Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)

`

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

------------------

ĐẶNG ANH THƯ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA LOÀI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM (Distichochlamys orlowii)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

------------------

ĐẶNG ANH THƯ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO

CỦA LOÀI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM (Distichochlamys orlowii)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2017.Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ HỒNG LUYẾN

ThS. NGUYỄN XUÂN TÙNG

HÀ NỘI – 2022

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Khoa học cơ sở Dược và toàn thể các thầy cô đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua.

Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến – Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng – Trường Đại học Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận.

Em xin trân trọng cảm ơn Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường.

Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm hoàn thành khóa luận này.

Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô giúp em hoàn thiện khóa luận hơn nữa.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

Đặng Anh Thư

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Ý nghĩa

1 ABTS• + 2,20 -azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid)

2 ADN Acid deoxyribonucleic

3 ARN Acid ribonucleic

5 BHA Butylated hydroxyanisole

4 BHT Butylated hydroxytoluene

Dichloromethan 6 DCM/ CH2Cl2

7 DC Cao chiết dichloromethan

8 ET Cao chiết ethanol

9 EA Cao chiết ethyl acetat

10 ME Cao chiết methanol

11 DPPH 2,3-diphenyl-1-picrylhydrazyl

12 EtOAc Ethyl acetate

13 EtOH Ethanol

14 GC-MC Sắc ký khí- khối phổ

15 IC50 Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory Concentration)

16 MeOH Methanol

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh .................................................... 10

Bảng 1.2. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp

......................................................................................................................... 13

Bảng 3.1. Khối lượng cao chiết thu được (mg) và hiệu suất chiết (%) .......... 24

Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần trong cao chiết của

cây D. Orlowii (%) .......................................................................................... 26

Bảng 3.3. Hoạt tính trung hòa DPPH (IC50, µg/mL) của cao chiết ................ 29

Bảng 3.4. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ (IC50) của các cao chiết...... 31

Bảng 3.5. Các thành phần tinh dầu trong dịch chiết n-hexan từ rễ và củ của

D.orlowii ......................................................................................................... 33

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hình ảnh loài Gừng đen lá tím (D. orlowii ....................................... 5

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A ...................................................... 11

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E ....................................................... 12

Hình 3.1. Đường chuẩn của acid gallic ........................................................... 25

Hình 3.2. Đường chuẩn của quercetin............................................................. 25

Hình 3.3 . Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng polyphenol và

flavonoid toàn phần của rễ củ của cây D. Orlowii tương ứng với các dung môi:

Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). .............. 27

Hình 3.4. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH

của rễ và củ cây D. orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A),

Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). ................................................... 30

Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trung hòa ABTS+

tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat

(C), Ethanol (D)............................................................................................... 32

Hình 3.6. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ củ của D. orlowii . 35

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN............................................................................ 3

1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys ............... 3

1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................. 3

1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii ............................................... 4

1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái ............................................................ 4

1.2.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................. 4

1.2.3. Thành phần hóa học .......................................................................... 5

1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý ........................................................ 6

1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa .......................................................... 6

1.3.1. Gốc tự do ........................................................................................... 6

1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ................. 14

1.4.1. Xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH ................................... 14

1.4.2. Thử nghiệm ABTS (TEAC) ........................................................... 14

CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 16

2.1. Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu ............................................. 16

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 16

2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất ..................................................................... 16

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 16

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 16

2.3.1. Phương pháp chiết .......................................................................... 16

2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các dịch chiết từ củ và rễ của cây .... 18

2.3.3. Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS .................................. 23

2.3.4. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 18

2.3.4. Xử lý số liệu .................................................................................... 23

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ ............................................................................... 24

3.1. Kết quả chiết xuất và định lượng một số các hợp chất tự nhiên trong rễ và củ của cây D.orlowii ...................................................................................... 24

3.1.1. Kết quả chiết xuất ........................................................................... 24

3.1.2. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 24

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết rễ và củ cây D. orlowii ................................................................................................................... 28

3.2.1. Theo mô hình trung hòa gốc tự do DPPH ...................................... 28 3.2.1. Theo mô hình trung hòa gốc tự do ABTS+ ..................................... 30

