8
CHƢƠNG II. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
– NHÂN GIỐNG IN VITRO
Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nổ công nghệ sinh
học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Đây là công cụ
nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật
này đã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay
người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống
thương mại. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương
pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công
nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Những
kiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cố
và có nhiều bước tiến rõ rệt. Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất
nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp
nhân giống truyền thống không thể thực hiện được.
1. Giới thiệu sơ lƣợc về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1. Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là
thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô,
cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối
khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện
vô trùng.
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ
quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Trước kia người
ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự
phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô
trong quá trình nuôi cấy. Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cấy
mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý
học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực
vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan
trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con
người.
1.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt l n đ u tiên đưa ra ý tưởng cấy mô
của sinh vật ra ngoài cơ thể nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không
thành công.
9
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn
của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1964, Ball là người đ u tiên tìm ra m m rễ từ việc nuôi cấy chồi
ngọn. Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi
trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh.
Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành ph n dinh dưỡng quan
trọng c n thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển
sự nhân chồi.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu
một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm
cơ sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến
nay.
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đ u
tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực
vật đã được phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng
thương mại hóa.
1.3. Tầm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối
với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho
thực tiễn sản xuất và đời sống.
1.3.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất
của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành so sánh đặc tính
cơ thể với các hợp ph n của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra mối
tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy
trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hoá gọi là
mô sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà
các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của
mình.
Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể
và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Phương pháp nuôi cấy mô có thể
khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái
được phân biệt một cách rõ rệt. Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu
về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mối quan hệ giữa chúng với bên
ngoài. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đẩy sự phát triển của cây trồng theo
10
hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành
nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ. Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề
về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản. Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn
dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn.
1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất
Phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các
giống cây quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ
biến trong công tác giống cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một
thời gian ngắn có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối được tạo
ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổ hợp các
chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng
trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn
trong nông nghiệp.
2. Các bƣớc nhân giống in vitro
2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy. Để
tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy c n lưu ý đến tuổi
sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây
lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch
bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium
hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân,...
2.2. Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân
giống in vitro. Có 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể
nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây
trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân
giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường
bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác.
Hình 2.1. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô
11
2.3. Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.
Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi
trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với
quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy
trì trong thời gian dài.
Hình 2.2. Các bước nhân giống in vitro
2.4. Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đ y đủ thân, lá và rễ để chuẩn
bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra
môi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó
là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy g n với điều kiện tự
nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in
vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N,
ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để
kích thích quá trình ra rễ in vitro.
2.5. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm
Cây con đã ra rễ được lấy khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,... Sau khoảng
2 tu n, cây đã bắt đ u thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng
cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình
nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống
giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh
12
dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên
hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ
cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện
tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ
chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ
chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đ u tiên c n phủ nylon
để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo
ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ d n d n lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con
thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích
thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ.
3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật
3.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
sinh trưởng và phát triển in vitro:
Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá m m thông
thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá m m và cây hạt tr n rất khó tái
sinh (trừ khi chúng còn non). Trong một số cây hai lá m m thì Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae và Cruciferae là những họ thực vật dễ
tái sinh nhất. Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì
chúng h u như dễ tái sinh in vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như
những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe farinacea h u như không có khả năng
hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro,
điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường
nuôi cấy.
Tuổi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta
thường dùng phôi và hạt làm vật liệu cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh
của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong
trường hợp cây bụi. Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì
chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều
kiện ban đ u. Đôi khi qua nhiều l n cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước
được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng
minh trên những đối tượng như nho (Pinus vinifera), táo tây (Malus sylvestris),
cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica).
Tuổi của mô và cơ quan
Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng
nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái