên men có rất ít, còn nghiên cứu sản xuất chè giàu GABA gần như chưa có.
***** Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
4
Nguyên liệu búp chè tươi được thu hái từ 4 giống chè Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, và Trung Du được trồng tại Viện
Khoa học Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc. Nguồn vi sinh vật từ bộ chủng vi khuẩn axit lactic do Bảo tàng Giống chuẩn Việt Nam (VTCC) thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học (IMBT), Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp. 2.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh vật
sodium dodecyl sulphate
Các hóa chất, kit, sử dụng trong quá trình nghiên cứu, phân tích, định lượng được sản xuất từ các hãng nước ngoài nổi tiếng, tin cậy và đảm bảo độ tinh khiết như Merck, Sigma, Wako. Các hóa chất làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật như Glucose, sucrose, peptone, cao nấm men, NaCl, MgSO4, MnSO4, Tween 80, Na2HPO4, K2HPO4, CH3COONa, C6H11NO7, agar của Merck, Trung Quốc. Hóa chất dùng để tách chiết DNA, điện di DNA, HPLC của hãng Sigma, Merck như Tris base, ethylene diamine tetra acetic axít (EDTA), CH3COOK, β- (SDS), ethanol, mercaptoethanol, chloroform, isoamyalcohol, agarose, ethydium bromide (EtBr). Hóa chất khác như chất mang là dextrin, sữa gầy và lactose của Sigma, chất chuẩn γ-aminobutyric axít của Sigma, hóa chất để phân tích GABA như methanol, ethanol, axit boric, acetone của Merck. Tám (8) loại môi trường ký hiệu từ MT1 đến MT8 có thành phần khác nhau đã được sử dụng. Công thức chuẩn bị các môi trường này nêu chi tiết tại mục 2.1.2.2 của luận án. 2.1.3. Thiết bị phân tích và thiết bị công nghệ
5
Các thiết bị máy móc và dụng cụ được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu bao gồm: Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ), cân điện tử AL-300 (Osi, Mỹ), nồi hấp khử trùng Hiclave HV-85 (Hirayama, Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh), tủ cấy (Nuaire, Mỹ), máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức), kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức), tủ nuôi vi sinh vật Sanyo (Nhật Bản), nồi điều nhiệt Labtech (Hàn Quốc), máy đo pH Thermo - Scientific (Mỹ), máy Votex (Đức), máy sấy phun Eyela (Nhật Bản), máy vò 6 CR-55 (Trung Quốc), quạt héo KM750 (Nhật Bản), máy sấy thùng quay 6 CCP-100 (Trung Quốc), máy đóng gói chân không LD-600 (Trung Quốc). 2.2. Kỹ thuật công nghệ áp dụng để nghiên cứu chế biến chè 2.2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ để nghiên cứu lên men chè Trình tự sản xuất chè GABA sẽ áp dụng theo quy trình sản xuất
chè đen thông thường, điểm khác biệt là theo quá trình lên men, đề tài luận án thực hiện 2 phương án sản xuất chè đen GABA có và không bổ sung vi sinh vật. Phương án 1: Lên men chè yếm khí ngay sau khi làm héo theo sơ đồ: Làm héo Xử lý yếm khí (12 h) Vò Lên men hiếu khí (90 ph) Sấy khô Chè đen GABA. Phương án 2: Lên men chè yếm khí sau khi vò theo sơ đồ: Làm héo Vò Lên men yếm khí + lên men hiếu khí Sấy khô Chè đen GABA. Điểm khác nhau cơ bản giữa 2 phương án là ở công đoạn lên men. 2.2.2. Kỹ thuật làm héo, vò và sấy chè
Các kỹ thuật làm héo, vò và sấy chè được tham khảo theo tài liệu của Đỗ Văn Chương (2009) với một số cải tiến nhất định. Dùng máy vò đơn (Trung Quốc) để vò chè, dung tích của máy vò 50 kg chè /mẻ, vò mỗi lần với thời gian vò 30 ph/mẻ, độ dập tế bào 70 - 80%. Chè đen thành phẩm được đánh giá chất lượng bằng phương pháp cảm quan theo tiêu chuẩn ngành TCVN 3218 - 2012. 2.2.3. Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí
Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí được tiến hành tham khảo một số tài liệu nước ngoài có cải tiến cho phù hợp điều kiện thực tế. Chè được đựng trong túi chất dẻo, đưa vào máy hút chân không, được hàn kín bằng nhiệt hoặc có thể làm kín miệng túi bằng kẹp có cấu tạo thích hợp cho dễ mở để lấy chè ra sau khi lên men, túi chất dẻo có thể được dùng nhiều lần. 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1. Lựa chọn chủng giống vi sinh vật và chè thích hợp
Gồm có các thí nghiệm: 1) Lựa chọn chủng giống vi khuẩn lactic; 2) Xác định khả năng lên men tạo GABA trên chè; 3) Xác định các thông số độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn; 4) Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. 2.3.2. Xác định tác dụng của lên men yếm khí
6
Gồm có các thí nghiệm: 1) Khả năng tích lũy GABA khi lên men yếm khí; 2) Xác định các yếu tố ảnh hưởng lên men yếm khí; 3) Tối ưu hóa lên men yếm khí; 4) So sánh chất lượng của 2 sản phẩm chè 2.3.3. Xác định tác dụng của lên men yếm khí kết hợp lên men bằng lactic
Gồm có các thí nghiệm: 1) Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa công nghệ của các yếu tố ảnh hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic; 2) Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí sử dụng chế phẩm vi khuẩn; 3) So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm từ 2 phương án lên men yếm khí không và có sử dụng chế phẩm vi khuẩn; 4) Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí chè đen bằng phương pháp thang điểm có sử dụng hệ số quan trọng của các chỉ tiêu chất lượng. 2.3.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất quy mô pilot
Gồm có các thí nghiệm: 1) Sản xuất chè đen ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ; 2) Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất; 3) Áp dụng quy trình đã hoàn thiện để sản xuất quy mô pilot; 4) Bảo quản chè đen giàu GABA. 2.4. Phương pháp phân tích 2.4.1. Phương pháp phân tích hàm lượng GABA
Mức độ GABA được xác định định tính bởi TLC theo phương pháp của Choi et al. với một tấm TLC bằng nhôm (Sigma-Aldrich Co., Germany). Phương pháp định lượng GABA bằng quang phổ,theo đó, hàm lượng GABA được xác định theo Watchararparpaiboon et al. Phân tích GABA trong chè và các sản phẩm lên men chè bằng HPLC được tiến hành theo phương pháp của Hayat et al. với một vài cải tiến nhỏ. Việc xác định GABA đã được thực hiện trên máy Agilent HPLC 1100 (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). HPLC được trang bị cột Supelcosil LC-DABS (4,6 × 150 mm, 3 μm) (Supelco, Bellefonte, PA) và detector diode array (ở bước sóng 465 nm). Pha động được tạo thành từ đệm axetat 25 mM : axetonitril theo tỷ lệ 65:35. Hệ thống đã được vận hành ở 55°C với tốc độ dòng 0,5 ml/ph. 2.4.2. Phương pháp xác định enzym glutamate decarboxylase
7
Theo phương pháp của Yu et al. dựa trên sự thay đổi màu sắc của xanh bromocresol do sự gia tăng độ pH khi proton bị tiêu thụ trong phản ứng có sự xúc tác của enzym. Màu xanh bromocresol được chọn làm chất chỉ thị vì nó có pKa tương tự với dung dịch đệm axetat được sử dụng. Sự thay đổi độ hấp thụ tương ứng ở bước sóng 620 nm được ghi lại bằng đầu đọc microplate khi phản ứng xảy ra. 2.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng chè
- Xác định độ ẩm của chè bằng sấy khô đến khối lượng không đổi - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo ISO 4833-1:2013 - Xác định tổng số E. coli theo TCVN 7924-2:2008 - Xác định tổng số bào tử nấm men nấm mốc theo TCVN 8275- 2:2010
- Xác định hàm lượng polyphenol theo TCVN 9745-1:2013 - Xác định hàm lượng chất xơ thô theo TCVN 5103 - 1990 - Hàm lượng chất hòa tan: TCVN 5610:2007 - Hàm lượng tro tổng số: TCVN 5611:2007 - Phân tích thành phần và hàm lượng axit amin bằng HPLC - Đánh giá chất lượng cảm quan của chè theo TCVN 3218 : 2012 2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, các số liệu phân tích là trung bình cộng của 3 lần lặp lại (n = 3) được xử lý bằng phần mềm Excel 2010. Sự khác nhau giữa các giá trị trung bình được phân tích theo phân tích phương sai một yếu tố ANOVA ở mức ý nghĩa α = 5% bằng phần mềm Minitab 16. Phương pháp tối ưu hoá quá trình 1 mục tiêu, đa yếu tố được thực hiện theo phương pháp Box-Willson; Tối ưu hoá quá trình đa mục tiêu, đa yếu tố được sử dụng theo phương pháp hàm mong đợi; Bài toán đa mục tiêu đa yếu tố thực hiện theo phương pháp thang điểm hoặc xây dựng Hàm-Phạt. ***** Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI KHUẨN LACTIC VÀ NGUYÊN LIỆU CHÈ THÍCH HỢP CHO SẢN XUẤT CHÈ GIÀU GABA BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN 3.1.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym glutamate decarboxylase cao
8
Công việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym glutamate decarboxylase cao để sử dụng trong quá trình lên men chè được tiến hành từ 263 chủng vi khuẩn lactic lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC). Kết quả sàng lọc được nêu trong Bảng 3.1. Từ bảng thấy sau khi thử nghiệm khả năng sinh enzym glutamate decarboxylase của các chủng vi khuẩn lactic, có 4
chủng vi khuẩn là VTCC-B-439, VTCC-B-411, 66 và 67 cho kết quả sinh enzym glutamate decarboxylase và có khả năng sinh trưởng tốt (OD600 > 2,4) sau cả 4 lần thử nghiệm. Bốn chủng vi khuẩn này được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
TT
Ký hiệu chủng
OD600
OD600
OD600
OD600
1 VTCC-B-439 2,688 2 VTCC-B-411 2,420 2,564 3 2,442 4
66 67
Kết quả + + + +
Kết quả 2,591 + 2,668 + 2,661 + 2,648 +
Kết quả 2,591 + 2,668 + 2,661 + 2,448 +
Kết quả + + + +
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym glutamatedecarboxylase được sàng lọc sơ bộ
2,883 2,603 2,768 2,571 3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và phân loại 4 chủng vi khuẩn lactic
Khuẩn lạc của các chủng VTCCB439, VTCCB411, 66 và 67 được quan sát sau 48 h nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS. Hình thái tế bào sau khi nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 h được quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X. Cả 4 vi khuẩn đều là Gram (+). Chủng VTCCB439 là tế bào dạng que ngắn hoặc que dài, đôi khi hơi cong, xếp thành cặp hoặc chuỗi, kích thước (0,61-0,72) x (0,87-1,49) µm. Khuẩn lạc chủng VTCCB411 có dạng tròn, lồi, bóng, mép hơi sần trong, màu trắng sữa, kích thước 0,49-0,97 mm; tế bào có dạng que thường kết đôi hoặc chuỗi, kích thước (0,39- 0.63) x (1,92-3,99) µm. Khuẩn lạc chủng 66 có dạng tròn, lồi, bóng, mép hơi lan, màu trắng đục, kích 0,76-1,39 mm; tế bào có dạng que thường kết đôi hoặc chuỗi, kích thước (0,55-0,83) x (1,44-2,31) µm. Hình thái khuẩn lạc chủng 67 có dạng tròn, lồi, bóng, mép răng cưa hơi lan, màu trắng đục, kích thước 0,68-1,07 mm; tế bào có dạng que thường kết đôi hoặc chuỗi, kích thước (0,52-0.,3) x (1,62-2,41) µm.
9
Kết quả so sánh trình tự cho thấy chủng 66 và 67 có quan hệ gần gũi nhất với loài L.brevis M58810 với độ tương đồng đoạn rDNA 16S là 99,9%. Chủng VTCC-B-439 có quan hệ gần gũi nhất với loài L.plantarum D79210 với độ tương đồng là 99,4%. Chủng VTCC-B- 411có độ tương đồng đoạn ADNr 16S là 100% vớiLactobacillus casei
M177140. Như vậy, dựa vào hình thái và trình tự rDNA 16S, các chủng 66 và 67 được định tên là Lactobacillus brevis; chủng VTCC-B-439 là Lactobacillus plantarum; chủng VTCC-B-411 được phân loại vào loài Lactobacillus casei. Đây là các chủng vi khuẩn lactic an toàn và thường được sử dụng trong thực phẩm. 3.1.3. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè
Từ kết quả Bảng 3.2 cho thấy, cả 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng tạo GABA với hàm lượng khác nhau trong cả 3 ngày thử nghiệm lên men. Chủng VTCC-B-439 và VTCC-B-411 có khả năng tạo GABA trên chè cao nhất sau 2 ngày, đạt trên 0,8 mg/ml. Chủng 66 và chủng 67 có khả năng tạo GABA trên chè thấp hơn, chỉ khoảng 0,3 mg/ml. Cả 4 chủng đều tạo GABA trên chè cao sau 2 ngày lên men và sau đó hàm lượng GABA không tăng nữa. Như vậy, sau kết quả thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn lactic, 2 chủng VTCC-B-439 và chủng VTCC-B-411 có khả năng tạo GABA cao nhất được lựa chọn. Bảng 3.2. Khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn
L. plantarum (VTCC-B-439) L. casei (VTCC-B-411) L. brevis (66) L. (67)
Hàm lượng GABA (mg/ml) 3 ngày 2 ngày 1 ngày 0,897 0,888 0,421 0,815 0,813 0,359 0,289 0,301 0,233 0,331 0,323 0,267 3.1.4. Xác định chế độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic để lên men chè giàu GABA
(a) Lựa chọn môi trường lên men phù hợp: Kết quả cho thấy môi trường MT2 (glucoza 20g/l, K2HPO4 2g/l, CH3COONa 5g/l, diamonium hydrogen citrat 2g/l, MgSO4 0,2g/l, MnSO4 0,04g/l, Tween 80 1g/l, cao nấm men 50,1g/l) là tốt nhất. Ở môi trường này mật độ vi khuẩn đạt cực đại OD600 = 3,1-3,2, hàm lượng GABA trong chè lên men đạt xấp xỉ 0,8 mg/ml nước chiết chè.
