TNU Journal of Science and Technology
230(01): 235 - 242
http://jst.tnu.edu.vn 235 Email: jst@tnu.edu.vn
EVALUATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND ABILITY TO
CYTOTOXIC CANCER CELLS OF BACTERIA ISOLATED FROM
TAM GIANG LAGOON SLUDGE, THUA THIEN HUE PROVINCE
Nguyen Thi Ngoc Anh1,2, Tran Thi Hong2,3*, Ta Thi Thu Thuy1, Vu Kim Thoa1
1Hanoi Open University, 2Graduate University of Science and Technology - VAST,
3Mientrung Institute for Scientific Research, Vietnam National Museum of Nature - VAST
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
22/7/2024
Tam Giang, a lagoon located in the Central region of Vietnam, is one of the
largest in Southeast Asia, and is considered very diverse and rich in biological
resources. However, there have been no studies evaluating the microflora here.
This study aimed to isolate bacterial strains capable of being cultured in the Tam
Giang lagoon and their potential to biosynthesize antibacterial and anti-cancer
compounds. This study screened twenty-two bacterial strains with antagonistic
activity against 1 - 6 test strains. An antagonistic ring diameter ranging from 5.0
- 36.3 mm, especially strain TGGD GII15 was determined to be antagonistic to
the six tested strains included Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus
aureus ATCC 6538, Pseudomonas putida 3326K1, Pseudomonas auroginosa
ATCC 9027, Cadida albicans ATCC 10231, and Salmonella typhimurium
ATCC 14028. This strain was also found to be cytotoxic to the MCF-7 breast
cancer and Hep G2 liver cancer cells but not to the regular HEK 293T cells.
Gene 16S rRNA sequencing results showed that strain TGGD GII15 was
99.93% similar to Bacillus amyloloquefaciens (NR code 041455.1 in NCBI).
This is the first study on Vietnamese coastal lagoon microorganisms, opening
up excellent prospects for exploiting valuable biological compounds from this
ecosystem.
Revised:
17/11/2024
Published:
18/11/2024
KEYWORDS
Tam Giang Lagoon
Bacterial
Antibacterial
Anticancer
Bacillus amyloliquefaciens
ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ GÂY ĐỘC T BÀO UNG THƯ
CA VI KHUN PHÂN LP T BÙN ĐÁY PHÁ TAM GIANG,
TNH THA THIÊN HU
Nguyn Th Ngc Anh1,2, Trn Th Hng2,3*, T Th Thu Thu1, Vũ Kim Thoa1
1Trường Đại hc M Hà Ni, 2Hc vin Khoa hc và Công ngh - Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam,
3Vin Nghiên cu Khoa hc Min Trung, Bo tàng Thiên nhiên Vit Nam
TÓM TT
Ngày nhn bài:
22/7/2024
Tam Giang, mt phá nm min Trung, Vit Nam, thuc loi ln nhất Đông
Nam Á, được nhn đnh rt đa dạng phong phú v i nguyên sinh vt nhưng
ca có nghiên cứu nào đánh giá hệ vi sinh vt nơi đây. Nghn cuy nhm
pn lp các chng vi khun kh ng ni cấy phá Tam Giang tim ng
sinh tng hp các hp cht kháng khun chng ung thư của chúng. Trong
nghn cuy 22 chng vi khun có hotnh đối kng vi 1 - 6 chng kim
định đã đưc sàng lc. Đường kính vòng đối kng t 5,0 36,3 mm, đặc bit
chủng TG GII15 được c định là đi kháng vi 6 chng kiểm định gm
Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538,
Pseudomonas putida 3326K1, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027, Cadida
albicans ATCC 10231 và Salmonella typhimurium ATCC 14028. Chng này
cũng được xác định y độc tế o ung thư MCF-7, tế o ung thư gan Hep
G2, không gây độc tế bào thường HEK 293T. Kết qu gii tnh t gene16S
rRNA cho thy chng TGGĐ GII15 ơng đng 99,93% vi Bacillus
amyloloquefaciens ( s NR 041455.1 trong NCBI). Đây nghiên cứu đầu
tn trên đốing vi sinh vt đầm p ven bin Vit Nam, m ra trin vng
ln trong vic khai tc hp cht sinh hc có g tr t h sinh thái này.
