Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA

VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL

HÓA VÀ MỘT SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa

: QH.2013.Y

Ngƣời hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ THỊ THƠM

2. PGS. TS. DƢƠNG THỊ LY HƢƠNG

Hà Nội - 2018

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược,

Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược

học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình

học tập trong suốt 5 năm qua.

Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và

PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo

điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em

trong quá trình hoàn thành khóa luận.

Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp

khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài

cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-

18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin

cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,

em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hồ Thị Thu Hà

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Giải thích

Acetylcholin ACh

Tetrahydrobiopterin BH4

Camodulin CaM

Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation) CD

GMP vòng (Cyclic guanosine monophosphate) cGMP

Cyclooxygenase COX

Cyclooxygenase-1 COX-1

Cyclooxygenase-2 COX-2

Endothelial nitric oxide synthase eNOS

Flavin adenine dinucleotide FAD

Flavin mononucleotide FMN

Guanosine-5'-triphosphate GTP

Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người (Human umbilical vein HUVEC endothelial cell)

ICAM - 1 Phân tử kết dính liên bào 1 (Intercellular adhesion molecule 1)

Inducible nitric oxide synthase iNOS

Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%) LD50

Lipopolyshaccharide LPS

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

Neuronal nitric oxide synthase nNOS

Nitric oxide NO

4

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nitric oxide synthase NOS

Thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti- NSAIDs inflammatory drugs)

Nhiễm sắc thể NST

PDGF Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet-derived growth factor)

Prostaglandin PG

Prostaglandine E2 PGE2

Prostacyclin PGI2

Cao giàu saponin Tam thất hoang PS27

Cao chiết bằng dung môi n - butanol Tam thất hoang PSBt

Cao chiết bằng dung môi n - hexan Tam thất hoang PSnH

Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% Tam thất hoang PST

PCR thời gian thực (Reverse transcription polymerase chain RT-PCR reaction)

Serine Ser

Guanylyl cyclase hòa tan (Soluble guanylyl cyclase) sGC

Threonin Thr

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M.Feng) TTH

5

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

VCAM-1 Phân tử kết dính tế bào mạch (Vascular cell adhesion molecule)

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình Trang

Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. 2

Feng)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các chất 1–15 phân lập từ Panax 3

stipuleanatus

Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch 5

Hình 1.4 Cấu trúc của eNOS 9

Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS 11

Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội 12

mạc

Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin 15

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang 18

Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang 19

-

Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuôi và hệ thống ghi 20

23 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2

Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang 25

Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang 25

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng 26

hợp NO

Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 27

hiện protein eNOS phosphoryl hóa

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 28

hiện mARN COX-2

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu 29

6

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

hiện protein COX-2

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 1.1 Các dạng của NOS 8

7

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 3.1 Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập 24

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 2

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang ................................................................................. 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 2

1.1.2. Sinh thái và phân bố .................................................................................. 2

1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................... 3

1.1.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................... 4

1.1.5. Công dụng .................................................................................................. 4

1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS ........................................................... 5

1.2.1. Nội mạc mạch máu .................................................................................... 5

1.2.2. eNOS .......................................................................................................... 6

1.3. Tổng quan về viêm và COX-2 ............................................................................ 14

1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm .......................................................... 14

1.3.2 COX – 2 ................................................................................................... 15

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18

2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu ................................................................ 18

2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 18

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 19

2.2. Dung môi, hóa chất và thiết bị ............................................................................ 20

2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 21

2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập.................................................. 21

2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa ............. 22

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 24

8

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3.1. Kết quả ................................................................................................................ 24

3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập .................................................................... 24

3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa .................................. 26

3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2 .......................................................... 28

3.2. Thảo luận ............................................................................................................ 30

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập .................................................................... 30

3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa .................................. 31

3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2 ................................................... 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 35

9

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn

mạch quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu như trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô…

Tại nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội

mạc (eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều

khiển bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là một trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67]. Rối loạn chức

năng nội mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được

báo cáo trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37].

Trong những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa

đang là một mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi

Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].

Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất

hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài

thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp

NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58].

Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Điều này đặt ra câu hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay

không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu:

1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên

cơ trơn cô lập của khí quản, bàng quang và thể hang.

2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.

3. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện của gen COX-2 và protein COX-2.

1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang

Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M.

Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên

khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].

1.1.1. Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do

vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá.

Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai

đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5

nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2].

Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11]

1.1.2. Sinh thái và phân bố

Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia

Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9].

2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.1.3. Thành phần hóa học

Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin

khung dammaran với hàm lượng thấp [19].

Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2

saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43].

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được

11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là

spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm

tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra

3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45]

Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trong TTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh

dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố vi lượng [5,6].

3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.1.4. Tác dụng dƣợc lý

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 – 11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc

trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người

(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15]. Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15, hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2

(cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị

như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45].

Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân lập từ TTH là stipudiol và stipuol

ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích

hoạt quá trình apotosis của tế bào [46].

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao

TTH có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở

các mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao

saponin toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành

malonyl dialdehyd. Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều LD50 = 8,8 g/kg [5].

Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả

TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11].

1.1.5. Công dụng

Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh

dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma Panacis Stipuleanati [2].

4

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS

1.2.1. Nội mạc mạch máu

1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc

Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo

đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; lớp áo giữa gồm

những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3].

Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1]

Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch

huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch. Lớp nội mô thuộc biểu mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa

nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào

nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (1013) tế bào, bao phủ một diện tích khoảng 1 - 7 m2 hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52].

1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu

Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các

quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi [30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].

Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các mô xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65]. Rối

loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết.

5

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI2), EDHF (yếu tố cường phân cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin, P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và

VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch cầu hạt – đại thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL-6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin,

fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa

plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu tố mô), TFPI (chất ức chế con đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:

VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor),

PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu/ platelet derived growth factor)

[17,26,27,38].

Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến

nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch

vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn

và các hội chứng viêm [26,27].

1.2.2. eNOS

1.2.2.1. Nitric oxide

Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của

động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự có mặt của nội mô

nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tố giãn mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR). Năm 1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25]. Ngày

nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai trò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41]. NO tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69].

6

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30

Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của NO có một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO có khả năng phản ứng với các

nguyên tố kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc

tính quan trọng trong con đường tín hiệu của nó. Mặt khác, NO tan kém trong

nước, có thể dễ vượt qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trình sinh lý. Tuy nhiên, chất này không bền có thời gian bán thải (T1/2) ngắn và bị chuyển hóa nhanh trong cơ thể [25].

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym -. NOS là enzym xúc tác NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO2 cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O2 [69]. Ở động vật có vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST)

khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay

NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai -, phản ứng này được tạo điều kiện bởi để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2 - reductase như các enzym chứa molypden (xanthin oxidase), NOS và enzym NO2 - đóng vai nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO2 trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn. - Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO2 -. Quá trình này có thể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một và NO3 -) để hình phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O2 thành nên peroxynitrit (ONOO-) [25,69].

7

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69]

NOS - 1 NOS – 2 NOS - 3

nNOS iNOS eNOS Tên phổ

(Neuronal NOS) (Inducible NOS) (Endothelial NOS) biến

Tế bào nội mô

Neuron thần kinh và một số tế bào khác. Nhiều loại tế bào hệ thống miễn dịch như

đại thực bào khi đáp Tế bào ứng với biểu hiện lipopolysaccharid

(LPS), cytokin và các

chất khác.

NST 12, gồm 29 exon NST 17, 26 exon NST 7, 26 exon Gen

Enzym cảm ứng Enzym cấu trúc Đặc điểm Enzym cấu trúc

Ở hệ thần kinh trung Tham gia vào sinh lý Tham gia vào

ương: có liên quan bệnh của quá trình nhiều chức năng

thống

đến quá trình học tập và ghi nhớ; kiểm soát viêm và hệ miễn dịch tim mạch quan trọng: Giãn mạch, Chức năng ức chế các quá huyết áp trung ương. và các quá trình như kết tập Ở hệ thần kinh ngoại trình sinh tiểu cầu, kết dính vi: Chất dẫn truyền học bạch cầu, tăng sinh thần kinh, giãn cơ trơn

của tế bào cơ trơn và mạch

thành mạch.

1.2.2.2. eNOS

eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO

sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều hòa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu hiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tế bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế bào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70].

8

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Cấu trúc gen và protein

eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36); có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70].

Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng

homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:

- Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắn của NADPH (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide).

- Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4

(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin.

- Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid

amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM).

Hình 1.3. Cấu trúc của eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin) [29]

Phosphoryl hóa eNOS

Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc

Ca2+ và không phụ thuộc Ca2+:

Cơ chế phụ thuộc Ca2+: eNOS là một enzym phụ thuộc Ca2+/CaM. Khi nồng độ Ca2+ nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS. CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD và FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O2 từ đó oxi hóa L- arginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69].

Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã, được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS. Mặc dù hoạt động của eNOS phụ thuộc vào nồng độ Ca2+ nhưng đây không phải là yếu tố duy nhất cần

9

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

cho sự điều hòa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của

dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41]. Các nghiên cứu

chỉ ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp hơn trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hóa Ser1177, Ser617 và Ser633 làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr495 và Ser114 làm giảm chức năng eNOS. Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điều hòa bởi nhiều yếu tố như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF), bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/ threonin kinase Akt, CaMKII (Ca2+/ calmodulin dependent protein kinase II), AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl

hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41].

Ngoài ra, hoạt động của eNOS còn được điều khiển bởi sự tương tác với các

protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của

caveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS

[59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều

hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào

nội mô khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và

“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS với 2 protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca2+.

10

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1.5. Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS. Các vị trí eNOS phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41]

(VEGF: Vascular endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu; 8-Br-cAMP: 8-bromoadenosine-3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P:

sphingosine 1-phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: high-

density lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; )

1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc

a. Điều hòa trương lực mạch máu

Tại nội mạc NO được tạo ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa tan

(sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP

vòng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành

cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG), thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca2+ nội bào và giãn mạch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm chuột

bị xóa bỏ gen eNOS [47].

b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu

NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch. NO làm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch

cầu CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội mô hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu. Sự kết dính bạch cầu là

11

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành

xơ vữa động mạch [69]. Rối loạn tính toàn vẹn của hàng rào nội mô có thể khởi phát các sự kiện của tiền viêm. NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mô

gây ra bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS -

reactive oxygen species) và angiotensin II. Điều này có thể góp phần vào tác dụng

chống viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64].

c. Ức chế sự kết tập tiểu cầu

NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu

vào thành mạch [68,72].

d. Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch

NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh

của tế bào cơ trơn thành mạch. Tác dụng này có thể thông qua trung gian cGMP

[14,51]. Bên cạnh đó NO còn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng có

nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn. NOS cũng

quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dòng chảy

trong bệnh mạn tính [22].

Hình 1.6. Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52]

12

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.2.2.4. Vai trò của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý

a. Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn

tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16]. Quá

trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO

kèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1. Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho thấy NO có thể ức chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch. Do vậy, eNOS có thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt

tính của eNOS thông qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâm

đáng kể vì những vai trò sinh lý bệnh của nó [41].

b. Nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi

máu ở chuột bị loại bỏ eNOS không thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì

đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và

tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trò có lợi của NO và

eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55].

c. Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động

mạch, suy tim, bệnh động mạch vành, đột quỵ. NO và eNOS có vai trò quan trọng

giãn mạch gây hạ áp. Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa

bỏ gen eNOS [47].

d. Stress oxy hóa

Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và

phá hủy các ROS. Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh lý như dị tật tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn

đến rối loạn chức năng nội mô. Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mô [41].

Bên cạnh đó, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS còn liên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạn cương dương, Alzheimer... Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOS

phosphoryl hóa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].

13

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.3. Tổng quan về viêm và COX-2

1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm

Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố

gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương,

hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4]. Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự

tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau. Quá trình này có sự tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin, prostaglandin, leucotrien. Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố

đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3].

PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa được giải phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A2. Acid arachidonic được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/H synthase để hình thành nên PGG2 và sau đó là PGH2. PGH2 không bền bị chuyển hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7). Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2 (PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α) [33,61]. Trong đó, PGE2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm. Cụ thể, PGE2 gây giãn mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien, PGE2 làm tăng tính thấm của thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện. Đau là kết quả PGE2 làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau. Cuối cùng, PGE2 được xem như một chất trung gian gây sốt. Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36].

Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX. Enzym này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase – 2). COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận. Ngược lại,

COX-2 là một enzym cảm ứng, nó không biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất thấp trong các mô bình thường; dưới kích thích của các yếu tố tiền viêm, hormon và

14

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây

viêm và tham gia vào bệnh lý viêm. Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory

drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu

hiện nay [44].

Hình 1.7. Sinh tổng hợp prostaglandin [33]

(Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzym prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)

1.3.2. COX – 2

COX-2 là một trong 2 dạng chính của COX. Enzym này xúc tác cho hai bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36]. Ở người, gen mã hóa cho COX-2

nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63]. COX-2 là enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm. Sự tăng biểu hiện của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mô hình viêm khớp ở động vật cũng như

trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75].

15

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.3.2.1. COX-2 trong một số bệnh lý

a. Xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là sự tích tụ của cholesterol dưới lớp áo trong động mạch

gây ra hẹp, loét, xơ cứng lòng mạch. Đây là nguyên nhân của một số bệnh lý như

hội chứng mạch vành cấp, đột quỵ, thiếu máu cục bộ. Quá trình viêm xảy ra bên

trong các mảng xơ vữa đóng góp cho bệnh sinh của bệnh [35]. Một số nghiên cứu cho thấy, enzym COX-1 xuất hiện trong cả động mạch bình thường và động mạch xơ vữa trong khi COX-2 chỉ được tìm thấy trong các động mạch xơ vữa. Trong mảng xơ vữa, COX-2 được biểu hiện bởi nhiều loại tế bào như tế bào đại thực bào,

bạch cầu mono, tế bào nội mô. Enzym này có thể tham gia vào xơ vữa động mạch

theo nhiều cơ chế liên quan đến một số quá trình như hoạt hóa các chất hóa hướng

động, sản xuất của các cytokin gây viêm, biến đổi tính thấm của thành mạch [28].

Nghiên cứu trên chuột cũng cho thấy, celecoxib một chất ức chế chọn lọc COX-2 có

thể ngăn chặn sự tiến triển của tổn thương mảng xơ vữa [54]. Từ đó, có thể thấy

được vai trò của viêm và COX-2 trong xơ vữa động mạch. Tuy nhiên, các chất ức

chế chọn lọc COX-2 cũng có thể gây ra bất lợi trong sự ổn định của mảng xơ vữa và

do vậy làm tăng nguy cơ biến cố tim mạch và tử vong [35].

b. Sinh mạch và ung thư

Sinh mạch là sự hình thành các mạch máu mới trên nền các mạch máu cũ, xảy

ra trong suốt quá trình phát triển của phôi thai, sinh mạch cũng tham gia vào bệnh

sinh nhiều rối loạn đặc biệt là ung thư. Các báo cáo chỉ ra rằng, các chất trung gian gây viêm (như PGE2, CRP, IL-6, TNFα) tăng trong ung thư [23,35]. Sự tăng tổng hợp PGE2 và tăng biểu hiện của COX-2 nhưng không phải là COX-1 cũng đã được quan sát thấy trong mô ung thư đại trực tràng khi so sánh với mô lành [48,71]. Ngoài ra, cả

hai loại NSAIDs tác dụng không chọn lọc và chọn trên COX-2 đã thể hiện hoạt tính ức chế sự sinh mạch và tăng sinh của khối u trên mô hình động vật [50]. Từ đó có thể gợi ý được vai trò quan trọng COX-2 trong sự tiến triển của ung thư [23,35].

c. Suy thận

Các PG đặc biệt là PGE2 và PGI2 đóng vai trò quan trọng trong chức năng thận người trưởng thành. PG gây giãn mạch thận; ức chế sự tái hấp thu natri ở ống thận; kiểm soát sự giải phóng renin và phát triển thận ở giai đoạn bào thai. Ở thận vai trò của COX-2 trong tổng hợp PG khá phức tạp, tham gia cho đáp ứng cả chức

năng sinh lý và bệnh lý. Nghiên cứu cho thấy, trong suy thận, nồng độ của mARN

16

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

COX-2 và protein COX-2 cũng như hoạt tính của enzyme này tăng lên. Sự tăng biểu

hiện của COX-2 có liên quan đến sự sản xuất angiotensin II, tăng natri, tăng huyết áp cầu thận và viêm ống thận [62]. Bên cạnh đó, các chất ức chế chọn lọc trên COX-2

cũng cho thấy tác dụng làm chậm sự xơ hóa cầu thận và protein niệu trên chuột bị cắt

bỏ một phần thận gợi ý vai trò có lợi của các chất này trong suy thận [49].

1.3.2.2. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2

Các thuốc chống viêm không steroid (Non-steroidal anti-inflammatory drugs - NSAIDs) được sử dụng rộng rãi trong điều trị lâm sàng. Tuy nhiên ngoài những tác dụng dược lý mà chúng mang lại như hạ sốt, giảm đau, chống viêm thì các

NSAIDs cũng kèm theo nhiều tác dụng phụ đặc biệt là trên hệ tiêu hóa như viêm

loét dạ dày tá tràng gây ra do sự ức chế không chọn lọc của chúng trên enzym

COX-1 là enzym chịu trách nhiệm trong việc tạo ra các PG cần cho tác dụng sinh lý

bình thường. Chính vì vậy, xu hướng mới là tạo ra các NSAIDs có tác dụng chọn

lọc trên enzym COX-2 để giảm các tác dụng phụ mà vẫn duy trì được tác dụng

chống viêm của nó. Một số thuốc tác dụng chọn lọc trên COX-2 hiện nay như

rofecoxib, celecoxib, valdecoxib [10,36]. Ngoài ra, các nghiên cứu về vai trò của

COX-2 trong một số bệnh lý cũng tạo ra các hướng mới trong tác dụng có thể có

khác của các thuốc ức chế chọn lọc trên COX-2 như chống ung thư [48]. Tuy nhiên,

một trong những tác dụng phụ đáng chú ý nhất của các thuốc này là tăng nguy cơ

trên các bệnh tim mạch. Chính vì vậy, việc sử dụng các thuốc ức chế chọn lọc trên

COX-2 cũng cần đặc biệt thận trọng trên các bệnh nhân tim mạch [10].

17

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu và đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Thân rễ Tam thất hoang được thu hái tại Hoàng Su Phì, Hà Giang vào tháng

08/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Tam thất hoang - Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài

nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Quy trình chiết xuất các phân đoạn của Tam

thất hoang được tiến hành theo sơ đồ dưới (Hình 2.1 và 2.2). Các phân đoạn dịch

chiết dược liệu được tiến hành tại khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp. Các phân đoạn được nghiên cứu bao gồm: Cao tổng (ký hiệu:

PST); phân đoạn n-hexan (ký hiệu: PSnH); phân đoạn diclomethan (ký hiệu: PS

DCM); phân đoạn n-butanol (ký hiệu: PSBt) và cao giàu saponin (ký hiệu: PS27)

Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang

18

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang

2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu

 Cơ trơn cô lập của bàng quang, thể hang và khí quản

Chuột cống trắng khỏe mạnh chủng Wistar, trọng lượng từ 150 – 250 g được

sử dụng trong nghiên cứu này. Chuột được nuôi trong điều kiện thoáng mát với chu

kỳ 12 giờ sáng: 12 giờ tối và không hạn chế về thức ăn nước uống. Mọi quy trình

nghiên cứu trên động vật thực nghiệm trong nghiên cứu này tuân theo hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật của Học viện Quân Y.

Quy trình cô lập cơ trơn khí quản, bàng quang và thể hang chuột:

- Gây mê chuột bằng ketamin 25 mg/kg. - Bộc lộ bàng quang, thể hang và khí quản. - Tách lấy các cơ quan trên cho vào cốc chứa dịch nuôi Tyrode ở nhiệt độ

khoảng 37 °C.

- Phẫu tích loại bỏ toàn bộ tổ chức liên kết bám ở các đoạn cơ trơn.

19

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Dùng 2 móc kim loại để móc 2 đầu dải cơ trơn và cho vào bình nuôi đã chứa sẵn dung dịch nuôi Tyrode (15 ml) được ổn định nhiệt độ 37 °C và cung cấp đủ oxy. Một móc được gắn cố định dưới đáy bình và móc còn lại được nối

với đầu đo áp lực của hệ thống Powerlab để ghi sự biến đổi lực co của đoạn

cơ trơn (Hình 2.3).

Hình 2.3. Phƣơng pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuôi và hệ thống ghi

 Tế bào nghiên cứu

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 sử dụng cho nghiên cứu biểu hiện của

COX-2 và tế bào HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người/ human umbilical

vein endothelial cell) dùng cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa

được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD).

Tế bào được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 37 °C, CO2 5 %, trong môi trường có chứa 10 % huyết thanh bào thanh bò (Fetal bovine serume - FBS), penicillin (100 units/ml) và streptomycin (100 µg/ml). Đối với tất cả các thí nghiệm, các tế bào được nuôi đến mật độ 80 – 90 % và chịu không quá 20 lần phân chia tế bào.

2.2. Dung môi, hóa chất và thiết bị

 Dung môi, hóa chất - Acetylcholin được mua từ Sigma-Aldrich và được pha với nước cất theo tỷ lệ

1:103, 1:104 và 1:105.

20

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Dung dịch nuôi Tyrode (Thành phần gồm: NaCl: 139,2 mM; KCl: 2,7 mM; CaCl2: 1,8 mM; MgCl2: 0,49 mM; NaHCO3: 11,3 mM; Na2HPO4: 0,4 mM; glucose: 5,5 mM).

- Nghiên cứu biểu hiện của eNOS và COX-2: Bộ dụng cụ kiểm tra, chuẩn hóa chất, kháng thể, các dung môi được mua từ Promega, Sigma-Aldrich và

Santa Cruz.

 Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống bình nuôi cô lập gồm 4 bình nuôi, với hệ thống ổn nhiệt và cung

cấp oxy liên tục cho các bình nuôi.

- Hệ thống ghi Powerlab 8.0 của công ty Austruments, Úc.

- Máy đo mật độ quang Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo

Scientific).

- Máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied Biosystems).

- Máy chụp Western blot Odyssey Fc Imager (LI-COR Biosciences).

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập

Nghiên cứu tác dụng của Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập được tiến hành

tại Bộ môn Sinh lý học, Học viện Quân Y. Quy trình thử thuốc như sau:

- Cơ trơn sau khi cô lập và được gắn vào bình nuôi, đặt một lực tác động cơ sở tương đương 2 g lên đoạn cơ trơn cô lập và chờ 30 phút để hoạt động của cơ

trơn ổn định.

- Nhỏ vào bình nuôi 0,15 ml dung dịch acetylcholin với nồng độ tăng dần từ 1:103 đến 1:105. Khi có sự thay đổi lực co cơ rõ ràng trên đồ thị, tiến hành chuyển sang thử tác dụng của dược liệu.

- Nhỏ 0,15 ml dung dịch mỗi loại dịch chiết dược liệu vào bình nuôi cô lập từ nồng độ 0,5 mg/ml đến nồng độ 2 mg/ml. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử 4 phân đoạn dược liệu (Cao tổng, phân đoạn n-hexan, phân đoạn diclomethan và phân đoạn n-butanol) với 3 mức liều: 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml. Mỗi phân đoạn dược liệu được thử 2 lần.

- Theo dõi sự giãn cơ trơn của cơ quan cô lập trên đồ thị và đánh giá ảnh

hưởng của các phân đoạn dược liệu tới sự giãn cơ trơn cô lập.