3.3. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ dịch chiết rễ và củ cây D. orlowii ............................................................................................................................... 33

CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN ............................................................................ 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Trong xã hội tiến bộ và phát triển như ngày nay thì cuộc sống của con người đã được nâng cao. Do đó, các vấn đề về bảo vệ sức khỏe và sắc đẹp ngày càng được quan tâm, đặc biệt là những nghiên cứu, thảo luận liên quan đến sự lão hóa. Nguyên nhân chính gây ra quá trình lão hóa là do các gốc tự do phân hủy tế bào cơ thể gây ra các bệnh liên quan đến tim mạch, gan, thần kinh, nội tiết, thận,... gây tổn hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người [35]. Gốc tự do làm tổn thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các acid béo dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào [11]. Tuy nhiên, các gốc tự do này có thể bị phân hủy bởi các chất oxy hóa nội sinh trong cơ thể con người và các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên là các thực phẩm như rau củ, trái cây tươi và một số loại dược liệu [8]. Ngoài ra, có nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp đã được nghiên cứu và đang được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, các chất chống oxy hóa tổng hợp gần đây không còn được ưa chuộng vì các tác dụng có hại được quan sát như độc tính đối với con người, khả năng gây ung thư và gây ô nhiễm môi trường [6]. Do đó, trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các hợp chất kháng oxy hóa trong tự nhiên đang được đẩy mạnh và nhận được nhiều sự quan tâm.

Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) là một loài thực vật thuộc chi Gừng đen (Distichochlamys), họ Gừng (Zingiberaceae) là một loài gừng đặc hữu tại Việt Nam mới được phát hiện [1]. Họ Gừng là một họ cây phổ biến ở Việt Nam với nhiều công dụng khác nhau. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ ra các tính chất dược lý vượt trội của một số hợp chất tồn tại trong các cây họ Gừng. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và các tác dụng sinh học của loài D. orlowii. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu thêm về các thành phần hóa học và các hoạt tính của loài D. orlowii là rất cần thiết.

Chính vì vậy, với mục đích nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật, định lượng một số hợp chất và xác định khả năng chống oxy hóa từ củ và rễ của cây D.orlowii nhằm củng cố và cung cấp thêm các thông tin khoa học có giá trị và tin cậy về hoạt tính sinh học; từ đó giúp cho việc khai thác sử dụng

1

cây làm nguồn dược liệu trong thực tế có hiệu quả hơn, chúng em đã lựa chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)” với những mục tiêu sau:

1. Khảo sát hàm lượng flavonoid, polyphenol và thành phần của tinh dầu

có trong cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii.

2. Đánh giá sơ bộ hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết từ

rễ và củ của Distichochlamys orlowii.

2

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys

1.1.1. Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa [21], chi Distichochlamys có vị

trí phân loại như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheophyta)

Ngành: Thực vật có hoa/ Ngành Ngọc lan/ Hạt kín

(Magnoliophyta)

Lớp: Liliopsida

Bộ: Zingiberales

Họ: Zingiberaceae

Chi: Distichochlamys

1.1.2. Đặc điểm phân bố

Giống gừng nhỏ Distichochlamys MF Newman là một chi đặc hữu của Việt Nam thuộc họ Zingiberaceae, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1995 bởi Newman [26]. Chi Distichochlamys ở Việt Nam đã xác định được bốn loài phân bố ở một số nơi.

D. citrea MF Newman còn được gọi là Gừng đen, là loài Distichochlamys đầu tiên được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam (Newman 1995; Nguyen and Leong-Škorničková 2012). Sự xuất hiện của D. citrea cũng đã được báo cáo ở các vùng khác của Việt Nam, bao gồm Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam và Nghệ An [38].

D. orlowii K. Larsen & MF Newman phân bố ở một khu vực hạn hẹp thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam [21].

D. rubrostriata WJKress & Rehse phân bố ở một số tỉnh miền Bắc Việt

Nam và Vườn Quốc gia Cúc Phương [30].

3

D. benenica phân bố ở Vườn quốc gia Bến En, Huyện Như Thanh, Tỉnh

Thanh Hóa, Việt Nam [27].