Ngày hoàn thin:
17/11/2024
Ngày đăng:
18/11/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10799
* Corresponding author. Email: tranhongtrn@gmail.com
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 235 - 242
http://jst.tnu.edu.vn 236 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Gii thiu
Phn ln các hp cht có hot tính sinh học đều có ngun gc t các vi sinh vt trên cạn, nhưng
ngày nay, vic phát hin c cht chuyn hóa mới đang giảm dn [1]. vy, vic tìm kiếm các
phân t có hot tính mới đã được m rng sang sàng lc các vi sinh vt những môi trường ít đưc
khám phá hơn như vùng biển và ven bin [2], [3]. Nhiu nghiên cu đã chỉ ra nhng vi khuẩn đặc
hu hin diện trong môi trường đầm phá ngun cung cp các hot chất đặc tính chng ung
thư, kháng khuẩn chng sinh trùng [4]. Vi khun nhng thành viên sinh thái quan trng
trong đầm phá, nhưng số ng, thành phn và s đa dạng của chúng trong các môi trường chuyn
tiếp này ít được biết đến [5].
Việt Nam, các đầm phá ch yếu tp trung miền Trung, nơi giàu bồi tích cát ven bờ, động
lc sóng mnh và thy triu không ln. Phá Tam Giang là mt phá ln trên thế gii và ln nht
Vit Nam, chiếm khong 11% diện tích đầm phá ven b ca c nước, được đánh giá là phong phú
v tài nguyên sinh vật và đa dạng v h sinh thái động thc vt thy sinh và vi sinh vật… Hin nay,
đã có những nghiên cu v hình thái, cu trúc, tiến hóa đầm Tam Giang - Cu Hai, v chất lưng
nước [6], s ô nhim bi polychloribated dibenzopdioxins dibenzofurans (PCDD/Fs) [7], nghiên
cu v các khu h động vt, thc vật như c định 43 loài động vt ni (Zoophankton) thuc 24
ging ca 18 h và 3 b ca h đầm phá [8], đánh giá s phân b và phong phú ca thm thc vt
nước trong các đầm phá ven bin [9]Tuy nhiên, chưa có nghiên cu v vi sinh vt ca h sinh
thái này. Do vy, nghiên cứu này được tiến hành vi mc tiêu phát hin các vi khun tiềm năng
sinh tng hp các hp cht có hot tính kháng khun và c chế tế bào ung thư.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Vt liu nghiên cu
Các mẫu bùn đáy phá Tam Giang được ly ti 5 v trí đại din cho phá gm, mu ti khu vc
giao gia các sông phá (TGCS); giữa phá (TGGĐ); vùng nông cách bờ 100 m (TGCB); ca
bin Thun An giao vi phá (TGTA); rng ngp mặn Rú Chá (TGRC) (Hình 1). Bùn đáy sau khi
lấy, đựng trong l cha mu vô trùng, bo qun lnh và vn chuyn ngay v phòng thí nghiệm để
tiến hành phân lp vi sinh vt. Phn mẫu còn dư, bổ sung glycerol 20%, bo qun t -30oC.
Vi sinh vt kiểm định (VSVKĐ) gây bnh s dng trong nghiên cu: Bacillus cereus ATCC
11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas putida 3326K1, Pseudomonas
auroginosa ATCC 9027, Cadida albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 11105,
Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 được cung cp bi
Trung tâm Ging bo tn ngun gene Vi sinh vt (VCCM), Vin Công ngh sinh hc, Vin Hàn
lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam.
