Giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật: Phần 2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:124

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nối tiếp nội dung phần 1, phần 2 của giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật tiếp tục trình bày các nội dung của phần B và C. Phần B Quy luật di truyền của tính trạng: phân tích di truyền tính trạng chất lượng, di truyền liên kết, trao đổi chéo. Phần C Gây đột biến nhân tạo và di truyền quần thể: phương pháp gây tạo và phát hiện đột biến ở thực vật, di truyền quần thể.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Giáo trình Thực hành Di truyền học thực vật: Phần 2

PHẦN B - QUY LUẬT DI TRUYỀN CỦA TÍNH TRẠNG Bài 5. PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TÍNH TRẠNG CHẤT LƢỢNG Mục đích nắm được đặc điểm của phương pháp phân tích di truyền để nghiên cứu bản chất di truyền ở mức cơ thể. Phân tích di truyền tính trạng chất lượng nhằm đánh giá tính trạng do một gen kiểm soát và hai gen kiểm soát. Áp dụng phép kiểm định Khi bình phương (χ2) để đánh giá kết quả. 5.1. PHƢƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH DI TRUYỀN 5.1.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp phân tích di truyền Nhƣ đã biết phân tích lai là phƣơng pháp cơ bản và đặc thù của di truyền học. Phƣơng pháp này bao gồm việc tiến hành lai và nghiên cứu sự di truyền các tính trạng và tính chất riêng rẽ ở cơ thể lai qua các thế hệ. Con cái thu đƣợc từ phép lai các dạng bố mẹ khác nhau về các tính trạng và tính chất di truyền gọi là con lai, còn quá trình thu nhận các con lai gọi là sự lai. Gregor Mendel là ngƣời đầu tiên đã tiến hành các thí nghiệm về lai hữu tính trên thực vật vào những năm 1856 – 1865, cụ thể là ở đậu Hà Lan. Ông theo dõi tỷ mỉ sự biểu hiện các tính trạng của các dạng bố mẹ, đem lai ở các thế hệ lai kế tiếp nhau và đã rút ra những quy luật cơ bản đặt nền móng cho sự ra đời của di truyền học sau này. Sở dĩ Mendel thu đƣợc kết quả nhƣ vậy vì ông đã không đi theo phƣơng pháp nghiên cứu của các tác giả đƣơng thời, mà tiến hành với các phƣơng pháp nghiên cứu riêng, độc đáo của mình và sau đó đã trở thành cơ sở của phƣơng pháp phân tích di truyền: 1. Để lai cần chọn các bố mẹ khởi đầu là những cây thuần chủng (đƣợc chọn lọc qua nhiều đời tự thụ phấn, các tính trạng nghiên cứu đã đƣợc ổn định) phân biệt theo một số tính trạng tƣơng phản rõ nét. Khi tiến hành lai và theo dõi qua các thế hệ, ông chỉ chú ý đến cặp tính trạng tƣơng phản quan tâm, bỏ qua các tính trạng khác. 2. Trong mỗi thế hệ lai, cần nghiên cứu mỗi cặp tính trạng tƣơng phản một cách riêng rẽ, không tính đến những sai khác giữa các cây lai. 3. Sử dụng toán thống kê để tính toán một cách chặt chẽ số lƣợng các con lai theo từng tính trạng tƣơng phản ở các thế hệ. 4. Tiến hành phân tích di truyền các tính trạng ở con lai theo từng cá thể một cách riêng rẽ qua các thế hệ. Sau khi phân tích các thí nghiệm, Mendel đã rút ra các quy luật cơ bản về sự truyền đạt các tính trạng qua các thế hệ, đó là sự di truyền theo các nhân tố tách biệt (không phải theo tính chất hòa hợp nhƣ trong thuyết Pangen của Darwin). Điều đó nói lên tính trạng đƣợc kiểm tra bởi nhân tố di truyền mà sau này đƣợc gọi là gen. 51
Mặc dù chƣa có những minh chứng về tính kế thừa vật chất di truyền qua các thế hệ, nhƣng Mendel đã tiên đoán về quy luật này. Đó là giả thuyết của ông về nhân tố di truyền tồn tại theo một ở giao tử và tồn tại theo hai ở cơ thể, từ đó đã đƣa ra các sơ đồ diễn giải các quá trình di truyền. Khoa học về sau đã phát hiện ra đôi nhiễm sắc thể tƣơng đồng và cơ sở kế thừa vật chất di truyền qua các thế hệ. Những đóng góp to lớn của Mendel thể hiện ở sự thiết lập các quy luật cơ bản về sự di truyền và đặt nền móng cho phát triển di truyền hiện đại. Ngày nay trong phân tích di truyền các tính trạng nhân loại vẫn tuân thủ và thực hiện theo các đặc điểm của phƣơng pháp phân tích di truyền mà Mendel đƣa ra. Các kí hiệu thƣờng đƣợc sử dụng trong phân tích di truyền: – P – bố mẹ. Mẹ kí hiệu ♀, bố kí hiệu ♂. – Lai hữu tính kí hiệu bằng dấu nhân (x), trong sơ đồ lai thƣờng viết mẹ trƣớc bố sau. – F – chỉ thế hệ con lai, các chỉ số F1, F2…Fn là các thế hệ thứ nhất, thứ hai,… thứ n. – Con lai lai lại với bố mẹ kí hiệu Fb. 5.1.2. Nguyên tắc về kỹ thuật lai ở một số cây trồng 5.1.2.1. Nguyên tắc chung Kỹ thuật lai ở thực vật đƣợc thực hiện bằng việc đƣa phấn lên nhụy hoa do con ngƣời tiến hành. Kỹ thuật chi tiết của việc lai tạo thƣờng là khác nhau và có đặc trƣng riêng, phụ thuộc vào từng đối tƣợng cụ thể. Nhƣng kỹ thuật lai của các loại cây trồng đều bao gồm các bƣớc: Chọn cặp bố mẹ và chuẩn bị cây lai; khử đực và bao cách ly và thụ phấn. a. Công việc chuẩn bị cho lai Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết nhƣ: Panh, kéo, thẻ đánh dấu, bao cách ly, lọ/túi màu đen đựng hạt phấn. Bao cách ly có thể đƣợc làm từ giấy dầu hay những mảnh polyetylen cắt theo hình chữ nhật với kích thƣớc cần thiết. Gấp đôi, gấp các mép và dán hay khâu lại đối với giấy dầu, còn nếu dùng polyetylen thì có thể sử dụng một mỏ hàn nhiệt để dán lại. Bao cách ly phải có độ trong cần thiết và đủ dai khi gặp mƣa, nhanh khô khi bị ƣớt. Thẻ đánh dấu có thể đƣợc làm từ giấy dầu, cắt thành các dải rộng 4 – 5cm. Sau đó cắt dải giấy thành những đoạn từ 10 – 12 cm. Sử dụng những đoạn giấy này làm thẻ, mỗi thẻ đục một lỗ ở mép và luồn một sợi dây nhỏ hay chỉ khâu để buộc lên cây. b. Chọn cây bố mẹ và chuẩn bị cây lai Sau khi đã xác định đƣợc tổ hợp lai, chọn đƣợc cặp bố mẹ cần trồng cây để có vật liệu lai. Thƣờng thì cây lai đƣợc trồng ở ruộng riêng, đƣợc chăm sóc chu đáo để chúng sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng. Cần nghiên cứu kỹ vật liệu lai để bố trí sao cho 52
