Ngày nhận bài: 30-08-2024 / Ngày chấp nhận đăng bài: 28-10-2024 / Ngày đăng bài: 28-10-2024
*Tác giả liên hệ: Trương Quốc Kỳ. Khoa Dược - Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.
E-mail: kytq@pnt.edu.vn
© 2024 Bản quyền thuộc về Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh.
https://www.tapchiyhoctphcm.vn 47
ISSN : 1859-1779
Nghiên cứu Dược học
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học;27(4):47-54
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.04.06
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng arsen, chì,
cadmium, thủy ngân trong đất trồng dược liệu bằng
phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử
Nguyễn Văn Hiển1, Võ Lê Khanh2, Trương Quốc Kỳ2,*
1Khoa Dược, Trường Đại học Văn Lang, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
2Khoa Dược, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Việc sử dụng các sản phẩm thảo dược đã tăng lên rất nhiều trong ba thập kỷ qua. Tuy nhiên, vấn đề ô nhiễm đất bởi kim
loại nặng là một nguy cơ tiềm ẩn gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng của dược liệu.
Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng arsen, chì, cadmium, thủy ngân trong đất bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các mẫu đất được xử lý trong hệ thống phá mẫu vi sóng với acid HNO3 65%. Thể tích HNO3
65% và khối lượng mẫu là hai thông số được phần mềm Design Expert sử dụng để tối ưu hóa. Phương pháp được thẩm định dựa trên
quy định của ICH Q3D (R2) và ICH Q2(R1). Hàm lượng kim loại nặng được xác định bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Kết quả: Đã tối ưu hóa quy trình vô cơ hóa mẫu đất. Kết quả thẩm định quy trình phân tích cho thấy quy trình có tính đặc hiệu cao, tính
tuyến tính với hệ số tương quan hồi quy tuyến tính không nhỏ hơn 0,99, độ đúng thể hiện qua độ phục hồi nằm trong khoảng 80 – 110%
và RSD < 10% đối với độ chính xác.
Kết luận: Đề tài đã xây dựng thành công quy trình định lượng arsen, chì, cadmium, thủy ngân trong đất bằng phương pháp quang phổ
hấp thu nguyên tử.
Từ khóa: đất, kim loại nặng, thẩm định, quang phổ hấp thu nguyên tử (AAS)
Abstract
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN ATOMIC ABSORPTION
SPECTROMETRY METHOD TO DETERMINE ARSENIC, LEAD, CADMIUM
AND MERCURY IN SOILS
Nguyen Van Hien, Vo Le Khanh, Truong Quoc Ky
Background: The use of herbal medicinal products has increased tremendously over the past three decades. Soil pollution by heavy
metals is a potential risk causing adverse effects on the quality of medicinal herbs.
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 4* 2024
48 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.04.06
Objectives: Quantitative determination of heavy metal concentration in soils by flame atomic absorption spectrometry, including
arsenic, lead, cadmium, and mercury.
Methods: Soil samples were processed in a microwave digestion system with 65% HNO3 acid. For the digestion process of soil samples
to have the highest recovery, the volume of HNO3 65% and sample weight are two parameters used for optimization by Design Expert
software. The method was validated based on ICH Q3D (R2) and ICH Q2(R1) guidelines. The content of heavy metals was determined
by the atomic absorption spectrophotometer.
Results: The condition of the sample digestion was optimized. The results of the validation of the analytical procedure show that the
procedure has high specificity, linear regression not less than 0.99, the accuracy expressed in recovery is in the range of 80 - 110%,
and RSD < 10% for precision.
Conclusions: An atomic absorption spectrometry method was successfully developed for quantitative determination of heavy metal
concentration of arsenic, lead, cadmium, mercury in soils.
Keyword: atomic absorption spectrometry; heavy metal; validation; soil
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tại các nước phát triển,
việc sử dụng thuốc từ dược liệu và các phương pháp điều trị
có liên quan đến y học cổ truyền chiếm 80% dân số trong việc
chăm sóc sức khỏe ban đầu. Dễ tiếp cận, ít tác dụng phụ và an
toàn là các lợi ích được kể đến khi sử dụng thuốc từ dược liệu
thay thế cho thuốc tân dược [1]. Tuy nhiên, vấn đề ô nhiễm
môi trường đất ngày càng gia tăng do việc xử lý không đúng
cách các chất thải từ hoạt động đô thị hóa - công nghiệp hóa
và cơ khí hóa nông nghiệp đã đặt ra nhiều lo ngại về các vấn
đề an toàn và chất lượng liên quan đến việc trồng và sử dụng
các sản phẩm thảo dược [2]. Kim loại nặng là một trong các
tác nhân gây ô nhiễm đất được quan tâm rộng rãi trong các
nghiên cứu vì đây là chất độc, có khả năng tích lũy sinh học,
tồn tại bền vững, không phân hủy và có thể gây các tác động
xấu đến hệ sinh thái [3]. Ô nhiễm đất bởi kim loại nặng là mối
nguy cơ tiềm ẩn gây ra các tác động xấu đến chất lượng dược
liệu [4]. Bên cạnh đó, hàm lượng kim loại nặng là một trong
những chỉ tiêu về kiểm tra chất lượng dược liệu theo tiêu chuẩn
Dược điển Việt Nam V. Vì vậy, việc định lượng kim loại nặng
trong đất để phát hiện các vùng đất bị ô nhiễm kim loại nặng
nhằm đưa ra các giải pháp xử lý là thực sự cần thiết. Điều này
đảm bảo chất lượng môi trường đất nuôi trồng dược liệu đối
với chỉ tiêu kim loại nặng, góp phần vào việc lựa chọn địa
điểm phù hợp để trồng dược liệu theo tiêu chuẩn Thực hành
tốt nuôi trồng, thu hái dược liệu và các nguyên tắc, tiêu chuẩn
khai thác dược liệu tự nhiên của Việt Nam (GACP), hướng
đến dược liệu xanh, sạch. Theo Cơ quan thống kê các chất độc
và bệnh Hoa Kỳ (ATSDR) và Cơ quan bảo vệ Môi sinh Hoa
Kỳ (US EPA), As, Pb, Hg và Cd là các kim loại nặng được xếp
ở vị trí đầu trong danh sách chất ưu tiên (SPL) dựa trên sự kết
hợp giữa tần suất, độc tính và khả năng phơi nhiễm [5]. Theo
quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn cho phép của một số
chất ô nhiễm trong đất quy định thì Pb là 70 mg/kg, As là
15 mg/kg, Hg là 12 mg/kg và Cd là 1,5 mg/kg. Do đó, đề
tài tập trung chú trọng vào 4 kim loại trên. Trong nghiên
cứu này, quy trình vô cơ hóa mẫu được tối ưu bởi phần
mềm Design Expert 12.0 và quy trình định định lượng được
thẩm định theo ICH [6].
2. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các kim loại nặng (cụ thể là As, Hg, Pb, Cd) và mẫu đất
xây dựng quy trình. Nghiên cứu được thực hiện tại Khoa
Dược, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch.
2.2. Trang thiết bị, hóa chất, dung môi
2.2.1. Trang thiết bị
Máy phá mẫu Multiwave PRO (Anton Paar, Áo), máy
quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS PinAAcle Series với bộ
hydride FIAS 100 (Perkin Elmer, Mỹ), cân phân tích
Sartorius QUINTIX224 (Sartorius, Đức), máy lọc nước siêu
sạch WaterPro® PS (Labconco - Mỹ).
2.2.2. Hóa chất, dung môi
HNO3 đậm đặc (Merck, Mỹ), HCl đậm đặc (Merck, Mỹ),
nước siêu sạch và mẫu đất không chứa kim loại nặng.
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 4 * 2024
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.04.06
https://www.tapchiyhoctphcm.vn
|
49
2.3. Phương pháp lấy mẫu
Lấy theo phương pháp lấy mẫu hỗn hợp ở các vùng Hóc
Môn hoặc Củ Chi thực hiện theo TCVN 7538 – 2:2005, khối
lượng 1,0kg đất/mẫu.
2.4. Chuẩn bị mẫu
2.4.1. Dung dịch gốc
Các dung dịch cadmium, chì, arsen, thủy ngân 1000 mg/L
(Merck KGaA, Germany).
2.4.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn
Pha các dung dịch chuẩn ở nồng độ thích hợp với dung
môi HNO3 0,2%.
2.4.3. Chuẩn bị mẫu thử
Cân 0,3 g mẫu đất sau khi đã sấy khô và phân tán cho vào
ống teflon, thêm 8,1 ml HNO3 đậm đặc. Cho hỗn hợp trên
vào máy phá mẫu vi sóng để thực hiện phá mẫu. Sau khi phá
xong, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi pha loãng các dung
dịch thu được bằng HNO3 0,2% trong bình định mức 50 ml
rồi đem lọc thu được dung dịch trong suốt.
2.4.4. Chuẩn bị mẫu trắng
Cân 0,3 g mẫu đất không chứa kim loại nặng sau khi đã
sấy khô và phân tán cho vào ống teflon, thêm 8,1 ml HNO3
đậm đặc. Cho hỗn hợp trên vào máy phá mẫu vi sóng để thực
hiện phá mẫu. Sau khi phá xong, để nguội đến nhiệt độ
phòng rồi pha loãng các dung dịch thu được bằng HNO3
0,2% trong bình định mức 50 ml rồi đem lọc thu được dung
dịch trong suốt.
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Chương trình nhiệt cho hệ thống vi sóng
Chu trình nhiệt của của điều kiện vi sóng sử dụng là
EPA 3051A của hãng Anton Paar với điều kiện như sau:
nhiệt độ ban đầu ở 70 0C tăng nhiệt độ lên 175 0C trong 5
phút 30 giây, sau đó giữ ở nhiệt độ 175 0C trong vòng 4
phút 30 giây.
2.5.2. Thiết kế và tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu
Quy trình vô cơ hóa mẫu đất được tối ưu hóa bằng phần
mềm Design Expert version 12 (Stat-Ease) sử dụng mô hình
CCD (Central Composite Design).
Hai biến độc lập là khối lượng mẫu và thể tích HNO3 65%
được trình bày trong Bảng 1. Bốn biến phụ thuộc là độ phục
hồi của cadmium, độ phục hồi của chì, độ phục hồi của arsen,
độ phục hồi của thủy ngân.
Dựa vào các dữ liệu thực nghiệm, phần mềm Design
Expert sử dụng phương pháp phân tích phương sai
(ANOVA) của Microsoft Excel để đánh giá ảnh hưởng của
các biến độc lập lên biến phụ thuộc và đề xuất điều kiện vô
cơ hóa mẫu tối ưu.
Bảng 1. Các mức của từng biến độc lập
Biến độc lập -1 0 +1
X1: Khối lượng mẫu (g) 0,3 0,4 0,5
X2: Thể tích HNO3 (ml) 6 8 10
2.5.3. Điều kiện do quang phổ AAS của các kim
loại
Điều kiện đo quang phổ AAS được trình bày ở Bảng 2.
Trong đó hai kim loại arsen và thủy ngân được sử dụng bộ
nguyên tử hóa bên ngoài hydrid.
Bảng 2. Điều kiện phân tích kim loại nặng cadmium, chì, arsen
và thủy ngân
Nguyên tố Cadmium
(Cd)
Chì
(Pb)
Arsen
(As)
Thủy ngân
(Hg)
Kỹ thuật Ngọn lửa Ngọn lửa Lò graphit
Lò graphit
Khí Không khí -
Acetylen
Không khí -
Acetylen Argon Argon
Bước sóng
(nm) 228,8 283,31 193,70 253,65
Độ rộng
khe (nm) 0,7 0,7 0,7 0,7
Đèn HCL EDL EDL EDL
Chiều cao
ngọn lửa
(cm)
10 10 - -
2.5.4. Thẩm định quy trình
Sau khi xác định được điều kiện vô cơ hóa mẫu tối ưu từ
phần mềm, sẽ tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo
hướng dẫn của ICH Q2(R1) bao gồm độ đặc hiệu, độ đúng,
độ chính xác, tính tuyến tính và giới hạn định lượng.
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 4* 2024
50 | https://www.tapchiyhoctphcm.vn https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.04.06
2.5.5. Áp dụng phân tích mẫu đất trồng dược liệu
Phương pháp phân tích được áp dụng trên các mẫu đất
được thu thập ở Xã Tân Thông Hội, Huyện Củ Chi và Xã
Đông Thạnh, Huyện Hóc Môn.
Hàm lượng kim loại (μg) có trong 1 g mẫu thử được tính
theo công thức: X (μg/g) =    
  ()
Trong đó:
X: Hàm lượng Pb, Cd, As và Hg trong mẫu đất (μg/g)
C: Hàm lượng Pb, Cd, As và Hg đo được trên thiết bị
tương ứng với độ hấp thu A(μg/mL)
V: Tổng thể tích dung dịch mẫu (mL)
f: Độ pha loãng thêm của mẫu thử (nếu có)
p: Khối lượng cân của mẫu thử (g)
h: Độ ẩm của mẫu phân tích.
