Khóa luận tốt nghiệp: Đánh giá tính an toàn và tác dụng trên các thông số lipid máu của cao chiết từ lá cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) trên thực nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

----------

NÔNG THỊ TUYÊN

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN

VÀ TÁC DỤNG TRÊN CÁC THÔNG SỐ LIPID MÁU CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

---------

Người thực hiện: NÔNG THỊ TUYÊN

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN

VÀ TÁC DỤNG TRÊN CÁC THÔNG SỐ LIPID MÁU CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(DƯỢC HỌC)

Khóa : QH.2017.Y

Người hướng dẫn : ThS. BSNT. Phan Hồng Minh

TS. Mai Phương Thanh

Hà Nội – 2022

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “đánh giá tính an toàn và tác dụng trên các thông số lipid máu của cao chiết từ lá cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) trên thực nghiệm” là nội dung em đã chọn đề tài nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau 5 năm học tập và rèn luyện ngành Dược học tại trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Để hoàn thành được đề tài bên cạnh sự nỗ lực của bản thân từ những kiến thức được học em cũng nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và gia đình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô đang công tác tại trường Đại học Y dược thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và cung cấp cho em những kiến thức quan trọng để em có nền tảng nghiên cứu, hoàn thành khóa luận và là hành trang cần thiết cho sự nghiệp của em trong tương lai. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS. BSNT Phan Hồng Minh và TS. Mai Phương Thanh, giảng viên trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo em tận tình cả về kiến thức, kĩ năng, kinh nghiệm và thái độ làm việc để em có thể hoàn thành đề tài này một cách tốt nhất. Em cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ em về vật chất và tinh thần trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.

Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù em đã cố gắng hoàn thiện đề tài qua việc tham khảo tài liệu, trao đổi, tiếp thu những ý kiến góp ý nhưng không tránh khỏi có những thiếu sót. Em mong nhận được những ý kiến, đóng góp của quý thầy cô để khóa luận của em được hoàn thiện nhất.

Em xin trân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Diễn giải STT Kí hiệu

Poloxamer 407 P-407 1

Rối loạn lipid máu 2 RLLPM

Lipoprotein tỉ trọng rất thấp 3 VLDL

Lipoprotein tỉ trọng trung bình IDL-C 4

Lipoprotein tỉ trọng thấp LDL-C 5

Lipoprotein tỉ trọng cao 6 HDL-C

Cholesterol toàn phần TC 7

Triglyceride TG 8

Cholesteryl-estertransfer-protein 9 CETP

Lecithin-cholesterol-acyltransferase 10 LCAT

Hepatic lipase 11 HL

Xơ vữa động mạch 12 XVĐM

Glutamat Oxaloacetat Transaminase 13 GOT

Glutamat pyruvat transaminase 14 GPT

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chuyển hóa lipid trong cơ thể ........................................................... 6

Hình 1.4: Điều trị RLLPM bằng thuốc .......................................................... 12

Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến thể trọng chuột cống trắng .............. 20

Hình 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến nồng độ creatinin trong máu chuột

cống trắng ........................................................................................................ 24

Hình 3.3: Nhuộm HE cho các mô gan với độ phóng đại 400x ....................... 25

Hình 3.4: Nhuộm HE cho các mô thận với độ phóng đại 400x ...................... 25

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Phân loại và đặc điểm của các lipoprotein huyết tương ................... 4

Bảng 1.6: Cây chè vằng tự nhiên và các sản phẩm cao chiết ......................... 13

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng tạo máu chuột cống trắng

......................................................................................................................... 21

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến độ hủy hoại tế bào gan chuột cống

trắng ................................................................................................................. 22

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng gan chuột cống trắng ..... 23

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của lô mô hình P-407 lên chuột nhắt trắng (mmol/L) . 26

Bảng 3.5: Tác dụng của cao chiết chè vằng lên các chỉ số lipid máu của chuột

nhắt trắng sau 24h tiêm P-407 (mmol/L) ........................................................ 26

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1 - TỔNG QUAN .............................................................................. 3

1.1. SINH LÝ HỌC LIPID MÁU .................................................................. 3

1.1.1. Lipid, cấu tạo của lipid ..................................................................... 3

1.1.2. Thành phần của lipoprotein .............................................................. 3

1.1.3. Phân loại lipoprotein ......................................................................... 3

1.1.4. Chuyển hóa lipoprotein ..................................................................... 5

1.2. SINH LÝ BỆNH RỐI LOẠN LIPID MÁU ........................................... 7

1.3. CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN LIPID MÁU ............................................... 9

1.4. ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU .................................................... 10

1.4.1. Không dùng thuốc ........................................................................... 10

1.4.2. Dùng thuốc ...................................................................................... 11

1.5. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG LIPID MÁU TRÊN THỰC NGHIỆM 12

1.6. GIỚI THIỆU VỀ CAO CHIẾT LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) .................................................................. 13

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 15

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................. 15

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 17

2.2.1. Đánh giá độc tính bán trường diễn ................................................. 17

2.2.2. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu dựa trên mô hình gây tăng cholesterol máu nội sinh ........................................................................... 18

2.2.3. Xử lý số liệu .................................................................................... 19

Chương 3 - KẾT QUẢ .................................................................................. 20

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ................................. 20

3.1.1. Tình trạng chung ............................................................................. 20

3.1.2. Sự thay đổi trọng lượng chuột cống trắng ...................................... 20

3.1.3. Đánh giá chức năng tạo máu........................................................... 21

3.1.4. Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan ............................................ 22

3.1.5. Đánh giá chức năng gan .................................................................. 23

3.1.7. Thay đổi về mô bệnh học sau 90 ngày uống thuốc ........................ 24

3.2. TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) TRÊN MÔ HÌNH RLLPM THEO CƠ CHẾ NỘI SINH .................................................................................................... 26

Chương 4 - BÀN LUẬN ................................................................................ 28

4.1. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN ...................................................... 28

4.2. HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) TRÊN CÁC THÀNH PHẦN LIPID MÁU ...................................................................... 31

4.2.1. Đánh giá mô hình tăng lipid máu nội sinh bằng P-407 .................. 31

4.2.2. Đánh giá mô hình thuốc đối chứng Atorvastatin 10 mg................. 32

4.2.3. Đánh giá tác dụng của cao chiết lá chè vằng trên các chỉ số lipid máu ............................................................................................................ 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Rối loạn lipid máu là yếu tố quan trọng cho việc hình thành và phát triển của bệnh xơ vữa động mạch, bệnh động mạch vành, động mạch não... Xơ vữa động mạch gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng, đe dọa tính mạng như: tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não...[13, 18, 19]. Rối loạn lipid máu chiếm tỷ lệ rất cao ở bệnh nhân cao tuổi tăng huyết áp, đặc biệt ở những bệnh nhân có các yếu tố nguy cơ tim mạch khác đi kèm như thừa cân, béo phì, uống nhiều rượu và ít vận động thể lực, theo tạp chí Y học Việt Nam (2022) thì tỷ lệ rối loạn lipid máu ở bệnh nhân cao tuổi tăng huyết áp là 88,0% [27]. Y học hiện đại đã áp dụng nhiều biện pháp để điều trị RLLPM: chế độ ăn uống, sinh hoạt điều độ, rèn luyện thể lực và dùng thuốc. Có nhiều nhóm thuốc có tác dụng điều chỉnh RLLPM như các dẫn xuất statin, nhóm fibrat, acid nicotinic, các chất gắn acid mật... Các thuốc trên đều đạt hiệu quả điều trị tốt nhưng có nhiều tác dụng không mong muốn như gây rối loạn tiêu hóa, đau đầu, chóng mặt, mất ngủ, suy giảm nhận thức, phản ứng ngoài da…, đặc biệt là gây tăng enzym gan, viêm cơ, tiêu cơ vân và có một tỷ lệ gây đột biến ảnh hưởng đến quá trình phát triển thai nhi [4, 29, 34]. Bên cạnh đó, chi phí điều trị bằng các thuốc này còn khá cao, trong khi bệnh thường phải điều trị dài ngày. Vì thế, một trong những xu hướng hiện nay là hướng về các thuốc có nguồn gốc tự nhiên, vừa mang lại hiệu quả điều trị, vừa hạn chế các tác dụng không mong muốn và giảm chi phí điều trị cho người bệnh [22].

Việt Nam là một nước có nguồn gốc dược liệu tự nhiên vô cùng phong phú với trên 5000 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật, 75 loại khoáng vật được dùng làm thuốc và 200 loài có tiềm năng khai thác và phát triển để trồng. Nhiều loài được xếp vào loại quý hiếm trên thế giới như: Sâm Ngọc Linh, thông đỏ, bách hợp… Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) từ lâu đã được ông cha ta dùng chữa viêm loét ngoài da, thông kinh, hoạt huyệt, chữa viêm tuyến sữa, trị thiếu máu, bổ gan, thải độc, ổn định huyết áp, kích thích tiêu hoá, ngủ ngon giấc, chống oxi hoá. Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về lá chè vằng để khai thác hết hiệu quả điều trị từ cao chiết này. Để có cơ sở khoa học giúp khai thác hết tiềm năng của chè vằng và lấy đó làm căn cứ cho việc sử dụng thuốc trên lâm sàng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “đánh

giá tính an toàn và tác dụng trên các thông số lipid máu của cao chiết từ lá cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) trên thực nghiệm” với hai mục tiêu như sau:

1. Đánh giá độc tính bán trường diễn của cao chiết lá chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) trên động vật thực nghiệm.

2. Đánh giá tác dụng trên các thông số lipid máu của cao chiết lá cây chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) trên chuột nhắt trắng.

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1. SINH LÝ HỌC LIPID MÁU

1.1.1. Lipid, cấu tạo của lipid

Lipid là thành phần quan trọng của màng tế bào. Lipid không tan trong nước nên để tuần hoàn được trong huyết tương và hệ bạch huyết, chúng phải kết hợp với protein đặc hiệu tạo thành phức hợp lipoprotein (LP) [2, 10]. Lipid là những sản phẩm ngưng tụ của các acid béo với alcol. Ngoài ra, lipid là danh từ chỉ dùng cho acid béo, cholesterol tự do và cholesterol este.

Trong cơ thể, lipid tồn tại dưới 3 dạng:

+ Cấu trúc: có trong tất cả các mô, tham gia cấu tạo màng tế bào, thành

phần là các loại lipid phức tạp, phổ biến là phospholipid.

+ Dự trữ: tạo nên lớp mỡ dưới da thành phần chủ yếu là triglycerid (TG).

+ Lưu hành: gồm phospholipid (PL), triglycerid (TG), cholesterol tự do

(FC), cholesterol este (CE) và acid béo tự do.

1.1.2. Thành phần của lipoprotein

Lipoprotein là những phân tử hình cầu gồm 2 phần: nhân và vỏ [1, 10]. Phần vỏ được cấu tạo bởi các phân tử lipid phân cực gồm phospholipid, cholesterol tự do và các apoprotein. Phần vỏ đảm bảo tính tan của LP trong huyết tương, có tác dụng vận chuyển các lipid không tan. Phần nhân: chứa triglycerid và cholesterol este hoá không phân cực.