1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii

1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái

Distichochlamys orlowii là một loài thực vật có hoa thuộc chi Distichochlamys, họ Gừng. Loài này được K. Larsen & M.F. Newman mô tả khoa học đầu tiên năm 2001, tên Việt Nam là gừng orlow hay gừng đen lá tím [1]. Nó phân bố ở một khu vực hạn hẹp thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam [21].

D. orlowii là cây chịu bóng, sống dưới tán rừng thường xanh ở độ cao trung bình khoảng 350 – 400 m so với mực nước biển. Các loài cây họ Gừng chủ yếu ưa độ ẩm cao và phát triển tốt hơn ở điều kiện chiếu sáng thấp nên chúng thường được phát hiện ở các khu vực ven suối, rừng nguyên sinh, rừng thứ sinh và các trảng cây bụi [1].

1.2.2. Đặc điểm thực vật

D. orlowii là loài thực vật có hoa, thân rễ thuộc chi Gừng đen (Distichochlamys) trong họ Gừng (Zingiberaceae). Thân rễ leo, dài 8 – 10 mm, màu đỏ; khi khô chuyển sang màu nâu [20]. Lá mọc thẳng từ thân rễ; bẹ lá dài 4 – 7 cm, mép mỏng, hơi đỏ. Lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới đỏ tím sẫm. Cuống lá dài 15 – 20 cm, khía 4 mm, màu xanh lục, có rãnh ở mặt lưng. Phiến lá rộng, hình elip, nhẵn ở cả hai mặt. Gân chính ở giữa, mỗi bên của gân chính có 12 – 18 gân nhỏ nổi rõ ở trên song song nhau. Gân lá bậc hai và bậc ba mỏng hơn, kích thước 15 – 27 x 8,5 – 13 cm [19]. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 4 hằng năm. Cụm hoa đơn tính mọc từ các bẹ lá phía dưới. Cuống hoa dài 1 cm. Lá bắc lớn áp vào chùm hoa, màu xanh lục với mép đỏ, dài 30 – 40 x 8 – 10 mm, mỗi lá bắc phụ có một lá mầm với 2 – 3 hoa màu vàng. Lá bắc có màng, hình ống, kích thước 25 – 30 x 8 – 10 mm. Noãn dài 3 – 4 mm. Đài hoa hình ống dài 10 mm, đỉnh có 3 răng cưa. Ống tràng hoa dài 30 mm, rộng 3 mm, ở đỉnh tràng hoa có thùy 10 mm [19, 30]. Bao phấn hoa màu vàng, dạng sợi dài 4 mm, không phủ lông tuyến. Các nhị bên rộng dưới 6 mm, màu vàng thuần;

4

cánh hoa màu vàng với các vân tím và các dải ở giữa màu vàng sẫm [19, 30, 38]. Quả và hạt không xác định [19].

Hình 1.1. Hình ảnh loài Gừng đen lá tím (D. orlowii)

1.2.3. Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây D. orlowii còn rất hạn chế và chưa được nghiên cứu nhiều. Năm 2017, bằng kỹ thuật sắc ký khí ngọn lửa ion hóa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS), Lê Thị Hương và cộng sự đã xác định được các thành phần hóa học của tinh dầu chưng

5

cất từ thân rễ của cây D. orlowii thu thập từ Vườn quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An, Việt Nam. Nghiên cứu này đã định lượng được một lượng đáng kể các hydrocarbon monoterpene (23,9%), monoterpen oxy hóa (29,4%), hydrocarbon sesquiterpene (33,7%), sesquiterpenes oxy hóa (11,2%) và xuất hiện một lượng diterpenes rất nhỏ (0,3%). Người ta quan sát thấy rằng geranyl axetat (16,5%), β-elemene (9,2%), β-pinene (9,0%) và β-caryophyllene (7,9%) là các thành phần chủ yếu của D. orlowii. Bên cạnh đó có các hợp chất định tính khác bao gồm α-humulene (4,9%), (Z) -citral (4,6%), bicyclogermacrene (3,6%), γ- gurjunene (3,4%), linalool (3,1%) và limonene (3,1% ),… [9]

1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý

Zingiberaceae là một họ cây chứa nhiều tinh dầu nên hầu hết các loài cũng như các bộ phận trong cùng một loài đều có sự tích lũy tinh dầu; do đó có giá trị sử dụng là cây cho tinh dầu [1].