cây bố và cây mẹ nở hoa trùng khớp. Nếu cần có thể sử dụng các biện pháp đặc biệt để điều chỉnh bố mẹ ra hoa cùng nhau nhƣ xử lý ánh sáng, xử lý nhiệt độ thấp, dùng chất điều tiết sinh trƣởng… Chọn cây sinh trƣởng tốt, khỏe mạnh, điển hình, trồng ở ruộng kỹ thuật cao hoặc trồng trong chậu ở trong nhà kính để dễ chăm sóc và bảo quản. Để khử đực thụ phấn có hiệu quả cần nghiên cứu cấu tạo hoa, thời gian nở hoa, sức sống hạt phấn, cấu tạo nhụy cái. Điều chỉnh thời gian nở hoa bằng cách gieo lệch ngày (giống ra hoa sớm gieo sau). Chọn cây lai, cắt bỏ các cây không dùng cho phép lai, loại bỏ lá chết, lá vàng úa, cắt bỏ hoa thừa. Trong các cây đƣợc dùng để lai chọn những chùm hoa, những hoa ra sớm nhất, loại bỏ các hoa phát triển không đầy đủ (chƣa hoàn chỉnh) hay những hoa đã tàn, chỉ để lại những hoa dùng cho lai. Ngoài ra còn bỏ tất cả các phần của cụm hoa và của hoa làm cản trở đến việc khử đực và thụ phấn. Ví dụ: Với lúa, ở cây mẹ chỉ cần giữ một số hoa nhất định 15 – 20 hoa/bông, hoa không non, không già và có bao phấn mọc đến 2/3 vỏ trấu. c. Khử đực và bao cách ly Khử đực: Là việc tách tất cả các bao phấn ra khỏi hoa cây mẹ để phấn của nó không rơi vào đầu nhụy. Việc khử đực đƣợc thực hiện cả ở cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Đối với các cây có hoa đơn tính mà ở chúng hoa đực hoàn toàn riêng rẽ thì không cần khử đực, công việc đơn giản là cắt bỏ hoa đực vào những lúc thích hợp (ví dụ ở ngô, bầu bí và ở các cây khác). Các hoa ở cây mẹ phải đƣợc khử đực triệt để trƣớc khi nhị đực tung phấn. Đây là khâu quan trọng đặc biệt ở cây tự thụ phấn. Khi khử đực không đƣợc làm tổn thƣơng nhụy, không làm vỡ bao phấn và phải loại bỏ hết nhị. Thông thƣờng ở hầu hết các loài cây trồng đều tiến hành khử đực vào chiều hôm trƣớc và thụ phấn vào sáng hôm sau. Tuy nhiên, cần nghiên cứu kỹ đặc tính nở hoa của từng loài cây để xác định thời điểm khử đực tốt nhất sao cho bộ phận đực bị tiêu diệt nhƣng bộ phận cái vẫn nguyên vẹn, sức sống bình thƣờng. Có rất nhiều phƣơng pháp khử đực khác nhau đƣợc xếp thành 3 nhóm: 1) Khử đực bằng tay: Những loại cây có hoa đủ lớn, dễ phân biệt các bộ phận của hoa (lúa, cà chua, đậu…) dùng panh gắp bỏ hết bao phấn ở hoa của cây mẹ, không làm tổn thƣơng đầu vòi nhụy; 2) Khử đực bằng máy: Dùng máy hút chân không có vòi nhỏ để hút bỏ các bao phấn và 3) Khử đực bằng hóa chất: Áp dụng cho những cây có hoa rất nhỏ, xử lý hóa chất vào thời kỳ phân hóa hoa để diệt giao tử đực mà không làm ảnh hƣởng đến giao tử cái. Các loại hóa chất thƣờng dùng là Hydrazid của axít malic, ester thơm. Nhìn chung, khi khử đực thƣờng để lại bao hoa (vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc nảy mầm của hạt phấn và sự lớn lên của ống phấn). Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp cần thiết khi khó tách các bao phấn ở những cây có hoa rất bé (ví dụ hoa đậu tƣơng) và với mục đích nâng cao hiệu suất lao động thì mới tiến hành khử đực đồng thời với việc tách cả bao hoa. 53
Sau khi khử đực, dùng thẻ ghi tên giống, ngƣời khử, ngày khử và cần bao cách ly để tránh sự xâm nhập của hạt phấn lạ. Đối với các cây có hoa đơn tính hoặc các dòng bất dục thì không cần khủ đực mà chỉ cần bao cách ly trƣớc khi hoa nở từ 12 – 20 giờ. Vật liệu cách ly thƣờng dùng là túi giấy dầu hay polyetylen (kích thƣớc của bao tùy thuộc vào đối tƣợng nghiên cứu), có độ trong cần thiết và đủ dai khi gặp mƣa, nhanh khô khi bị ƣớt (nhƣ trình bày ở mục a). Ở chỗ buộc bao dƣới lớp polyetylen hay giấy dầu cần lót một lớp bông mỏng để ngăn cản sự xâm nhập của côn trùng. d. Thụ phấn Thụ phấn là việc đƣa vào vòi nhụy hoa cây mẹ phấn của hoa cây bố (cây cho), đƣợc tiến hành sau khi khử đực một vài ngày tùy thuộc vào đối tƣợng và điều kiện thời tiết. Thời tiết lạnh, trời u ám và mƣa nhiều làm chậm trễ sự chín của nhụy và các bao phấn, còn thời tiết khô và nóng thúc đẩy quá trình này nhanh hơn. Việc thụ phấn phải tiến hành vào lúc nhụy hoa hoàn toàn chín và sẵn sàng tiếp nhận hạt phấn. Tuổi của hạt phấn thích hợp nhất cho việc thụ phấn và thời gian sống của nó đƣợc xác định theo khả năng tạo hạt của nhụy. Ở một số trƣờng hợp đặc biệt sẽ tiến hành thụ phấn lặp lại (tức là đƣa hạt phấn lên nhụy liên tục một số ngày). Hoa của cây bố có phấn đã chín đƣợc thu thập cho vào một hộp, sau đó đƣa hạt phấn lên đầu nhụy bằng bút lông mềm hoặc một dụng cụ khác nào đó. Thời điểm thụ phấn tốt nhất là buổi sáng vào lúc hoa nở tự nhiên (khoảng từ 7 – 10 giờ). Không thụ phấn cho hoa vào lúc mƣa hay những lúc quá nóng trong ngày. Sau khi thụ phấn ghi vào thẻ tổ hợp lai, ngƣời thụ phấn, ngày thụ phấn sau đó đeo thẻ lên cây mẹ. Nên lai với một số lƣợng nhất định để ở F1 có khoảng 100 cây lai, F2 có từ 500 – 1.000 cây. Số lƣợng hoa lai này bảo đảm tạo đƣợc nhiều dạng lai. Cây lai sau đó phải đƣợc theo dõi thƣờng xuyên để phòng chống dịch hại cây, quả và hạt lai. Bón đầy đủ dinh dƣỡng để cây sinh trƣởng phát triển tốt. Khi hạt lai chín phải thu hoạch kịp thời, ghi ngày thu hoạch, bảo quản hạt lai cẩn thận để sử dụng trong các giai đoạn tiếp theo. 5.1.2.2. Kỹ thuật lai ở ngô Hạt ngô của các dạng bố mẹ đƣợc gieo với khoảng cách 60 × 70 × 30, sao cho cứ hai hàng cây mẹ thì có một hàng cây bố và sau đó cắm một bảng đánh dấu các dạng bố mẹ ở gần hàng ngô đã gieo. Đối với cây mẹ, khi cây mới nhú cờ thì cần loại bỏ ngay đi, không để cho bông cờ xòe ra và phơi màu. Lúc bắp mới nhú khỏi bẹ lá trƣớc khi phun râu thì phải dùng bao cách ly bao bắp lại. Cờ ngô cũng đƣợc bao cách ly bằng giấy dầu hay giấy bóng mờ (polyetylen) vào lúc bắt đầu nở hoa (tung phấn) và không muộn hơn 24 tiếng trƣớc khi thụ phấn. Khi cây mẹ phun râu, tiến hành thu phấn từ cây bố, lấy phấn vào lúc 7 – 8 giờ sáng. Nhẹ nhàng rung các phấn vào bao cách ly cờ, sau đó đem rắc lên các vòi nhụy (râu ngô). Sau khi thụ phấn, dùng túi cách ly bao kín bắp lại, khi râu đã thâm hết thì bỏ bao cách ly đi. Mỗi bắp buộc một thẻ ghi công thức lai, ngày thụ phấn. Những hạt chín trên bắp ngô ở năm lai là thế hệ hạt lai F1. Trên chúng có thể quan sát đƣợc biểu hiện của 54
tính trạng trội. Năm sau gieo hạt F1, mọc thành cây F1, cho chúng tự thụ phấn bắt buộc sẽ thu đƣợc hạt lai F2. Tập trung các hạt F2 để phân tích sự di truyền của những tính trạng cần nghiên cứu. 5.1.2.3. Kỹ thuật lai ở đậu Hà Lan Hạt đậu Hà Lan của các dạng bố mẹ đã chọn đƣợc gieo trong vƣờn thí nghiệm với hàng cách hàng 50 – 60 cm, nếu gieo dày quá sẽ không thuận tiện cho việc tiến hành lai. Sau đó, các cây con cần đƣợc buộc vào giàn/giá đỡ cứng (có thể làm bằng tre hay nứa). Hình 5.1. Lai hữu tính ở đậu Hà Lan Nguồn: https://hoc24.vn/ly–thuyet/quy–luat–phan–li.147/ Ở giai đoạn ra nụ: Khi các nụ non còn có màu xanh nhạt thì tiến hành khử đực. Nếu các hoa đã mọc thành 2 – 3 chiếc một ở nách lá thì ở chúng đã xảy ra tự thụ phấn. Những nụ hoa quá non cũng không thích hợp với việc khử đực cần loại bỏ. Thao tác tiến hành khử đực cho đậu Hà Lan nhƣ sau: Ngón tay trái giữ đài hoa, tay phải dùng panh tách cánh hoa để xuống dƣới. Sau đó vứt bỏ tất cả nhị. Các hoa đã 55
đƣợc khử đực của cây mẹ đƣợc thụ phấn bằng phấn của cây cho (cây bố). Việc thụ phấn cho đậu Hà Lan có thể tiến hành ngay sau khi khử đực. Nếu việc thụ phấn đƣợc tiến hành 1 – 2 ngày sau khi khử đực tức là lúc nhụy đã chín thì các hoa đã khử phải đƣợc phủ bao cách ly ngay. Mang bao phấn của cây bố để cho hạt phấn tiếp xúc với đầu nhụy của hoa đã đƣợc khử đực, cũng có thể tập trung các hạt phấn của các cây bố vào đĩa petri rồi dùng bút lông mềm đƣa phấn vào đầu nhụy hoa mẹ. Các hoa đã đƣợc khử đực và thụ phấn cần đƣợc bao bằng bao cách ly ngay. Vài ngày sau khi thụ phấn, khi hạt phấn bắt đầu hình thành cần bỏ bao cách ly. Những hạt trong quả đậu ở năm lai đã là thế hệ lai thứ nhất (F1), trên chúng có thể quan sát sự biểu hiện của tính trạng trội. Vụ sau/năm sau, gieo các hạt F1 mới thành cây F1, trong quả của chúng do tự thụ phấn tạo nên hạt lai F2. Tập trung các hạt lai F2 để phân tích sự di truyền của những tính trạng cần nghiên cứu. 5.2. CÁC QUY LUẬT DI TRUYỀN 5.2.1. Lai theo một cặp tính trạng 5.2.1.1. Quy luật tính trội và phân ly tính trạng Lai theo một cặp tính trạng là phép lai trong đó các dạng bố mẹ phân biệt bởi một cặp tính trạng tƣơng phản. Từ những kết quả các thí nghiệm của Mendel nghiên cứu cho thấy, ở thế hệ F1 chỉ có một tính trạng giống với bố mẹ đƣợc biểu hiện, đó là tính trạng trội. Từ đó ông đƣa ra quy luật tính trội – quy luật 1, hay còn gọi là quy luật về sự biểu hiện đồng nhất của con lai F1: ―Khi lai giữa các bố mẹ thuần chủng phân biệt bởi một cặp tính trạng tương phản, ở con lai F1 chỉ biểu hiện tính trạng trội thuộc về bố hoặc mẹ”. Sau đó Mendel cho các con lai F1 tự thụ phấn thì ở thế hệ F2 ông thu đƣợc cả hai kiểu hình của bố mẹ ban đầu với tỷ lệ xấp xỉ 3/4 trội và 1/4 lặn. Nhƣ vậy, tính trạng lặn bị che khuất ở F1 đã thể hiện ở quần thể F2, hiện tƣợng này gọi là sự phân ly tính trạng. Từ kết quả trên Mendel đã đƣa ra quy luật phân ly tính trạng – quy luật 2: ―Khi lai giữa các bố mẹ thuần chủng phân biệt bởi một cặp tính trạng tương phản, ở con lai F 2 biểu hiện cả tính trạng trội và tính trạng lặn với tỷ lệ 3:1‖. Ví dụ: Đối với tính trạng màu sắc hoa, ký hiệu nhân tố di truyền kiểm tra hoa màu tím – A, màu trắng – a, từ đó sơ đồ diễn tả sự di truyền trong lai theo một cặp tính trạng đƣợc trình bày nhƣ hình 5.2. Ở con lai F1 (Aa), mặc dù nhân tố lặn không thể hiện, song nó (a) không bị hòa lẫn vào nhân tố trội (A), tới thế hệ sau tính trạng lặn đƣợc thể hiện ở kiểu phân ly (aa). Rõ ràng con lai F1 có cấu trúc di truyền Aa đã tạo thành giao tử có theo một nhân tố di truyền A và a với tỷ lệ tƣơng đƣơng. Vấn đề này gọi là thuyết giao tử thuần khiết. Về sau, nhân tố di truyền kiểm tra tính trạng đƣợc W. Johansen (1909) đề xuất gọi là gen. 56
Hình 5.2. Sơ đồ lai của thí nghiệm lai theo một cặp tính trạng Nguồn: http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch14/segregation.html Trong thí nghiệm của Mendel, hạt của từng cây F2 đƣợc theo dõi riêng, đời F3 đã cho thấy rằng 1/4 cây của F2 sinh ra kiểu hình lặn tất cả đều là các cây lặn thuần chủng; điều đó có nghĩa là tất cả con cái của chúng là lặn. Tuy nhiên, trong số 3/4 các cá thể biểu hiện kiểu hình trội (ví dụ, màu sắc hoa tím), có hai phần tiếp tục phân ly, còn một phần đƣợc ổn định dạng hoa tím. Nhƣ vậy, kiểu hình trội ở F2 không đồng nhất về kiểu gen, có hai phần là dị hợp tử (2Aa), một phần là đồng hợp tử (1AA). Trong khi đó, hậu thế của dạng hạt nhăn có sự thể hiện đồng nhất là hạt nhăn, nhƣ thế, kiểu gen lăn thể hiện ở trạng thái đồng hợp tử (aa), toàn bộ chúng có kiểu gen tƣơng ứng với kiểu hình. Hình 5.3. Sơ đồ phân ly tính trạng màu sắc hoa ở thế hệ F3 Nguồn: https://hoc24.vn/ly–thuyet/quy–luat–phan–li.147/ 57
Điều kiện nghiệm đúng quy luật phân ly tính trạng (theo kiểu hình 3 trội : 1 lặn; theo kiểu gen 1AA : 2Aa : 1aa) nhƣ sau: – Các dạng bố mẹ phải thuần chủng, phân biệt bởi các cặp tính trạng tƣơng phản. – Tính trạng nghiên cứu trội hoàn toàn (giao tử thuần khiết). – Số lƣợng cá thể phân tích ở thế hệ lai phải đủ lớn. Ở trƣờng hợp lai theo một cặp tính trạng, sự phân ly về kiểu hình (3:1), kiểu gen (1:2:1)… gọi là những kết quả trông chờ, hay lý thuyết. Sự chênh lệch giữa kết quả thu đƣợc qua thực nghiệm với kết quả lý thuyết có thể ở mức nhỏ, mang tính ngẫu nhiên (có thể bỏ qua), hoặc sự chênh lệch này là lớn, mang tính quy luật, khi ấy cần tìm các nguyên nhân giải thích. Để kiểm chứng sự tƣơng ứng giữa kết quả thực tế thu đƣợc và 2 kết quả lý thuyết trông chờ, giới nghiên cứu thƣờng sử dụng phƣơng pháp kiểm định χ – khi bình phƣơng. 5.2.1.2. Lai phân tích Sự phân ly ở F2 về kiểu hình (3A– : 1aa) và kiểu gen (1AA : 2Aa : 1aa) chỉ có thể thu đƣợc khi kiểu dị hợp tử F1 (Aa) tạo ra hai dạng giao tử với tỷ lệ tƣơng đƣơng (1A : 1a). Để kiểm tra sự phân ly này, đã tiến hành phép lai F1 với bố hoặc mẹ có kiểu gen đồng hợp tử lặn (aa), phép lai này gọi là lai phân tích (Hình 5.4). Nhƣ vậy có thể hiểu: Lai phân tích là phép lai giữa cá thể có kiểu hình trội cần xác định kiểu gen (AA hoặc Aa) với một cá thể có kiểu hình lặn (aa), mục đích là kiểm tra (xác định) kiểu gen của cá thể có kiểu hình trội. Hình 5.4. Sơ đồ lai phân tích về tính trạng màu sắc hoa ở đậu Hà Lan Nguồn: https://hoc24.vn/ly–thuyet/quy–luat–phan–li.147/ 58
– Nếu cá thể có kiểu hình trội đem lai là thuần chủng (AA), con lai xuất hiện có tỉ lệ 100% kiểu hình trội. – Nếu cá thể đem lai là dị hợp tử (Aa) sẽ xuất hiện tỉ lệ 1 : 1 (Hai kiểu hình phân ly thu đƣợc ở đời Fb : hoa tím, hoa trắng có tỷ lệ bằng nhau, chứng tỏ kiểu dị hợp tử F1 đã tạo ra hai dạng giao tử với tỷ lệ tƣơng đƣơng). Tỷ lệ 1 : 1 là tỷ lệ đặc trưng của phép lai phân tích. Nhƣ vậy, phép lai phân tích cho phép xác định được bản chất di truyền của con lai. Thông qua kết quả phân ly về kiểu hình và kiểu gen ở Fb, rút ra được các dạng giao tử và tỷ lệ của chúng được hình thành từ kiểu gen đem phân tích. Phép lai này có nhiều ứng dụng trong phân tích di truyền. 5.2.1.3. Di truyền trội không hoàn toàn (di truyền trung gian) Một trƣờng hợp khác với thí nghiệm của Mendel là cơ thể lai F1 mang tính trạng trung gian giữa bố và mẹ (di truyền trung gian hay di truyền trội lặn không hoàn toàn). Ở trƣờng hợp tính trạng thể hiện trội không hoàn toàn (kí hiệu chữ cái lớn có gạch ở trên – Ā) kiểu dị hợp tử (Āa) có biểu hiện kiểu hình khác với kiểu đồng hợp tử trội (ĀĀ). Ở đây, kết quả thu đƣợc sự tƣơng ứng về phân ly kiểu gen và phân ly kiểu hình (nói cách khác đây là trƣờng hợp tỷ lệ phân ly về kiểu gen tƣơng ứng với tỷ lệ phân ly về kiểu hình). Ví dụ, ở cây hoa phấn (Mirabilis jalapa) lai giữa dạng hoa đỏ và dạng hoa trắng, con lai F1 có dạng hoa hồng (trung gian). Ở F2 thu đƣợc sự phân ly theo 1 đỏ : 2 hồng : 1 trắng (Hình 5.5.). Hình 5.5. Hiện tƣợng di truyền trội lặn không hoàn toàn ở cây hoa phấn 59
Trƣờng hợp này có thể giải thích rằng, kiểu đồng hợp tử trội ĀĀ tạo sắc tố màu đỏ, kiểu aa không có sắc tố thể hiện màu trắng, kiểu dị hợp tử Āa không đủ sắc tố màu đỏ nên có màu hồng (trung gian). Hiện tƣợng tính trạng thể hiện trội không hoàn toàn quan sát thấy ở nhiều đối tƣợng sinh vật, ví dụ: Tính trạng màu sắc hoa cây cẩm chƣớng hay màu sắc quả cà tím… (Hình 5.6). (A) (B) Hình 5.6. (A) – Màu sắc hoa cẩm chƣớng (bên trái – đỏ; giữa – hồng; bên phải – trắng) và (B) – màu sắc quả cà tím (bên trái – tím đậm; bên phải – tím nhạt) 5.2.1.4. Di truyền đồng trội Di truyền đồng trội là đó là trƣờng hợp khi trong kiểu gen của một cơ thể có hai gen trội alen với nhau cùng biểu hiện tính trạng. Các alen nhƣ thế đƣợc gọi là các alen đồng trội. Điển hình là trƣờng hợp di truyền tính trạng nhóm máu AB của hệ nhóm máu ABO và nhóm máu MN của hệ nhóm máu M – N ở ngƣời (Hình 5.7). Ví dụ 1. Ở ngƣời, trong hệ nhóm máu ABO, các alen IA và IB át chế hoàn toàn alen IO (i) và giữa chúng có tác động ngang nhau (tức là IA, IB trội tƣơng đƣơng với nhau và trội hơn IO). Một cặp vợ chồng, trong đó ngƣời vợ có nhóm máu A với kiểu gen IAIO (hoặc IAi), còn ngƣời chồng có nhóm máu B với kiểu gen là IBIO (hoặc IBi). Khả năng cặp vợ chồng này sinh ra các con có thể có các nhóm máu là: A (IAi); B (IBi); AB (IAIB) và nhóm máu O (ii). Ngƣời con có nhóm máu AB, kiểu gen là IAIB nhận đồng thời hai alen 60
trội tƣơng đƣơng: IA từ mẹ và IB từ bố. Hiện tƣợng này là gọi là di truyền đồng trội (Hình 5.7a). Ví dụ 2. Trong hệ nhóm máu M – N (do một locus thuộc nhiễm sắc thể thƣờng kiểm soát) có hai alen trội tƣơng đƣơng nhau là LM và LN. Nhƣ thế, trong một quần thể sẽ có ba kiểu gen LMLM, LMLN và LNLN, tƣơng ứng với ba kiểu hình hay nhóm máu là M, MN và N. Ngƣời vợ có nhóm máu M, kiểu gen là LMLM lấy ngƣời chồng có nhóm máu N, kiểu gen là LNLN. Cặp vợ chồng này sinh ra ngƣời con có nhóm máu MN, kiểu gen là LMLN. Ngƣời con nhận đồng thời hai alen trội là LM từ mẹ và LN từ bố. Hiện tƣợng này gọi là di truyền đồng trội (Hình 5.7b). (a) (b) Hình 5.7. Sơ đồ hiện tƣợng di truyền đồng trội nhóm máu ở ngƣời (a) – Hệ nhóm máu ABO; (b) – Hệ nhóm máu M–N Ngoài ra hai ví dụ trên còn quan sát thấy hiện tƣợng di truyền đồng trội trên thực vật nhƣ màu sắc hoa của cây Trà, màu sắc lông của một số động vật nhƣ gà, ngựa, bò… (Hình 5.8). (a) (b) 61
(c) (d) Hình 5.8. Hiện tƣợng di truyền đồng trội ở thực vật và động vật (a) – màu sắc hoa cây Trà; (b) – màu sắc lông ở gà; (c) màu sắc lông ở ngựa; (d) màu sắc lông ở bò 5.2.2. Lai theo hai hay nhiều cặp tính trạng Phép lai giữa các dạng bố mẹ khác nhau về hai cặp tính trạng tƣơng phản gọi là lai hai tính trạng; khác nhau về nhiều cặp tính trạng gọi là lai nhiều cặp tính trạng. Trên cơ sở phân tích các dẫn liệu của thí nghiệm về hai cặp tính trạng Mendel đã đƣa ra quy luật thứ 3 – quy luật phân ly độc lập các tính trạng. 5.2.2.1. Quy luật phân ly độc lập các tính trạng Sau khi chứng minh các tính trạng tƣơng phản nghiên cứu đều di truyền theo một phƣơng thức (trội – lặn), Mendel quan tâm đến việc nghiên cứu sự phân ly đồng thời của hai cặp tính trạng trong cùng một phép lai. Trong thí nghiệm kinh điển của Mendel đã sử dụng các dòng bố mẹ phân biệt nhau đồng thời hai cặp tính trạng: Màu sắc tử diệp vàng (A) và màu sắc tử diệp xanh (a); Dạng hạt trơn (B) và dạng hạt nhăn (b). Bố mẹ là các đồng hợp tử: Vàng, trơn (AABB) và xanh, nhăn (aabb) đƣợc đƣa vào tổ hợp lai, sơ đồ quá trình di truyền trình bày ở hình 5.5. Hình 5.5. Lai theo hai cặp tính trạng ở đậu Hà Lan 62
Kết quả cho thấy, F1 dị hợp tử theo hai cặp gen (AaBb) thể hiện đồng nhất theo hai tính trạng trội hạt vàng, trơn. Ở F2 Mendel đã thu đƣợc bốn kiểu hình phân ly với số liệu sau: 315 hạt vàng, trơn : 108 hạt xanh, trơn : 101 hạt vàng, nhăn : 32 hạt xanh, nhăn. Kết quả này tƣơng ứng với tỷ lệ trông chờ (lý thuyết) là 9/16 : 3/16 : 3/16 : 1/16 (xử lý theo phƣơng pháp χ2 thu đƣợc χ2TN = 0,51, sự tƣơng ứng này là tin cậy). Kết quả về phân ly kiểu hình ở đây cho phép nhận định rằng, trƣờng hợp lai theo hai cặp tính trạng, xảy ra sự phân ly và tổ hợp của các alen đồng thời nhƣ sự phối hợp của hai lai đơn độc lập. Có thể giải thích nhƣ sau: – Nếu xét tỷ lệ phân ly của từng tính trạng ở F2, sẽ có: 315 + 101 = 416 vàng và 108 + 32 = 140 xanh, xấp xỉ 3 vàng : 1 xanh. Tƣơng tự, về hình dạng hạt, có 315 + 108 = 423 trơn và 101 + 32 = 133 nhăn, xấp xỉ 3 trơn : 1 nhăn. Điều đó chứng tỏ mỗi tính trạng đều tuân theo quy luật phân ly 3 trội : 1 lặn. – Bằng cách áp dụng quy tắc nhân xác suất của các biến cố độc lập (xem mục 2.3.2c), dễ dàng chứng minh đƣợc rằng sự phân ly của hai tỷ lệ này là hoàn toàn độc lập nhau nhƣ dự đoán ban đầu. Thật vậy, (3 vàng :1 xanh)(3 trơn :1nhăn) = 9 vàng, trơn : 3 vàng, nhăn : 3 xanh, trơn : 1 xanh, nhăn. Thu đƣợc các kết quả về phân ly F2 nhƣ trên, chứng tỏ F1 dị hợp tử theo hai gen (AaBb) đã tạo ra bốn dạng giao tử: AB, Ab, aB và ab với tỷ lệ tƣơng đƣơng (hình 5.5). Để kiểm tra sự kiện này Mendel đã tiến hành phép lai phân tích. Kết quả thu đƣợc bốn kiểu hình phân ly ở Fb : 55 vàng, tròn : 51 vàng, nhăn, 49 xanh, tròn, 53 xanh, nhăn. Xử lý theo phƣơng pháp χ2 cho thấy kết quả này tƣơng ứng với tỷ lệ 1 : 1 : 1 : 1. Cần lƣu ý rằng tỷ lệ 9:3:3:1 này cũng đƣợc Mendel tìm thấy trong khi lặp lại thí nghiệm với các tính trạng khác. Từ đó ông xây dựng nên quy luật phân ly độc lập các tính trạng hay quy luật 3: “Khi lai hai cơ thể bố mẹ thuần chủng phân biệt bởi hai cặp tính trạng tương phản thì sự di truyền của cặp tính trạng này không phụ thuộc vào sự di truyền của cặp tính trạng kia, kiểu hình ở F2 phân ly theo tỷ lệ 9:3:3:1”. Trong trƣờng hợp này, các alen của từng cặp gen phân ly độc lập, ngẫu nhiên, tạo nên các tổ hợp giao tử khác nhau – hai dạng giống thế hệ xuất phát, hai dạng tổ hợp mới tái tổ hợp. Những khả năng phối hợp khác nhau của các giao tử hình thành quần thể phân ly F2 : tỷ lệ phân ly kiểu hình 9 : 3 : 3 : 1, trong đó hai kiểu giống thế hệ xuất phát (9 vàng, tròn : 1 xanh, nhăn) và hai kiểu tổ hợp mới (3 vàng, nhăn : 3 xanh, tròn), gọi là các kiểu tái tổ hợp. 5.2.2.2. Lai theo nhiều cặp tính trạng Xuất phát từ phân tích sự di truyền của một đôi alen trong lai một cặp tính trạng, có thể xây dựng mô hình di truyền của hai và nhiều cặp tính trạng độc lập. Giả sử bố mẹ tham gia vào tổ hợp lai đƣợc phân biệt đồng thời theo ba cặp tính trạng tƣơng phản độc lập, sẽ có sơ đồ lai: P AA BB CC x aa bb cc → F1: Aa Bb Cc 63
