Bài giảng : Nuôi cấy mô thực vật

Chia sẻ: Paradise_12 Paradise_12 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:38

Thêm vào BST

Báo xấu

432
lượt xem 88
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nguyên tắc pha chế môi trường Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng : Nuôi cấy mô thực vật

Bài giảng Nuôi cấy mô thực vật 1 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
BÀI I PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC 1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá ch ất với hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trư ờng nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường m à chu ẩn bị trước dưới dạng nhiều loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, ch ỉ cần pha với nước cất hai lần hay n ước vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các dung d ịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock ch ất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác. 1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật Tùy theo thành ph ần các chất có trong môi trường, có thể phân th ành 3 loại môi trường: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này thích h ợp vào các giai đo ạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến d ưỡng của mô thực vật. - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg. Loại môi trường n ày được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài ngày. - Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. 2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CH ẤT - DỤNG CỤ 2.1 - Hoá chất - Saccharose (sucrose) - Agar - NH4NO3 - KNO3 - MgSO4.7H2O - KH2PO4 2 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
- CaCl2.5H2O - KI - Na2MoO4.2H2O - CoCl2.6H2O - H3PO3 - MnSO4.4H2O - ZnSO4.7H2O - CuSO4.5H2O - Thiamine HCl - Myo-inositol - Glycine - NAA - BA (6-Benzyl aminopurin) - Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2 EDTA -Fe2(SO4)3 2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Số Đơn vị STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Bình định mức: 100 ml 1 cái 10 - Bình định mức: 500 ml 2 cái 3 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 ml 4 cái 3 - Đũa khuấy 5 cái 15 6 - Bình màu 200 ml cái 5 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Bể ổn nhiệt Dùng để pha Fe-EDTA 8 cái 1 - Cốc 100 ml 9 cái 30 - Cốc 200 ml 10 cái 15 11 - Pipett: 1 ml cái 15 12 - Pipett: 5 ml cái 15 13 - Pipett: 10 ml cái 15 - Bình định mức 250 ml 14 cái 15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 15 100 - Bông mỡ 16 g 200 3 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Bảo quản các stock 17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường MS (Murashige – Skoog) như sau: dung d ịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung d ịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất điều hoà sinh trưởng 4 - THỰC H ÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog) 4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20) Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong khoảng 400 ml n ước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào theo trình tự nhất định sau: Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch Tên hoá chất nuôi cấy (mg/lít) stock (x20) (mg/lít) - MgSO4.7H2O 370 7 .400 - KH2PO4 170 3 .400 - KNO3 1 .900 38.000 - NH4NO3 1 .650 33.000 - CaCl2.2H2O 440 8 .800 Mỗi lần cho một loại khoáng vào ph ải khuấy tan ho àn toàn và b ổ sung thêm 100 ml nước cất hai lần trư ớc khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể tích tăng dần). Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng. Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000 ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch này đư ợc bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000) Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây, ta phải tiến h ành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) có nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”. Sau khi pha song các dung dịch “b à ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock khoáng vi lượng X1000 tương tự nh ư ở phần trên. Thành ph ần các khoáng như sau: Nồng độ môi Nồng độ dung dịch Nồng độ dung dịch Tên hoá chất stock (x1000) “bà ngoại “(x100) trường nuôi cấy (mg/lít) (mg/lít) (mg/lít) H3PO3 6,2 6200 MnSO4.4H2O 22,3 22300 ZnSO4.4H2O 8,6 8600 4 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Na2MoO4.2H2O 0,25 250 KI 0,83 830 CuSO4.5H2O 0 ,025 25 2500 CoCl2.6H2O 0 ,025 25 2500 4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200) Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất n ày, sắt sẽ được phóng thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau: Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock Tên hoá chất nuôi cấy (mg/lít) (x200) (mg/lít) FeSO4.7H2O 27,8 5560 Na2 EDTA 37,3 7460 Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80 oC. Cân chính xác 5,56 g FeSO4.7H2O cho vào becher 500 ml có 400 ml nư ớc trên, khuấy tan hoàn toàn. Cân chính xác 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khu ấy tan hoàn toàn. Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10 oC, dùng 5ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.4. Pha stock hormon Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau. IAA, NAA, BA pha trong NaOH 1N (thêm 2 -3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm nước đến thể tích cần). GA3, 2 ,4-D pha trong cồn 50o cho đủ thể tích. Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau: + Cách 1: pha theo hệ mol Ví d ụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol (milimol) từ IAA tinh khiết. 176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung d ịch có nồng độ 1 mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Nh ư vậy, muốn có 100 ml dung d ịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M2,4-D: 221,04; MBA: 225,2) + Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng. Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC. 4.5. Pha sto ck vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500) Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau: Tên hoá chất Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock 5 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
