2/28/2011
1
CHƢƠNG II
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ
& TẾ BÀO THỰC VẬT
Nguồn gốc sự sống?
•Các nhà khoa học theo thuyết tự sinh:
đất ẩm cỏ dại, bùn lươn,… Sự
sống tự sinh (ngẫu nhiên)
•Pasteur: sữa để lâu chua sinh vật
có nguồn gốc từ sinh vật
Nguồn gốc sự sống?
Tính toàn thế
Sinh vật duy trì nòi giống
như thế nào?
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
= Thuật ngữ mô tả các phương pháp
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong
ống nghiệm có chứa môi trường dinh
dưỡng thích hợp trong điều kiện vô
trùng.
Lịch sử phát triển
• Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý
tưởng cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể.
• Năm 1934, White đã thành công trong việc
phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế
bào rễ cà chua.
• Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi
trường nuôi cấy đánh dấu một bước tiến trong
kỹ thuật nuôi cấy mô.
• Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vô tính lan
bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thương mại
hóa.
2/28/2011
2
Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi
cấy mô và tế bào thực vật
•Về mặt lý luận sinh học cơ bản
•Về mặt thực tiễn sản xuất
Các bƣớc nhân giống
in vitro
B 1
B 4
B 5
1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
2. Tạo thể nhân giống
3. Nhân giống in vitro
4. Tái sinh cây hoàn chỉnh
5. Chuyển cây con ra vườn ươm
B 2
B 3
1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
•Khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý
của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy
mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kích thước và
vị trí lấy mẫu đó.
•Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà
phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử
trùng hóa học như calcium hypochloride,
chlorur thủy ngân,...
2. Tạo thể nhân giống
in vitro
•Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng
thích hợp để tạo thể nhân giống
in vitro
.
•Có 2 thể nhân giống
in vitro
là thể chồi và thể
cắt đốt. Tạo thể nhân giống
in vitro
phụ thuộc
vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng.
• Đối với những loài không có khả năng nhân
giống, người ta thường nhân giống bằng cách
tạo cụm chồi từ mô sẹo.
3. Nhân giống
in vitro
•Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường
nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi,
đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho
phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài.
•Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống
in vitro
ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời
gian dài.
4. Tái sinh cây
in vitro
hoàn chỉnh
• Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy
đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn
ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức
sống khi ra môi trường bình thường.
•Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ,
thay vào đó là các chất kích thích quá trình
tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự
nhiên bên ngoài.
2/28/2011
3
5. Chuyển cây con ra vƣờn ƣơm
•Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa
sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng
râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,...
• Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình
nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do
sự khác biệt về điều kiện sống giữa
in vitro
và
ex vitro
.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình
nuôi cấy mô thực vật
Mẫu cấy Môi trường nuôi cấy
Ánh sáng Độ thoáng khí
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Kiểu di truyền:
•Những cây hai lá mầm thông thường có khả
năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây
hạt trần rất khó tái sinh.
•Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi
trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh
in vitro
.
•Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và
Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh
nhất.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Tuổi sinh lý của cây:
•Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao.
•Các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn, khi
cây già đi, khả năng tái sinh của chúng cũng
giảm theo.
• Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mẫu cấy già
từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái
sinh và phân chia tế bào.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Tuổi của mô và cơ quan:
•Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy
hơn những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường
hợp ngoại lệ.
•Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt
hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan
của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân
chia tế bào giảm.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Tình trạng sinh lý:
•Thông thường các bộ phận của cây trong giai
đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn
sinh sản.
•Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó
nuôi cấy
in vitro
hơn chồi của những cây đã
vượt qua được giai đoạn này.
2/28/2011
4
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Vị trí của mẫu cấy trên cây:
•Những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp
trên cây phát triển trong môi trường
in vitro
tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn
chồi nách.
•Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ
những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần
khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có
phản ứng
in vitro
giống nhau.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Kích thước mẫu cấy:
•Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô
phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn
những cấu trúc lớn như thân, lá, củ.
•Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh
dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái
sinh trên môi trường
in vitro
hơn những cơ
quan ít chất dự trữ.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Vết thương:
•Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai
trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy.
•Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp
thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng
thời ethylene được tạo ra nhiều hơn.
Phương pháp cấy:
•Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường
theo nhiều cách khác nhau: có cực hoặc không
có cực.
•Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu
được cấy không cực.
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
1. Ảnh hƣởng của mẫu cấy
Kiểu di truyền
Tuổi sinh lý của cây
Tuổi của mô và cơ quan
Tình trạng sinh lý
Vị trí của mẫu cấy trên cây
Kích thước mẫu cấy
Vết thương
Phương pháp cấy
Khoáng đa lượng:
•Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách
rời không khác nhiều so với cây trồng trong
điều kiện tự nhiên.
•Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N,
P, K, Ca, Mg
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
2/28/2011
5
Khoáng vi lượng:
•Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,
người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi
lượng vào môi trường nuôi cấy.
•Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào
là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo…
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Carbon và nguồn năng lượng:
•Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và
sucrose.
•Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến
hành thử nghiệm như lactose, galactose,
maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate
này có hiệu quả kém hơn so với glucose và
sucrose.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Vitamin:
•Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin
cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của
chúng.
•Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất
trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid
nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật:
•Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi
cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin,
acid abscisic và ethylen.
•Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân
hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy: A/C
cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi.
2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng
Auxin
•Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng
trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô
phân sinh ngọn chồi từ nhu mô.
•Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ
khởi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng
của các sơ khởi này.
•IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T,
phenoxyacetic acid
Cytokinin
•Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có
auxin).
•Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự
phân chia tế bào: phân nhân và phân bào.
•Kinetin, zeatin, BA, TDZ