1.1.3. Phân loại lipoprotein

Dựa vào tỷ trọng, lipoprotein được chia thành 5 loại, lipoprotein có hàm lượng lipid càng cao thì tỷ trọng càng thấp. Bao gồm: Chylomicron (CM), VLDL (lipoprotein tỷ trọng rất thấp), LDL (lipoprotein tỷ trọng thấp), IDL (lipoprotein tỷ trọng trung bình), HDL (lipoprotein tỷ trọng cao).

Bảng 1.1: Phân loại và đặc điểm của các lipoprotein huyết tương

Lipoprotein

Tỷ trọng (g/ml)

Đường kính trung bình (nm)

CM

< 0,950

500

Nguồn gốc: Ruột

Chức năng: Vận chuyển triglycerid ngoại sinh

VLDL

0,960 – 1,006

Nguồn gốc: Gan

Chức năng: Vận chuyển triglycerid nội sinh

IDL

1,007 – 1,019

Nguồn gốc: Sản phẩm chuyển hóa của VLDL

Chức năng: Tiền chất của LDL

LDL

1,020 – 1,063

Nguồn gốc: Sản phẩm chuyển hóa VLDL qua IDL

Chức năng: Vận chuyển cholesterol từ gan đến mô ngoại vi

HDL

1,064 – 1,210

Nguồn gốc: Gan, ruột

Chức năng: Vận chuyển cholesterol trở về gan

(Wiliam J.Marshall, Clinical chemistry, Fourth Edition, Mosby 2000)

Các thành phần trên được mô tả như sau:

+ Chylomicron (CM): Đây là loại lipoprotein với hàm lượng lipid cao nhất, vì vậy tỷ trọng của nó là nhỏ nhất. ApoB-48, apoE và apoC-II là các apoprotein chủ yếu của loại lipoprotein này. CM chỉ có mặt trong huyết tương một thời gian ngắn (khoảng vài giờ) sau bữa ăn giàu lipid, nhiệm vụ vận chuyển triglycerid trong thức ăn từ ruột tới gan. Loại này do thời gian tồn tại ít nên không gây nên các rối loạn trong cơ thể dù nhiều hay ít [21].

+ Lipoprotein tỷ trọng rất thấp (VLDL): Loại Lipoprotein này được tổng hợp tại gan, có tác dụng vận chuyển trigycerid nội sinh vào hệ tuần hoàn. Apoprotein của VLDL bao gồm ApoB-100, ApoC-I, ApoC-II và apoE. VLDL

được vận chuyển từ gan đến mô mỡ, hoạt hóa enzym lipoprotein lipase, xúc tác thủy phân trigycerid, giải phóng acid béo [21].

+ Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL): Là sản phẩm thoái hóa của VLDL trong máu, giàu cholesterol và cholesterol ester. Apoprotein của LDL là ApoB- 100. LDL có vai trò vận chuyển cholesterol đến các mô. Cholesterol trong LDL được coi là cholesterol xấu vì nó tham gia vào sự hình thành và phát triển các mảng xơ vữa động mạch, gây nên các bệnh tim mạch nguy hiểm [21].

+ Lipoprotein tỷ trọng trung gian (IDL): IDL chính là dạng chuyển hóa trung gian giữa LDL và VLDL. VLDL sau khi giải phóng trigycerid, nhận thêm cholesterol ester và mất đi ApoC sẽ chuyển thành IDL, sau đó nhanh chóng bị thoái hóa thành LDL [21].

+ Lipoprotein tỷ trọng cao (HDL): HDL được tạo thành ở gan và ruột non, nó giàu protein, hàm lượng lipid thấp. HDL có vai trò vận chuyển cholesterol ở các mô ngoại vi về gan để thoái hóa thành acid mật. Cholesterol của HDL được xem là cholesterol tốt vì chúng giúp bảo vệ thành mạch, giảm nguy cơ xơ vữa. Một số nghiên cứu cho rằng, HDL giúp loại trừ các mảng xơ vữa, hạn chế các mảng xơ vữa này phát triển. HDL cao giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh lý về tim mạch, ngược lại, khi HDL thấp thì khả năng mắc bệnh sẽ tăng lên [21, 33].

1.1.4. Chuyển hóa lipoprotein

Trong cơ thể, lipoprotein được tổng hợp theo 2 con đường: con đường

ngoại sinh và con đường nội sinh [8].

+ Con đường ngoại sinh: liên quan đến lipid do thức ăn đưa vào, sau khi ăn thức ăn giàu chất béo, triglycerid và cholesterol được hấp thu vào tế bào ruột dưới dạng acid béo và cholesterol tự do rồi được tái este hóa, sáp nhập và vận chuyển bởi phân tử chylomicron theo mạch bạch huyết vào tuần hoàn. Trong máu, lipoprotein lipase thủy phân triglycerid của chylomicron thành acid béo cung cấp cho mô, phần còn lại là chylomicron tồn dư bị gan thâu tóm.

+ Con đường nội sinh: liên quan đến lipid được tổng hợp tại gan: VLDL được tổng hợp ở gan, vận chuyển trong máu phần triglycerid bị thủy phân bởi lipoprotein lipase tạo acid béo cung cấp cho mô, phần còn lại là VLDL tồn dư

hay IDL. Khoảng một nửa IDL được chuyển hóa ở gan, phần còn lại tiếp tục bị thủy phân phần triglycerid thành acid béo cho mô, trở thành LDL. LDL bị thâu tóm bởi tương tác với receptor LDL màng tế bào, cung cấp cholesterol cho mô.

Ba enzym vận chuyển ngược cholesterol: cholesterol-estertransfer- protein (CETP), lecithin-cholesterol-acyltransferase (LCAT), và hepatic lipase cùng với HDL-C chịu trách nhiệm vận chuyển cholesterol dư thừa từ mô ngoại vi về gan thải trừ vào mật. Tại huyết tương, HDL-C gắn và hoạt hóa đặc hiệu LCAT, ester hóa cholesterol tự do ở bề mặt, cholesterol este được chuyển vào lõi HDL mới sinh ra tạo HDL mới. Tiếp đó, enzym CETP trung gian vận chuyển một triglycerid của LDL, VLDL hoặc chylomicron để trao đổi một cholesterol este với HDL. Cuối cùng, enzym hepatic lipase tạo ra IDL từ LDL và biến đổi HDL2 thành HDL3 trở về gan. Vì vậy cholesterol của HDL-C được coi là cơ chế chống xơ vữa động mạch quan trọng nhất.

Hình 1.1: Chuyển hóa lipid trong cơ thể

Ở người bình thường, quá trình tổng hợp và thoái hóa lipid được điều hòa bởi nhiều cơ chế và phụ thuộc vào nhu cầu cơ thể, nhờ đó mà duy trì được sự ổn định hàm lượng lipid và lipoprotein trong máu. Khi có sự bất thường, sẽ dẫn đến hội chứng rối loạn lipoprotein hay được gọi là rối loạn lipid máu.

1.2. SINH LÝ BỆNH RỐI LOẠN LIPID MÁU

Nguyên nhân và phân loại rối loạn lipid máu

Bình thường: Lipid toàn phần trong máu ổn định trong khoảng 600-800 mg/dl, là nhờ sự cân bằng giữa cung cấp (hấp thu, tổng hợp) và tiêu thụ. Tăng lipid máu có thể gặp sau bữa ăn, do sự huy động của tuyến yên, tuyến giáp hay thượng thận hay sự giảm sử dụng và chuyển hóa làm gan giảm sản xuất chất vận chuyển mỡ (apoprotein). Tăng lipid máu trong một thời gian ngắn không gây hậu quả gì đáng kể, nhưng nếu tăng kéo dài thì dẫn đến một số hậu quả: béo phì, suy giảm chức năng một số cơ quan (gan), tăng cholesterol gây xơ vữa động mạch [9].

Nguyên nhân gây rối loạn lipid máu có thể là nguyên phát (do các bệnh về gen) hoặc thứ phát (do thói quen ăn uống, sinh hoạt hoặc một số bệnh lý). Các nguyên nhân thứ phát có thể góp phần làm rối loạn lipid máu do nguyên nhân tiên phát biểu hiện ra hoặc nặng nề hơn, ví dụ rối loạn lipid máu hỗn hợp mang tính gia đình có thể chỉ biểu hiện ra khi có sự tham gia có ý nghĩa của các nguyên nhân thứ phát [8]. ➢ Nguyên nhân nguyên phát:

Rối loạn lipid máu nguyên phát do đột biến gen làm tăng tổng hợp quá mức cholesterol (TC), triglycerid (TG), LDL-C hoặc giảm thanh thải TC, TG, LDL-C hoặc giảm tổng hợp HDL-C hoặc tăng thanh thải HDL-C. Rối loạn lipid máu thường xảy ra sớm ở trẻ em và người trẻ tuổi, ít khi kèm thể trạng béo phì, gồm các trường hợp sau:

+ Tăng glycerid nguyên phát: là bệnh cảnh di truyền theo gen lặn, biểu hiện lâm sàng thường người bệnh không bị béo phì, có gan lách lớn, cường lách, thiếu máu giảm tiểu cầu, nhồi máu lách, viêm tụy cấp gây đau bụng.

+ Tăng lipid máu hỗn hợp: là bệnh cảnh di truyền, trong gia đình có nhiều người cùng mắc bệnh. Tăng lipid máu hỗn hợp có thể do tăng tổng hợp hoặc giảm thoái biến các lipoprotein. Lâm sàng thường béo phì, ban vàng, kháng insulin, đái tháo đường tuyp 2, tăng acid uric máu [5].

➢ Rối loạn lipid máu thứ phát

Nguyên nhân của rối loạn lipid máu do lối sống tĩnh tại, dùng nhiều bia rượu, thức ăn giàu chất béo bão hòa. Các nguyên nhân thứ phát khác của rối loạn lipid máu như đái tháo đường, bệnh thận mạn tính, suy giáp, xơ gan, dùng thuốc thiazid, corticoids, estrogen, chẹn beta giao cảm [5].

➢ Tăng lipid thứ phát:

+ Đái tháo đường: thường tăng triglycerid máu do hoạt tính enzym lipoprotein lipase giảm. Nếu glucose máu được kiểm soát tốt thì triglycerid sẽ giảm sau vài tuần. Tăng TG máu là yếu tố nguy cơ xơ vữa động mạch ở người bệnh đái tháo đường [5].

+ Cường cortisol (Hội chứng Cushing): có tình trạng giảm dị hóa các lipoprotein do giảm hoạt tính enzym lipoprotein lipase. Tình trạng này càng rõ hơn trong trường hợp kèm kháng insulin và đái tháo đường [5].

+ Sử dụng estrogen: ở phụ nữ dùng estrogen thời gian dài, có sự gia tăng TG do tăng tổng tổng hợp VLDL. Trong thai kỳ, nồng độ estrogen tăng cũng làm gia tăng TG gấp 2-3 lần và sẽ trở lại mức bình thường sau sinh khoảng 6 tuần [5].

+ Nghiện rượu: làm rối loạn lipid máu, chủ yếu tăng triglycerid (TG). Đặc biệt, rượu làm tăng đáng kể nồng độ triglycerid máu ở những người tăng sản TG nguyên phát hoặc thứ phát do các nguyên nhân khác. Hội chứng Zieve tăng TC máu, rượu chuyển thành acetat làm giảm sự oxyd hóa các acid béo ở gan nên acid béo tham gia sản xuất TG gây gan nhiễm mỡ và tăng sản xuất VLDL, chức năng gan giảm dẫn đến giảm hoạt tính enzym LCAT (Lecithin cholesterol acyltransferase: enzym ester hóa cholesterol) nên cholesterol ứ đọng trong hồng cầu làm vỡ hồng cầu gây thiếu máu tan huyết [5].

+ Bệnh thận: trong hội chứng thận hư, tăng VLDL và LDL do gan tăng tổng hợp để bù vào lượng protein máu giảm do thải qua nước tiểu. TG tăng do albumin máu giảm nên acid béo tự do gắn với albumin cũng giảm, acid béo tự do gắn vào lipoprotein làm cho sự thủy phân TG của các lipoprotein này cũng giảm [5].

1.2.1. Hậu quả của rối loạn lipid máu

+ Trên hệ tim mạch: tăng huyết áp, xơ vữa động mạch, nhồi máu não, đột quỵ Rối loạn lipid máu là nguyên nhân dẫn tới quá trình xơ vữa động mạch làm hẹp lòng động mạch. Lượng máu không đủ cung cấp cho tim và não - hai cơ quan quan trọng của cơ thể. Nếu không phát hiện và điều trị kịp thời có thể gây ra các biến chứng nhồi máu cơ tim, nhồi máu não... Bên cạnh đó các mảng xơ vữa gây ra do rối loạn lipid máu khiến mạch máu bị thu nhỏ lại, thành mạch bị xơ vữa, không đàn hồi. Vì vậy lượng máu lưu thông chảy qua sẽ khó khăn đòi hỏi tim phải tăng co bóp dẫn tới huyết áp tăng cao.

+ Trên hệ nối tiết: Một số tuyến nội tiết sản xuất ra các hormon cho cơ thể phải sử dụng cholesterol như estrogen, testosterone và cortisol. Vì vậy phụ nữ trung niên sẽ tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch tương tự nam giới do nồng độ estrogen suy giảm.

+ Trên hệ thần kinh: cholesterol trong máu cao có thể đẩy nhanh quá trình hình thành các mảng beta-amyloid gây tổn thương não ở những người mắc bệnh Alzheimer.

+ Trên hệ tiêu hóa: khi có quá nhiều cholesterol trong dịch mật, phần dư thừa sẽ thúc đẩy hình thành các tinh thể, lâu dài sẽ tạo thành sỏi cứng trong túi mật, đường mật trong gan. Hệ quả sẽ gây tắc nghẽn làm người bệnh đau quặn từng cơn hoặc sốt cao do nhiễm trùng - nhiễm độc từ đường mật.

1.3. CHẨN ĐOÁN RỐI LOẠN LIPID MÁU

Rối loạn lipid máu được đặt ra ở những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng hoặc biến chứng của rối loạn lipid máu (ví dụ xơ vữa động mạch). Rối loạn lipid máu tiên phát được nghi ngờ ở những bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng của rối loạn lipid máu, bệnh xơ vữa động mạch xuất hiện sớm (trước 60 tuổi), tiền sử gia đình có người mắc bệnh động mạch hoặc cholesterol máu > 240 mg/dl (>6,2 mmol/L). Chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm các thành phần lipid máu: cholesterol toàn phần, TG, HDL-cholesterol và LDL-cholesterol [8].

Định lượng các thành phần lipid máu: TC, TG, HDL-C được định lượng trực tiếp; nồng độ TC và TG phản ánh cholesterol và TG trong các lipoprotein lưu hành, bao gồm chylomicron, VLDL, IDL, LDL, và HDL. Nồng độ TC thay đổi khoảng 10% và TG biến đổi tới 25% giữa các ngày khác nhau ngay cả trong

điều kiện bình thường. TC và HDL-C có thể xét nghiệm khi bệnh nhân không đói, tuy nhiên người ta thường xét nghiệm khi đói để đạt độ chính xác tối đa và chắc chắn. Không nên làm xét nghiệm khi bệnh nhân đang mắc các bệnh cấp tính, nhất là viêm nhiễm vì lúc này TG thường tăng và cholesterol thường giảm. Các thành phần lipid máu có thể thay đổi trong thời gian 30 ngày sau nhồi máu cơ tim cấp, tuy nhiên kết quả xét nghiệm trong vong 24h sau khi bị nhồi máu cơ tim cấp vẫn có giá trị hướng dẫn điều trị bằng thuốc hạ lipid máu [8].

Nồng độ non-HDL-C thường được tính bằng công thức:

(Non-HDL-C) = (TC) – (HDL-C)

Các xét nghiệm khác: Glucose máu khi đói, SGOT, SGPT, creatinin, TSH và protein niệu.

Nên được xét nghiệm cho hầu hết các bệnh nhân mới được chẩn đoán rối loạn lipid máu và những bệnh nhân có các thành phần lipid máu biến đổi theo chiều hướng xấu đi không giải thích được. Ngoài ra, cũng nên định lượng C- creractive protein (CRP) và homocysteine nếu điều kiện cho phép [8].

1.4. ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU

1.4.1. Không dùng thuốc

+ Thay đổi lối sống

+ Hạn chế thực phẩm chứa cholesterol và axit béo bão hòa là biện pháp hiệu quả nhất làm giảm LDL-C và TG, khuyến cáo của Hội Tim mạch Hoa kỳ và NCEP lượng chất béo trung bình ở người lớn ≤ 30% tổng calo nhập vào trong 24h, hạn chế thức ăn chiên xào…

+ Giảm cân nặng càng gần BMI < 22 càng tốt

+ Hoạt động thể lực: ngồi tại chỗ < 2h/ngày, và tăng thời gian hoạt động

mạnh > 60 ph/ngày, 3 – 4 lần/ tuần

+ Ngừng hút thuốc lá…[12-14].

1.4.2. Dùng thuốc

Bảng 1.4: Điều trị RLLPM bằng thuốc [12-14, 32]

Tác dụng trên lipid

Liều

Nhóm statin

Giảm LDL-C Giảm TG Tăng HDL

18 – 55% 7 – 30% 5 – 15%

Simvastatin: 5-40mg/ngày Atorvastatin: 10-80mg/ngày Rosuvastatin: 5-40mg/ngày

Cơ chế: ức chế HMG-CoA reductase, ngăn chặn tổng hợp cholesterol Tác dụng phụ: đau cơ, nhức đầu, chướng bụng, nổi mẩn đỏ, tăng men gan...

Nhựa gắn với acid mật

Cholestiramin: 8-32g/ngày Colestipol:10-40g/ngày

Giảm LDL-C Tăng HDL-C TG

15 – 30% 3 – 5% Không ảnh hưởng

Cơ chế: tăng oxyd hóa cholesterol thành acid mật Tác dụng phụ: táo bón, chướng bụng, đầy hơi, buồn nôn...

Acid fibtic

Gemfibrozil: 600mg x 2/ngày Fenofibrate: 200-300 mg/ngày

Giảm TG Giảm LDL-C Tăng HDL-C TC

20 – 50% 5 – 20% 10 – 20% 20 – 25%

Cơ chế: là chất chủ vận cho yếu tố chuyển nhân, kích thích sự tổng hợp các men oxyd hóa acid béo làm giảm TG Tác dụng phụ: khó tiêu, đau bụng, tiêu chảy

Acid nicotinic

1-3 g x 3/ngày

Tăng HDL-C Giảm LDL-C Giảm TG

15 – 35% 5 - 35% 20 - 50%

Cơ chế: ngăn chặn sự hấp thu axít mật ở ruột, thúc đẩy tăng thụ thể LDL ở gan để thu nhận cholesterol tuần hoàn để tổng hợp mật. Tác dụng phụ: đỏ bừng da, rối loạn tiêu hóa, viêm gan…

Eztimib

10mg/ngày

Giảm LDL-C Giảm TC TG HDL-C

18 - 20% 12% Giảm nhẹ Tăng nhẹ

Cơ chế: ức chế hấp thu cholesterol trên thành ruột non (NPC1L1).

1.5. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG LIPID MÁU TRÊN THỰC NGHIỆM

Để nghiên cứu thuốc điều trị rối loạn lipid máu, trước hết phải gây được mô hình tăng lipid máu. Có ba mô hình dược lý đã được nghiên cứu và áp dụng trên động vật thực nghiệm là: gây tăng cholesterol hoặc lipid máu ngoại sinh (đưa cholesterol và mỡ theo đường thức ăn), gây tăng cholesterol máu nội sinh (gây tăng tổng hợp cholesterol) hoặc phối hợp cả hai loại này.

Động vật thường được sử dụng trong các mô hình tăng cholesterol máu là: thỏ, chuột cống, chuột nhắt, hamster, ngoài ra có thể dùng khỉ, lợn, chim cút…

Tại Việt Nam, các mô hình đánh giá tác dụng hạ lipid máu chưa có nhiều. Tập trung chủ yếu vào các mô hình gây tăng bằng các chất gây tăng theo cơ chế ngoại sinh như mô hình gây tăng bằng chế độ ăn giàu chất béo, giàu cholesterol. Việc gây tăng bằng chế độ ăn giàu cholesterol đã được chứng minh có thể gây tăng được lipid máu. Tuy nhiên chỉ 30% cholesterol có nguồn gốc ngoại sinh, 70% còn lại được gan tổng hợp có nguồn gốc nội sinh. Do vậy, việc gây tăng bằng chế độ ăn thường mất thời gian, tốn kém, mức gây tăng thường không cao, chưa thực sự phù hợp với mục đích sàng lọc thuốc.

Để gây tăng lipid máu nội sinh, các chất gây tăng lipid máu thường sử dụng là Tween 80 (Polysobarte 80), Triton WR-1339 (Tyloxapol), Poloxamer 407 (P-407),.. với đặc điểm chung: liều đơn tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm màng bụng có thể gây tăng lipid nhanh và rõ rệt, nồng độ đỉnh quan sát được sau khi gây tăng bằng Tween 80 là 6-12 giờ, Triton WR-1339 là khoảng 24 giờ, P-407 là khoảng 36 giờ sau tiêm. Do đó, so với gây tăng lipid máu bằng chế độ ăn thì phương pháp này nhanh và đơn giản hơn giúp phát hiện các thuốc có tác dụng trên sinh tổng hợp và chuyển hóa lipid, thích hợp cho việc nghiên cứu, sàng lọc ban đầu [23, 40].

Trên thế giới mô hình gây tăng lipid máu theo cơ chế nội sinh (kích thích gan tăng tổng hợp cholesterol) thường hay được áp dụng hơn để sàng lọc các thuốc có tác dụng hạ lipid máu. Các mô hình này đã được chứng minh có khả năng tăng mạnh lipid máu trong thời gian ngắn, thuận tiện và tiết kiệm được chi phí, phù hợp để sàng lọc và đánh giá các thuốc hạ lipid máu. Trong các chất

gây tăng theo cơ chế nội sinh, P-407 được sử dụng khá phổ biến, hiệu quả gây tăng cao và không gây độc tính cho động vật thực nghiệm [36].

Mô hình gây tăng lipid máu bởi Poloxamer 407: mô hình được nghiên cứu bởi Johnston T.P và cộng sự. Năm 1992, nhóm nghiên cứu của Johnston tiêm phúc mạc liều duy nhất P407 1,5g/kg trên chuột cống cho thấy khả năng tăng cholesterol và triglycerid huyết tương của P407. Sau đó là những nỗ lực tìm kiếm cơ chế gây tăng lipid máu trên cả invivo thực nghiệm động vật và invitro ty thể tế bào gan sử dụng liều 300mg/kg P407 [36].

1.6. GIỚI THIỆU VỀ CAO CHIẾT LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) là một loài cây mọc khá phổ biến ở nước ta đặc biệt là các tỉnh miền Trung, được sử dụng rộng rãi để chữa viêm loét ngoài da, thông kinh, hoạt huyệt, chữa viêm tuyến sữa, trị thiếu máu, bổ gan, thải độc, ổn định huyết áp, kích thích tiêu hoá, ngủ ngon giấc, chống oxi hoá. Chè được thu hái phơi khô hoặc nấu cao [7].

Hình 1.6: Cây chè vằng tự nhiên và các sản phẩm cao chiết

Chè vằng còn được gọi là chè cước man, dây cẩm vân, cây dâm trắng, cây lá ngón, dây vắng, mổ sẻ. Tên khoa học Jasminum subtriplinerve Blume, thuộc họ Nhài (Oleaceae). Nhiều người gọi nhầm cây chè vằng là cây lá ngón, nhưng một cây có hoa vàng (lá ngón thật), một cây kia hoa trắng (chè vằng), ngoài ra còn có một số điểm khác cần chú ý để tránh nhầm lẫn [20].

Mô tả cây: chè vằng là một cây nhỏ, mọc thành bụi ở bờ rào hay bụi tre hoặc mọc ở các cây lớn. Thân cây cứng, chia thành từng đốt, đường kính 5-6 mm, chia thành nhiều cành, có thể vươn cao 1-1,5m và vươn dài đến 15-20m, thân và cành đều nhẵn. Lá mọc đối, hình mũi mác, phía cuống tù hay hơi tròn, đầu lá nhọn, dài 4-7,5cm, rộng 2-4,5cm, những lá phía trên nhỏ hơn lá phía dưới, mép nguyên, có 3 gân rõ rệt. Cuống lá nhẵn, dài 3-12mm. Hoa mọc thành xim nhiều hoa (chừng 7-9 hoa), cánh hoa màu trắng. Quả hình cầu, đường kính 7-8mm (bằng hạt ngô). Khi chín có màu vàng, trong quả có một hạt rắn chắc. Mùa quả chín tháng 7-10 [20].

apiosylverbascosid, isooleoverbascosid,

Thành phần hóa học: Nghiên cứu từ những năm 1984 cho thấy chè vằng có terpenoid, glycosid đắng, flavonoid, syringin. Nhiều hợp chất có dược tính tốt đã được biết và công nhận như betulin, axit betulinic, 3β-acetyl-oleanoic, lupeol, β-sitosterol, rutin, astragalin, isoquercetrin, nicotiflorin, verbascosid, 6'-O- isoverbascosid, menthiafoloylverbascosid, Daucosterol, Dotriacontanol có trong chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) [7, 43].

Tác dụng sinh học: Chè vằng có 4 nhóm hợp chất (terpenoid, glycosid đắng, flavonoid, syringin) đều có tác dụng kháng khuẩn (tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tan máu, Shigella dysenteriae, S.shigae, trực khuẩn thương hàn, Achromobacter và ức chế yếu hơn đối với trực khuẩn mủ xanh). Tác dụng sinh học chủ yếu của chè vằng là tác dụng kháng khuẩn. Ngoài ra, chè vằng còn có tác dụng chống viêm, hạ sốt, làm lành vết thương bảo vệ niêm mạc, tăng tiết dịch mật, giảm nhu động ruột. Hoạt tính kháng khuẩn của chè vằng không biến động theo thời tiết và thời kỳ sinh trưởng của cây [11].

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

▪ Nguyên liệu: Lá chè vằng được thu mua tại huyện Thanh Chương và Tương Dương, tỉnh Nghệ An sẽ được chiết, cô đặc tạo cao chiết theo các bước mô tả như sau:

- Chọn lọc, xử lý, làm sạch lá.

- Lấy chất dịch chiết: Cho lá đã xử lý vào nồi đun với tỉ lệ 4kg nguyên liệu và 4 lít nước. Sau khi đun lần thứ nhất, để nguội, dùng mảnh vải mỏng hoặc vải màn gạn vắt bỏ bã, để lắng lọc lấy phần trong. Lặp lại với quá trình trên, chiết lần 2 với 4 lít nước. Kết thúc 2 lần đun thu được 5 lít dịch chiết.

- Cô đặc thành cao: khi cô phải ở nhiệt độ thấp, thời gian cô 4-5 giờ. Cao thu được cao ở thể dẻo, đặc quánh, sờ không dính tay. Bảo quản ở nơi kín khí, hạn chế oxi, phòng tránh oxy hóa, ở nhiệt độ phòng và áp suất thường.

Quy trình

Lá tươi

Đun lấy nước

Dịch chiết 2 Dịch chiết 1

Dịch chiết tổng

Cô đặc

Bảo quản

- Kết quả: Với 4kg nguyên liệu lá và 4 lít nước, chiết ở nhiệt độ sôi 100oC, áp suất thường. Đem cô đặc thu được 10-15% nước. Qua quá trình nấu từ 10-12 giờ, thu được 1 lạng cao lá ở thể dẻo, đặc quánh, sờ không dính tay. Bảo quản kín khí, tránh oxy hóa, nhiệt độ phòng và áp suất thường.

▪ Động vật thực nghiệm:

+ Chuột cống trắng chủng Wistar khỏe mạnh, cả hai giới, trọng lượng

180 ± 20g: để đánh giá độc tính bán trường diễn.

+ Chuột nhắt trắng dòng Swiss khỏe mạnh, cả hai giới, trọng lượng trung

bình 25 ± 2 g/con (để đánh giá tác dụng trên lipid máu).

+ Chuột được cung cấp bởi Học viện Quân y và được nuôi bằng thức ăn tổng hợp, uống nước đun sôi để nguội, phòng nuôi chuột được khống chế nhiệt độ trong khoảng 23-25C, độ ẩm 45-75% [3, 44, 50].

Thuốc, hóa chất và máy móc phục vụ nghiên cứu:

+ Poloxamer 407 500g (Sigma – Singapore).

+ Atorvastatin viên nén bao phim 10mg (STADA - Việt Nam).

+ Fomandehit 500ml (công ty TNHH SX TM Việt Mỹ - Việt Nam)

+ Máy phân tích huyết học tự động Coulter LH 780, Máy phân tích sinh hóa tự động Beckman Coulter AU5800. Kính hiển vi. Bộ dụng cụ chẩn đoán ERBA thương mại được sử dụng để phân tích huyết thanh học của cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), lipoprotein- cholesterol mật độ cao (HDL-C).

+ Các hóa chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Đánh giá độc tính bán trường diễn

Theo quy định của Bộ Y tế Việt Nam [6] hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới [50] và OECD [45] về hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng thuốc từ Đông y, thuốc từ dược liệu. Liều tương đương lâm sàng được tính từ liều LD50 (thử nghiệm độc tính cấp) trên chuột cống trắng.

Chuột cống trắng 30 con chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi lô 10 con.

+ Lô 1 (lô chứng sinh học): uống nước cất 1ml/100g/ngày.

+ Lô 2 (lô trị 1): uống cao chiết liều 18 mg/kg/ngày (liều có tác dụng

tương đương trên người, tính theo hệ số 6).

+ Lô 3 (lô trị 2): uống cao chiết liều 54 mg/kg/ngày (liều tương đương

gấp 3 lần trên người, tính theo hệ số 6).

Chuột cống trắng được uống nước hoặc cao chiết trong 90 ngày liên tục,

mỗi ngày một lần vào 8-9 giờ sáng.

Các chỉ tiêu đánh giá: Kiểm tra và theo dõi các chỉ tiêu trước lúc uống

cao chiết, sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống cao chiết, bao gồm:

- Tình trạng chung, thể trọng (mg) của chuột cống trắng.

- Đánh giá chức phận tạo máu: thông qua số lượng hồng cầu (RBC), thể tích trung bình hồng cầu (MCV), hàm lượng hemoglobin (HGB), hematocrit (HCT), số lượng bạch cầu (WBC), công thức bạch cầu (NEU và LYM) và số lượng tiểu cầu (PLT).

- Đánh giá chức năng gan: thông qua định lượng chất chuyển hoá trong

máu: bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol.

- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan: thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: alanin aminotransferase (ALT), aspartat aminotransferase (AST).

- Đánh giá chức năng thận: thông qua định lượng nồng độ creatinin

huyết thanh.

- Xét nghiệm mô học: Sau 90 ngày uống cao chiết, mổ chuột để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan. Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô. Đối với các con bị chết, cần mổ nghiên cứu các mô bệnh học. Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Thời gian thử nghiệm: độc tính bán trường diễn được thực hiện trong

90 ngày.

Thời điểm xét nghiệm: Lấy máu để làm các chỉ số xét nghiệm trên tại 4 thời điểm: trước thí nghiệm (T0), sau 30 ngày (T30), sau 60 ngày (T60) và sau 90 ngày (T90) uống thuốc.

2.2.2. Đánh giá tác dụng hạ lipid máu dựa trên mô hình gây tăng cholesterol máu nội sinh

Thực hiện trong 7 ngày. Gây mô hình rối loạn lipid máu nội sinh bằng cách tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200 mg/kg (0,1 mL/10g) [39, 49, 52].

Chuẩn bị dung dịch P-407 2% bằng cách pha 0,4g P-407 trong nước muối sinh lý 0,9% vừa đủ 20 mL, để tủ lạnh qua đêm để làm tăng độ tan của P- 407. Kim và xylanh dùng để tiêm chuột được ngâm trong nước đá trước khi sử dụng. Mô hình rối loạn lipid máu gây ra Poloxamer 407 (P-407) được Millar và cộng sự (2005) mô tả trong thiết kế thí nghiệm, các động vật được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con.

- Lô 1 (lô đối chứng sinh học): Cho chuột uống nước cất 0,2mL/10g thể trọng/ngày; sau đó tiêm màng bụng 0,9% NaCl 10 mL/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 2 (lô mô hình P-407): Cho chuột uống mỗi lần nước cất 0,2mL/100g thể trọng/ngày; sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 3 (lô đối chứng dương): Chuột uống atorvastatin liều 100mg/kg/ngày; sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 4 (lô trị 1: dịch chiết lá chè vằng liều thấp): Cho chuột uống dịch chiết chè vằng với liều 36 mg/kg thể trọng/ngày (liều tương đương trên người); sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

- Lô 5 (lô trị 2: dịch chiết lá chè vằng liều cao): Cho chuột uống dịch chiết lá chè vằng với liều 108 mg/kg thể trọng/ngày (liều gấp 3 lần liều tương đương trên người); sau đó tiêm màng bụng 2% P-407 với liều 200 mg/kg thể trọng vào ngày thứ 7.

Chuột được uống nước cất và thuốc thử hàng ngày. Đến ngày thứ 7 chuột ở tất cả các lô (trừ lô 1) được tiêm màng bụng dung dịch P-407. Sau khi được tiêm P-407, chuột được cho nhịn đói hoàn toàn nhưng vẫn được uống nước tự do. Máu được lấy vào 24 giờ sau khi tiêm màng bụng P-407 và phân tích cac chỉ số lipid huyết thanh bao gồm TG, TC và HDL-C và non-HDL-C được tính theo công thức:

(non-HDL-C) = (TC) − (HDL-C).

2.2.3. Xử lý số liệu

Xử lý kết quả nghiên cứu: Tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá X̅ ± SD (giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2016. So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng phân tích one–way ANOVA, hậu kiểm để so sánh giữa lô thử nghiệm với lô chứng (với thiết kế nghiên cứu từ 3 lô trở lên) hoặc dùng T-test ( với thiết kế nghiên cứu có 2 lô). Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Chương 3 - KẾT QUẢ

3.1. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

3.1.1. Tình trạng chung

Trong 90 ngày thí nghiệm, chuột ở các nhóm đều hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, ăn uống tốt, phân khô, lông mượt, không có chuột bị chết hoặc có các biểu hiện bất thường.

250

200

)

G M

(

150

100

G N Ọ R T Ể H T

T30

T60

T90

THỜI GIAN (NGÀY)

Lô trị 2

3.1.2. Sự thay đổi trọng lượng chuột cống trắng

Lô chứng Lô trị

Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến thể trọng chuột cống trắng

Hình 3.1 cho thấy sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống thuốc, mức độ gia tăng trọng lượng chuột cống trắng giữa hai lô trị với nhau và so với lô chứng khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05).

3.1.3. Đánh giá chức năng tạo máu

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng tạo máu chuột cống trắng

Sau uống cao chiết

Lô

Trước khi uống cao chiết (T0)

T30

T60

T90

Lô chứng

7,32 ± 0,54

7,49 ± 0,56

7,01 ± 0,67

7,07 ± 0,81

Lô trị 1

7,53 ± 0,72

7,40 ± 0,66

7,19 ± 0,63

7,83 ± 0,78

Lô trị 2

7,40 ± 0,66

7,42 ± 0,67

7,04 ± 0,58

7,07 ± 0,97

Số lượng hồng cầu (T/L)

> 0,05

Lô chứng

12,03 ± 2,12

12,06 ± 1,26

11,78 ± 0,89

11,93 ± 0,91

Lô trị 1

12,01 ± 1,16

11,80 ± 2,12

11,10 ± 1,19

11,67 ± 0,93

Lô trị 2

12,12 ± 1,28

12,78 ± 0,79

11,67 ± 1,03

11,10 ± 1,09

Hàm lượng huyết sắc tố (g/L)

> 0,05

Lô chứng

35,21 ± 1,06

36,48 ± 3,89

35,33 ± 3,06

34,70 ± 2,36

Lô trị 1

36,09 ± 3,11

35,86 ± 2,86

33,63 ± 1,85

Hematocrit (%)

Lô trị 2

36,11 ± 3,09

35,63 ± 3,96

35,76 ± 2,26

33,69 ± 2,93

> 0,05

Lô chứng

47,37 ± 3,77

47,17 ± 1,69

47,16 ± 1,86

47,54 ± 1,86

Lô trị 1

47,37 ± 3,80

47,37 ± 2,77

47,66 ± 2,33

46,69 ± 2,63

Lô trị 2

48,23 ± 4,10

47,75 ± 2,95

47,17 ± 1,85

47,15 ± 1,97

Thể tích trung bình hồng cầu (fL)

> 0,05

Lô chứng

9,82 ± 2,41

9,76 ± 2,26

9,36 ± 1,99

9,56 ± 3,26

Lô trị 1

9,91 ± 2,69

8,92 ± 2,03

9,68 ± 2,37

8,92 ± 2,03

Lô trị 2

10,48 ± 2,45

9,66 ± 1,35

9,97 ± 2,64

10,29 ± 2,53

Số lượng bạch cầu (G/L)

> 0,05

Lô chứng

328,20 ± 53,72 330,80 ± 42,61 330,50 ± 70,71 333,10 ± 90,82

Lô trị 1

323,40 ± 65,20 314,30 ± 80,11 379,70 ± 71,63 335,30 ± 54,47

Lô trị 2

343,80 ± 41,02 314,50 ± 66,76 309,20 ± 69,09 318,80 ± 40,80

Số lượng tiểu cầu (G/L)

> 0,05

Chú thích:số liệu được trình bày dưới dạng 𝑋̅ ± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Kết quả bảng 3.1 cho thấy sau 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày uống cao chiết, các thông số máu không có sự thay đổi đáng kể nào về số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hematocrit, mức hemoglobin, số lượng tiểu cầu, tổng số bạch cầu và công thức bạch cầu giữa chuột cống ở lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.4. Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến độ hủy hoại tế bào gan chuột cống trắng

Sau uống cao chiết

Trước khi uống cao chiết

Lô

(T0)

T30

T60

T90

Lô chứng

99,50 ± 30,11

89,30 ± 21,75

94,10 ± 29,68 99,80 ± 32,04

Lô trị 1

89,60 ± 29,12

89,20 ± 22,37

100,20 ± 30,30 99,10 ± 20,30

AST (UI/L)

Lô trị 2

92,10 ± 29,53

88,10 ± 21,26

99,91 ± 29,19 97,30 ± 18,02

> 0,05

Lô chứng

51,20 ± 7,64

57,90 ± 8,90

56,30 ± 10,53 56,80 ± 15,58

Lô trị 1

57,00 ± 16,65

57,50 ± 8,76

55,90 ± 10,88

53,10 ±15,90

ALT (UI/L)

Lô trị 2

51,30 ± 9,31

56,80 ± 10,20

57,40 ± 11,76 58,50 ± 10,54

> 0,05

Chú thích: số liệu được trình bày dưới dạng 𝑋̅ ± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Aspartat transaminase (AST) và Alanine transaminase (ALT) là 2 enzym để đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, sau 30, 60, 90 ngày uống cao chiết chè vằng, phân tích thống kê ALT, AST không có sự khác biệt đáng kể nào về giá trị trung bình giữa lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.5. Đánh giá chức năng gan

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng gan chuột cống trắng

Sau uống cao chiết

Trước uống cao chiết

Lô

(T0)

T30

T60

T90

Lô chứng

13,49 ± 0,65

13,52 ± 0,81

13,53 ± 0,59 13,53 ± 0,51

Lô trị 1

13,48 ± 0,49

13,90 ± 0,72

13,57 ± 0,75 13,75 ± 0,65

Lô trị 2

13,50 ± 0,37

13,50 ± 0,55

13,50 ± 0,51 13,54 ± 0,59

Bilirubin toàn phần (mmol/L)

> 0,05

Lô chứng

29,10 ± 5,40

29,50 ± 3,30

27,70 ± 5,20 28,90 ± 6,70

Lô trị 1

29,30 ± 3,30

33,0 0± 6,30

31,00 ± 6,00 25,70 ± 4,20

Lô trị 2

29,10 ± 3,50

31,20 ± 4,20

27,80 ± 5,10

26,8 ± 3,90

Nồng độ Albumin (g/L)

> 0,05

Lô chứng

1,52 ± 0,20

1,69 ± 0,36

1,55 ± 0,29

1,46 ± 0,26

Lô trị 1

1,63 ± 0,31

1,68 ± 0,39

1,56 ± 0,16

1,49 ± 0,16

Lô trị 2

1,55 ± 0,20

1,61 ± 0,37

1,56 ± 0,31

1,67 ± 0,41

Nồng độ cholesterol (mmol/L)

> 0,05

Chú thích: số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD; T0: trước khi uống cao chiết; T30: 30 ngày; T60: 60 ngày; T90: 90 ngày sau khi sử dụng cao chiết.

Bảng 3.3 cho thấy, sau 30, 60 và 90 ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa về bilirubin toàn phần, nồng độ albumin và nồng độ cholesterol toàn phần giữa các lô được điều trị bằng cao chiết và lô đối chứng. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.6. Đánh giá chức năng thận

Creatinin (mg/dl)

1.4

) l d

1.2

/ g m

i

( n n

0.8

0.6

0.4

0.2

i t a e r C ộ đ g n ồ n

T30

T60

T90

Thời gian (ngày)

Lô chứng

Lô trị 1

Lô trị 2

Hình 3.2: Ảnh hưởng của cao chiết đến nồng độ creatinin trong máu chuột cống trắng

Thông số thận (creatinin) được khảo sát để thăm dò chức năng thận. Kết quả trong hình chứng minh rằng sau thời gian điều trị, không có ảnh hưởng đáng kể đến creatinin của chuột cống trắng được ghi nhận ở lô chứng và lô trị 1, lô trị 2. Khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

3.1.7. Thay đổi về mô bệnh học sau 90 ngày uống thuốc

❖ Đại thể

Trên tất cả các chuột cống trắng thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận và hệ thống tiêu hoá.

❖ Vi thể:

Hình thái vi thể gan:

+ Lô chứng: 3/3 mẫu bệnh phẩm gan có kết quả bình thường.

+ Lô trị 1: (uống cao chiết liều cao): 2/3 mẫu bệnh phẩm gan có thoái

hóa nhẹ tế bào gan; 1/3 mẫu bệnh phẩm gan có kết quả bình thường.

+ Lô trị 2: (uống cao chiết liều thấp): 2/3 mẫu bệnh phẩm gan có thoái

hóa nhẹ tế bào gan; 1/3 mẫu bệnh phẩm có thoái hóa vừa tế bào gan.

3

2

1

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

1. Tế bào gan bình thường. 2. Tế bào gan thoái hóa nhẹ. 3. Tế bào gan thoái hóa vừa.

Hình 3.3: Nhuộm HE cho các mô gan với độ phóng đại 400x

Hình thái vi thể thận:

2

1

2

1

Lô chứng Lô trị 1 Lô trị 2

1. Cầu thận bình thường.

2. Ống thận bình thường.

Hình 3.4: Nhuộm HE cho các mô thận với độ phóng đại 400x

Vi cấu trúc gan, thận của chuột cống trắng: với liều 36 mg/kg/ngày, không có tổn thương rõ ràng về vi cấu trúc gan, thận của chuột cống trắng sau 90 ngày dùng thuốc so với lô đối chứng. Liều 108 mg/kg/ngày có tổn thương vi cấu trúc gan mức độ nhẹ và vừa so với nhóm chứng sinh học sau 90 ngày dùng thuốc không có tổn thương vi cấu trúc thận.

3.2. TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) TRÊN MÔ HÌNH RLLPM THEO CƠ CHẾ NỘI SINH

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của lô mô hình P-407 lên chuột nhắt trắng (mmol/L)

Lô thí nghiệm

Lô chứng sinh học Lô mô hình P-407

% thay đổi

TG

1,39 ± 0,31

10,76 ± 0,87 ***

↑ 674,1 %

TC

2,55 ± 0,40

7,61 ± 0,53 ***

↑ 198,4 %

HDL-C

0,56 ± 0,03

0,58 ± 0,04

↑ 3,57 %

non-HDL-C

2,00 ± 0,39

7,03 ± 0,53 ***

↑ 251,5 %

Chú thích: khác biệt so với lô chứng sinh học: *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.

Kết quả bảng 3.4 cho thấy: Tiêm màng bụng dung dịch P-407 2% liều 200 mg/kg có tác dụng gây RLLPM rõ rệt. Ở lô mô hình, các chỉ số TC, TG và non- HDL-C tăng có ý nghĩa so với lô chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Riêng HDL-C có xu hướng tăng nhưng sự tăng là không đáng kể, khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

Bảng 3.5: Tác dụng của cao chiết chè vằng lên các chỉ số lipid máu của chuột nhắt trắng sau 24h tiêm P-407 (mmol/L)

Lô thí nghiệm

n

Atorvastatin

Lô trị 1

Lô trị 2

Lô mô hình P-407

TG

10,76 ± 0,87

9,22 ± 0,33 ** (↓14,3%)

9,91 ± 0,81 ** (↓7,9%)

9,76 ± 0,47 ** (↓9,3%)

TC

7,61 ± 0,53

5,54 ± 0,49 *** (↓27,2%)

6,42 ± 0,48 ** (↓15,6%)

6,33 ± 0,40 *** (↓16,8%)

0,54 ± 0,03

0,58 ± 0,03

0,59 ± 0,05

HDL-C

0,58 ± 0,04

non-HDL-C

7,03 ± 0,53

5,00 ± 0,50 *** (↓28,9%)

5,84 ± 0,49 ** (↓16,9%)

5,74 ± 0,40 *** (↓18,3%)

Chú thích: khác biệt so với lô mô hình: *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.

Số liệu từ bảng 3.5 thể hiện nồng độ các chỉ số lipid máu của chuột nhắt trắng ở các lô mô hình và các lô dùng thuốc tại thời điểm 24 giờ sau khi tiêm màng bụng dung dịch P-407 gây RLLPM nội sinh.

- Cao chiết lá chè vằng liều 36 mg/kg và 108 mg/ngày và lô chứng dương (atorvastatin) đều làm giảm có ý nghĩa thống kê chỉ số TG (p <0,01), TC (p <0,001) và non-HDL-C (p <0,001) nhưng không làm thay đổi hàm lượng HDL- C so với lô mô hình, khác biệt chưa có ý nghĩa (p >0,05).

- Giữa lô trị 1, lô trị 2 so với atorvastatin mức giảm các chỉ số TC, TG,

non-HDL-C, HDL-C sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p >0,05).

- Giữa lô trị 1 và lô trị 2 mức giảm các chỉ số TC, TG, non-HDL-C, HDL- C sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p >0,05).

Chương 4 - BÀN LUẬN

4.1. ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được thực hiện bằng cách cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày liên tục trong một khoảng thời gian nhất định. Trong bài nghiên cứu, khoảng thời gian được chọn cho thử nghiệm là 90 ngày. Chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng với 2 mức liều: liều 18 mg/kg/ngày là liều có tác dụng tương đương trên người (tính theo hệ số 6) và một liều cao hơn gấp 3 lần liều tương đương trên người (54 mg/kg/ngày), uống liên tục trong 90 ngày. Độc tính là mức độ mà một chất có thể gây hại cho con người hoặc động vật. Nó có thể tác động lên cấu trúc cơ thể , chẳng hạn như tế bào (độc tế bào), cơ quan (ví dụ: độc tính trên thận hoặc gan), hoặc toàn bộ sinh vật. Vậy để đánh giá tính an toàn của cao chiết chè vằng, chúng tôi tiến hành đánh giá một số chỉ tiêu sau:

▪ Ảnh hưởng của cao chiết về tình trạng chung, thể trọng chuột và cơ quan tạo máu: Theo hướng dẫn của WHO, tình trạng chung, trọng lượng cơ thể và các chỉ số huyết học là những xét nghiệm bắt buộc khi đánh giá độc tính của thuốc. Máu là một tổ chức quan trọng vì máu liên quan mật thiết với mọi bộ phận, cơ quan trong cơ thể [51]. Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng của tất cả các tổ chức đó nhưng đồng thời cũng bị ảnh hưởng và phản ánh tình trạng riêng của cơ quan tạo máu. Nếu thuốc có ảnh hưởng đến cơ quan tạo máu thì trước hết các thành phần của máu sẽ bị thay đổi, đặc biệt thường làm giảm số lượng bạch cầu. Vì vậy, các xét nghiệm về số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, số lượng tiểu cầu trên chuột cống cần được xác định. Định lượng huyết sắc tố cho biết rõ chức năng của hồng cầu. Thể tích trung bình hồng cầu phản ánh đặc điểm của tình trạng thiếu máu. Hematocrit là tỷ lệ % giữa khối hồng cầu và máu toàn phần [17]. Nếu thuốc làm thay đổi số lượng hồng cầu hoặc làm mất nước hay ứ nước trong tế bào máu thì chỉ số này sẽ thay đổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 30, 60 và 90 ngày nghiên cứu, trọng lượng chuột ở cả 2 lô dùng cao chiết đều tăng so với trước khi uống dịch chiết, tuy nhiên không có sự khác biệt giữa lô chứng sinh học và 2 lô dùng cao chiết. Tất cả các chỉ số huyết học ở lô chứng sinh học và cả 2 lô trị đều trong giới hạn bình thường, thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với trước khi dùng cao

chiết và so với lô chứng sinh học ở các thời điểm sau 30, 60 và 90 ngày uống cao chiết liên tục. Như vậy, với 2 mức liều cao chiết 54 mg/kg/ngày và 108 mg/kg/ngày không làm ảnh hưởng tới sự phát triển thể trạng, cân nặng và không thể hiện độc tính trên các cơ quan tạo máu của chuột cống trắng.

▪ Ảnh hưởng của cao chiết đến chức năng gan, thận: Trong cơ thể, gan có nhiều chức năng quan trọng. Việc đưa thuốc vào cơ thể có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng đến chức năng của cơ quan này. Vì vậy, khi đánh giá độc tính của thuốc thì nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đối với chức năng gan là rất cần thiết [17]. Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan (AST, ALT) trong huyết thanh thường được định lượng. ALT là enzym có nhiều nhất ở gan, khu trú trong bào tương của tế bào nhu mô gan. Khi tổn thương hủy hoại tế bào gan, thậm chí chỉ cần thay đổi tính thấm của màng tế bào gan, hoạt độ ALT trong máu đã tăng cao. Khác với ALT, 2/3 AST khu trú trong ty thể (mitochondria) và chỉ ít hơn 1/3 lượng AST khu trú ở bào tương của tế bào. Khi tổn thương tế bào gan ở mức độ dưới tế bào, AST trong ty thể được giải phóng ra. Vì vậy, trong viêm gan nói chung, hoạt độ ALT luôn tăng cao hơn AST. Ngoài ra, người ta còn đánh giá chức năng gan qua các chỉ số nồng độ bilirubin toàn phần, cholesterol toàn phần và albumin trong máu. Kết quả cho thấy sau 30, 60 và 90 ngày uống cao chiết, các chỉ số hoạt độ AST, ALT, nồng độ bilirubin toàn phần, cholesterol toàn phần và albumin trong máu không thay đổi có ý nghĩa so với lô chứng và so sánh giữa hai thời điểm trước và sau khi uống các liều cao chiết. Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể, nhu mô thận rất dễ tổn thương bởi các chất nội sinh và ngoại sinh vì là mô có nhiều máu qua nhất. Vì vậy, khi đưa thuốc vào cơ thể thuốc có thể gây tổn thương thận, từ đó ảnh hưởng đến chức năng thận [51]. Creatinin là thành phần đạm trong máu ổn định nhất, hầu như không phụ thuộc vào chế độ ăn hoặc những thay đổi sinh lý mà chỉ phục thuộc vào khả năng đào thải của thận. Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin máu tăng sớm hơn ure. Do vậy, creatinin máu là chỉ tiêu tin cậy và quan trọng hơn ure máu, nên hiện nay dùng để đánh giá và theo dõi chức năng thận [17]. Kết quả nghiên cứu cho cao chiết chè vằng ở cả 2 liều khi dùng đường uống trên chuột cống liên tục trong 90 ngày không làm thay đổi nồng độ creatinin so với lô chứng sinh học.

▪ Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc đại thể và vi thể: Theo hướng dẫn của WHO, giải phẫu đại thể và vi thể gan thận là chỉ số bắt buộc khi đánh giá độc tính bán trường diễn. Ngoài ra, xét nghiệm vi thể còn là tiêu chuẩn vàng để đánh giá tổn thương 2 cơ quan chính chịu trách nhiệm chuyển hóa và thải trừ thuốc là gan và thận [51]. Trên tất cả chuột nghiên cứu, không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quan. Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy cao chiết chè vằng cả 2 liều khi dùng đường uống trên chuột cống liên tục trong 90 ngày không làm thay đổi hình ảnh mô bệnh học thận so với lô chứng sinh học.

Hình ảnh vi thể gan không có sự khác biệt giữa lô chứng và các lô uống cao chiết chè vằng. Quan sát ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan của 30% số chuột kết quả cho thấy mẫu bệnh phẩm gan có hình ảnh thoái hóa nhẹ (lô trị 1) đến thoái hóa vừa (lô trị 2) tế bào gan. Tại gan, khi các nguyên nhân gây tổn thương tấn công, các tế bào gan có thể bị ảnh hưởng nặng hoặc nhẹ tùy thuộc vào loại nguyên nhân và thời gian tiếp xúc với nguyên nhân tổn thương. Sự tổn thương của tế bào nói chung và tế bào gan nói riêng được chia làm 3 mức độ khác nhau là tổn thương có khả năng hồi phục (thoái hóa), tổn thương có nguy cơ gây chết tế bào và tổn thương không có khả năng hồi phục (hoại tử) [15]. Trong các tổn thương tế bào nói trên, tổn thương thoái hóa là tổn thương ban đầu và nhẹ nhất của tế bào, các tế bào có thể tự phục hồi lại được tổn thương này để trở về tình trạng bình thường. Sự thoái hóa của tế bào có thể là thoái hóa hạt, thoái hóa nước và thoái hóa mỡ. Kết hợp với kết quả xét nghiệm đánh giá tổn thương tế bào gan, hoạt độ ALT và AST ở 2 lô uống cao chiết chè vằng đều ở mức bình thường, không khác biệt so với lô chứng, nên theo nhóm nghiên cứu, chưa có cơ sở để cho rằng cao chiết chè vằng gây tổn thương gan chuột thông qua xét nghiệm vi thể gan chuột tại nghiên cứu độc tính bán trường diễn.