nuôi cấy (mg/lít) (x500) (mg/lít) Acid nicotinic 0,5 250 Thiamin HCl 0,1 50 P yridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 Glycine 2 1 .000 Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml. Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0oC, dùng 2ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy. 4.6. Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy) Pha 1 lít môi trường MS cơ b ản: - Dùng ống đong, đong 500 ml nư ớc cất hai lần vào becher. - Bổ sung 30 g đư ờng sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn - Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều. - Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều. - Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khu ấy đều. - Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500. - Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy. - Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml - Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8. - Bổ sung 6-8 g agar. - Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy, cần chia xong trư ớc khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50oC. Hấp khử trùng (đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung vào môi trường sau khi hấp). Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25 oC. 5 - BÁO CÁO THỰC H ÀNH 1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III. 2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích. 3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít. Biết MBA =225,2. 4. Cần bao nhiêu ml dung d ịch stock IAA có nồng độ 150 mol/lít đ ể pha môi trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 mol/lít. 6 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Một thí n ghiệm nuôi cấy mô th ực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh thường tiến hành trong m ột thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế, ch ỉ cần m ột tế bào vi khuẩn , một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường nuôi cấy, sau một thời gian ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến h ành làm lại từ đ ầu. Do đó việc vô trùng tức lo ại b ỏ h ết n ấm khuẩn trong nuôi cấy m ô thực vật vô cùng quan trọng. Mô cấy có thể là h ầu h ết các bộ ph ận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đ ầu rễ, thân củ … tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên n goài, các bộ phận n ày chứa nhiều hay ít vi khu ẩn và n ấm. Để chuyển mô th ực vật từ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro , mô thực vật phải trải qua giai đo ạn khử trùng để loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên q uá trình này p hải đảm bảo là mô thực vật còn sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất h iện nay là dùng các ch ất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực d iệt nấm khu ẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và kh ả n ăng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đ ẩy hết các bọt khí b ám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả n ăng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch d iệt khuẩn . Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Rất tốt Canxi h ypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt Natri h ypoclorid 2 5 – 30 Tốt Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Nước Brom Rất tốt 1–2 2 – 10 HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình Chất kháng sinh Khá tốt 4 – 50 30 – 60 Trong thời gian xử lý, mô cấy p hải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ b ằng xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước m áy. Khi xử lý song, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy b ị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mô cấy lên mô trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc n goài khi ngâm mô vào dung dịch d iệt khuẩn. Lớp cuối cùng n ày sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đ ặt mô cấy lên môi trường. 7 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Như vậy, để có thể đ ạt được mục đ ích khử trùng (loại bỏ h ết m ầm vi sinh vật, mô thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt ch ẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là: - Chất khử trùng - Nồng độ ch ất khử trùng - Thời gian khử trùng. Vô trùng m ẫu là một thao tác khó , ít khi thành công n gay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm nồng độ và th ời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử ch ắc ch ắn sẽ đạt kết qu ả. 2 - VẬT LIỆU - HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu - Cây Trầu bà - Hạt thuốc lá 2.2 - Hoá chất - Xà phòng bột - Cồn 70 o, 90 o - Javel - Ca(OCl)2 (Caxi h ypoclorid) 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi d ao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 m l 