21

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa

 Phân tích RT – PCR cho mARN của COX-2

ARN toàn phần được phân lập từ tế bào bằng cách sử dụng bộ Kit miRNeasy

Mini Kit (Qiagen, #217004) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức độ biểu hiện

của mARN được phân tích bằng máy Real-time PCR StepOnePlus (Applied

Biosystems) sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Xanh (Qiagen, # 204156) và các cặp mồi xét nghiệm từ Qiagen: cặp mồi Ptgs2 (COX-2, QT00165347) có trình tự mồi xuôi 5’-GCCCAGCACTTCACGCATCAG-3’ và mồi ngược 5’- GACCAGGCACCAGACCAAAGACC-3’; cặp mồi Mm_GADPH (QT01658692)

có trình tự mồi xuôi 5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′ và mồi ngược 5′-

CTCCACGACGTACTCAGCG-3′.

 Phân tích Western blotting

- Sau khi nuôi cấy, các tế bào được thu gom và rửa bằng PBS (Phosphate buffer saline, thành phần gồm NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM và KH2PO4 1,8 mM).

- Ly giải tế bào bằng 100 µl dung dịch đệm gồm NaCl 120 mM, Tris 40 mM

(pH 8), NP40 0,1% trong đá ở thời gian 30 phút.

- Ly tâm tốc độ 13.000 vòng/ phút trong 20 phút. Phần dung dịch phía trên được thu thập và nồng độ protein được xác định bằng phương pháp

Bradford.

- Ủ phần dung dịch chứa protein ở 95 °C trong 5 phút và điện di trên gel SDS -

polyacrylamid 10%.

- Chuyển protein trong gel sang màng nitrocellulose.

- Ủ với kháng thể đơn dòng sơ cấp chuột chống COX-2 cho nghiên cứu biểu hiện của COX-2 hoặc phosphoryl-eNOS cho nghiên cứu biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và beta-actin. Để phát hiện kháng thể sơ cấp, các màng được

tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp liên hợp với peroxidase (Beverly, MA). Trong các phân tích Western blot, beta-actin được sử dụng như là protein chứng cho biểu hiện của các protein khác.

- Cuối cùng, protein được phát hiện bằng cách sử dụng chất tăng cường hóa phát quang cho phát hiện các băng protein đích trên màng nitrocellulose

(Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

22

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- và NO3

 Đo quang sản phẩm NO Lượng NO trong môi trường nuôi cấy tế bào được xác định gián tiếp thông - (nitrit) bằng cách sử dụng thuốc thử Griess (Enzo Life Sciences, qua ion NO2 Plymouth Meeting, PA). NO có thời gian bán hủy ngắn, trong cơ thể NO bị chuyển - (nitrat) do vậy để phân tích chính xác lượng NO tổng số hóa thành NO2 -. Thuốc thử Griess gồm - và NO3 được tạo ra ta phải theo dõi cả nồng độ NO2 sulfanilamid và N-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid (NED). Đầu tiên, - tạo thành muối diazoni. Sau đó muối này sẽ sulfanilamid sẽ phản ứng với NO2 phản ứng với NED để hình thành nên hợp chất azo màu hồng và có cực đại hấp thụ

ở bước sóng 540 nm (Hình 2.4).

-

Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2

- thành NO2

Môi trường tế bào HUVEC (100 µl) sau khi được ủ 24 giờ với 30 µg/ml dịch

chiết dược liệu, được ủ tiếp với enzym nitrit reductase trong 1 giờ ở 37 ° C để khử -. Thêm thuốc thử Griess 100 µl sau đó và mẫu được đem đo mật độ NO3 quang ở bước sóng 540 nm.

 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Khoa học Y học thực nghiệm, Khoa

Y, Đại học Lund, Thụy Điển (Department of Experimental Medical Science,

Faculty of Medicine, Lund University, Sweden).

 Xử lý kết quả

- Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Kết quả được biểu

-

diễn dưới dạng X ± SE (X: giá trị trung bình, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng test one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Tukey hoặc Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của từng lô. Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05. Hình ảnh điện di protein được xử lý bằng phần mềm Image J 1.49u để đưa ra dữ liệu định lượng cho kết quả protein trên bản điện di.

23

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả

3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập

Để xác định tác dụng co giãn trên các hệ cơ trơn cô lập, chúng tôi đã tiến

hành thử trên 4 phân đoạn của Tam thất hoang gồm cao tổng (PST); phân đoạn n- hexan (PSnH); phân đoạn diclomethan (PS DCM) và phân đoạn n-butanol (PSBt)

thu được kết quả ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên cơ trơn cô lập

Thuốc Liều thử Cơ trơn khí Cơ trơn bàng Cơ trơn thể

thử (mg/ml) quản quang hang

0,5 ± - -

PST 1 + + -

2 ++ + +

0,5 - - -

1 - + - PSBt

2 + ++ +

0,5 - ± ±

1 - ± ± PSnH

2 + ± ±

0,5 ± ± ±

1 ± ± ± PS DCM

2 ± ± ±

(-) không giãn; (±) tác dụng không rõ ràng; (+) giãn nhẹ; (++) giãn rõ

Nhận xét: Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng (PST) và phân đoạn n-butanol (PSBt) của TTH gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí

quản và cơ trơn bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn này bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn rõ từ nồng độ 2 mg/ml.

Phân đoạn n-hexan (PSnH) và phân đoạn diclomethan (PS DCM) hầu như không thể hiện tác dụng trên các hệ cơ trơn này ở tất cả các nồng độ.

24

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

 Một số hình ảnh giãn cơ trơn của các phân đoạn TTH

Hình 3.1. Sự giãn cơ trơn khí quản của phân đoạn tổng Tam thất hoang

Nhận xét: Hình 3.1 cho thấy khí quản co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:104 và giãn không rõ ràng ở liều PST 0,5 mg/ml, giãn nhẹ ở liều 1 mg/ml và giãn rõ từ liều 2 mg/ml.

Hình 3.2. Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của phân đoạn tổng Tam thất hoang

Nhận xét: Hình 3.2 cho thấy bàng quang co dưới liều acetylcholin nồng độ 1:104 và sau đó giãn bắt đầu từ liều PST 1 mg/ml.

25

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3.1.2. Tác dụng trên eNOS phosphoryl hóa

Tác dụng giãn cơ trơn có thể do NO được giải phóng từ hệ thống tế bào nội mô mạch máu tạo ra. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đo nồng độ NO

được giải phòng từ tế bào nội mô sau khi ủ với các dịch chiết Tam thất hoang. Tế

bào HUVEC sau khi ủ với nhiều phân đoạn dịch chiết khác nhau (30 µg/ml) của

Tam thất hoang trong 24 giờ, lượng NO trong môi trường nuôi cấy được xác định - bằng phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Griess. Kết quả gián tiếp qua NO2 thu được ở hình 3.3.

 Tác dụng của tam thất hoang trên sự tổng hợp NO:

Hình 3.3. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng hợp NO (Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5).

Trong đó: (*): p<0,05 so với nhóm chứng; (**): p<0,01 so với nhóm chứng)

Nhận xét: Kết quả phân tích hình 3.3 cho thấy có 2 phân đoạn là phân đoạn tổng

(PST) và cao giàu saponin (PS27) làm tăng sản phẩm NO có ý nghĩa so với nhóm chứng. Trong đó phân đoạn tổng tăng 1,83 ± 0,24 lần (p < 0,05) và cao giàu saponin tăng 2,11 ± 0,36 lần (p < 0,01) so với nhóm chứng.

Các phân đoạn n-hexan (PSnH), phân đoạn diclomethan (PS_DCM) và phân đoạn n-butanol (PSBt) làm tăng sản phẩm NO ở tế bào HUVEC nhưng sự khác biệt

không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p > 0,05).

26

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

 Tác dụng trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa

Việc tăng sản xuất NO có liên quan gì tới việc hoạt hóa eNOS bằng cơ chế phosphoryl hóa hay không. Kết quả thí nghiệm phân tích hàm lượng protein eNOS

được phosphoryl hóa được trình bày ở hình 3.4.

(A)

(B)

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện protein eNOS phosphoryl hóa (p-eNOS: Protein eNOS phosphoryl hóa)

Nhận xét: Các băng của protein β-actin giữa các nhóm khá đồng đều và rõ nét (hình 3.4.A). Phân tích định tính kết quả Western blot cho thấy tất cả các phân đoạn TTH

đều làm tăng biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa so với nhóm chứng, trong đó phân đoạn tổng (PST) và cao giàu saponin (PS27) làm tăng sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa rõ nhất, thể hiện ở những băng đậm, rõ nét hơn so với

băng của nhóm chứng (hình 3.4.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần mềm Image J (hình 3.4.B) cũng cho kết quả phân đoạn tổng (PST) và cao giàu saponin TTH (PS27) làm tăng tỷ lệ protein eNOS phosphoryl hóa/ β-actin lần lượt

27

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

6,73 và 9,61 lần so với nhóm chứng. Như vậy kết quả Western blot tương đồng với

kết quả định lượng sản phẩm NO.

3.1.3. Tác dụng trên gen COX-2 và protein COX-2

Bên cạnh các tác dụng trên co giãn mạch, các hoạt tính về chống viêm của

các dịch chiết cũng được thử nghiệm trên tế bào đại thực bào. COX-2 được biết là

một trong các protein liên quan tới đáp ứng viêm của tế bào. Biểu hiện mARN phản ánh gián tiếp sự biểu hiện của protein COX-2. Tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm bằng LPS (Lipopolysaccharid) 1 µg/ml rồi ủ cùng với các dịch chiết các phân đoạn của TTH (nồng độ 30 µg/ml) trong 24 giờ. Kết quả phân tích

mARN và protein COX-2 được trình bày lần lượt ở hình 3.5 và hình 3.6.

 Tác dụng trên sự biểu hiện gen COX-2:

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện

mARN COX-2 (Số liệu được trình bày dưới dạng: Trung bình ± sai số chuẩn (n=5);

(*): p < 0,05 so với nhóm chứng; LPS: Lipopolysaccharide)

Nhận xét: Kết quả phân tích RT-PCR cho mARN COX-2 hình 3.5 cho thấy, tế bào RAW 246.7 sau khi được kích thích gây viêm bằng LPS biểu hiện của mARN COX-2 tăng lên so với nhóm chứng không bị kích thích (p < 0,05). Tất cả các phân

đoạn của TTH (30 µg/ml) đều không làm giảm sự biểu hiện của gen COX-2 so với

nhóm LPS (p > 0,05).

28

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

 Tác dụng trên sự biểu hiện protein COX-2:

(A)

(B)

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu hiện

protein COX-2

Nhận xét: Phân tích Western blot cho protein COX-2 cũng cho kết quả tương đồng

với phân tích biểu hiện mARN COX-2: nhóm tế bào được ủ với LPS làm tăng biểu hiện của protein COX-2 so với nhóm chứng (băng đậm, rõ nét hơn so với nhóm đối

chứng). Các tế bào đã được kích thích gây viêm bằng LPS được ủ với dịch chiết

dược liệu, các phân đoạn TTH không làm thay đổi nhiều sự biểu hiện của protein COX-2 so với nhóm LPS (kích thước và độ đậm của các băng không thay đổi nhiều,

hình 3.6.A). Định lượng lại kết quả Western blot bằng phần mềm Image J hình 3.6.B cũng cho kết quả tương tự. Phân đoạn n-hexan, phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol có làm giảm biểu hiện của protein COX-2 nhưng mức độ giảm rất ít so với nhóm LPS. Tuy nhiên, trong phân tích này các băng protein β-actin giữa các

nhóm không đồng đều, các băng không rõ nét; điều này có thể gây ảnh hưởng đến

kết quả nghiên cứu.

29

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3.2. Thảo luận

Chi Panax L. là một chi thuốc quý với nhiều loài đã được khẳng định giá trị sử dụng như Nhân sâm (Panax ginseng), Tây dương sâm (Panax quinquefolium),

Tam thất (Panax notoginseng), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)… Nghiên

cứu về thành phần hóa học của các loài cây này đều chỉ ra saponin là thành phần

chính [76]. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi Panax L., là cây thuốc có giá trị, ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9]. Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của tam thất hoang có chứa saponin khung oleanan với hàm lượng cao cùng

một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp [6]. Tuy nhiên, đến nay các

nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Mặt khác, saponin trong các loài thuộc chi

Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng sự tổng hợp NO

[39,73] và chống viêm [32,45,58]. Chính vì vậy, chúng tôi chọn đối tượng nghiên

cứu là Tam thất hoang và tiến hành đề tài này với mong muốn làm rõ tác dụng của

tam thất hoang trên cơ trơn cô lập và biểu hiện của eNOS, COX-2 từ đó nâng cao

giá trị sử dụng cho loài cây này.

3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập

Theo kết quả ở bảng 3.1, phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của TTH

gây giãn trên các cơ trơn khác nhau đặc biệt rõ nhất là cơ trơn khí quản và cơ trơn

bàng quang theo phương thức phụ thuộc liều. Tác dụng giãn cơ trơn này bắt đầu

xuất hiện từ liều 1 mg/ml và giãn mạnh từ nồng độ 2 mg/ml. Các phân đoạn n-

hexan (PSnH) và diclomethan (PS_DCM) hầu như không thể hiện tác dụng trên các

hệ cơ trơn này ở tất cả các nồng độ.

Nghiên cứu của tác giả Lê Thị Tâm (2016) cho kết quả cả phân đoạn tổng và

phân đoạn n-butanol của TTH đều cho tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [7]. Mặc dù nghiên cứu của chúng tôi đánh giá trên một tác dụng khác nhưng đều cho thấy phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol TTH là 2 phân đoạn có hoạt tính sinh học

cao, có thể chứa các thành phần hóa học có tiềm năng. Gợi ý những nghiên cứu sâu hơn trên 2 phân đoạn này.

Liên quan đến tác dụng trên cơ trơn, chúng tôi nghiên cứu ở 3 mức liều là 0,5 mg/ml, 1 mg/ml và 2 mg/ml. Đây là những mức liều đã được nghiên cứu về tác dụng chống đông và chống kết tập tiểu cầu in vitro trước đó [7,11]. Theo nghiên

cứu của Choi Y. D (1998) dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc P.ginseng bắt đầu gây

30

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

giãn cơ trơn thể hang thỏ khi kích thích gây co bằng phenylephrin (5 x 10-6 M) tại liều 1 mg/ml và gây giãn cực đại tại liều 40 mg/ml, tác dụng phụ thuộc nồng độ [20]. Tương tự, theo Kim Sun Ouck (2008), dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc

P.ginseng (chiết bằng dung môi ethanol 50 %) bắt đầu gây giãn cơ trơn âm đạo thỏ

từ liều 1 mg/ml và gây giãn trên 85 % tại liều 20 mg/ ml (p < 0,05) [42]. Nghiên

cứu của Wen Fei Chiou (2000) cũng cho thấy ginsenosid tổng của P. ginseng (dịch chiết n-butanol) gây giãn thể hang thỏ được kích thích gây co bằng phenylephrin (3 x 10-6 M) theo phương thức phụ thuộc liều từ 1 – 20 mg/ml với EC50 là 3,65 ± 0,27 mg/ml [18]. Nghiên cứu của chúng tôi tuy tiến hành trên đối tượng cơ trơn khác,

yếu tố kích thích gây co cũng như dược liệu khác nhưng cho kết quả khá tương

đồng với các nghiên cứu trên. Tuy nhiên, chúng tôi mới chỉ dừng lại ở bước đầu

đánh giá định tính sơ bộ tác dụng của các phân đoạn TTH với khoảng liều hẹp.