F1 dị hợp tử theo 3 gen tạo tám dạng giao tử với tỷ lệ tƣơng đƣơng: 1ABC : 1ABc : 1Abc : 1AbC : 1aBC : 1aBc : 1 abC : 1abc, số lƣợng các dạng giao tử tƣơng ứng với 23. Kiểu hình phân ly F2 bao gồm 8 kiểu với tỷ lệ 27 : 9 : 9 : 9 : 3 : 3 : 3 : 1, tỷ lệ này ứng với triển khai của (3 : 1)3. Số lƣợng các kiểu gen ở F2 là 27 kiểu (3)3, có tỷ lệ tƣơng ứng với triển khai (1:2:1)3. Các công thức tổng quát dùng để dự tính trong lai nhiều cặp tính trạng trình bày ở bảng 5.1. Cần lƣu ý rằng, các tính toán này đƣợc thỏa mãn chỉ với điều kiện các cặp gen di truyền độc lập, tức nằm trên các cặp nhiễm sắc thể tƣơng đồng riêng biệt (Nguyễn Hồng Minh, 1999). Bảng 5.1. Công thức tổng quát dự tính trong lai theo nhiều cặp tính trạng Số dạng Số lượng Phân ly kiểu gen Phân ly kiểu hình Tỷ lệ dạng Số cặp gen giao tử ở tổ hợp ở Số Số đồng hợp tử dị hợp Tỷ lệ phân ly Tỷ lệ phân ly F1 F2 lượng lượng lặn ở F2 1 2 4 3 1:2:1 2 3:1 1/4 2 2 4 16 9 (1:2:1) 4 9:3:3:1 1/16 3 3 3 8 64 27 (1:2:1) 8 (3:1) 1/64 – – – – – – – – – – – – – – – – n n n n n n n n 2 4 3 (1:2:1) 2 (3:1) 1/4 5.2.3. Ứng dụng lý thuyết xác suất trong dự đoán và phân tích di truyền Để hiểu rõ hơn các phát hiện của Mendel và các nguyên lý của di truyền học nói chung, cũng nhƣ để vận dụng các kiến thức này một cách có hiệu quả vào trong học tập, nghiên cứu và thực tiễn đời sống–sản xuất, cần nắm vững một vài khái niệm và nguyên lý xác suất cơ bản dƣới đây. 5.2.3.1. Một số khái niệm và tính chất cơ bản của xác suất Xác suất (probability) đƣợc định nghĩa là số lần xảy ra một biến cố hay sự kiện (event) cụ thể chia cho tổng số cơ may mà biến cố đó có thể xảy ra. Nếu ký hiệu xác suất của biến cố A là P(A), m là số lần xuất hiện của A và n là tổng số phép thử hay toàn bộ số khả năng có thể có, khi đó: P(A) = m / n; trong đó 0 ≤m ≤n, và n > 0. Nhƣ vậy, 0 ≤ P(A) ≤ 1. Phép thử là việc thực hiện một nhóm các điều kiện xác định, ví dụ một thí nghiệm tung đồng xu hay gieo hột xúc xắc hoặc một phép lai cụ thể. Các kết quả khác nhau có thể có từ phép thử gọi là các biến cố, đƣợc ký hiệu bằng các chữ cái in hoa nhƣ A, B, C... Ví dụ: Khi tung một đồng xu, sự kiện xảy ra chỉ có thể là mặt sấp (S) hoặc ngửa (N) với xác suất tƣơng đƣơng là 0,5. Tƣơng tự, kiểu gen dị hợp Aa có thể tạo ra hai loại giao tử mang A và a với xác suất ngang nhau là 0,5 trong khi các kiểu gen đồng hợp 64
nhƣ aa chẳng hạn chỉ cho một loại giao tử mang a; vì vậy đời con của phép lai phân tích Aa × aa có tỷ lệ kỳ vọng là 0,5 Aa : 0,5 aa. Khi thực hiện phép thử có thể xuất hiện một trong các loại biến cố sau: – Biến cố ngẫu nhiên (A) là sự kiện có thể xảy ra nhƣng cũng có thể không, 0 ≤P(A) ≤1. – Biến cố chắc chắn (Ω) là sự kiện nhất thiết xảy ra, P(Ω) = 1. – Biến cố không thể có (Ø) là sự kiện nhất thiết không xảy ra, P(Ø) = 0. – Biến cố xung khắc: Hai biến cố A và B đƣợc gọi là đôi xung khắc với nhau nếu tích của chúng là một biến cố không thể có: A∩B = Ø ⇒ P(A∩B) = 0 và P(A∪B) = P(A) + P(B). – Biến cố đối lập: ―không A‖ (Ā) đƣợc gọi là biến cố đối lập của biến cố A khi Ā= Ω\ A và Ā∪A= Ω. Khi đó P(Ā) = 1 − P(A). – Nhóm đầy đủ các biến cố hay không gian biến cố sơ cấp (Ω) là tập hợp toàn bộ các biến cố sơ cấp (ω) của một phép thử mà khi đƣợc thực hiện thì nhất thiết một trong chúng phải xảy ra, và có hiện tƣợng xung khắc từng đôi. Ví dụ, dãy các biến cố B1, B2,..., Bn lập thành một nhóm đầy đủ nếu thoả mãn hai điều kiện: (i) tổng của chúng là một biến cố chắc chắn: B1∪ B2 ∪... ∪ Bn= Ω; và (ii) chúng xung khắc từng đôi một: BiBj = Ø; i≠j (i, j = 1,2,..., n). 5.2.3.2. Một số nguyên lý xác suất cơ bản a. Quy tắc cộng: Xác suất kết hợp của hai (hoặc nhiều) sự kiện xung khắc từng đôi xảy ra là tổng các xác suất riêng rẽ của chúng. (i) Với A, B là hai biến cố bất kỳ, có P(A∪B) =P(A) + P(B) − P(A∩B). (ii) Nếu A và B là hai biến cố xung khắc, thì: P(A∪B) =P(A) + P(B). (iii) Hệ quả: Nếu Ā là biến cố đối lập của A, thì P(Ā) = 1 − P(A). Ví dụ, với kiểu gen Yy, nếu ký hiệu xác suất của loại giao tử mang alen Y là P(Y) và của loại giao tử mang alen y là P(y), theo lý thuyết sẽ có: P(Y hoặc y) = P(Y) + P(y) = 1/2 +1/2 = 1. b. Xác suất điều kiện: Nếu A, B là hai biến cố bất kỳ và P(A) > 0, thì xác suất điều kiện của biến cố B với điều kiện biến cố A đã xảy ra là: P(B/A) = P(A∩B):P(A). Ví dụ: Từ kết quả thí nghiệm lai giữa hai thứ đậu thuần chủng hạt vàng và hạt xanh của Mendel, hãy tìm xác suất để một cây đậu hạt vàng ở F2 là thể dị hợp (Vv)? – Bằng lập luận thông thƣờng cho thấy trong số bốn kiểu tổ hợp ở F2 có 3 kiểu tổ hợp cho kiểu hình hạt vàng (V–) nhƣng chỉ có 2 kiểu là dị hợp (Vv). Vì vậy xác suất cần tìm là 2/3. – Nếu giải theo định nghĩa xác suất, ký hiệu: A là sự kiện hạt vàng ở F2 và B là sự kiện hạt vàng dị hợp. Theo lý thuyết, ở F2 có 4 sự kiện đồng khả năng với tỷ lệ là 1VV: 65