Các dòng tế bào s dng trong nghiên cu: Tế bào ung thư gan Hep G2, tế bào ung thư
MCF-7, tế bào thường HEK 293T được cung cp bi Trung tâm Nghiên cu ng dng Tế bào gc
và Liu pháp gene, Vin Công ngh sinh hc; và Vin Hóa sinh bin, Vin Hàn lâm Khoa hc và
Công ngh Vit Nam.
Các môi trường s dụng để phân lp vi khuẩn đáy đầm phá: Môi trường MA (g/L): NHNO
0,0016; H3BO3 0,022; CaCl2 1,8; Na2HPO4 0,008; C6H5FeO7 0,1; MgCl2 5,9; MgSO 3,24; peptone
5,0; KBr 0,08; KCl 0,55; NaHCO 0,16; NaCl 19,45; NaF 0,0024; Na2SiO3 0,004; SrCl2 0,034;
cao nấm men 1,0; agar 15,0; nước bin nhân to 1000 mL, pH 7,6 ± 0,2 (25oC). OLIGO (g/L): Cao
nm men 0,05; trytone 0,5; C3H7Na2O6P 0,1; agar 15,0; nước bin nhân to 1000 mL. SCA (g/L):
Soluble starch 10,0; K2HPO4 2,0; KNO3 2,0; casein 0,3; MgSO4.7H2O 0,05; CaCO3 0,02; FeSO4.7H2O
0,01; agar 15,0; nước bin nn to 1000 mL; pH 7.0 ± 0.1. AIA (g/L): Sodium caseinate 2,0; L-
Asparagine 0,1; sodium propionate 4,0; K2HPO4 0,5; MgSO 0,1; FeSO4 0,001; agar 15,0; pH 8,1 ±
0,2 25°C; nước bin nhân to 1000 mL. KA (g/L): Glycerol 10 mL; casein 0,3; KNO3 2,0; NaCl 2,0;
K2HPO4 2,0; MgSO4.7H2O 0,05; CaCO3 0,02; FeSO4.7H2O 0,01; agar 18,0; nước bin nhân to 1000
mL. Gauze I (g/L): Soluble starch 20,0; FeSO4.7H2O 0,01; KNO3 1,0; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5;
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 235 - 242
http://jst.tnu.edu.vn 237 Email: jst@tnu.edu.vn
NaCl 2,0; agar 15,0; nước bin nhân to 1000 mL. Gauze II (g/L): Glucose 10,0; NaCl 5,0; pepton 5,0;
trypton 3,0; agar 15,0; nước bin nn to 1000 mL. M1 (g/L): Soluble starch 10,0; cao nm men 4,0;
pepton 2,0; agar 18,0; c bin nhân to 1000 mL.
Môi trường nuôi cy vi sinh vt kiểm định: Môi trường nuôi cy vi khun (LB, g/L): pepton
10,0; cao nấm men 5,0; NaCl 5,0; nưc cất 1000 mL; môi trường nuôi cy nm (Hansen, g/L):
glucose 50,0; pepton 10,0; K2HPO4 3,0; MgSO4.7H2O 2,0; nước ct 1000 mL.
Hình 1. Bản đồ v trí ly mu ti phá Tam Giang
2.2. Phương pháp nghiên cu
2.2.1. Phân lp vi khun t các mẫu bùn đáy phá Tam Giang
Mi mẫu bùn đáy được n 10 g nghin nh trong ci chày s (đã khử trùng). Sau đó hòa
tan trong 90 mL nước mui sinh lý vô trùng (0,85% NaCl), lc 150 vòng/phút trong 10 - 20 phút,
để lng 15 phút ri hút 1 mL dung dch sang ng nghiệm có 9 mL nước mui sinhmi. Tiếp tc
pha loãng ti 10-4 và 10-5. T mi nồng độ pha loãng hút 1 mL dung dch cấy trang trên đĩa petri
cha các môi trường phân lp vi khuẩn đáy đầm phá, 30oC, trong 1 - 5 ngày quan sát s phát
trin ca khun lc, làm thun và gi ging.
2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng khun
Các chng vi khun phân lập được nuôi cấy trong môi trường gốc ban đầu 30oC, trong 1-2
ngày, vi tốc độ lc 150 vòng/phút để nghiên cu kh năng kháng VSVKĐ bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch ca Hadacek cng s (2000) [10]. Vòng kháng khun/ kháng nm
được xác định theo công thc: HTKS = D - d (mm)
Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khun/ kháng nm
d: Đường kính l thch.
2.2.3. Th nghim kh năng gây độc tế bào
Xét nghim MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) đưc dùng
để xác định kh năng ảnh hưởng ca các chng vi khun có hoạt tính đối kháng tuyn chn t phá
Tam Giang đến kh năng sống ca các dòng tế bào ung thư gan Hep G2, ung thư vú MCF7 và tế
bào thường HEK 293T theo Monks và cng s (1991) [11]. Các dòng tế o được nuôi cy in vitro
theo phương pháp ca Skehan và cng s (1990) [12]. Các giá tr độ hp ph được đo bước sóng
570 nm bng đầu đọc vi bn và tính toán kh năng sống sót ca tế bào (CS%).
CS% = 𝑂𝐷 (𝑚𝑢 𝑡ℎ)−𝑂𝐷 (𝑛𝑔à𝑦 0)
𝑂𝐷 (đ𝑖 𝑐ℎ𝑛𝑔)𝑂𝐷 (𝑛𝑔à𝑦 0) x 100
2.2.4. Định danh các chng vi khuẩn đáy tuyển chn
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 235 - 242
http://jst.tnu.edu.vn 238 Email: jst@tnu.edu.vn
DNA tng s ca chng vi khun tuyn chọn được tách chiết theo hướng dn ca NucleoSpin
Soil Mini Kit for DNA (Macherey Nagel, Đức). Gene 16S rRNA ca vi khuẩn được khuếch đại
bng cp mồi 16SF: 5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC A-3’ và 16SR: 5’-AAG GAG GTG ATC
CAG CC-3’ (Sigmaaldrich, M) vi chu trình nhit : 94oC trong 3 phút, 30 chu k (94oC trong 1
phút, 50oC trong 1 phút, 72oC trong 1 phút 30 giây), chu k cui 72oC: 7 phút và gi mu 4oC.
Sn phẩm PCR được điện di kim tra trên gel agarose 1%. Mẫu đưc gửi đi giải trình t ti hãng
FIRST BASE Malaysia theo nguyên gii trình t ca Sanger. X trình t nhận đưc bng
phn mm Bioedit so sánh với sở d liu ca ngân hàng gene NCBI bằng chương trình
BLAST nhm tìm ra các chủng có độ tương đồng cao vi chng nghiên cu. Cây phát sinh chng
loi ca các chng nghiên cứu đưc xây dng bng phn mm MEGA11.
3. Kết qu và tho lun
3.1. Phân lp và sàng lc vi khun có hoạt tính đối kháng và gây độc tế bào ung thư từ các mu
bùn đáy phá Tam Giang
Tại phá Tam Giang, độ mn các v trí ly mu có s chnh lch nhau, ti v trí giao thoa gia
phá vi ca bin khu vc rng ngp mặn, đ mặn cao hơn so với khu vực đu phá gia
phá, còn v trí giao thoa vi các sông chảy vào phá thì độ mặn tương đối thp. o mùa khô, phá
Tam Giang có độ mn trung bình 10,8 ± 7,78‰ và mùa mưa độ 8,0 ± 6,28‰ [13]. Trong nghiên
cu này, thời điểm ly mẫu là vào tháng 4, đây là thời k giao mùa gia mùa khô và mùa mưu nên
nồng độ mui có th ảnh hưởng đến s phân b vi khuẩn trong môi trường phá c v trí ly mu.