Hiện nay, các hiểu biết về loài Distichochlamys orlowii còn rất là sơ khai. Các thành phần hóa học trong thân rễ của cây có nhiều tiềm năng về tác dụng dược lý. Geranyl acetate có tác dụng chống viêm, chống nấm mạnh mẽ [13]. Các thử nghiệm in vitro cho thấy β-elemene hoạt động như một chất ức chế Rhokinase [40] và có tác dụng chống tăng sinh đối với một số loại tế bào ung thư [43]; từ đó cho thấy tiềm năng cao sử dụng trong hóa trị liệu. β- Caryophyllene đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm liên quan đến hoạt động của thụ thể cannabinoid loại 2 [3]. Citral cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm [28]. Citral đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa, ngừa ung thư, kháng khuẩn và tẩy giun sán [16]. β-linalool được nghiên cứu là có khả năng hỗ trợ hoạt động chống oxy hóa, giảm độc tế bào… [18]

1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa

1.3.1. Gốc tự do

1.3.1.1. Khái niệm

Khái niệm về gốc tự do (Free Radical) được đề xướng lần đầu tiên vào năm 1954 trong luận thuyết về sự lão hóa (Free Radical Theory of Aging) [14]. Một gốc tự do là một nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử (electron) hóa

6

trị lẻ. Như vậy, gốc tự do là các mảnh phân tử ( •OH...), phân tử ( •NO, •NO2, CO2-•...), nguyên tử tự do ( •Cl, •Br..) hay ion ( O2 •-...) trung tính hay mang điện tích, có lớp điện tử ngoài cùng chứa một điện tử không ghép cặp (điện tử đơn độc). Chúng có thể mang điện tích dương, âm hoặc không mang điện và cả ba loại này đều giữ vai trò quan trọng trong hệ thống sinh học. Do có điện tử không ghép cặp ở lớp ngoài cùng nên gốc tự do rất không ổn định về cả năng lượng cũng như điện học. Chúng luôn có xu hướng lấy điện tử từ các nguyên tử hay phân tử khác để trở về trạng thái ổn định, nhưng lại biến các nguyên tử, phân tử này thành gốc tự do. Phản ứng dây chuyền tiếp diễn làm cấu trúc và chức năng của các thành phần tế bào bị phá hủy dẫn tới sự lão hóa, nếu nặng tế bào sẽ bị chết [11].

1.3.1.2. Nguồn sinh gốc tự do

Các gốc tự do luôn luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau, từ chính cơ thể sinh vật sinh ra hay từ các yếu tố như môi trường, khói bụi ô nhiễm, thức ăn độc hại, thuốc lá ... Vì vậy, gốc tự do được chia thành hai loại chính là gốc tự do nội sinh và ngoại sinh [15].

Gốc tự do nội sinh

Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được hình thành do những quá trình chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể. Chẳng hạn như trong chuỗi chuyển điện tử của hô hấp tế bào, một số điện tử có thể bị rò rỉ. Sau đó, chúng tương tác với oxy và hình thành nên gốc superoxide. Khoảng 2 – 5% oxy sử dụng cho trao đổi chất hiếu khí trong ty thể chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt động (reactive oxygen species – ROS). Bên cạnh đó, quá trình thực bào của các tế bào bạch cầu khi có các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể cũng sinh ra các gốc tự do thông qua việc hoạt hóa enzyme NADPH oxidases ở màng bạch cầu. Enzyme này xúc tác cho phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do superoxide O2•-, từ đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể [41].

Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể còn có thể tham gia vào các phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân giải lipid hydroperoxide tạo gốc tự do peroxide. Sau đó, gốc tự do này tham gia vào phản ứng dây chuyền

7

peroxide hóa lipid gây hại cho cơ thể. Ngoài ra, việc vận động gắng sức cũng phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim [41].