2Vv: 1vv. Ở đây P(A) = 3/4 và P(A.B) = P(B) = 2/4 ⇒ P(B/A) = P(A∩B) : P(A) = 2/4 : 3/4 = 2/3. c. Quy tắc nhân: Xác suất trùng hợp của cả hai biến cố độc lập bằng tích các xác suất riêng rẽ của chúng. Nghĩa là, nếu A và B là các biến cố độc lập thì: P(A∩B) = P(A).P(B). Ở đây có thể hiểu hai biến cố A và B được gọi là độc lập với nhau nếu P(B/A) = P(B) hoặc P(A/B) = P(A). Nghĩa là sự xảy ra hay không xảy ra của biến cố này không ảnh hưởng đến sự xảy ra của biến cố kia. Ví dụ: Khi gieo một đồng xu hai lần liên tiếp hoặc gieo hai đồng xu cân đối và đồng chất cùng một lƣợt thì có 4 khả năng xảy ra là (SS), (SN), (NS), (NN) với xác suất ngang nhau. Thật vậy, xác suất xuất hiện cả hai mặt sấp hoặc ngửa là: P(S,S) = P(N,N) = 1/2 × 1/2 = 1/4; còn xác suất xuất hiện một mặt sấp và một mặt ngữa là P(S,N) = 2 × 1/2 × 1/2 = 1/2; và tổng các xác suất của tất cả các sự kiện đó đƣơng nhiên bằng 1. Dựa trên cơ sở lý thuyết xác suất của phép thử độc lập và quy tắc nhân xác suất có thể xây dựng nguyên tắc giải bài toán lai hai hay nhiều cặp tính trạng. Nguyên tắc này, chủ yếu dùng để kiểm tra xem quy luật di truyền chi phối đồng thời cả hai hay nhiều cặp tính trạng nào đó trong một phép lai là độc lập hay liên kết (có thể là liên kết hoàn toàn hay liên kết không hoàn toàn), hoặc một tính trạng nào đó có liên kết với giới tính hay không. Nguyên tắc này nhƣ sau: – Nếu các gen phân ly độc lập và tổ hợp tự do, thì tỷ lệ phân ly đồng thời của cả hai hay nhiều cặp tính trạng bằng tích các tỷ lệ phân ly riêng rẽ của các cặp tính trạng đó, và ngược lại. Ví dụ: Kết quả của một phép lai hai cặp tính trạng có tỷ lệ phân ly là 3:3:1:1 và các tỷ lệ của từng cặp tính trạng là 3:1 và 1:1. Nhƣ vậy, các cặp tính trạng đó tuân theo quy luật phân ly độc lập, vì: 3:3:1:1 = (3:1)(1:1). – Nếu tích các tỷ lệ phân ly riêng rẽ của các tính trạng khác với tỷ lệ phân ly đồng thời của cả hai tính, chứng tỏ các tính trạng đó tuân theo quy luật di truyền liên kết. Ví dụ: Kết quả của một phép lai cho thấy tỷ lệ phân ly của cả hai cặp tính trạng là 1A–bb:2A–B–:1aabb hoặc 3A–B–:1aabb, trong khi tỷ lệ phân ly của mỗi cặp tính trạng vẫn là 3:1. Dễ dàng thấy rằng tích (3:1)(3:1) ≠ 1:2:1 hoặc 3:1, chứng tỏ các cặp tính trạng này tuân theo quy luật liên kết hoàn toàn, và kiểu gen của bố mẹ chúng đối với trƣờng hợp đầu là Ab/aB × Ab/aB hoặc AB/ab × Ab/aB, và trƣờng hợp sau là AB/ab × AB/ab. 5.2.3.3. Phương pháp kiểm định khi bình phương (χ2) Các số liệu thống kê thu đƣợc từ các thí nghiệm vốn sai khác ít nhiều so với các số liệu mang tính chất lý thuyết, tuỳ thuộc chủ yếu vào mẫu thí nghiệm và phƣơng pháp lấy mẫu. Trong trƣờng hợp đó, thƣờng đặt ra câu hỏi rằng liệu sự giả định ―xấp xỉ‖ có thật chắc chắn không? Hay nói theo ngôn ngữ thống kê, ―giả thuyết tƣơng đồng Ho đƣợc chấp nhận hay bị bác bỏ‖, nghĩa là kết quả thu đƣợc có thật là nghiệm đúng với tỷ lệ của một quy luật nào đó hay không? 66
Để có đƣợc câu trả lời thỏa đáng cho vấn đề này chỉ có cách là sử dụng trắc nghiệm 2 khi bình phƣơng (χ ). Đây là phƣơng pháp lƣợng hóa độ lệch giữa giá trị quan sát thực tế 2 với giá trị lý thuyết mong muốn. Có 3 loại kiểm định χ đƣợc áp dụng trong nghiên cứu di truyền học là kiểm định phù hợp, kiểm định đồng nhất và kiểm định độc lập. 2 a. Kiểm định χ phù hợp Trắc nghiệm khi bình phƣơng là một công cụ toán thống kê thông dụng cho phép kiểm tra độ phù hợp giữa các trị số thực tế quan sát đƣợc (observed, ký hiệu: O) và các trị số lý thuyết đƣợc kỳ vọng (expected, ký hiệu: E) của một giả thuyết hay phân phối thực nghiệm khoa học nào đó, hoặc để kiểm tra tính độc lập của hai đại lƣợng ngẫu nhiên. Nhờ đó có thể rút ra quy luật, hoặc hiệu quả của hai phƣơng pháp thí nghiệm nào đó. Các bước tiến hành kiểm định khi bình phương (χ2) thực hiện như sau: – Bước 1. Đƣa ra đƣợc giả thuyết (Ho), từ đó biết đƣợc tỷ lệ giả định về sự phân ly của tính trạng; – Bước 2. Xác định χ2TN dựa vào tỷ lệ giả định theo Ho ở trên và số liệu thực tế thu nhận đƣợc (đề bài cho), công thức tính là: 𝑂−𝐸 2 χ2TN = 𝐸 Trong đó: O – số liệu thực nghiệm; E – số liệu lý thuyết trông chờ; ∑ – Tổng số theo tất cả các lớp so sánh trong thực nghiệm. 2 2 – Bước 3. So sánh χ TN với χ LT (Khi bình phƣơng lý thuyết) để khẳng định giả thuyết đƣa ra có phù hợp hay không? Ở đây χ2LT là giá trị cho sẵn (tra bảng 5.2), đƣợc xác định dựa vào độ tự do k (k = n – 1, trong đó n là số lớp kiểu hình) và mức ý nghĩa α. Mức α = 0,05 thƣờng đƣợc dùng làm ranh giới phân chia giữa miền ấn định chấp nhận giả thuyết Ho và miền ấn định bác bỏ giả thuyết Ho. Nguyên tắc kiểm định sau: + χ2TN < χ2LT – sai khác có tính ngẫu nhiên, kết quả thực nghiệm phù hợp với giả thuyết đƣa ra (chấp nhận giả thiết Ho); + χ2TN > χ2LT – sai khác mang tính quy luật, kết quả thực nghiệm không phù hợp với giả thuyết đƣa ra, cần tìm giải thích khác. Với công thức tính χ2TN nêu trên sẽ gây khó khăn khi xác định χ2TN, để thuận tiện và dễ dàng tính toán χ2TN, tác giả đã xây dựng lại bảng tính χ2TN nhƣ sau: Đại lượng Tỷ lệ phân ly 2 2 2 Lớp theo lý thuyết O E d = O–E d = (O–E) χ2 = d /E kiểu hình (Ho) KH1 KH2 … Tổng 67