4 cái 3 - Đũa khu ấy 5 cái 15 - Cốc 500 m l 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 m l 9 cái 30 - Cốc 200 m l 10 cái 15 11 - Pipett: 1 m l cái 5 12 - Pipett: 5 m l cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 8 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi vô - Tủ cấy vô trùng 18 cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH Học sinh th ực h ành khử trùng đốt thân cây Trầu b à, hạt thuốc lá. Sau khi vô trùng tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên môi trường MS. 4 - TH ỰC HÀNH 4.1 - K hử trùng cây Trầu bà a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm - Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này d ưới vòi nước m áy cho sạch bụi đất. - Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang một chồi n gủ. Cắt bỏ lá, rễ. - Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen. - Rửa lại bằng nước m áy nhiều lần cho sạch xà phòng. b. Thực hiện trong tủ cấy - Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút - Chiết bỏ cồn. Ngâm các m ẫu trong dung d ịch Caxi h ypoclorid 10% trong 10 phút (hay d ung dịch javel đ ược pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút). - Rửa sạch d ung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 -6 lần - Gạn bỏ nước. 4.2 - K hử trùng hạt thuốc lá - Thực h iện trong phòng thí n ghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy. - Lắc h ạt với nước có pha một ít xà phòng. - Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng - Thực h iện trong tủ cấy, lắc h ạt với cồn 70 o trong 1 phút. - Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi h ypoclorid 10% trong 5 phút. - Rửa sạch d ung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5 -6 lần. - Gạn bỏ nước. 4.3 - Cách cấy mẫu a. Mẫu cây Trầu bà 9 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đ ã khử trùng, được đặt trên giấy cấy vô trùng. Dùng d ao mổ và kẹp tách các lá. - Ở mỗi nách lá có m ang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn m ẫu có kích thước kho ảng 1x1 cm cấy vào môi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm . - Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân . Các ống nghiệm đ ược đặt trong phòng lạnh nhiệt độ 25 oC, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux. b. Mẫu hạt thuốc lá - Hạt thuốc lá sau khi kh ử trùng, dùng kẹp đặt đều trên b ề m ặt môi trường MS trong các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm. - Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn. 5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1. Trình bày p hương pháp khử trùng đốt thân Trầu b à, hạt thuốc lá. 2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn , canxi h ypoclorid. 3. Ghi nh ận kết quả nuôi cấy. 10 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
BÀI 3 KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC HẠT CAM 1 - NGUYÊN TẮC Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây trồng, bên cạnh những phương pháp đòi hỏi người làm việc ph ải có kỹ thuật cao n hư tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy ch ồi ngủ (chồi nách ) là phương pháp đơn giản, dễ thực h iện và m ang lại hiệu quả cao nh ất. Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi n gủ. Các chồi n gủ này có đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đ ỉnh sinh trưởng ở trạng thái tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ th ể thực vật toàn vẹn. Các chồi n gủ n ày đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi n ách n ày ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách này có th ể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới h àng trăm chồi). Với những chồi m ới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mới thì hệ số nhân giống rất đ áng kể. Với những loài th ực vật có đ ỉnh sinh trưởng nhỏ (đ ỉnh sinh trưởng d ấu hoa thị) thì việc tách lấy đ ỉnh sinh trưởng rất khó th ực hiện . Vì vậy, với những loại thực vật n ày, phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi n ách. Chồi nách đ em nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, h iệu qu ả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn so với phương pháp nuôi cấy đ ỉnh sinh trưởng Việc tách chồi n ách thường th ực hiện với nh ững đoạn nhánh có mang chồi của thực vật. Những đoạn nhánh n ày được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang chồi n ách. Bên cạnh đ ó, việc tách chồi n ách cũng có thể thực h iện từ những cây vô trùng trong ống n ghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống. Trong b ài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua nuôi cấy ch ồi n ách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ h ạt giống. 2- VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2 .1 - Vật liệu - Cây h oa cúc - Hạt cam 2 .2 - Hoá chất - Cồn 70 o, 90 o - Môi trường MS bổ sung 2,4 – D - Xà phòng bột - Cồn 70 o, 90 o - Javel 11 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
- NAA - BA 2 .3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi d ao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 m l 4 cái 3 - Đũa khu ấy 5 cái 15 - Cốc 500 m l 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 m l 9 cái 30 - Cốc 200 m l 10 cái 15 11 - Pipett: 1 m l cái 5 12 - Pipett: 5 m l cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí vô - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Sinh viên tiến h ành cắt đốt thân cúc, thực hiện xác đ ịnh công thức khử trùng. Nuôi cấy thân cúc trên môi trường MS bổ sung. - Sinh viên tiến hành khử trùng, tách vỏ và nuôi cấy hạt cam trên môi trường MS. 4 - TH ỰC HÀNH 4 .1 - Khử trùng và nuôi cấy thân cúc cắt đốt a . Khử trùng 12 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng d ao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một đoạn cách gốc 1015 cm. - Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy. - Cắt thành nh ững đo ạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đo ạn có một chồi ngủ. - Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 1015 phút. - Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy. - Lắc với cồn 70o trong 1 phút. - Lắc với dung d ịch javel/nước ở các tỷ lệ 1 /9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1. - Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 56 lần. b . Nuôi cấy - Thân cúc sau khi khử trùng đ ược nuôi cấy trên môi trường MS b ổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA/BA
BÀI 4 VI NHÂN GIỐNG DỨA B ẰNG NUÔI CẤY CHỒI NGỦ 1 - NGUYÊN TẮC Đối với một số cây như tre, mía, d ứa, phương pháp nhân giống vẫn thường được sử dụng h iện nay trong nông nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi n ách, chồi ngầm , thân ngầm, giâm h om… Tuy nhiên đ ặc điểm chung của các phương pháp n ày là hệ số nhân giống thấp , không đ áp ứng được nhu cầu về cây giống đ ể m ở rộng sản xuất. Trước nhu cầu của việc m ở rộng sản xu ất, trong một số năm gần nay đ ể nhân giống dứa thường tiến h ành bằng nuôi cấy ch ồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu đ iểm của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn. Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi n gủ ở ngọn dứa, sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro. Các chồi có hình d ạng giống như vảy cá hoặc h ạt gạo n ằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách riêng đ ể nuôi cấy để tạo thành cụm chồi. 2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2.1 - Vật liệu Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuôi cấy. 2.2 - Hoá chất - Cồn 70 o, 90 o - Môi trường MS bổ sung NAA, BA - Javel - Xà phòng bột 2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi d ao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 m l 4 cái 3 - Đũa khu ấy 5 cái 15 - Cốc 500 m l 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 m l 9 cái 30 - Cốc 200 m l 10 cái 15 14 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng 11 - Pipett: 1 m l cái 5 12 - Pipett: 5 m l cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí vô - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 trùng 3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ . - Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên m ôi trường MS bổ sung NAA và BA. 4 - TH ỰC HÀNH 4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ng ủ dứa - Tách bỏ toàn bộ các lá ở ph ần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ d ưới lên trên, từ ngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ. - Tách rời phần cùi (lõi) có m ang chồi ngủ . - Rửa nh ẹ n hàng cùi dứa dưới vòi n ước m áy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ. - Dùng dao cắt lấy b ốn mặt của cùi dứa có m ang chồi ngủ. - Lắc nhẹ nhàng các mảnh có m ang ch ồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10 phút. - Rửa sạch n ước xà phòng dưới vòi nước máy. - Lắc các m ảnh mô dứa trong cồn 700 trong 2 phút. - Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút. - Rửa sạch lại b ằng nước cất vô trùng 5 ÷6 lần . 15 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa 4.2 - Phương pháp nuôi cấy - Dùng dao mổ cắt những đường dọc, n gang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy. - Cắt vát 4 cạnh dưới của m iếng mô dứa có m ang chồi ngủ tạo thành hình tháp. - Cắm p hần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy. - Đặt các b ình nuôi cấy trong đ iều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC. 4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi Sau thời gian nuôi cấy từ 20 -30 n gày các chồi được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy để tạo cụm chồi. Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30 -40 n gày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng ch ất lên nhau thành một cụm chồi (thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi d ứa: cường độ ánh sáng 4000 lux, thời gian chiếu sáng 10 -14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C. Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa 5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH 1. Trình bày n hững điểm cần lưu ý khi tách chồi n gủ dứa 2. Trình bày q uy trình nhân giống d ứa bằng chồi ngủ. 3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh d ưới của m iếng mô dứa có mang chồi n gủ? 16 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO THỰC VẬT 1 - NGUYÊN TẮC Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về m ặt vật lý (những vết cắt trên cơ th ể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế b ào mới đ ể hàn kín nh ững chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới được h ình thành đó là tế b ào mô sẹo. Mô sẹo là m ột khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ ch ức, hiện diện trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế b ào trong vùng tượng tầng (vùng phân sinh ) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành . Nh ững tế bào mô sẹo thường có h ình cầu, màu trắng h oặc n âu nhạt. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn ch ỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo m ô sẹo. Nuôi cấy tạo mô sẹo được th ực h iện đối với các loài thực vật không có kh ả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế b ào diệp nhục, lá, trụ b ì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ m ột cụm tế b ào mô sẹo có th ể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. A B H ình 3 . Sự tái sinh chồi từ mô sẹo. A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh. Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan , nh ất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây n on hay những mảnh thân non của cây trư ởng thành dễ tạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có kh ả n ăng tạo mô sẹo. Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi m ôi trường nuôi cấy được bổ sung m ột lượng auxin (2,4-D) thích h ợp. Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình: - Sự ph ản phân hoá của tế b ào nhu mô : xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi. 17 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào b ào tượng tầng của phần lớn cây hai lá mầm d ễ d àng phân chia dưới tác động của auxin. - Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ kh ởi (chồi hay rễ). 2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ 2 .1 - Vật liệu Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS. Sử dụng các cây con làm vật liệu thí nghiệm. 2 .2 - Hoá chất - Cồn 70 o, 90 o - Môi trường MS bổ sung 2,4 - D 2 .3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành Đơn vị Số STT Tên dụng cụ, thiết bị Ghi chú tính lượng - Dao mổ 1 cái 15 - Lưỡi dao mổ Dùng lưỡi d ao mổ nhọn 2 cái 15 - Ống đong: 100 ml 3 cái 12 - Ống đong 500 m l 4 cái 3 - Đũa khu ấy 5 cái 15 - Cốc 500 m l 6 cái 15 - Quả bóp cao su 7 cái 15 - Cốc 1000 ml 8 cái 5 - Cốc 100 m l 9 cái 30 - Cốc 200 m l 10 cái 15 11 - Pipett: 1 m l cái 5 12 - Pipett: 5 m l cái 5 13 - Pipett: 10 ml cái 5 14 - Erlen 250ml cái 60 - Kẹp dài 25 cm 15 Cái 15 - Bông mỡ 16 g 200 - Ống nghiệm Þ25 17 cái 15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn 18 cái 15 - Đèn cồn 19 cái 15 Tủ cấy có quạt thổi khí vô - Tủ cấy vô trùng 20 cái 1 trùng 18 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH - Học sinh tiến hành cắt đốt thân, m ảnh lá, đoạn rễ cây thu ốc lá để nuôi cấy tạo mô sẹo, nh ững đoạn có mang chồi n gủ được nuôi cấy tái sinh cây. - Các thành phần n ày được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4 – D. 4 - TH ỰC HÀNH 4 .1 - Vật liệu nuôi cấy a . Mô cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua nuôi cấy hạt - Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá. - Nuôi cấy hạt thuốc lá trong môi trường MS. - Bình nuôi cấy đ ược đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 250C cho nảy mầm. - Cây con được nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng. - Sau 15 -20 ngày nuôi cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10 -15cm, có th ể sử dụng là n guyên liệu cho nuôi cấy mô sẹo b . Mô cấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên Cây thuốc lá mọc n goài tự nhiên có sức tăng trư ởng mạnh, khả năng hình thành mô sẹo rất lớn . Những mô đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên phải trải q ua giai đoạn vô trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy. 4 .2 - Chuẩn bị mẫu cấy a . Cắt đốt thân - Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong b ình nuôi cấy đặt lên giấy cấy. - Dùng d ao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân. - Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là m ột đốt thân . Từ các đốt n ày, tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước kho ảng 0,2 – 0,4 cm . Các đoạn nhỏ này được nuôi cấy tạo mô sẹo. - Điều lưu ý khi cắt các đo ạn thân là ph ải bỏ tất cả các phần m ắt của đốt. Các phần này không có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo chồi. b . Cắt mảnh lá - Từ các lá ở ph ần trên , sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá. - Các phần lá n ày được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm . - Các mảnh lá n ày được nuôi cấy tạo mô sẹo. c. Cắt đoạn rễ - Sau khi cắt các đoạn thân , lá, ph ần rễ còn lại được rửa sạch agar trong n ước cất vô trùng. - Dùng d ao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đo ạn này được nuôi cấy tạo mô sẹo . 19 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT
A B C H ình 4 . Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C) 4 .3 - Nuôi cấy tạo mô sẹo a . Nuôi cấy thân, lá - Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D. - Kho ảng cách giữa các đo ạn thân, mảnh lá là 1 cm . Tránh cấy quá dày. - Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4 -D có nồng độ là 1µmol/lít môi trường. b . Nuôi cấy đoạn rễ - Các đoạn rễ được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng đ ộ 0,1 µmol/lít môi trường. Những khối mô sẹo hình thành qua quá trình nuôi cấy có thể đ ược tách ra và chuyển sang nuôi cấy có nồng độ 2,4-D giảm (0,05µmol/lít môi trường) để tiếp tục phân chia tạo thành những khối mô sẹo mới. Thời gian cấy chuyền giữa các lần nuôi cấy là 4-6 tu ần. Khối mô sẹo cũng có thể được cho tái sinh thành cây n ếu môi trường nuôi cấy lo ại bỏ 2,4 -D và bổ sung BA vào. 5. BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH 1 . Khái niệm mô sẹo? Nguyên nhân của việc hình thành mô sẹo ở thực vật? 2 . Vai trò của auxin đối với việc hình thành mô sẹo ở thực vật. Nồng độ thích hợp nhất kích thích tạo mô sẹo từ thân, lá, rễ cây thuốc lá. 3 . Phương pháp cắt đốt thân, đoạn rễ, mảnh lá để tạo m ô sẹo ở cây thuốc lá. 20 Trang THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT