1
BÀI GIẢNG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
2
MỤC LỤC
Bài 1. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật ............................................. 2
Bài 2. Phương pháp khử trùng mô thực vật .......................................................................... 8
Bài 3. Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam ........................................................... 12
Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ .............................................................. 15
Bài 5. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật ........................................................... 20
Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo .................................................................... 25
Bài 7. Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ....................................................... 30
Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật............................................................................... 34
Bài 9. Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm ................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................. 42
3
BÀI I
PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường
Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là
có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất
nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc),
người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều
loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước
vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ
được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các
dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh
trưởng, và các stock cần thiết khác.
1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật
Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môi
trường:
- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này
thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển
cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng
trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg.
Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh
dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài
ngày.
- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là
môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi
trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất
dinh dưỡng.
2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ
2.1 - Hoá chất
- Saccharose (sucrose)
- Agar
- NH4NO3
- KNO3
- MgSO4.7H2O
- KH2PO4
- CaCl2.5H2O
4
- KI
- Na2MoO4.2H2O
- CoCl2.6H2O
- H3PO3
- MnSO4.4H2O
- ZnSO4.7H2O
- CuSO4.5H2O
- Thiamine HCl
- Myo-inositol
- Glycine
- NAA
- BA (6-Benzyl aminopurin)
- Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2 EDTA
-Fe2(SO4)3
2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị
tính
Số
lượng Ghi chú
1 - Bình định mức: 100 ml cái 10
2 - Bình định mức: 500 ml cái 3
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Bình màu 200 ml cái 5
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Bể ổn nhiệt cái 1 Dùng để pha Fe-EDTA
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 15
12 - Pipett: 5 ml cái 15
13 - Pipett: 10 ml cái 15
14 - Bình định mức 250 ml cái 15
15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 100
16 - Bông mỡ g 200
17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 Bảo quản các stock
5
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường
MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch
mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất
điều hoà sinh trưởng
4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS
(Murashige – Skoog)
4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong
khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào
theo trình tự nhất định sau:
Tên hoá chất Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x20) (mg/lít)
- MgSO4.7H2O 370 7.400
- KH2PO4 170 3.400
- KNO
3
1.900 38.000
- NH
4
NO
3
1.650 33.000
- CaCl
2
.2H
2
O 440 8.800
Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm
100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể
tích tăng dần). Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất
này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng.
Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000
ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch
này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một
1000 ml môi trường nuôi cấy.
4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)
Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất
nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây,
ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) có
nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”.
Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock
khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau:
Tên hoá chất
Nồng độ môi
trường nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x1000)
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
“bà ngoại “(x100)
(mg/lít)
H
3
PO
3
6,2 6200
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 22300
ZnSO
4
.4H
2
O 8,6 8600
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 250