10
(b) Lựa chọn nhiệt độ, pH và tỷ lệ giống khởi động phù hợp: Kết quả thực nghiệm chứng tỏ rằng: Nhiệt độ lên men phù hợp khoảng 30- 40oC; pH thích hợp của trong khoảng pH 6-7; tỷ lệ giống khởi động 5% (OD600 = 3,1).
(c) Lựa chọn thời gian lên men phù hợp: Kết quả thực nghiệm cho
thấy thời gian lên men vi khuẩn phù hợp là khoảng 40-56 giờ. 3.1.5. Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic
Chỉ tiêu cần tối ưu: Mật độ OD600 -> cực đại. Các yếu tố ảnh hưởng: Thời gian nuôi cấy: x1 [40÷56 giờ]; Nhiệt độ nuôi cấy: x2 [30oC÷40oC]; pH môi trường: x3 [5÷8]. Mô hình toán học mô tả quá trình có dạng: y = b0 + b1𝑥̃1 + b2𝑥̃2 + b3𝑥̃3 (1), trong đó: y là OD600 của canh trường vi khuẩn; b0: số hạng tự do; bi (i = 1÷3): hệ số của phương trình hồi quy; xi (i = 1÷3): biến số mã của các yếu tố ảnh hưởng. Ma trận thực nghiệm được lập theo phương pháp trực giao cấp 1. Số thí nghiệm cần tiến hành là 8. Kết quả thực nghiệm được biểu diễn ở Bảng 3.6. Từ bảng số liệu 3.6 đã tiến hành các bước tiếp theo:
- Kiểm tra độ chính xác của bảng số liệu: Chuẩn Cocren tra bảng: 0,56; Chuẩn Cocren tính toán: 0,0003. Nhận thấy rằng GB > GTT, từ đó kết luận số liệu ở Bảng 3.6 được đo cùng một độ chính xác và chấp nhận được.
- Tính các hệ số: Theo phương pháp đã dẫn, tính được: B0 = 2,38; b1 = 0,12; b2 = -0,31; b3 = 0,43
x1
TT 1 2 3 4 5 6 7 8
x3 x2 +(56) +(40) +(8) -(40) +(40) +(8) -(30) +(8) +(56) -(30) +(8) -(40) -(5) +(56) +(40) -(5) -(40) +(40) -(5) -(30) +(56) -(5) -(30) -(40)
y1 2,42 2,62 3,24 2,92 2,06 1,62 2,20 1,83
y3 2,45 2,65 3,27 2,96 2,09 1,66 2,26 1,86
𝑦̅ 2,43 2,63 3,25 2,94 2,07 1,64 2,23 1,84
2 𝑆𝑗 0,0002 0,0004 0,0003 0,0004 0,0003 0,0004 0,0005 0,0003
y2 2,44 2,61 3,24 2,92 2,06 1,62 2,20 1,83 2 = 0,0029
∑𝑆𝑗
11
Vậy mô hình có dạng: y = 2,38 + 0,12𝑥̃1 - 0,31𝑥̃2 + 0,43𝑥̃3 (2) - Các khâu kiểm tra khác: + Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số: Sử dụng chuẩn Student thấy rằng tất cả các hệ số của phương trình (2) đều có nghĩa; + Kiểm tra sự thích ứng của mô hình: Sử dụng chuẩn Fisher thấy rằng Fbảng > Ftính toán. Vì vậy phương trình (2) hoàn toàn thích ứng với Bảng 3.6. - Tiến hành tối ưu hóa quá trình: Quá trình tối ưu hóa bằng thực nghiệm được thực hiện theo phương pháp Box-willson. Bảng 3.6. Kết quả thực nghiệm theo ma trận
Lược đồ tối ưu hóa theo phương pháp này bao gồm các bước sau: + Chọn bước nhảy cho các biến khi dịch chuyển giữa 2 thí nghiệm kề nhau. x1 = 1 giờ; x3 = 0,3
i (i = 1÷3),
x2 = 10C ; + Tiến hành thực nghiệm theo ma trận như sau: - Thí nghiệm đầu tiên, các biến đặt ở mức cơ bản xi = x0 cụ thể: x1 = 48 giờ; x2 = 350C; x3 = 6,8
𝑘+1 = 𝑥𝑖 𝑥𝑖
(i= 1 - 3)
- Các thí nghiệm tiếp theo: Các yếu tố nhận các giá trị: 𝑘 + ∆𝑥𝑖 Kết quả thực nghiệm được thể hiện trên Bảng 3.7. Từ bảng số liệu này thấy rằng OD600 max đạt được ở thí nghiệm thứ 4. Ứng với thí nghiệm này ta nhận được giá trị tối ưu của các biến: x1 tối ưu = 51 giờ; x2 tối ưu =320C và pH tối ưu = 7,4; OD600max = 3,29. Bảng 3.7. Lược đồ tối ưu hóa thực nghiệm
TT 1 2 3 4 5 6 7
x1 48 49 50 51 52 53 54
x2 35 34 33 32 31 30 29
x3 6,5 6,8 7,1 7,4 7,7 8,0 8,3
y (OD600) 2,48 2,66 2,89 3,29 * 2,98 2,78 2,56
3.1.6. Phân tích các chỉ số chất lượng một số giống chè của Việt Nam
Đã tiến hành phân tích các chỉ số độ ẩm, hàm lượng chất hòa tan, hàm lượng tamin, hàm lượng tổng axit amin và hàm lượng axit amin thành phần của 4 giống chè phổ biến ở Việt Nam là Keo Am Tích, Phú Vân Tiên, Kim Tuyên và Trung Du. Kết quả thu được, trình bày ở các Bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và 3.12. Từ số liệu ở các bảng trên, ta thấy giống chè Phúc Vân Tiên là phù hợp nhất cho quá trình sản xuất chè đen giàu GABA.
Giống
Phúc Vân Tiên
77,8 77,0 77,0 78,0
78,6 78,0 77,8 79,0
76,9 76,6 76,0 77,0
77,9 77,0 77,0 78,0
12
Bảng 3.8. Độ ẩm nguyên liệu của giống chè theo thời gian (%) TT Tháng 3 Tháng 6 Tháng 9 Trung bình 1 Keo Am Tích 2 3 Kim Tuyên Trung Du 4
Bảng 3.9. Hàm lượng chất hòa tan trong nguyên liệu của các giống chè theo thời gian trong năm (% chất khô)
Giống
Tháng 3 Tháng 6 Tháng 9 Trung bình
Phúc Vân Tiên
41,98 40,61 40,70 43,15
43,40 41,65 41,38 43,97
42,15 40,47 41,56 43,40
40,39 39,71 39,16 42,08
TT 1 Keo Am Tích 2 3 Kim Tuyên Trung Du 4 Bảng 3.10. Hàm lượng tanin trong nguyên liệu của các giống chè theo thời gian trong năm (% chất khô) Giống
Tháng 3 Tháng 6 Tháng 9 Trung bình
Phúc Vân Tiên
TT 1 Keo Am Tích 2 3 Kim Tuyên Trung Du 4
27,47 26,91 26,30 31,02
28,97 28,86 27,12 31,84
28,25 28,07 27,48 31,57
28,23 27,95 26,97 31,48
Bảng 3.11. Hàm lượng tổng axit amin trong nguyên liệu của các giống chè theo thời gian trong năm (%)
Giống
Tháng 3 Tháng 6 Tháng 9 Trung bình
Phúc Vân Tiên
2,65 2,72 2,54 1,78
2,30 2,45 2,42 2,19
2,48 2,90 2,78 2,06
2,47 2,69 2,58 2,01
Alanin Arginin Aspatic Glutamic Glycin Histidin Izolơxin Lơxin Lysin
TT 1 Keo Am Tích 2 3 Kim Tuyên 4 Trung Du Bảng 3.12. Hàm lượng các axit amin thành phần trong nguyên liệu thu hoạch vào tháng 6 của các giống chè (% chất khô) TT Axit amin Keo Am Tích Phúc Vân Tiên Kim Tuyên Trung Du 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Methionin 11 Phenylalanin 12 13 14 15 16
0,151 0,147 0,157 0,282 0,143 0,108 0,148 0,177 0,149 0,115 0,147 0,196 0,123 0,143 0,133 0,158 2,477
0,127 0,140 0,201 0,524 0,134 0,120 0,146 0,186 0,152 0,111 0,171 0,189 0,143 0,135 0,152 0,151 2,782
0,102 0,098 0,115 0,203 0,134 0,098 0,137 0,168 0,129 0,104 0,126 0,163 0,108 0,121 0,114 0,137 2,057
0,157 0,161 0,212 0,556 0,157 0,111 0,155 0,193 0,167 0,122 0,160 0,179 0,122 0,147 0,140 0,160 2,899
Prolin Serin Threonin Tyrosin Valin Tổng
13
Mẫu 1 (Đối chứng) Mẫu 2 (Thí nghiệm)
TT Giống chè
GABA Hương Vị GABA Hương Vị
3.2. TÁC DỤNG CỦA LÊN MEN YẾM KHÍ TỚI HIỆU QUẢ TÍCH LŨY GABA VÀ CHẤT LƯỢNG CHÈ ĐEN GIÀU GABA 3.2.1. Thăm dò khả năng tích luỹ GABA do quá trình lên men yếm khí Thí nghiệm có 2 mẫu, mẫu 1 là chè đen được chế biến theo quy trình truyền thống: Nguyên liệu làm héo vò lên men hiếu khí sấy khô chè đen thành phẩm. Mẫu 2 được bổ sung lên men yếm khí: Nguyên liệu làm héo vò lên men yếm khí lên men hiếu khí sấy khô chè đen thành phẩm. Điều kiện lên men của mẫu 1 (đối chứng): Lên men hiếu khí ở 35oC, thời gian 90 ph, của mẫu 2 (thí nghiệm): Lên men yếm khi ở 35oC, thời gian 90 ph. Sử dụng cả 4 giống chè: Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, Trung Du. Các chỉ số phân tích gồm: Hàm lượng GABA trong thành phẩm, đánh giá cảm quan về hương, đánh giá cảm quan về vị, chỉ số phụ màu sắc nước chè. Kết quả thực nghiệm được thể trong Bảng 3.16. Qua số liệu ở bảng thấy rằng chất lượng cảm quan về hương và vị ở mẫu đối chứng tốt nhất, tiếp theo cùng hạng là giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên ở mẫu thí nghiệm. Hàm lượng GABA ở mẫu thí nghiệm cao nhất thuộc về giống chè Phúc Vân Tiên. Căn cứ vào mục tiêu của luận án là lựa chọn phương án lên men để có hàm lượng GABA trong chè là cao nhất, nên giống chè Phúc Vân Tiên sẽ được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Bảng 3.16. Kết quả phân tích các chỉ số của bán thành phẩm chè đen lên men theo 2 phương án H.lượng GABA trong nguyên liệu (mg/100g) 60 72 73 66
135 4,25 4,25 175 175 5,00 5,00 215 173 4,75 4,75 195 140 4,50 4,75 170
1 Keo Am Tích 2 Phúc Vân Tiên 3 Kim Tuyên Trung Du 4
4,0 4,0 4,5 4,25 4,5 4,25 4,0 4,20 3.2.2. Các yếu tố ành hưởng đến chất lượng quá trình lên men yếm khí Kết quả ảnh hưởng của 2 yếu tố nhiệt độ và thời gian lên men yếm khí đến hàm lượng GABA tích luỹ trong chè cho thấy nhiệt độ dao động từ 27oC đến 31oC hàm lượng GABA đạt từ 165 mg/100g đến 179 mg/100g chất khô. Thời gian lên men tạo hàm lượng GABA cao nhất (từ 170 mg/100g đến 177 mg/100g) là 9 h đến 13 h. 3.2.3. Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí
14
Các chỉ tiêu cần tối ưu: Hàm lượng GABA trong chè đen Y1 cao nhất; - điểm cảm quan về mùi của chè đen Y2 cao nhất; điểm
cảm quan về vị của chè đen Y3 cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men yếm khí: Nhiệt độ lên men x1 [27÷31oC]; thời gian lên men yếm khí x2 [9÷13 giờ].
Đây là bài toán tối ưu hóa một quá trình có nhiều chỉ tiêu cần tối ưu với yếu tố ảnh hưởng. Để giải bài toán tối ưu hóa dạng này, ta áp dụng phương pháp hàm mong đợi [11]. Theo phương pháp đã dẫn, ma trận thực nghiệm để giải bài toán này bao gồm 32 thí nghiệm. Trong đó: 3 là số mức mà mỗi yếu tố sẽ tiến hành thực nghiệm (mức dưới, mức giữa và mức trên), 2 là số yếu tố ảnh hưởng. Số thí nghiệm cần tiến hành ở bài toán này là 9.
Kết quả thực nghiệm và tính toán giá trị của các hàm mong đợi được thể hiện ở 2 bảng số liệu 3.19 và 3.20. Từ số liệu ở bảng 3.19, ta tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp hàm mong đợi [11].
Hàm mong đợi của các mục tiêu có dạng d = exp [-exp (-y’)]. Ở đây y’là giá trị của chỉ tiêu tối ưu thu được bằng thực nghiệm ở từng thí nghiệm trong ma trận thực nghiệm. bo, b1 là 2 hệ số cần phải tính toán. Việc tính toán bo, b1 và hàm mục tiêu d, thực hiện theo phương pháp đã dẫn, thu được kết quả nêu ở bảng 3.19 (chọn dmax = 0,8 và dmin = 0,2).
Kết quả tính toán ở bảng 3.20, thấy rằng tại thí nghiệm số 4, kỳ vọng của 3 mục tiêu đạt cao nhất. Điều kiện thí nghiệm ở mẫu số 4 chính là lân cận của vùng tối ưu. Khi giá trị các biến lấy ở vùng lân cận đó thì tổng kỳ vọng của đồng thời của 3 mục tiêu đạt trị số lớn nhất.
𝑦1 179 183 189 202 200 192 175 180 198
TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 𝑚𝑎𝑥
𝑚𝑖𝑛
𝑚𝑎𝑥
𝑦3 4,50 4,50 4,25 4,75 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 = 4,25;
Bảng 3.19. Hàm lượng GABA và các chỉ số cảm quan của các mẫu thí nghiệm theo ma trận
𝑦2 4,75 4,75 4,5 4,5 4,5 4,25 4,75 4,75 4,25 = 4,75; 𝑦2
𝑚𝑎𝑥
𝑚𝑖𝑛
= 4,25
𝑥̃1,oC 𝑥̃2,h 𝑥̅2(9) 𝑥̅1(27) 𝑜(11) 𝑥̅1(27) 𝑥2 +(13) 𝑥̅1(27) 𝑥2 𝑜(29) 𝑥̅2(9) 𝑥1 𝑜(11) 𝑜(29) 𝑥2 𝑥1 𝑜(29) +(13) 𝑥2 𝑥1 +(31) 𝑥̅2(9) 𝑥1 𝑜(11) +(31) 𝑥2 𝑥1 +(13) +(31) 𝑥2 𝑥1 𝑚𝑖𝑛 = 202 mg/100g; 𝑦1 𝑦3
= 179 mg/100g; 𝑦2 = 4,75; 𝑦3
15
𝑦1
TT
d1d2d3 7,14 7,28 4,25 7,98 6,24 4,31 6,99 7,17 4,43
d1 15,66 15,98 15,46 15,50 15,34 15,70 15,34 15,74 15,18
d3 0,60 0,60 0,43 0,76 0,60 0,60 0,60 0,60 0,60
Số 1 Số 2 Số 3 Số 4 Số 5 Số 6 Số 7 Số 8 Số 9
3 √𝑑1𝑑2𝑑3 1,97
1 2 3 4 5 6 7 8 9
𝑥1
Bảng 3.20. Kết quả tính toán các hàm mong đợi d2 Thí nghiệm 0,76 0,76 0,60 0,60 0,60 0,43 0,76 0,76 0,43
𝑥̅ 1 = 28, 𝑥̅ 2 = 8 giờ,
𝑜 = 29, 𝑥1 𝑜 = 9 giờ,
𝑥2
Kiểm định lời giải của quá trình tối ưu bằng thực nghiệm: Kết quả tính toán trung bình nhân kỳ vọng của 3 mục tiêu ta thấy thí nghiệm số 4 có D lớn nhất. Ứng với thí nghiệm này ta có: 𝑥1 = 29oC, 𝑥2 = 9 giờ. Để kiểm định lời giải trên đây có độ tin cậy chấp nhận được hay không, đã tiến hành thực nghiệm với các giá trị lân cận của 𝑥1 và 𝑥2 , cụ thể tiến hành thí nghiệm với các mốc của các biến như sau: += 30 += 10 giờ 𝑥2
Hàm lượng GABA 𝑦1 mg/100g 203 203 202 203 200 201 200 200 199
𝑥̅1 - (28) - (28) - (28) 0 (29) 0 (29) 0 (29) + (30) + (30) + (30)
𝑥̅2 - (8) 0 (9) + (10) - (8) 0 (9) + (10) - (8) 0 (9) + (10) ∑ = 1811 𝑦̅ 1 = 1811/9 ≈ 201,2
16
Tổng số có 9 thí nghiệm, chỉ xét mục tiêu 𝑦1 là hàm lượng GABA chè đen bán thành phẩm. Kết quả thực nghiệm được trình bày trong Bảng 3.21. Giá trị hàm mục tiêu 𝑦1ở ma trận xuất phát (bảng 3.19) là 202 mg/100g, sai số giữa thí nghiệm kiểm định với lời giải tối ưu là 1 mg/100g. Với sai lệch này, có thể tạm thời khẳng định: Vùng tối ưu của các biến ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan và lượng GABA trong chè đen khi cải tiến quá trình lên men (thêm lên men yếm khí) là 𝑥1 = 29 ± 1oC, 𝑥2 = 9 ± 1 giờ). Bảng 3.21. Hàm lượng GABA của 9 mẫu thí nghiệm kiểm định TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9
3.3. TÁC DỤNG CỦA LÊN MEN YẾM KHÍ KẾT HỢP LÊN MEN BẰNG VI KHUẨN LACTIC TỚI HIỆU QUẢ TÍCH LŨY GABA VÀ CHẤT LƯỢNG CHÈ ĐEN GIÀU GABA 3.3.1. Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa công nghệ của các yếu tố ảnh hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic Chỉ tiêu chất lượng khảo sát là hàm lượng GABA trong chè (mg/100g). Các yếu tố ảnh hưởng: Tỷ lệ giống khởi động, thuỷ phần chè vò, thời gian lên men và nhiệt độ lên men. Kết quả thực nghiệm thu được như sau:
- Lượng giống khởi động, 𝑥1 Є [4 - 8%] - Thủy phần của chè vò, 𝑥2 Є [55 - 70%] - Nhiệt độ lên men, 𝑥3 Є [25 - 35oC]; - Thời gian lên men, 𝑥4 Є [8 - 12 giờ]
3.3.2. Tối ưu hoá quá trình lên men yếm khí kết hợp lên men lactic Chỉ tiêu tối ưu hóa là hàm lượng GABA trong chè y max. Các yếu tố ảnh hưởng và khoảng xác định của chúng như đã chỉ ra ở mục 3.3.1. Lược đồ tối ưu hoá theo phương pháp Box-Willson có phương trình hồi quy như sau: 𝑦 = 267 - 1,5𝑥̃1 + 2,1𝑥̃2 - 0,8𝑥̃3 + 1,2𝑥̃4. Quá trình thực nghiệm để tìm vùng tối ưu các yếu tố ảnh hưởng được tiến hành theo phương pháp “độ dốc”.
Kết quả thu được như sau: Hàm lượng GABA đạt max = 275mg/100g trong điều kiện tỷ lệ giống vi khuẩn: 2,5% so với lượng mẫu; độ ẩm chè vò: 68% (lấy tròn số); nhiệt độ lên men: 27oC; thời gian lên men: 11,5 giờ. 3.3.3. So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm giữa 2 phương án lên men yếm khí không và có sử dụng chế phẩm vi khuẩn
Tiến hành sản xuất chè đen với 2 phương án lên men yếm khí: Không sử dụng vi khuẩn lactic (mẫu đối chứng) và có sử dụng vi khuẩn lactic. Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của 2 loại chè, kết quả thu được trình bày trong Bảng 3.26. Từ số liệu ở bảng thấy rõ một xu thế: Ở điều kiện mà tạo ra nhiều GABA thì chất lượng cảm quan của chè đen giảm. Để nâng cao chất lượng cảm quan của chè đen thì ta phải tìm một chế độ lên men yếm khí thích hợp, sao cho lượng GABA trong sản phẩm phù hợp để chất lượng cảm quan tăng lên.