Vì vậy, đểth phân lập được ti ưu lượng vi khuẩn và đánh giá mật độ vi khun xut hin các
mẫu bùn đáy phá Tam Giang, các nồng độ muối 0,5%; 1,5%; 2,5% và 4,0% đã được kho sát.
a, b, c, d,
Hình 2. Mt s hình nh phân lp vi khun t bùn đáy phá Tam Giang trên các môi trường khác nhau
a, b: Mẫu TGGĐ phân lập vi khuẩn trên môi trường MA 2,5 % mui, MA 4% muối, tương ứng;
c, d: Mu TGTA phân lp vi khun trên môi trường MA 2,5 % mui, MA 4% muối, tương ứng.
Kết qu thí nghim cho thy s ng vi khun phân lập được nhiu nhất và đa dạng nht là v
trí gia phá, tiếp đến v trí cách b 100 m, v trí giao thoa gia các sông, rng ngp mn, ít
nht là v trí giao thoa vi ca bin Thuận An. Như vậy, có th thy, các v trí có độ mn cao, s
ng vi khun xut hin khá thp. Hu hết các vi khun mc nhiu nhất, đa dạng nht phát
trin tt nht trên nồng đ mui 2,5% tt c các mu. Ti nồng đồ mui 0,5% và 4,0% hầu như
không s xut hin ca vi khun hoc rt ít. Trong các môi trường phân lp, môi trường MA,
Gauze II và MI phân lập được s ng vi khun nhiu nhất và đa dạng màu sc nht hu hết các
mẫu, trong khi đó môi trường SCA, AIA phân lập được ít vi sinh vt nht. Các vi khun phân lp
trên môi trường nồng độ mui 0,5%; 1,5% 4,0% đều phát trin tt trên môi trường nồng độ
2,5%. Vì vy, nồng độ muối 2,5% được la chọn để thc hin các nghiên cu tiếp theo.
Tng s 553 khun lc vi khuẩn đã được la chọn và nuôi tăng sinh trên các môi trường phân
lập tương ứng và th hoạt tính đối kháng vi 8 chng vi sinh vt gây bnh kiểm định trên (Phn
2.1). Kết qu thu được 40 khun lc (chng) kh năng đối kháng ngun bệnh, trong đó 21 chủng
được nhận định là có kh năng đối kháng tt nhất được trình bày trong bng 1. T kết qu bng 1
cho thấy, đa số các chng hoạt tính được phân lp ch yếu v trí gia phá (8/21 chng)
rng ngp mn Rú C(9/21 chủng), trong đó mt s chng có kh năng kháng 2 chủng kiểm định
như TGRC AIA24, TGRC GII2, TGRC GII15.3, TGRC GII24, TGRC GII27, TGGĐ GII17,
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 235 - 242
http://jst.tnu.edu.vn 239 Email: jst@tnu.edu.vn
TGGĐ GII14, TGCB GI4, với đường kính vòng kháng khun t 9,3 - 36,3 mm; mt s chng có
kh năng kháng 3 đến 4 chng kiểm định như TGRC MI40.2, TGRC GII6, TGGĐ GII9, TGGĐ
GII18, TGGĐ GII16, TGGĐ GII7.1 và TGGĐ GII7.2, với đường kính vòng kháng khun t 5,0 -
22,3 mm; đặc bit, chủng TGGĐ GII15 có khả năng ức chế lên đến 6 chng kiểm định, với đưng
kính vòng kháng khun t 13,7 - 21,0 mm. T kết qu nghiên cu bng 1 cũng cho thấy, vi khun
phân lp ti phá Tam Giang có kh năng ức chế đa dng, t vi khun Gram âm (P. putida 3326K1,
P. auroginosa ATCC 9027, E. coli ATCC 11105 S. typhimurium ATCC 14028) đến vi khun
Gram dương (B. cereus ATCC 11778, S. aureus ATCC 6538 E. aerogenes ATCC 13048)
nm men C. abicans ATCC 10231.