* Lưu ý: 2 Bởi vì χ là một hàm phân phối liên tục, do vậy để giảm thấp nhất sai số có thể 2 xảy ra khi kiểm định χ với kích cỡ mẫu (số lƣợng cá thể nghiên cứu) nhỏ, cần sử dụng 2 hệ số hiệu chỉnh Yates (½ hay 0,5). Công thức tính χ đƣợc hiệu chỉnh nhƣ sau: Tùy thuộc vào đặc điểm của từng thí nghiệm cụ thể mà đƣa ra quy định về ―kích cỡ mẫu nhỏ‖ khác nhau. Trong các mô hình thí nghiệm của chƣơng trình thực hành này, kích cỡ mẫu nhỏ đƣợc qui định là: Số lượng mẫu (số lượng cá thể) N ≤ 100 và độ tự do k = 1. Ví dụ: Trong thí nghiệm lai hai cặp tính trạng của Mendel, kết quả thu đƣợc về phân ly kiểu hình ở F2 là: 315 hạt vàng, trơn: 108 hạt xanh, trơn: 101 hạt vàng, nhăn: 32 hạt xanh, nhăn. Ta có thể xác định tỷ lệ phân ly nhƣ sau: – Kết quả thu đƣợc ở F2 cho thấy sự phân ly về kiểu hình xấp xỉ tỷ lệ 9:3:3:1. Đó chính là giả thuyết Ho cần kiểm tra. 2 – Xác định giá trị χ TN theo bảng: Đại lượng Tỷ lệ phân ly 2 2 2 Lớp theo lý thuyết O E d = O–E d = (O–E) χ2 = d /E kiểu hình (Ho) Vàng, trơn 9 315 313 2 4 0,01 Vàng, nhăn 3 101 104 –3 9 0,09 Xanh, trơn 3 108 104 4 16 0,15 Xanh, nhăn 1 32 35 –3 9 0,26 Tổng 16 556 0,51 2 Kết quả tính ở bảng cho thấy χ TN = 0,51. 2 2 2 – Với k = 4–1 = 3, ở mức α = 0,05 thì χ LT = 7,815 (tra bảng 5.2) → χ TN < χ LT, nên giả thuyết Ho hoàn toàn đƣợc chấp nhận. Nghĩa là kết quả thí nghiệm trên phù hợp một cách sít sao với tỷ lệ 9:3:3:1. Điều đó có nghĩa rằng sự sai khác giữa các số liệu thực và các con số lý thuyết tƣơng ứng là rất không đáng kể, không có ý nghĩa về phƣơng diện thống kê. Bảng 5.2. Bảng phân phối các giá trị chuẩn của χ2 Các mức ý nghĩa (α) Độ tự do (k) 0,20 0,05 0,01 1 1,642 3,814 6,635 2 3,219 5,991 9,210 3 4,642 7,815 11,341 4 5,989 9,488 13,277 5 7,289 11,070 15,086 68
Độ tự do (k) Các mức ý nghĩa (α) 6 8,558 12,592 16,812 7 9,803 14,067 18,475 8 11,030 15,507 20,090 9 12,242 16,919 21,666 10 13,442 18,307 23,209 2 a. Kiểm định χ đồng nhất Khi thực hiện các thí nghiệm riêng lẻ với cùng một mục đích nhƣ kiểm định tỉ lệ phân ly giao tử hay quy luật di truyền của một tính trạng nào đó, kết quả thu đƣợc có thể sẽ đƣa đến kết luận nhƣ nhau và cùng thỏa mãn mục đích hay giả thuyết đƣa ra ban đầu. Tuy nhiên, dù phƣơng tiện và phƣơng pháp thí nghiệm có giống nhau đi chăng nữa thì vẫn có những sai lệch trong quá trình thực hiện (do đó mà số liệu thí nghiệm thƣờng khác nhau). Hơn nữa, để có thể rút ra đƣợc những nhận định chung mang tính khái quát, các nhà nghiên cứu thƣờng phải khảo sát kết quả tổng hợp đƣợc ghi nhận từ rất nhiều thí nghiệm. Vì vậy, để tránh những trƣờng hợp này, các nhà nghiên cứu thƣờng phải kiểm định tính đồng nhất giữa các cá thể trƣớc khi quyết định gộp chung để khảo sát. 2 Đồng thời, mục đích của kiểm định χ đồng nhất là kiểm định tính đồng nhất của các kết quả thí nghiệm riêng lẻ. 2 * Công thức tính χ đồng nhất: χ2đồng nhất = ∑ χ2thành phần – χ2tổng số kđồng nhất = ∑ kthành phần – ktổng số Trong đó: ∑ χ2thành phần : Là tổng các giá trị χ2 thành phần từ các kết quả của các thí nghiệm riêng lẻ (không sử dụng hệ số hiệu chỉnh Yates trong trường hợp mẫu nhỏ). χ2tổng số : Là giá trị χ2 tính từ tổng cộng số liệu ở các thí nghiệm riêng lẻ. *Ví dụ: Kiểm định tính đồng nhất của sự phân ly kiểu hình hình dạng hạt của các cây đậu Hà Lan F1. Ho: Các cá thể F1 đồng nhất phân ly theo tỷ lệ kiểu hình ¾ hạt trơn : ¼ hạt nhăn. 2 Cây Hạt trơn Hạt nhăn χ thành phần dfthành phần 1 48 17 0,05 1 2 27 6 0,82 1 3 29 8 0,23 1 4 18 11 2,59 1 5 38 13 0,01 1 Tổng 160 55 3,7 5 2 Giá trị χ đồng nhất đƣợc tính nhƣ sau: 2 Tổng các χ thành phần = 3,7. 69
χ2tổng cộng = [(161 – 161,25)2]+[(55 – 53,75)2] = 0,0625 + 1,5625 = 1,625. χ2đồng nhất = 3,7 – 1,625 = 2,075. Tổng các df thành phần = 5. Dftổng cộng = 2 – 1 = 1. dfđồng nhất = 5 – 1 = 4. 2 2 Kết quả: χ tính,df = 4 = 2,075 < χ bảng,df=4; 5% = 9,49. Kết luận: Chấp nhận giả thuyết với độ tin cậy 50% < P < 75%. Nhƣ vậy, tất cả các cây F1 đều đồng nhất phân ly theo tỷ lệ 3 trơn: 1 nhăn. 2 b. Kiểm định χ độc lập Trong một số trƣờng hợp, thí nghiệm có thể đƣợc tiến hành ở những điều kiện khác nhau, do đó kết quả có thể có một số sai khác. Vấn đề đƣợc đặt ra là những sai khác này có thực sự quan trọng hay nói cách khác là môi trƣờng có thực sự làm cho kết qủa thí nghiệm trở nên khác nhau? Kiểm định tính độc lập giữa sự biểu hiện tính trạng và môi trƣờng thí nghiệm sẽ đƣợc thực hiện. * Ví dụ: Khảo sát kết quả phân ly ở thế hệ F2 tại hai địa điểm thí nghiệm khác nhau khi các cá thể dị hợp tử F1 tự thụ: Kiểu hình F2 (3 trội : 1 lặn) Địa điểm thí nghiệm Trội Lặn Tổng số 85 35 Địa điểm 1 120 (a) (b) 95 30 Địa điểm 2 125 (c) (d) 180 65 245 Tổng số (a+c) (b+d) N = (a+b+c+d) Ho: Giả sử tỷ lệ phân ly của các thí nghiệm không phụ thuộc vào địa điểm bố trí thí nghiệm đối với tỷ lệ phân ly kiểu hình ở F2 (3 trội : 1 lặn). 𝑎𝑑 − 𝑏𝑐 2 × 𝑁 χ2độ𝑐 𝑙ậ𝑝 = 𝑎+𝑏 𝑎+𝑐 𝑐+𝑑 𝑏+𝑑 [(85 × 30) − (35 × 95)]2 × 245 = = 0,838 85 + 35 85 + 95 95 + 30 35 + 30 χ2tính,df = 1 = 0,838 < χ2bảng,df=1; 5% = 3,84 Kết luận: Chấp nhận giả thuyết với độ tin cậy 25% < P < 50%. Nhƣ vậy, sự biểu hiện tính trạng phân ly theo tỷ lệ 3 trội: 1 lặn của các cây F1 không phụ thuộc vào môi trƣờng thí nghiệm. 5.2.4. Tƣơng tác giữa các gen không cùng alen Sau khi ra đời các quy luật di truyền của Mendel, đã xuất hiện nhiều công trình nghiên cứu trên các đối tƣợng khác nhau nhƣ: Bí ngô, đậu thơm, ớt ngọt, ngô, ruồi 70