17
Nhìn vào mô hình hồi quy của hàm lượng GABA trong chè khi tiến hành tối ưu hóa (mục 3.3.2) có nhận xét: 1) Để cho hàm lượng GABA giảm xuống thì cần gia tăng giới hạn của lượng giống vi khuẩn
Mô tả
Mẫu đối chứng (không sử dụng vi khuẩn lactic) Điểm Thơm đặc trưng, dễ chịu 4,75
Các chỉ tiêu cảm quan Mùi Chát dịu, có hậu vị rõ Vị 0,6 ml I2 0,1N/100ml Màu nước Ngoại hình Nâu đen, xoắn chặt Tổng điểm GABA
203 mg/100g chè
275 mg/100g chè
khởi động, gia tăng giới hạn trên của nhiệt độ lên men; b) Để cho hàm lượng GABA giảm thì giảm giới hạn trên của thủy phần trong chè và giảm giới hạn trên của thời gian lên men. Bảng 3.26. Các chỉ số cảm quan của 2 mẫu chè có chế độ lên men yếm khí có và không sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic Mẫu thí nghiệm (có sử dụng vi khuẩn lactic) Điểm Mô tả Thơm nhẹ, hơi khé 4,25 4,75 Chát nhẹ, có hậu vị nhẹ 4,25 4,25 0,7 ml I2 0,1N/100ml 4,00 3,75 Nâu đen, xoắn 4,25 16,25 18,0
3.3.4. Tối ưu hoá lên men yếm khí chè đen bằng phương pháp thang điểm có sử dụng hệ số quan trọng cho các chỉ tiêu chất lượng Phương án lên men cần đạt được 2 điều kiện: Hàm lượng GABA phải cao hơn hẳn so với mẫu không sử dụng vi khuẩn (đối chứng), và tổng điểm cảm quan phải tiệm cận được với mẫu đối chứng. Để đạt được 2 mục tiêu trên, cần lập bài toán tối ưu theo các bước sau đây: Bước 1: Lập ma trận thực nghiệm với 3 yếu tố ảnh hưởng: 𝑥1 Є [2 - 6%]; 𝑥1 Є [23 - 270C]; 𝑥1 Є [8 - 12 giờ] Mỗi yếu tố sẽ tiến hành thực nhiệm ở 3 mức: mức âm (-), mức cơ bản (0) và mức dương (+). Tổng số thí nghiệm của ma trận là 33 = 27.
Số TT TNo
Bước 2: Tiến hành 27 thí nghiệm và phân tích GABA. Kết quả phân tích nêu trong Bảng 3.27. Từ bảng này chọn được 12 thí nghiệm tại đó hàm lượng GABA của chè đen cao hơn nhiều so với 203 mg/100g (mẫu đối chứng). Phân tích các chỉ tiêu cảm quan về mùi và vị của chè đen 12 mẫu này. Kết quả thu được trình bày trong Bảng 3.28.
Lượng GABA 228 201 205
Lượng GABA 198 201 205
Số TT TNo 1, x+ 2, x0 1,, 𝑥̅2, x0 2, x0 1, x0
3: 3: 3:
1/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, 𝑥̅3: 2/ 𝑥̅1, xo 2,, 𝑥̅3: 3/ 𝑥̅1, x+ 2, 𝑥̅3:
18
Bước 3: Xây dựng thang điểm cho các chỉ tiêu chất lượng của chè đen. Xây dựng thang điểm cho chỉ tiêu mùi hương của chè (y2) ta thấy y2 max= 4,50, y2 min = 3,75; Hiệu số y2 max - y2 min = 0,75. Bảng 3.27. Kết quả phân tích hàm lượng GABA của 27 mẫu thí nghiệm 15/ xo 16/ x+ 17/ x+
3:
Lượng GABA 267 211 208 216 226 213 237 260 266 282
Số TT TNo 2, x0 1, x+ 3: 3: 3: 3: 3: 3: 3: 3: 3:
Lượng GABA 219 245 256 200 206 257 200 204 209 213 226
Số TT TNo 18/ x+ 4/ xo 1, 𝑥̅2, 𝑥̅3: 19/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, x+ 5/ 𝑥̅1, xo 2, 𝑥̅3: 2, x+ 20/ 𝑥̅1, x0 1, x+ 6/ xo 2, 𝑥̅3: 21/ 𝑥̅1, x+ 2, x+ 7/ x+ 1, 𝑥̅2, 𝑥̅3: 1, 𝑥̅2, x+ 22/ xo 8/ x+ 1, xo 2, 𝑥̅3: 2, x+ 1, x+ 23/ xo 2, x+ 1, x+ 9/ x+ 3 2, x+ 1, x+ 24/ xo 10/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, x0 3: 2, x+ 1, x- 25/ x+ 2, x0 11/ 𝑥̅1, xo 3 2, x+ 1, x0 26/ x+ 2, x0 12/ 𝑥̅1, x+ 3: 27/ x+ 2, x+ 1, x+ 1, 𝑥̅2, x0 13/ xo 3: 1, x+ 2, x0 14/ xo 3: Bảng 3.28. Kết quả phân tích các chỉ số cuối 12 mẫu
Mô tả sản phẩm
Mẫu số 4 Hương dịu, vị dịu 5 Hương nhẹ, vị đậm 6 Hương dịu, vị dịu 9 Hương dịu, vị gắt 14 Hương dịu, vị dịu 15 Hương dịu, vị đậm 18 Hương nhẹ, vị hơi chua 22 Hương dịu, vị hơi gắt 24 Hương dịu, vị hơi gắt 25 Hương hơi nồng, vị hơi chua 26 Hương nồng, vị hơi gắt 27 Hương nồng, vị gắt
GABA mg/100g (y1) 219 245 256 257 226 228 267 226 237 260 266 282
Vị (y3) 4,50 4,75 4,50 4,00 4,50 4,25 4,25 4,25 4,25 4,00 4,25 3,75
Tổng điểm Hương cảm quan (y2) 9,00 4,50 9,25 4,50 9,00 4,50 8,00 4,00 9,00 4,50 8,00 3,75 8,00 3,75 8,50 4,25 8,50 4,25 8,00 4,00 3,75 8,00 7,50 3,75 Chọn thang điểm 10 ta xây dựng được thang điểm cho y2 như sau: Giá trị thật của y2
Giá trị thật của y1
3,75 3,83 3,92 4,00 4,08 4,16 4,25 4,33 4,41 4,5 Giá trị quy đổi của y2 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10 + Theo cách tương tự, ta lập được mục tiêu thang điểm cho y1 và y3. 219 226 233 240 247 254 261 268 275 282 Giá trị quy đổi của y1 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10
Giá trị thật của y3
3,75 3,86 3,97 4,08 4,19 4,30 4,41 4,52 4,63 4,75 Giá trị quy đổi của y3 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10
19
Căn cứ vào vai trò của các chỉ tiêu chất lượng, cần chọn hệ số quan trọng của chúng như sau: k1 = 1,3; k2 = 1; k3=1. Sử dụng thang điểm
Tổng điểm quy đổi Y1+Y2+Y3
Thí nghiệm số
Hệ số
Hệ số
Hệ số
đã xây dựng và hệ số quan trọng của các chỉ tiêu chất lượng chè đen, tính được tổng điểm quy đổi của các chỉ tiêu. Kết quả trình bày trong Bảng 3.29. Từ bảng này thấy rằng vùng mà tại đó tổng giá trị y1+y2+y3 lớn nhất là 20,6 - 25,8. Ứng với các biến là: Lượng vi khuẩn giống khởi động x1 ϵ [2-4%]; Nhiệt độ lên men x2 ϵ [25÷27oC]; Thời gian lên men x3 ϵ [6÷8 giờ].