Bng 1. Các chng vi khun phân lp có hoạt tính đối kháng mnh với VSV
Stt
Chng vi khun
phân lp
Kh năng ức chế vi sinh vt gây bnh kiểm định (D-d, mm)
B. cereus
ATCC
11778
P. putida
3326K1
S. aureus
ATCC
6538
C. abicans
ATCC
10231
P.
auroginosa
ATCC 9027
E. coli
ATCC
11105
S.
typhimurium
ATCC 14028
E.
aerogenes
ATCC
13048
1
TGRC AIA 24
13,0 ± 3,6
-
-
-
9,3 ± 2,5
-
-
-
2
TGRC AIA 22
21 ± 1,0
-
-
-
-
-
-
-
3
TGRC MI 40.2
22,3 ± 1,5
14,7 ± 0,7
-
-
-
17,7 ± 0,6
-
-
4
TGRC GII 2
17,7 ± 0,6
-
-
-
-
-
-
13,0 ± 1,0
5
TGRC GII 6
11,3 ± 0,6
13,3 ± 0,6
15,7 ± 0,6
-
-
13,5 ± 0,3
-
-
6
TGRC GII 15.3
-
-
26,0 ± 1,0
14,0 ± 1,0
-
-
-
-
7
TGRC GII 23
-
-
-
-
-
-
14,0 ± 1,7
-
8
TGRC GII 24
-
-
16,0 ± 1,0
-
16,3 ± 0,6
-
-
-
9
TGRC GII 27
-
-
15,0 ± 1,0
-
16,3 ± 0,6
-
-
-
10
TGGĐ GII 9
-
-
-
-
11,7 ± 1,1
12,0 ± 1,7
10,7 ± 0,6
-
11
TGGĐ GII 15
21,0 ± 1,0
14,3 ± 1,1
15,0 ± 1,0
16,7 ± 1,5
13,7 ± 0,7
-
14,7 ± 0,6
-
12
TGGĐ GII 18
-
14,7 ± 0,7
-
16,3 ± 0,6
15,3 ± 0,6
-
-
-
13
TGGĐ GII 19
-
-
-
30,3 ± 1,5
-
-
-
-
14
TGGĐ GII 16
-
13,7 ± 1,5
8,7 ± 1,3
-
5,0 ± 1,7
-
8,7 ± 1,1
-
15
TGGĐ GII 17
-
-
-
36,3 ± 1,5
13,7 ± 1,0
-
-
-
16
TGGĐ GII 7.1
14,7 ± 0,6
-
14,0 ± 1,0
-
14,0 ± 1,0
-
-
-
17
TGGĐ GII 7.2
14,7 ± 0,6
-
14,0 ± 1,0
-
14,7 ± 1,5
-
-
-
18
TGGĐ GII 14
-
-
-
35,3 ± 1,5
11,7 ± 0,7
-
-
-
19
TGCB SCA 12.2
20,3 ± 0,6
-
-
-
-
-
-
-
20
TGCB GI 4
12,7 ± 0,7
25,3 ± 0,6
-
-
-
-
-
-
21
TGTA GII 1
-
-
-
-
23,3 ± 0,6
-
-
-
a.
b.
c.
d.
Hình 3. Kh năng kháng VSVKĐ của mt s chng vi khun phân lp ti phá Tam Giang
a. Kh năng kháng nấm C. anbicans ATCC 10231 ca chủng TGCĐ GII 17; b. Khả năng kháng P. putida
3326K1 ca chng TGCB GI14; Kh năng kháng B. cereus ATCC 11778 ca chủng TGGĐ GII 15; Khả năng
kháng B. cereus STCC 11778 ca chng TGRC MI 40.2
Nhiu nghiên cu cho thy, phn ln hot chất kháng ung thư được sn sinh t các chng vi
sinh vt có hot tính kháng khun [14], [15]. Vì vy, trong nghiên cu này chúng tôi la chn 40
chng kh năng kháng VSVKĐ để tiến hành th kh năng gây độc tế bào ung thư vú MCF-7,
tế bào ung thư gan Hep G2 và tế bào thường HEK 293T theo phương pháp MTT đã nêu (Phương