Gốc tự do ngoại sinh

Gốc tự do ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ. Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật với một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ. Vì nước chiếm tới 55 – 60% cơ thể nên khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa. Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động. Sau đó, một chuỗi phản ứng 3 bước xảy ra. Nước được chuyển thành gốc hydroxy (-OH), hydrogen peroxide (H₂O₂), gốc superoxide (O₂•-), oxygen phân tử (O2). Gốc hydroxy rất hoạt động, có thể di chuyển electron ở bất kỳ phân tử nào nằm trên đường đi của nó, chuyển phân tử này thành tự do và vì vậy hoạt hóa một chuỗi phản ứng tiếp tục. Hydrogen peroxide nguy hiểm với DNA hơn là gốc hydroxy vì khả năng hoạt động của H2 hơn - OH nên H2O2 có đủ thời gian di chuyển vào nhân, rồi sau đó tiến hành phá hủy các đại phân tử DNA [36].

1.3.1.3. Ảnh hưởng của gốc tự do đến cơ thể

Lợi ích của gốc tự do

Gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất melanine cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng, tăng cường tính miễn dịch, làm cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, sự co bóp của cơ xương dễ dàng hơn. Gốc tự do được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể. Ở nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hòa phân ly tế bào; kích hoạt các yếu tố phiên mã cho gene tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm và điều hòa biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme kháng oxy hóa [42].

8

Tác hại của gốc tự do

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng. Nhưng khi tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần so với người trẻ. Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan [35].

Gốc tự do thường xảy ra trong quá trình chuyển hóa. Đôi khi chính hệ miễn dịch của cơ thể cũng tạo ra gốc tự do để tiêu diệt virus và vi khuẩn. Tuy nhiên, gốc tự do gây lo ngại nhất là những gốc tự do được hình thành do sự ô nhiễm môi trường, phóng xạ, khói thuốc, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ,... [15]

Gốc tự do là nguyên nhân phá vỡ màng tế bào khiến dinh dưỡng thất thoát. Tế bào không tăng trưởng, phát triển rồi dẫn đến chết. Mặt khác, những gốc tự do tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da tạo những vết đồi mồi trên mặt, bàn tay. Những gốc tự do cũng ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào, gây đột gene ở nhiễm sắc thể, DNA, RNA; làm chất collagen, elastin mất sự đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc [37].

Gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme, khiến cơ thể không tăng trưởng được. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào [10].

1.3.2. Chống oxy hóa

1.3.2.1. Khái niệm về chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa (hay chất kháng oxy hóa) là chất trực tiếp hoặc gián tiếp ngăn cản, trung hòa, loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do với cơ thể. Những chất kháng oxy hoá ngoài tác dụng trung hoà các gốc tự do bằng cách

9

nhường một điện tử của mình cho chúng, qua đó có thể cắt đứt phản ứng dây chuyền, ngăn chặn tổn thương DNA do các độc chất gây ra; chúng còn có thể khống chế sự phát triển của các tế bào ung thư [7].

1.3.2.2. Phân loại chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa nội sinh

Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có 2 loại là các chất có bản chất là enzyme và các chất không phải enzyme. Chúng đều có tác dụng ngăn chặn sự hình thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa nội sinh không phải là enzyme được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu đến từ thực phẩm bổ sung [8]. Các nhóm chất như flavonoid, carotenoid... đến từ thực vật có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Các chất chống oxy hóa nội sinh có thể tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng với nhau để chống lại các gốc tự do. Nhờ vậy mà quá trình oxy hóa trong cơ thể chỉ xảy ra ở mức độ nhất định, duy trì được cân bằng trao đổi chất. Hiện nay, các nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới trong thảo dược có thể hỗ trợ điều trị các bệnh có liên quan đến sự oxy hóa trong cơ thể đang nhận được nhiều sự quan tâm.

Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh

Bản chất là enzyme Không phải enzyme

Catalase Vitamin A, vitamin C, vitamin E

Coenzyme Q10

Superoxide dismutase Glutathione peroxidase

Glutathione reductase Hợp chất chứa nitơ (non-protein): acid uric

Glucose – 6 phosphate dehydrogenase Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion

Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật

Một số thực phẩm, đặc biệt là các thực vật, rất giàu chất chống oxy hóa thuộc nhiều nhóm khác nhau. Trong đó, đáng chú ý nhất là các dẫn xuất của phenol và các vitamin.