Nghiên cứu của Jang H. A và cộng sự (2012) cho kết quả saponin của

P.ginseng gây giãn cơ trơn bàng quang và niệu đạo đoạn tiền liệt trên cả in vitro và

in vivo [12]. Theo một nghiên cứu khác của Tamaoki J. và cộng sự (2000)

ginsenosid của P.ginseng gây giãn cơ trơn phế quản người theo phương thức phụ

thuộc liều [39]. Tác dụng gây giãn cơ trơn của saponin cũng đã được chứng minh

qua nhiều nghiên cứu khác [18,73]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, n-butanol là

dung môi hòa tan tương đối chọn lọc các saponin, phân đoạn n-butanol thể hiện tác

dụng gây giãn cơ trơn tốt hơn phân đoạn n-hexan và diclomethan. Như vậy, saponin

có thể là thành phần cho tác dụng gây giãn cơ trơn của TTH.

Những kết quả nghiên cứu trên cho chúng tôi những đánh giá sàng lọc ban

đầu về tác dụng TTH trên cơ trơn. Tác dụng giãn cơ trơn của TTH có thể liên quan

đến sự giải phóng NO. Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng saponin của một

số loài thuộc chi Panax L. có tác dụng gây giãn cơ trơn thông qua cơ chế tăng giải phóng NO [39,73]. Do vậy, chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của các phân

đoạn dịch chiết TTH trên sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa và tổng hợp NO, đồng thời để đánh giá vai trò của saponin, ngoài các phân đoạn trên thì chúng tôi

tiến hành thêm với cao giàu saponin của TTH.

3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa

Theo kết quả ở hình 3.3 và 3.4, phân đoạn tổng và cao giàu saponin của TTH có tác dụng tăng sản phẩm NO và tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa so với

nhóm chứng trên tế bào HUVEC ở nồng độ 30 µg/ml. Trong đó, cao giàu saponin TTH thể hiện tác dụng mạnh hơn phân đoạn tổng TTH.

31

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nghiên cứu sự biểu hiện của protein eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp

NO cho kết quả khá tương đồng với nhau. Điều này cho thấy được vai trò quan trọng của eNOS phosphoryl hóa trong điều hòa hoạt động của eNOS và tổng hợp NO.

Theo Kim Young Mi và cộng sự (2007) dịch chiết nước của Hồng sâm Hàn

Quốc (P. ginseng) ở nồng độ 500 µg/ml có tác dụng tăng sản xuất NO so với nhóm

chứng trên tế bào HUVEC (p < 0,01) sau 4 giờ ủ và tăng eNOS phosphoryl hóa phụ thuộc thời gian [53]. Theo nghiên cứu của Ahn Hee Yoon (2013), tại nồng độ 150 µg/ml dịch chiết thô EtOH 70% và dịch chiết giàu gingsenosid của P.ginseng có tác dụng làm tăng NO và dịch chiết giàu gingsenoside loại protopanaxatriol còn làm

tăng biểu hiện eNOS phosphoryl hóa trên TB HUVEC có ý nghĩa so với nhóm

chứng (p<0,05) sau 10 phút ủ. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nồng độ thấp hơn

30 µg/ml, tuy nhiên hai nghiên cứu sử dụng dung môi chiết khác nhau, phương

pháp đo NO và thời gian ủ với dược liệu cũng khác nhau nên dẫn đến sự khác nhau

của kết quả.

Cao giàu saponin thể hiện tác dụng mạnh hơn phân đoạn tổng và các phân

đoạn khác. Theo Tamaoki J. và cộng sự (2000) ginsenosid tác dụng tăng giải phóng

NO từ mô phế quản phụ thuộc nồng độ [39]. Nghiên cứu của Ahn Hee Yoon và

cộng sự (2013) cũng cho thấy dịch chiết giàu ginsenosid loại protopanaxatriol của

P.ginseng tác dụng tốt hơn dịch chiết thô trên sự tổng hợp NO [74]. Như vậy có thể

thấy được saponin là thành phần quan trọng cho tác dụng trên eNOS và NO của TTH.

Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi phân đoạn n-butanol không làm

tăng sản phẩm NO có ý nghĩa so với nhóm chứng (p > 0,05), nhưng so với 2 phân

đoạn còn lại là phân đoạn n-hexan và phân đoạn diclomethan thì phân đoạn n-

butanol lại cho tác dụng mạnh hơn. Theo Trần Công Luận (2009), trong phân đoạn

chiết bằng ethanol 70 % của TTH có chứa các nhóm hợp chất: saponin, polyacetylen, triterpenoid, tinh dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic và các acid amin; trong đó hàm lượng saponin tổng là 6,14 % [6]. Điều này đặt ra cho

chúng tôi 2 giả thiết: 1) Đóng góp cho tác dụng của TTH trên sản xuất NO và biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa có thể có sự tham gia của các thành phần khác ngoài saponin; 2) Có thể hàm lượng saponin trong phân đoạn n-butanol thấp hơn cao giàu saponin nên chưa đủ để gây tác dụng ở liều thử. Đây là vấn đề mà chúng tôi chưa giải thích được trong nghiên cứu này do vậy cần có thêm các nghiên cứu khác để làm sáng tỏ.

32

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

NO và eNOS đóng vai trò quan trọng trong sự giãn cơ trơn thành mạch. Kết

hợp với kết quả nghiên cứu trên cơ trơn có thể thấy cơ chế gây giãn cơ trơn của TTH có liên quan đến sự giải phóng NO và hoạt hóa eNOS. Nghiên cứu của

Tamaoki J và cộng sự (2000) cũng đã chứng minh rằng tác dụng gây giãn cơ trơn

phế quản của ginsenosid từ P. ginseng thông qua cơ chế tăng giải phóng NO [39].

Theo Kim Sun Ouck và cộng sự (2008), tác dụng giãn cơ trơn âm đạo thỏ của dịch chiết Hồng sâm Hàn Quốc có thể thông qua nhiều cơ chế trong đó bao gồm qua trung gian NO [42]. Những nghiên cứu này củng cố thêm giả thiết mà chúng tôi đặt ra.

Trong nghiên cứu của chúng tôi TTH thể hiện tác dụng giãn cơ trơn, tăng

giải phóng NO và biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa. Các nghiên cứu trước cho

thấy TTH có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu, kéo dài thời gian đông máu in vitro

gợi ý tiềm năng của TTH trong điều trị các bệnh tim mạch [7,11].

3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2

Theo kết quả ở hình 3.5 và 3.6, tất cả phân đoạn TTH đều không ức chế sự

biểu hiện của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm

bằng LPS ở liều 30 µg/ml.

Chống viêm là tác dụng được nghiên cứu khá phổ biến của các loài thuộc chi

Panax L. Theo Bak Min Ji và cộng sự (2012), dầu P.ginseng được chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn ở mức liều 10 - 100 µg/ml làm ức chế biểu hiện của mARN và protein COX-2 trên tế bào RAW 246.7 được kích thích gây viêm bằng

LPS (p < 0,05) [57]. Theo Seo Jin Joung và cộng sự (2005), dịch chiết lên men giàu

ginsenosid Rg3 và Rh2 của P.ginseng ức chế biểu hiện protein COX-2 trên tế bào

RAW 246.7 ở mức liều 2 µg/ml; 10 µg/ml (p < 0,05) và 50 µg/ml (p < 0,001) [40].

Trên TTH, nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự (2013), cho thấy 3 chất

araloside a methyl ester, 3-O-b-D-xylopyranosyl (12)-b-D-glucopyranosyl-28-O- b-D-glucopyranosyl oleanolic acid và chikusetsusaponin IVa được phân lập từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam sử dụng dung môi chiết methanol (MeOH) ức chế sự biểu

hiện của COX-2 trên tế bào HepG2 (tế bào ung thư gan) khi kích thích bằng TNF-α 10 ng/ml (Tumor necrosis factor alpha – yếu tố hoại tử mô alpha) và tác dụng phụ thuộc nồng độ; ở nồng độ 10 µM là giảm sử biểu hiện mARN COX-2 lần lượt 30, 17 và 2 lần so với nhóm chứng [45]. Nghiên cứu của chúng tôi cho kết quả âm tính trên sự ức chế biểu hiện của COX-2 ở tất cả các phân đoạn ở liều 30 µg/ml. Sự khác

nhau về kết quả này có thể do Chun Liang và cộng sự nghiên cứu trên chất tinh

33

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

khiết còn nghiên cứu của chúng tôi dùng phân đoạn thô. Hơn nữa, hai nghiên cứu

sử dụng 2 dòng tế bào khác nhau (tế bào đại thực bào RAW 246.7 và tế bào ung thư gan HepG2) cũng như yếu tố kích thích gây viêm khác nhau (LPS và TNF) nên dẫn

đến kết quả khác nhau.

Hạn chế của nghiên cứu

Nghiên cứu của chúng tôi còn một số hạn chế như sau:

 Nghiên cứu tác dụng gây giãn cơ trơn của các phân đoạn Tam thất hoang còn mang tính chất định tính với khoảng liều hẹp và số lần lặp lại ít. Chúng tôi mới chỉ đánh giá được trên cơ trơn cô lập của bàng quang, khí quản và thể

hang mà chưa đánh giá được trên cơ trơn thành mạch là một trong những vị

trí có liên quan đến NO nội mạc và eNOS.

 Thành phần hóa học trong các phân đoạn dịch chiết chưa được nghiên cứu

đầy đủ gây khó khăn trong việc biện luận kết quả nghiên cứu.

34

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã rút ra một số kết luận sau:

1. Phân đoạn tổng và phân đoạn n-butanol của Tam thất hoang gây giãn cơ trơn khí quản, cơ trơn bàng quang và cơ trơn thể hang của chuột khi kích thích gây co bằng acetylcholin theo phương thức phụ thuộc liều, tác dụng bắt đầu xuất hiện từ liều 1 mg/ml, giãn rõ ở liều 2 mg/ml.

2. Phân đoạn tổng và cao giàu saponin của Tam thất hoang làm tăng sản phẩm NO và tăng sự biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa trên tế bào HUVEC ở

mức liều 30 µg/ml.

3. Ở liều 30 µg/ml, các phân đoạn của Tam thất hoang không ức chế biểu hiện của COX-2 trên tế bào đại thực bào Raw 246.7 được kích thích gây viêm

bằng lipopolysaccharid 1 µg/ml.

Đề xuất

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau:

1. Nghiên cứu tác dụng của phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol và cao giàu saponin Tam thất hoang trên cơ trơn thành mạch để xây dựng khoảng liều

phụ thuộc và đánh giá cơ chế gây giãn cơ trơn.

2. Nghiên cứu xác định thành phần các chất có mặt trong các phân đoạn như phân đoạn n-butanol, phân đoạn tổng và cao giàu saponin để có thể đánh giá

kết quả rõ ràng hơn.

35

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Trịnh Bình (2013), Mô - Phôi, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 101-111.

[2] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội, 700.

[3]

Phạm Thị Minh Đức (2011), Sinh lý học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 173, 335-336.

[4] Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh và Miễn dịch - Phần

Sinh lý bệnh học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 113-125.

[5] Trần Công Luận (2002), "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng

dược lý của 2 loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất

hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 8(2), 93 - 94.

[6] Trần Công Luận và cộng sự (2009), "Nghiên cứu thành phần hóa học của 2

loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus. Tsai et Feng)", Tạp chí Dược liệu, 1(14), 17-23.

[7] Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các

phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất

hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khóa

luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội.

[8] Nguyễn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí

Dược liệu, 10(3), 71-76.

[9] Nguyễn Văn Tập và cộng sự (2006), "Kết quả nghiên cứu về phân bố, sinh

thái sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 11(5),

177-180.

[10] Mai Tất Tố (2012), Dược lý học, Nhà xuất bản Y học, 264-274.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[11] Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2017), Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên in vitro, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Khoa Y Dược ĐHQG Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[12]

Jang H. A, Cho S. et al. (2012), "The relaxant effect of ginseng saponin on the bladder and prostatic urethra: an in vitro and in vivo study", Urol Int,

88(4), 463-469.

[13] Wendy K. A., Chris E. C. et al. (2001), "Nitric oxide synthases: structure,

function and inhibition", Biochemical journal, 357(Pt 3), 593–615.

guanosine monophosphate inhibit mitogenesis

[14] Garg U. C., Hassid A. (1989), "Nitric oxide-generating vasodilators and 8- bromo-cyclic and proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells", J Clin Invest,

83(5), 1774–1777.

[15] Liang C., Ding Y. et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax

stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorganic & medicinal

chemistry letters, 20(23), 7110-7115.

[16] Wann-Hansson C., Hallberg I. R. et al. (2005), "Healthrelated quality of life

after revascularization for peripheral arterial occlusive disease: long-term

follow-up", J Adv Nurs, 51(3), 227-235.

[17] Redmond E. M., Cahill P. A (2016), "Vascular endothelium - Gatekeeper of

vessel health", Atherosclerosis, 248, 97-109.

[18] Wen Fei Chiou, Woan Ching Jan et al. (2000), "Non major ginsenosides

contribute to the relaxation of panax ginseng in rabbit corpus cavernosum ",

J Chin Med, 11(4), 197-204.

[19] Yang Chongren, Zhidong Jiang et al. (1985), "Two new oleanolic acid-type

saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7(1), 103-

108.

[20] Choi Y. D, Xin Z. C et al. (1998), "Effect of Korean red ginseng on the rabbit corpus cavernosal smooth muscle", Int J Impot Res, 10(1), 37-43.

[21] Funk C. D (2001), "Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid

biology", Science, 294(5548), 1871-1875.

[22] Rudic R. D., Shesely E. G. et al. (1998), "Direct evidence for the importance of endothelium-derived nitric oxide in vascular remodeling", The Journal of

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Clinical Investigation, 101(4), 731-736.

[23] Salvado M. D., Alfranca A. et al. (2012), "Prostanoids in tumor

angiogenesis: therapeutic intervention beyond COX-2", Trends Mol Med, 18(4), 233-243.

[24] Dinh Q. N., Drummond G. R et al. (2014), "Roles of Inflammation, Oxidative

Stress, and Vascular Dysfunction in Hypertension", Biomed Res Int.

[25]

John Alexander Donald (2015), "Nitric Oxide", Handbook of Hormones, Elsevier, 603-e103A-604.

[26] Dierk H. E., Ernesto L. S. et al. (2004), "Endothelial Dysfunction", J Am Soc

Nephrol, 15(8), 1983-1992.

[27] Galley H. F., Webster N. R. (2004), "Physiology of the endothelium", British

journal of anaesthesia, 93(1), 105-113.

[28] Linton M. F., Fazio S. (2004), "Cyclooxygenase-2 and inflammation in

atherosclerosis", Curr Opin Pharmacol, 4(2), 116-123.

[29] Mount P. F., Kemp B. E. et al. (2007), "Regulation of endothelial and

myocardial NO synthesis by multi-site eNOS phosphorylation", Journal of

Molecular and Cellular Cardiology, 42(2), 271-279.

[30] Michel Félétou (2011), "Multiple Functions of the Endothelial Cells", The

Endothelium - Part 1: Multiple Functions of the Endothelial Cells—Focus on

Endothelium-Derived Vasoactive Mediators, Morgan & Claypool Life Sciences.

[31] García-Cardeña G., Fan R. et al. (1998), "Dynamic activation of endothelial

nitric oxide synthase by Hsp90", Nature, 392(6678), 821-824.

[32] Li S. H, Chu Y (1999), "Anti-inflammatory effects of total saponins of Panax

notoginseng", Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20(6), 551-554.

[33] Aaron N. Hata., Richard M. Breyer (2004), "Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation and immune modulation", Pharmacology & Therapeutics, 103, 147-166.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[34] Fleming I., Busse R. (2003), "Molecular mechanisms involved in the regulation of the endothelial nitric oxide synthase", American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, 284(1), R1-12.

[35] Gomez I., Foudi N. et al. (2013), "The role of prostaglandin E2 in human

vascular inflammation", Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 89(2-3), 55-63.