Số đo thật
Số đo thật
Y1 Điểm Điểm Số quy trên đo đổi thang thật 1,3 4,50 1,0 10 219 1,3 1,0 4,8 4,50 1,0 10 245 1,3 4,5 7,8 4,50 1,0 10 256 1,3 6,0 7,8 4,00 1,0 4,0 257 1,3 6,0 2,6 4,50 1,0 10 226 1,3 2,0 2,6 3,75 1,0 1,0 228 1,3 2,0 10,4 3,75 1,0 1,0 267 1,3 8,0 2,6 4,25 1,0 7,0 226 1,3 2,0 5,2 4,25 1,0 7,0 237 1,3 4,0 9,1 4,00 1,0 4,0 260 1,3 7,0 266 1,3 8,0 10,4 3,75 1,0 1,0 282 1,3 10,0 13,0 3,75 1,0 1,0
Y3 Điểm Điểm Điểm quy trên quy đổi thang đổi 10,0 4,50 1,0 8,0 8,0 10,0 4,75 1,0 10,0 10,0 8,0 10,0 4,50 1,0 8,0 4,0 4,0 4,00 1,0 4,0 8,0 10,0 4,50 1,0 8,0 6,0 1,0 4,25 1,0 6,0 6,0 1,0 4,25 1,0 6,0 6,0 7,0 4,25 1,0 6,0 6,0 7,0 4,25 1,0 6,0 5,0 4,0 4,00 1,0 5,0 6,0 1,0 4,25 1,0 6,0 1,0 1,0 3,75 1,0 1,0
19,3 24,8 25,8 15,8 20,6 9,6 17,4 15,6 18,2 18,1 17,4 15,0
4 5 6 9 14 15 18 22 24 25 26 27
Bảng 3.29. Điểm tổng hợp của 3 chỉ tiêu chất lượng chè Y2 Điểm trên thang
3.4. THỰC NGHIỆM SẢN XUẤT CHÈ GIÀU GABA QUY MÔ PILOT 3.4.1. Sản xuất chè ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ
Quá trình sản xuất thử nghiệm được tiến hành ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ theo 3 quy trình: Truyền thống (QT1); Có bổ sung công đoạn yếm khí (QT2); Có bổ sung lên men yếm khí kết hợp lên men lactic (QT3). Kết quả thu được như sau:
- Ở quy mô pilot, tương tự xu hướng ở quy mô nhỏ, hàm lượng GABA trong chè của quy trình QT3 vẫn cao hơn đáng kể so với chè đen của quy trình QT2 và QT3. Mặt khác, hàm lượng GABA trong chè của QT2 và QT3 đều cao hơn so với các giá trị tương ứng trong chè sản xuất ở quy mô nhỏ phòng thí nghiệm.
20
- Do bổ sung quá trình lên men yếm khí nên các chỉ tiêu chất lượng cảm quan của chè đen theo quy trình QT3 và quy trình QT2 đều thấp hơn so với quy trình QT1, cụ thể theo xu hướng: QT3 ≤ QT2 < QT1.
3.4.2. Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA
Hoàn thiện công đoạn làm héo búp chè: Ký hiệu H1, H2, H3, và H4 cho các công thức có thời gian làm héo tương ứng 6, 7, 8, và 9 h. Kết quả cho thấy trong quá trình héo nhẹ, độ ẩm của lá chè giảm dần và tính chất cơ lý của lá chè thay đổi theo. Lá chè trở nên mềm dẻo, mầu sắc của lá ngả dần sang mầu vàng. Đặc biệt lá chè xuất hiện mùi thơm của quả chín đây là biểu hiện tốt về chất lượng của sản phẩm sau này. Để đánh giá chất lượng cảm quan của chè đen thành phẩm, dùng phương pháp thử nếm. Từ kết quả nghiên cứu chỉ ra thời gian héo nhẹ ảnh hưởng khá rõ đến chất lượng của chè đen. Thời gian làm héo thích hợp nhất là 7-8 h.
Hoàn thiện công đoạn vò chè: Sử dụng máy vò đơn do Trung Quốc chế tạo để vò chè, dung tích của máy vò 50 kg nguyên liệu chè/mẻ, vò 2 lần với thời gian vò 30 ph, độ dập tế bào khoảng 70 đến 80%. Chè sau khi làm héo được đem sang khu vực vò chè. Chế độ vò 3 lần theo 3 chế độ thời gian khác nhau và sau mỗi lần vò đều sàng tơi, sau đó lấy mẫu kiểm tra độ dập tế bào và các tính chất cảm quan. Từ số liệu thu được nhận thấy mặc dù ở chế độ vò 50-45-45, cánh chè khá xoăn, gọn nhưng lại nhiều mảnh vụn làm ảnh hưởng không tốt tới ngoại hình và độ dập tế bào cũng không cao hơn nhiều so với chế độ vò 45-45-40. Do vậy chọn chế độ vò thích hợp nhất là: Vò 3 lần, thời gian vò: 45-45-40 (ph) để có độ dập tế bào: 78,5%.