- Vitamin A:

10

Vitamin A chỉ có trong thức ăn từ nguồn động vật, đặc biệt có nhiều trong gan cá, gan, thận các động vật có sừng, trong bơ, sữa, lòng đỏ trứng,... Còn carotene (tiền chất của vitamin A) có trong các phần xanh của cây, trong rau quả có màu vàng đỏ như carot, cà chua, ớt, quả mơ, quả gấc, bí đỏ,.... Các caroten nhờ có hệ kết nối luân phiên trên mạch cacbon dài, một phân tử caroten có thể hấp thu năng lượng của hàng ngàn phân tử O2 rồi giải phóng năng lượng dưới dạng nhiệt vô hại [39].

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A

Acid ascorbic (Vitamin C) có trong tất cả tế bào sống động vật cũng như thực vật. Vitamin C cần cho sự tạo thành collagen, tham gia trong một số phản ứng oxy hoá khử. Vitamin C tham gia trong quá trình chuyển hoá phenilalamine, tyrosine, acid folic, norepinephrine, histamine, sắt và một số hệ thống enzyme chuyển hoá thuốc [20].

Vitamin C còn có tính chất kháng oxy hóa ở môi trường nước như loại •- ), gốc hydroxy (•-OH) hydrogen peroxide, loại bỏ các gốc tự do superoxide (O2 và chặn đứng các phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc tự do. Vitamin C có khả năng vô hoạt gốc tự do vì có thể chuyển hai hydro cho các gốc tự do và chuyển thành dehydroascorbic [20, 25].

- Vitamin E:

Vitamin E là chất kháng oxy hoá hoà tan trong lipid và phân bố rộng khắp tế bào, được coi như chất bảo vệ của màng sinh học vì nó ngăn cản quá trình oxy hoá các acid béo chưa bão hoà của màng. Vitamin E có nhiều trong mầm ngũ cốc (lúa mạch), mầm đậu tương, giá đỗ, các loại dầu thực vật, xà lách, rau xanh, cà chua, gan động vật, lòng đỏ trứng [5]...

11

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E

Cơ chế kháng oxy hóa: Vitamin E bị oxy hóa, trở thành gốc tocopherol không bền vững và bị bẻ gãy dị vòng tạo nên tocopherol quinone. Đây không phải là chất kháng oxy hoá trong cơ thể sống và không biến đổi trở lại thành vitamin E [5, 22]. Vitamin E có thể liên kết với phần hydrocarbon của acid béo chưa bão hoà nhiều nối đôi và vì vậy tiếp cận gần vị trí của quá trình peroxide hoá, những phản ứng chuỗi gốc tự do.

- Flavonoid:

Flavonoid là một nhóm các hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol, flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone và flavones. Các nhóm hydroxyl phenolic của flavonoid có cấu trúc vòng, có đặc tính chống oxy hóa, hoạt động như các chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide và tạo phức chelat. Chúng cũng kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, giảm các gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử, giảm nitro hóa, tăng mức acid uric và các phân tử trọng lượng phân tử thấp. Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao là catechin, catechin-gallate, quercetin, kaempferol, genistein trong đậu nành [8, 15].

Ngoài ra còn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên

cũng có tác dụng chống oxy hóa như acid phenolic, lingin, carotenoid...

Các chất chống oxy hóa tổng hợp

Các chất chống oxy hóa tổng hợp đã được chiết xuất trong phòng thí nghiệm để sử dụng trong hệ thống đo lường tiêu chuẩn chống oxy hóa, so sánh với các chất chống oxy hóa tự nhiên và sử dụng trong ngành thực phẩm. Bảng 1.2 biểu thị các chất chống oxy hóa tổng hợp quan trọng nhất và có sẵn rộng rãi cũng như công dụng của chúng; cho thấy trọng tâm chính của chất chống oxy hóa tổng hợp là ngăn ngừa quá trình oxy hóa thực phẩm, đặc biệt là acid

12

béo. BHT (butylated hydroxytoluene) và BHA (butylated hydroxyanisole) là những chất chống oxy hóa hóa học được sử dụng rộng rãi nhất [8].