[36] Clària J (2003), "Cyclooxygenase-2 Biology", Current Pharmaceutical

Design, 9(27), 2177-2190.

[37] Davignon J, Ganz P. (2004), "Role of Endothelial Dysfunction in

Atherosclerosis", Circulation, 109(23 Suppl 1), III27-32.

[38] Herrmann J., Lerman A. (2001), "The endothelium: dysfunction and

beyond", J Nucl Cardiol, 8(2), 197-206.

[39] Tamaoki J., Nakata J. et al. (2000), "Ginsenoside-induced relaxation of

human bronchial smooth muscle via release of nitric oxide", British Journal

of Pharmacology, 130(8), 1859-1864.

[40] Seo Jin Young, Lee Jun Ho et al. (2005), "Effect of a fermented ginseng

extract, BST204, on the expression of cyclooxygenase-2 in murine

macrophages", International immunopharmacology, 5(5), 929-936.

[41] Kolluru G. K., Siamwala J. H. et al. (2010), "eNOS phosphorylation in

health and disease", Biochimie, 92(9), 1186-1198.

[42] Sun‐Ouck Kim, Kim Min Kyung et al. (2008), "The effect of Korean red ginseng extract on the relaxation response in isolated rabbit vaginal tissue

and its mechanism", The journal of sexual medicine, 5(9), 2079-2084.

[43] Zou Kun Zhu Shu Katsuko Komatsu (2002), "Analysis of Saponins of Panax

Stipuleanatus by Using HPLC andAPIMS/MS Techniques [J]", Journal of

University of Hydraulic and Electric Engineering/yichang, 4.

[44] Chen L., Yang G. et al. (2013), "Prostanoids and inflammatory pain",

Prostaglandins and Other Lipid Mediators, 104, 58-66.

[45] Chun L., D. Yan et al. (2013), "Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NF-κB", Journal of ginseng research, 37(1), 74.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[46] Chun L., Yan Ding et al. (2011), "Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and Their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells", Korean Chemical Society, 32(9), 3513-3516.

[47] Huang P. L., Huang Z. et al. (1995), "Hypertension in mice lacking the gene

for endothelial nitric oxide synthase", Nature, 377(6546), 239-242.

[48] Kargman S. L., et al (1995), "Expression of prostaglandin G/H synthase-1

and -2 protein in human colon cancer", Cancer Res, 55, 2556-2559.

[49] Wang J. L., Cheng H. F. et al. (2000), "A selective cyclooxygenase-2

inhibitor decreases proteinuria and retards progressive renal injury in rats", Kidney Int, 57(6), 2334-2342.

[50] Fischer S. M., Hawk E. T. et al. (2011), "Coxibs and other nonsteroidal antiinflammatory drugs in animal models of cancer chemoprevention",

Cancer Prev Res (Phila), 4(11), 1728-1735.

[51] Hogan M., Cerami A. et al. (1992), "Advanced glycosylation endproducts

block the antiproliferative effect of nitric oxide. Role in the vascular and

renal complications of diabetes mellitus", J Clin Invest, 199, 1110–1115.

[52] Khazaei M., Moien-Afshari F. et al. (2008), "Vascular endothelial function

in health and diseases", Pathophysiology, 15(1), 49-67.

[53] Kim Y. M., Namkoong S. et al. (2007), "Water Extract of Korean Red

Ginseng Stimulates Angiogenesis by Activating the PI3K/Akt-Dependent

ERK1/2 and eNOS Pathways in Human Umbilical Vein Endothelial Cells",

Biol. Pharm. Bull, 30(9), 1674-1679.

[54] Raval M., Frank P. G. et al. (2010), "Celecoxib combined with atorvastatin

prevents progression of atherosclerosis", J Surg Res, 163(2), e113-122.

[55] Scherrer-Crosbie M., Ullrich R. et al. (2001), "Endothelial nitric oxide

synthase limits left ventricular remodeling after myocardial infarction in

mice", Circulation, 104(11), 1286-1291.

[56] Zeiher A. M., Fisslthaler B. et al. (1995), "Nitric oxide modulates the expression of monocyte chemoattractant protein 1 in cultured human

endothelial cells", Circulation Research, 76(6), 980-986.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[57] Bak Min Ji, Hong Soon Gi et al. (2012), "Red ginseng marc oil inhibits iNOS and COX-2 via NFκB and p38 pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages", Molecules, 17(12), 13769-13786.

[58] Li Y. N., Wu Y. L. et al. (2008), "Interaction between COX-2 and iNOS

aggravates vascular lesion and antagonistic effect of ginsenoside", J Ethnopharmacol, 119(2), 305-311.

[59] Feron O., Belhassen L. et al. (1996), "Endothelial nitric oxide synthase

targeting to caveolae. Specific interactions with caveolin isoforms in cardiac

myocytes and endothelial cells", Journal of Biological Chemistry, 271 22810–22814.

[60]

Jack R., Lancaster Jr. (2015), "Nitric oxide: a brief overview of chemical and physical properties relevant to therapeutic applications", Future

science OA, 1(1).

[61] Emanuela Ricciotti, A. FitzGerald Garret (2011), "Prostaglandins and

Inflammation", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31(5), 986–1000.

[62] A. Rios, Vargas-Robles H. et al. (2012), "Cyclooxygenase-2 and kidney

failure", Prostaglandins Other Lipid Mediat, 98(3-4), 86-90.

[63] Bakhle Y. S., Botting R. M. (1996), "Cyclooxygenase-2 and its regulation in

inflammation", Mediators of Inflammation, 5(5), 305–323.

[64] Dimmeler S., Zeiher A. M. (1996), "Nitric oxide an endothelial cell survival

factor", Cell Death Differ, 6(10), 964–968.

[65] Irie S., Tavassoli M. (1991), "Transendothelial transport of macromolecules:

The concept of tissue blood barriers", Cell Biol Rev, 25(4), 317–321.

[66] Nadaud S., Bonnardeaux A. et al. (1994), "Gene structure, polymorphism

and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase gene",

Biochemical and Biophysical research communications, 198(3), 1027-1033.

[67] Curtis M. Steyers, Francis J. Miller (2014), "Endothelial Dysfunction in

Chronic Inflammatory Diseases", Int J Mol Sci, 15(7), 11324–11349.

[68] Alheid U., Frölich J. C. et al. (1987), "Endothelium-derived relaxing factor from cultured human endothelial cells inhibits aggregation of human platelets", Thrombosis Research, 47(5), 561-571.

[69] Förstermann U., Sessa William C. (2012), "Nitric oxide synthases: regulation

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

and function", European Heart Journal, 33(7), 829–837.

[70] Kenneth K. W. (2002), "Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase

Activity and Gene Expression", New York Academy of Sciences, 962(1), 122-130.

[71] Kutchera W. et al (1996), "Prostaglandin H synthase 2 is expressed

abnormally in human colon cancer: evidence for a transcriptional effect",

Proc Natl Acad Sci USA 93(10), 4816-4280.

[72] Radomski M. W., Palmer R. M. et al. (1987), "The anti-aggregating properties of vascular endothelium: interactions between prostacyclin and nitric oxide", Br J Pharmacol, 92(3), 639-646.

[73] Chen X., Lee T. J. (1995), "Ginsenosides-induced nitric oxide-mediated

relaxation of the rabbit corpus cavernosum", Br J Pharmacol, 115(1), 15-18.

[74] Ahn H. Y, Hong S. Y et al. (2013), "Panax ginseng extract rich in

ginsenoside protopanaxatriol offers combinatorial effects in nitric oxide

production via multiple signaling pathways", Springerplus, 2(1), 96.

[75] Kang R. Y., Freire-Moar J. et al. (1996), "Expression of cyclooxygenase-

2 in human and an animal model of rheumatoid arthritis", Br J

Rheumatology, 35, 711-718.

[76] Yang W. Z., Hu Y. et al. (2014), "Saponins in the genus Panax L.

(Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity",

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Phytochemistry, 106, 7-24.