3. KẾT QUẢ
3.1. Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện vô cơ hóa mẫu
3.1.1. Khảo sát điều kiện vô cơ hóa mẫu
Mô hình CCD (Central Composite Design) với 2 biến độc
lập, phần mềm đã đề xuất 13 thí nghiệm. Tiến hành các thí
nghiệm do phần mềm đề xuất sau khi đã cài đặt giới hạn trên,
giới hạn dưới cho từng biến độc lập. Kết quả của 13 thí
nghiệm được tiếp tục được phân tích phương sai.
3.1.2. Phân tích kết quả
Kết quả phân tích phương sai cho thấy trị số p-value
< 0,05 với tất cả các biến, cho thấy mô hình có ý nghĩa
về mặt thống kê. Bên cạnh đó, giá trị độ chính xác thích
hợp đo dựa vào tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu. Kết quả tỉ lệ
của 4 biến đều lớn hơn 4 và các thông số còn lại trong
giới hạn cho phép.
Ảnh hưởng của các biến độc lập lên biến phụ thuộc được
thể hiện trong Hình 1.
Dựa vào các dữ liệu thực nghiệm được trình bày ở
Bảng 3, kết hợp với điều kiện ràng buộc cho biến độc
lập và biến phụ thuộc, các thực nghiệm với các chỉ số
mong muốn khác nhau được phần mềm đề xuất. Chỉ số
mong muốn càng cao phản ánh khả năng tái lặp càng
cao khi so sánh giữa các dữ liệu được đề xuất bởi phần
mềm và dữ liệu thực nghiệm kiểm chứng. Thực nghiệm
có chỉ số mong muốn (desirability value) cao nhất
(0,7666) có khối lượng mẫu và thể tích HNO3 tương
ứng là 0,3 g và 8,0825 mL.
3.1.3. Thực nghiệm kiểm chứng
Tiến hành lặp lại 6 lần thực nghiệm tối ưu đã được đề xuất.
Dữ liệu đánh giá được thể hiện trong Bảng 4.
Bảng 3. Các thực nghiệm tối ưu được đề xuất từ phần mềm Design Expert
STT
Khối lượng
mẫu Thể tích HNO3
Độ phục hồi
(Cd)
Độ phục hồi
(Pb)
Độ phục hồi (As)
Độ phục hồi
(Hg)
Chỉ số mong muốn
1 0,3001 8,0825 100,38 94,18 86,58 100,00 0,7666
2 0,3194 9,0497 100,36 94,21 85,19 100,00 0,7471
3 0,5124 7,6041 100,52 91,70 88,99 83,24 0,6979
4 0,4999 7,5878 100,52 91,67 89,01 83,26 0,6979
5 0,4999 7,6238 100,52 91,74 88,97 83,21 0,6979
6 0,5000 7,5488 100,52 91,59 89,05 83,30 0,6978
7 0,4999 7,6963 100,51 91,90 88,87 83,04 0,6976
8 0,4999 7,7952 100,49 92,13 88,71 82,72 0,6966
Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh - Dược học * Tập 27 * Số 4 * 2024
https://doi.org/10.32895/hcjm.p.2024.04.06
https://www.tapchiyhoctphcm.vn
|
51
A
B
C
D
Hình 1. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thể tích HNO3 đến:
(A): Độ phục hồi của cadmium, (B): Độ phục hồi của chì
(C): Độ phục hồi của arsen, (D): Độ phục hồi của thủy ngân
Bảng 4. Kết quả thực nghiệm kiểm chứng
Biến phụ thuộc
Giá trị
trung bình
dự đoán
Khoảng tin cậy 95%
cho giá trị dự đoán Giá trị
trung bình
thực
nghiệm
Giới hạn
dưới
Giới hạn
trên
Độ phục hồi (Cd)
100,38 99,51 101,25 99,58
Độ phục hồi (Pb)
94,18 87,83 100,54 95,80
Độ phục hồi (As)
86,58 77,41 95,76 87,95
Độ phục hồi (Hg)
100,00 83,80 116,20 98,87
Giá trị trung bình thực nghiệm nằm trong khoảng tin cậy
của giá trị dự đoán. Do đó, mô hình được kiểm chứng.
3.1.4. Điều kiện vô cơ hóa mẫu tối ưu
Các kết quả khảo sát và tối ưu hóa thực nghiệm cho thấy
điều kiện vô cơ hóa mẫu đất tối ưu để định lượng các kim
loại nặng (Cd, Pb, As, Hg) trong đất bằng phương pháp
quang phổ hấp thu nguyên tử như sau: khối lượng mẫu 0,3 g
và thể tích HNO3 8,0825 mL.