21
Hoàn thiện công đoạn lên men: Để tạo môi trường lên men yếm khí, chè được cho vào bao hai lớp (PE/PP). Các bao chè được đặt vào trong buồng lên men và tiến hành lên men theo 3 chế độ về thời gian: 7 h; 7 h 30 ph và 8 h. Khi kết thúc lên men yếm khí, mẫu chè được dỡ khỏi túi để xếp lên khay và tiến hành quá trình lên men hiếu khí. Kết quả kiểm tra chất lượng chè đen GABA cho thấy với thời gian lên men yếm khí 7 h, hàm lượng GABA thấp nhất (247 mg/100g chè). Nhưng giá trị này của quy trình QT3 vẫn cao hơn so với mẫu chè từ quy trình QT2 như nêu trong mục trước. Với thời gian lên men 7 h, điểm cảm quan cũng cao nhất trong 3 phương án về thời gian lên men yếm khí. Như vậy, đã hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA theo phương pháp lên men kép, quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ, theo đó tập trung ở công đoạn làm héo, vò chè, và lên men. Từ đó đã đề xuất sơ đồ quy trình sản xuất chè đen giàu GABA hoàn
thiện với bổ sung công đoạn lên men yếm khí kết hợp lên men sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic được trình bày trên Hình 3.15. Quy trình có thể áp dụng cho các quy mô khác nhau. 3.4.3. Áp dụng quy trình đã hoàn thiện để sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot với một số giống chè Việt Nam
Thử nghiệm sản xuất sử dụng mỗi loại chè 15 kg búp 1 tôm 3 lá. Tất cả các thông số công nghệ được áp dụng chung cho cả 4 mẫu, mỗi mẫu lấy 10 kg chè vò, đóng túi như nhau. Sau khi sấy khô, đem phân tích hàm lượng GABA và đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của các mẫu. Qua số liệu thu được thấy rằng sản phẩm chè đen giàu GABA của giỗng chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên là tương đồng nhau. Sản phẩm từ giống chè Trung Du có hàm lượng GABA tuy cao hơn Keo Am Tích nhưng tổng điểm cảm quan lại thấp hơn. Nhìn chung thì cả 2 giống chè này cho sản phẩm chè đen chất lượng kém. Sản phẩm chè đen từ 2 giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên là có thể chấp nhận được.
22
Hình 3.15. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA
3.4.4. Sự biến đổi chất lượng cảm quan của chè đen giàu GABA giống Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên trong quá trình bảo quản
Nghiên cứu bảo quản được tiến hành trong 12 tháng tại phòng thí nghiệm trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm (Việt Trì). Các thời điểm lấy mẫu phân tích: Lần 1, ngày 10/8/2019 (thời tiết mùa thu); Lần 2, ngày 10/01/2020 (thời tiết mùa đông); Lần 3, ngày 10/04/2020 (thời tiết mùa xuân); Lần 4, ngày 10/07/2020 (thời tiết mùa hạ); Lần 5, ngày 10/8/2020 (thời tiết mùa thu). Lấy mẫu phân tích xác định các thông số chất lượng của chè ở từng thời điểm đã định đối với từng loại bao bì (từ B1 đến B3). Kết quả chỉ ra rằng chất lượng của chè giàu GABA từ giống Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên bị biến động theo thời tiết và phụ thuộc vào bao bì đóng gói chè. Bao bì kín như túi màng phức hợp hút chân không duy trì tốt nhất chất lượng chè trong suốt thời gian bảo quản 12 tháng.
***** KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
1. Đã sàng lọc, lựa chọn, thẩm định đặc điểm hình thái, và định danh được 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp gama-aminobutyric axit (GABA). Hai chủng vi khuẩn L. casei VTCC- B-411 và L. plantarum VTCC-B-439 có khả năng sinh tổng hợp GABA rất cao, không những trong môi trường nuôi cấy nhân tạo mà còn trên cơ chất lá chè tươi. Các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình sản xuất giống vi khuẩn lên men đã được xác định, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy bổ sung N, C, glutamate, nhiệt độ 32oC, pH 7,4, thời gian 51 h.
2. Trong 4 giống chè trồng phổ biến ở Việt Nam là Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, và Trung Du, đã xác định và kiến nghị chọn chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên làm nguyên liệu để sản xuất chè đen giàu GABA vì cho sản phẩm chè đen có hàm lượng GABA cao cùng chất lượng cảm quan tốt hơn.
23
3. Lên men yếm khí nguyên liệu chè Phúc Vân Tiên trong môi trường nghèo ô xy đã có tác dụng làm tăng rõ rệt hàm lượng GABA trong thành phẩm chè đen (215 mg/100g) so với mức GABA trong chè đen không lên men yếm khí (175 mg/100g), và trong lá chè nguyên liệu (72 mg/100g). Quá trình lên men yếm khí không làm thay đổi đáng kể chất lượng cảm quan của chè đen thành phẩm.
4. Đã xác định, tối ưu hóa và kiểm định thực nghiệm 2 thông số quan trọng của công đoạn lên men yếm khí trong quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA là nhiệt độ 29oC ± 1oC và thời gian ủ lên men 9 h ± 1. Với các thông số này, chè đen Phúc Vân Tiên cho hàm lượng GABA đạt mức 203 mg/100g và có tổng điểm cảm quan đạt 18,5.
5. Lên men chè bằng vi khuẩn lactic phối hợp cùng lúc với lên men yếm khí đã làm tăng hàm lượng GABA cao hơn đáng kể so với từng quá trình riêng rẽ, trong khi vẫn đảm bảo được ở mức độ nhất định chất lượng cảm quan của chè đen thành phẩm.
6. Từ khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa đa yếu tố, đã xác định được các thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm khí + vi khuẩn lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này, hàm lượng GABA của sản phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở mức hài hòa nhất có thể.
7. Đã thiết lập và hoàn thiện được quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ. Quy trình đã được áp dụng trong sản xuất thử nghiệm cho sản phẩm chè có hàm lượng GABA 265 mg/100g và có tổng điểm chất lượng cảm quan cao (17,25).
8. Chất lượng của chè giàu GABA bị biến động theo thời tiết và phụ thuộc vào bao bì đóng gói. Tuy nhiên, với bao bì kín như túi màng phức hợp, chất lượng của chè được duy trì trong suốt thời gian bảo quản 12 tháng. Kiến nghị
24
1. Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ để làm tăng hàm lượng GABA và chất lượng cảm quan của sản phẩm chè đen giàu GABA. 2. Mở rộng nghiên cứu nhằm áp dụng cho sản xuất các loại chè giàu GABA khác như chè xanh, chè ô long, nước chè. 3. Tiếp cận chuyển giao công nghệ cho một số cơ sở sản xuất chè ở Việt Nam. *****
NHỮNG CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Việt Phương, Vũ Đình Chương, Đào Thị Việt Hà (2019). Nghiên cứu, khảo sát lựa chọn giống chè phù hợp để sản xuất chè GABA. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Bộ Công Thương, 37, 39-41. 2. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Thịnh, Nguyễn Duy Lâm (2020). Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym glutamate-decarboxylaza hoạt lực cao nhằm sử dụng lên men chè đen thu sản phẩm giàu gama amiobutyric axit (GABA). Tạp chí Công Thương, 21, 38-43. 3. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2020). Xác định điều kiện thích hợp lên men chè nhằm thu sản phẩm giàu Gama-Aminobutyric Axit. Tạp chí khoa học Trường Đại học Mở Hà Nội, 73, 79-84. 4. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2021). Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy vi khuẩn lactic VTCC-B-439 và VTCC-B-411 để sử dụng lên men yếm khí nhằm thu chè đen giàu Gama-Aminobutyric Axit (GABA). Tạp chí công thương, 26, 389-393. 5. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2021). Tối ưu hoá quá trình lên men chè đen bằng vi khuẩn lactic. Tạp chí khoa học Trường Đại học Mở Hà Nội, 86, 01-09.
*****