Từ đó có thể kết luận rằng cao chiết lá chè vằng (Jasminum

subtriplinerve Blume Oleaceae) có tính an toàn.

4.2. HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ RỐI LOẠN LIPID MÁU CỦA CAO CHIẾT LÁ CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae) TRÊN CÁC THÀNH PHẦN LIPID MÁU

4.2.1. Đánh giá mô hình tăng lipid máu nội sinh bằng P-407

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn P-407 liều 200 mg/kg tiêm màng bụng để gây RLLPM nội sinh trên chuột nhắt trắng, atorvastatin liều 100 mg/kg được sử dụng làm thuốc đối chứng. Atorvastatin và cao chiết được uống kéo dài 7 ngày trước khi gây mô hình. Poloxamer 407 là một chất hoạt động bề mặt không ion hóa có khả năng gây RLLPM thông qua một số cơ chế liên quan đến các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa lipid [37]. Mô hình nội sinh được thực hiện bằng cách dùng các chất hoạt động bề mặt không ion hoá như Tween 80, Triton WR-1339 hoặc Poloxamer 407 (P-407) đường toàn thân mà không cần dùng tới nguồn lipid ngoại sinh bổ sung bằng đường ăn uống. Các chất này đã được chứng minh cơ chế làm tăng tổng hợp cholesterol tại gan [23, 41]. Trước đây, nhóm nghiên cứu đã sử dụng Tween 80 để gây rối loạn lipid máu nhưng kết quả thu được không ổn định, không làm rối loạn rõ rệt nồng độ lipid máu của động vật thí nghiệm. Ở nghiên cứu này, chúng tôi chọn P- 407 vì có khả năng gây tăng lipid máu cao hơn và an toàn hơn so với Triton WR-1339 [31, 41]. Tham khảo liều dùng P-407 trên chuột nhắt trắng từ các nghiên cứu trước [24, 25, 41] trong nghiên cứu này liều P- 407 được dùng là 200 mg/kg chuột. Sau khi tiêm màng bụng chuột, nồng độ lipid máu bắt đầu tăng và đạt cực đại sau 24 giờ, sau đó giảm dần về bình thường [24, 38], do vậy chúng tôi chọn thời điểm 24 giờ sau khi tiêm P- 407 để định lượng nồng độ lipid máu của chuột thí nghiệm.

Kết quả nghiên cứu trong bảng 3.4 cho thấy, ở các lô được tiêm màng bụng P- 407, tất cả các thông số lipid máu đều tăng lên rõ rệt so với lô chứng sinh học, trong đó tăng cao nhất là nồng độ TG (gấp khoảng 8 lần so với nhóm chứng), nồng độ TC và nồng độ non-HDL-C tăng ít hơn, gấp khoảng 3 lần so với nhóm chứng sinh học. Tất cả chuột ở các lô sau khi được tiêm P-407 đều không có dấu hiệu bất thường nào về tình trạng chung như: chuột vẫn hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, phân khô, không có chuột nào chết. Điều đó cho thấy P-407 là một chất có hiệu quả và an toàn trong việc gây mô

hình rối loạn lipid máu nội sinh trên động vật thí nghiệm. Kết quả này tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đó tiến hành trên chuột nhắt trắng [24, 31, 41], mặc dù mức tăng chỉ số TG thấp hơn so với mô hình của tác giả Phạm Thanh Tùng, Đỗ Quốc Hương và Tạ Thu Thủy nhưng cũng đã thể hiện được mức tăng đáng kể các chỉ số lipid máu, mức tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,001 với TC, TG và non-HDL-C) [16, 26, 28]. Vì vậy, mô hình tăng lipid máu bằng P-407 trong nghiên cứu là thành công.

4.2.2. Đánh giá mô hình thuốc đối chứng Atorvastatin 10 mg

Trên mô hình nghiên cứu thực nghiệm, thuốc đối chứng được lựa chọn là viên nén atorvastatin 10 mg. Đây cũng là loại thuốc thường được các nhà nghiên cứu trên thế giới sử dụng làm thuốc đối chứng. Atorvastatin là thuốc thuộc nhóm statin, là nhóm hiệu quả nhất trong điều trị rối loạn lipid máu hiện nay với cơ chế ức chế enzym HMG-CoA reductase, làm giảm tổng hợp cholesterol và làm tăng hoạt động của các LDL receptor ở gan. Về tác dụng của thuốc trong nhóm statin thì mức độ điều chỉnh RLLPM giảm dần theo thứ tự: Rosuvastatin, atorvastatin, simvastatin, lovastatin,…[53]. Do đó sử dụng rosuvastatin làm thuốc chứng dương sẽ có kết quả tốt nhất, tuy nhiên giá thành rosuvastatin đắt, mà atorvastatin có tác dụng khá tốt, nên chúng tôi chọn atorvastatin làm thuốc đối chứng để so sánh.

Trong nghiên cứu chúng tôi chọn mức liều cao là 100 mg/kg vì trên lâm sàng thuốc điều trị RLLPM thường bắt đầu có tác dụng sau 10 – 15 ngày và tối đa sau 1 tháng. Trong khi đó thời gian thực hiện trên mô hình nội sinh là 7 ngày nên phải chọn liều cao mới có thể đánh giá được tác dụng điều chỉnh RLLPM.

P-407 là một chất hoạt động bề mặt (chất hoạt động bề mặt) dựa trên polyether, cung cấp một phương tiện gây tăng lipid máu do nó khởi phát nhanh và dường như không có độc tính quá mức so với Triton WR-1339 [40]. Poloxamer 407 có được biết là gây tăng cholesterol máu phụ thuộc vào liều đáng kể và tăng triglycerid máu ở chuột cống và chuột nhắt theo một số cơ chế (ức chế lipoprotein lipase, kích thích gián tiếp HMG-CoA (3-hydroxy-3- methylglutaryl Co-A) reductase, thúc đẩy nồng độ cholesterol ở gan). Dựa trên cơ chế của P-407 và các mảnh bằng chứng về hiệu quả, statin được chọn làm

chất chuẩn tham chiếu cho thuốc. Nó ức chế HMG-CoA reductase, chống lại tác dụng của P-407, do đó làm giảm TC huyết thanh. Ngoài ra, nó cũng làm giảm mức LDL bằng cách hạ thấp mức độ tiền chất của nó (VLDL và IDL), giúp tăng cường hơn nữa tác dụng hạ lipid của nó. Hiện nay, có bảy loại statin khác nhau nói chung, nhưng chỉ atorvastatin và rosuvastatin được sử dụng trong liệu pháp cường độ cao. Atorvastatin có mức độ điều chỉnh rối loạn lipid máu vừa phải, thuốc có giá thành phù hợp và sẵn có trên thị trường tại thời điểm nghiên cứu nên thường được chọn làm thuốc đối chứng dương cho các đánh giá tác dụng hạ lipid máu trên mô hình thực nghiệm cũng như lâm sàng [35].

Kết quả bảng 3.5 cho thấy atorvastatin có hiệu quả giảm đáng kể tình trạng tăng lipid máu trên thực nghiệm về các chỉ số TC, TG, non-HDL-C. So sánh với mội số kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy có kết quả tương đồng với nghiên cứu của tác giả Phạm Thanh Tùng, Tạ Thu Thủy và Đỗ Quốc Hương [16, 26, 28].

4.2.3. Đánh giá tác dụng của cao chiết lá chè vằng trên các chỉ số lipid máu

Như chúng ta đã biết, ở hầu hết các phòng xét nghiệm, các chỉ số lipid máu thường được định lượng bao gồm TG, TC và HDL- C. Chỉ số LDL-C được tính theo công thức Friedewald: LDL- C (mmol/L) = TC- HDL- C - TG/ 2,2. Đây là công thức tương đối tin cậy và được Chương trình giáo dục quốc gia về cholesterol của Mỹ (National cholesterol Education Program - NCEP) khuyến cáo như một phương pháp thông thường để tính LDL- C [42]. Tuy nhiên công thức Friedewald cũng có những hạn chế nhất định, có thể gây sai số khi tính toán vì dựa trên định lượng 3 thông số lipid khác. Hơn nữa, nếu nồng độ TG > 2,26 mmol/L thì công thức này không đáng tin cậy và phải nhịn đói ít nhất 8 giờ trước xét nghiệm để loại trừ sự tồn tại của chylomicron trong máu [30]. Vì vậy, NCEP đã đưa ra chỉ số non- HDL-C, được tính toán theo công thức: non - HDL-C = TC - (HDL-C) khi nồng độ TG > 2,26 mmol/L [42]. Non - HDL- C chủ yếu bao gồm LDL và VLDL. Nồng độ non - HDL- C có thể được định lượng ngay cả những trường hợp không nhịn đói [48].

Kết quả nghiên cứu trong bảng 3.5 cho thấy cao chiết chè vằng có tác dụng điều chỉnh RLLPM, nhưng hiệu quả lên các chỉ số lipid máu có khác

nhau: Cả hai mức liều 36 mg/kg và liều 108 mg/kg đều làm giảm có ý nghĩa thống kê chỉ số TG, TC, non-HDL-C lần lượt là (7,9%, 15,6% và 16,9%) và (9,3%, 16,8% và 18,3%) so với lô mô hình. Có thể thấy cao chiết liều cao hơn thể hiện tác dụng điều chỉnh các chỉ số lipid tốt hơn. Tuy nhiên mức giảm các chỉ số lại thấp hơn so với thuốc đối chứng atorvastatin 100 mg/kg (TG: ↓14,3%; TC: ↓27,2%; non-HDL-C: ↓18,9%).

isoquercetrin,

nicotiflorin, apiosylverbascosid,

Giải thích cho tác dụng hạ lipid máu của cao chiết từ lá cây chè vằng: nghiên cứu từ những năm 1984 cho thấy chè vằng có terpenoid, glycosid đắng, flavonoid, syringin. Nhiều hợp chất có dược tính tốt đã được biết và công nhận như betulin, axit betulinic, 3β-acetyl-oleanoic, lupeol, β-sitosterol, rutin, verbascosid, astragalin, isoverbascosid, 6'-O-menthiafoloylverbascosid, isooleoverbascosid, Daucosterol, Dotriacontanol [7, 43]. Trong đó một số thành phần đã được chứng minh rằng có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu có thể kể đến là:

Betulin: Các protein liên kết yếu tố điều hòa sterol (SREBPs) là yếu tố phiên mã chính kích hoạt sự biểu hiện của các gen liên quan đến sinh tổng hợp cholesterol, axit béo và chất béo trung tính. Nghiên cứu của Jing-Jie Tang (2011) đã chỉ ra rằng sự ức chế SREBP bởi betulin đã làm giảm sinh tổng hợp cholesterol và axit béo do giảm thúc đẩy sự suy thoái HMG-CoA reductase. Vì vậy betulin được coi là một hợp chất hàng đầu để phát triển các loại thuốc điều trị chứng tăng lipid máu [47].

Lupeol: Điều trị bằng lupeol liều 50 mg/kg/ngày trên mô hình chuột cống ăn cholesterol ngoại sinh trong 15 ngày đã giảm đáng kể mức lipid với mức giảm TC và TG lần lượt là 26,7% và 28,7% so với lô mô hình. Nhóm được điều trị bằng lupeol đã cho thấy sự bài tiết cholesterol trong phân và axit mật và dần dần mức cholesterol trở lại bình thường [46].

Rutin: Một nghiên cứu về “tác dụng của rutin trên mô hình chuột tăng cholesterol máu” (2009) của Ziaee và cộng sự cho thấy chế độ ăn giàu cholesterol kết hợp với 10 mg/kg rutin đã làm giảm 21,1% TC và 48,8% LDL- C [54].

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận:

Cao chiết chè vằng mức liều 18 mg/kg/ngày và 54 mg/kg/ngày trên

chuột cống trắng trong 90 ngày cho kết quả an toàn.

Cao chiết chè vằng mức liều 36 mg/kg/ngày và 108 mg/kg/ngày trên chuột nhắt trắng gây mô hình RLLPM nội sinh bằng P-407 trong 7 ngày cho kết quả giảm đáng kể các chỉ số lipid có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) trong máu là TC, TG, non-HDL-C. Có thể tiến hành các nghiên cứu trên lâm sàng.

Đề xuất:

Cần thêm các nghiên cứu trên in vitro để đánh giá tác dụng hạ lipid máu của thành phần rutin, lupeol và betulin có trong cao chiết chè vằng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

Đông Thị Hoài An (2005), Lipid, apoprotein, lipoprotein huyết tương, Hóa sinh lâm sàng, Nhà xuất bản Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh.

Bộ môn hoá sinh Trường Đại học Y Hà Nôi (2001), Chuyển hoá lipid, Hoá sinh, Nhà xuất bản Y học.

Bộ Y tế (1996), Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền.

Bộ Y tế (2004), Danh mục thuốc quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

Bộ Y tế (2014), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh nội tiết-chuyển hóa.

Bộ Y Tế (2015), Quyết định 141/QĐ-K2ĐT 2015 Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc từ Đông Y, thuốc từ dược liệu.

PGS.TS Ngô Kim Chi (2017), "Nghiên cứu hiệu quả chiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học lá chè vằng La Văng Cam Lộ Quảng Trị", Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam.

TS Tạ Mạnh Cường (2010), Rối loạn lipid máu (tăng lipid máu). 8.

Đại học Y Hà Nội (2007), Sinh lý bệnh và miễn dịch, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

10. Nguyễn Thị Hà (2007), Lipid máu và rối loạn chuyển hóa lipid, Chuyên

đề Sau đại học, Bộ môn hóa sinh - trường Đại học Y Hà Nội.

11. Nguyễn Thị Ninh Hải (1986), GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CHÈ VẰNG (Jasminum subtriplinerve Blume - Oleaceae), Luận án Tiến sĩ Dược học.

12. Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam (1998), Khuyến cáo số 06 - Xử trí

rối loạn lipid máu.

13. Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam (2008), "Khuyến cáo 2008 của hội Tim mạch học Việt Nam về chẩn đoán và điều trị rối loạn lipid máu", Khuyến cáo 2008 về các bệnh lý tim mạch và chuyển hóa, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, pp. 94-99.

14. Hội Tim mạch học quốc gia Việt Nam (2008), Xử trí rối loạn lipid máu, Khuyến cáo về chẩn đoán và điều trị rối loạn chuyển hóa lipid máu.

15. Nguyễn Văn Hưng (2018), Giải phẫu bệnh học, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội.

16. Đỗ Quốc Hương (2016), Nghiên cứu độc tính và hiệu quả của viên nang Lipidan trong điều trị hội chứng rối loạn lipid máu, Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

17. Nguyễn Thế Khánh và Phạm Tử Dương (2001), Xét nghiệm sử dụng

trong lâm sàng, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

18. Phạm Khuê (2000), Vữa xơ động mạch, Bệnh học tuổi già, Nhà xuất bản

Y học, Hà Nội.

19. Phạm Khuê, Phạm Gia Khải và Nguyễn Lân Việt (2004), Xơ vữa động

mạch, ed. khoa, Bài giảng bệnh học nội, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

20. Đỗ Tất Lợi (2001), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

21. PGS.TS. Nguyễn Nghiêm Luật (2012), Hóa sinh, Sách đào tạo bác sĩ đa

khoa, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

22. Phí Thị Ngọc (2001), Nghiên cứu tác dụng của bài thuốc HHKV lên một số chỉ số lipid máu ở thỏ và chuột, Luận văn thạc sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội, Hà Nội.

23. Đoàn Thị Nhu (2006), "Phương pháp nghiên cứu dược lý thuốc chống tăng lipid máu và thuốc tác dụng trên vữa xơ động mạch", Phương pháp

nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, pp. 131-138.

24. Nguyễn Phương Thanh (2011), Nghiên cứu độc tính và tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của Monacholes trên thực nghiệm, Luận văn Bác sĩ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội.

25. Phương Thanh Mai (2013), Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu của bài thuốc Chỉ thực đạo trệ hoàn trên thực nghiệm, Luận văn thạc sỹ y hoc Hà Nội ed. Nội, Trường Đại học Y Hà, Hà Nội.

26. Tạ Thu Thủy (2016), Đánh giá tác dụng điều trị hội chứng rối loạn liid

máu của cao lỏng đại an, Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

27. Nguyễn Văn Tuấn và Hoàng Thị Cúc (2022), "Nghiên cứu rối loạn lipid

máu ở người cao tuổi tăng huyết áp", Tạp chí y học Việt Nam. 508(1).

28. Phạm Thanh Tùng (2019), Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng của viên nang cứng Vinatan trong điều trị hội chứng rối loạn lipid máu trên thực nghiệm và lâm sàng, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Y dược học Cổ truyền Việt Nam.

29. Nguyễn Lân Việt (2008), Cập nhật vai trò của Statin trong việc ngăn ngừa tiến triển của xơ vữa động mạch, Tài liệu hội thảo khoa học, Viện tim mạch học Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH

30. Bairaktari Eleni T, Seferiadis Konstantin I, and Elisaf Moses S (2005), "Evaluation of methods for the measurement of low-density lipoprotein cholesterol", Journal of cardiovascular pharmacology and therapeutics. 10(1), pp. 45-54.

31. Dumortier G., et al. (2006), "A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics", Pharm Res. 23(12), pp. 2709-28.

32. Expert Pannel on Detection Evaluation, and Treament of High Blood cholesterol in Adults (2001), "Executive Summary of The Third Report of The National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, And Treatment of High Blood Cholesterol In Adults (Adult Treatment Panel III)", Jama. 285(19), pp. 2486-97.

34. Garg A. and Simha V. (2007), "Update on dyslipidemia", J Clin

Endocrinol Metab. 92(5), pp. 1581-9.

35. Golomb B. A. and Evans M. A. (2008), "Statin adverse effects : a review of the literature and evidence for a mitochondrial mechanism", Am J Cardiovasc Drugs. 8(6), pp. 373-418.

36.

Johnston T. P. (2004), "The P-407-induced murine model of dose- controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: a review of findings to date", J Cardiovasc Pharmacol. 43(4), pp. 595-606.

37.

Johnston T. P., Korolenko T. A., and Sahebkar A. (2017), "P-407- induced Mouse Model of Dose-controlled Hyperlipidemia and Atherosclerosis: 25 Years Later", J Cardiovasc Pharmacol. 70(5), pp. 339-352.

38.

Johnston Thomas P and Palmer Warren K (1993), "Mechanism of poloxamer 407-induced hypertriglyceridemia in the rat", Biochemical pharmacology. 46(6), pp. 1037-1042.

39. Leon C., et al. (2006), "Acute P-407 administration to mice causes inducing cholesterolgenesis and down- hypercholesterolemia by regulating low-density lipoprotein receptor expression", Pharm Res. 23(7), pp. 1597-607.

40. Loginova V. M., et al. (2013), "Comparative characteristics of lipemia models induced by injections of Triton WR-1339 and poloxamer 407 in mice", Bull Exp Biol Med. 155(2), pp. 284-7.

41. Millar J. S., et al. (2005), "Determining hepatic triglyceride production in mice: comparison of poloxamer 407 with Triton WR-1339", J Lipid Res. 46(9), pp. 2023-8.

42. Detection National Cholesterol Education Program . Expert Panel on and Adults Treatment of High Blood Cholesterol in (2002), Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III), The Program.

43. Huong N. T., et al. (2008), "A new phenylpropanoid glycoside from Jasminum subtriplinerve Blume", J Asian Nat Prod Res. 10(11-12), pp. 1035-1038.

44. OECD (2001), Test Guideline for the Testing of Chemicals, Acute Oral

Toxicity – Up and Down procedure.

45. OECD (2018), Test no. 408: repeated dose 90-day oral toxicity study in

rodents, OECD Publishing.

46. Sudhahar V., Ashokkumar S., and Varalakshmi P. (2006), "Effect of lupeol and lupeol linoleate on lipemic--hepatocellular aberrations in rats fed a high cholesterol diet", Mol Nutr Food Res. 50(12), pp. 1212-9.

47. Tang J. J., et al. (2011), "Inhibition of SREBP by a small molecule, betulin, improves hyperlipidemia and insulin resistance and reduces atherosclerotic plaques", Cell Metab. 13(1), pp. 44-56.

48. Virani Salim S (2011), "Non-HDL cholesterol as a metric of good quality of care: opportunities and challenges", Texas Heart Institute Journal. 38(2), p. 160.

49. Wasan K. M., et al. (2003), "Poloxamer 407-mediated alterations in the activities of enzymes regulating lipid metabolism in rats", J Pharm Pharm Sci. 6(2), pp. 189-97.

50. WHO (2000), General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of Traditional Medicine, World Health Organization, Geneva.

51. WHO (2000), Working group on the safety and efficacy of herbal medicine,, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization.

52. Wout Z. G., et al. (1992), "Poloxamer 407-mediated changes in plasma cholesterol and triglycerides following intraperitoneal injection to rats", J Parenter Sci Technol. 46(6), pp. 192-200.

53. Zhang X., et al. (2020), "Comparative Lipid-Lowering/Increasing Efficacy of 7 Statins in Patients with Dyslipidemia, Cardiovascular Diseases, or Diabetes Mellitus: Systematic Review and Network Meta- Analyses of 50 Randomized Controlled Trials", Cardiovasc Ther. 2020, p. 3987065.

54. Ziaee A., et al. (2009), "Effects of rutin on lipid profile in hypercholesterolaemic rats", Basic Clin Pharmacol Toxicol. 104(3), pp. 253-8.