Bảng 1.2. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp

Tên hợp chất Công thức cấu tạo Ứng dụng

BHA (butylated hydroxyanisole) Chống oxy hóa thực phẩm

BHT (butylated hydroxytoluene) Chống oxy hóa thực phẩm

TBHQ (tert- butylhydroquinone) Chống oxy hóa thực phẩm chế biến từ động vật

PG (propyl gallate) Chống oxy hóa thực phẩm

OG (octyl gallate) Chống oxy hóa thực phẩm và mỹ phẩm

Kháng nấm

2,4,5-Trihydroxy butyrophenone Chống oxy hóa thực phẩm

Chống oxy hóa thực phẩm

NDGA (nordihydroguaiaretic acid)

13

4-Hexylresorcinol

Ngăn ngừa thực phẩm bị thâm đen

1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro

Ngày nay, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính chống oxy hóa, chia làm 2 loại là phương pháp in vitro và phương pháp in vivo. Một số thử nghiệm đánh giá in vitro thường được sử dụng như: Thu dọn gốc tự do DPPH, Thử nghiệm TEAC/ABTS, dọn gốc tự do hydroxyl OH•-, ... [24]

1.4.1. Xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH

DPPH (2,3-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do ổn định và xét nghiệm dựa trên phép đo khả năng thu gom của các chất chống oxy hóa. Điện tử lẻ của nguyên tử nitơ trong DPPH bị khử bởi một nguyên tử hydro để tạo thành chất chống oxy hóa là hydrazine tương ứng [32].

- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng [24, 32].

- Ưu, nhược điểm: Phổ biến nhất, nhanh, cho kết quả khá chính xác, chi phí thấp, dễ thực hiện các thí nghiệm, khả năng tái tạo, khả năng áp dụng ở nhiệt độ phòng, cũng như khả năng tự động hóa [24]. Tuy nhiên, phép thử này chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử vì DPPH không tồn tại trong cơ thể sống. Phương pháp này dùng trong sàng lọc các mẫu dược liệu [24].

1.4.2. Thử nghiệm ABTS (TEAC)

- Nguyên tắc: Thử nghiệm đo khả năng trung hòa cation gốc bền 2,20 - azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS• +) của chất chống oxy hóa, mang màu xanh lam – xanh lục, hấp thụ cực đại ở bước sóng 734 nm, có cường độ giảm ở sự hiện diện của chất chống oxy hóa. ABTS• + có thể được tạo

14

ra từ ABTS với sự hiện diện của các chất chống oxy hóa mạnh. Mức độ mất màu của màu xanh lam - xanh lục được định lượng khi độ hấp thụ giảm đột ngột tại bước sóng 734 nm. Phương pháp này phụ thuộc vào thời gian phản ứng, hoạt tính chống oxy hóa nội tại và nồng độ mẫu [24].

- Ưu, nhược điểm: Thử nghiệm TEAC/ABTS cho phép xác định nhiều chất chống oxy hóa khác nhau vì gốc ABTS• + phản ứng nhanh với cả chất chống oxy hóa tổng hợp và tự nhiên (ví dụ: phenol, acid amin, peptit, vitamin E và vitamin C). ABTS • + có khả năng hòa tan trong môi trường đệm và hữu cơ giúp thuận lợi cho các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ưa nước và ưa béo. Xét nghiệm TEAC rẻ và vận hành đơn giản. Tuy nhiên, thử nghiệm TEAC thiếu tính phù hợp về mặt sinh học do sử dụng cation gốc ABTS nhân tạo không được tìm thấy trong thực phẩm hoặc hệ thống sinh học [24].

1.4.3. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2

•

• tham gia phản ứng [24].

• được hình thành trong quá trình oxy hóa • tạo xanthin thành acid uric, được xúc tác bởi enzyme xanthinoxidase. Gốc O2 thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ cực đại tại bước sóng 560 nm. Tiến hành đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng O2

- Nguyên tắc: Gốc tự do O2

- Ưu, nhược điểm: Nhanh, dễ thực hiện, yêu cầu ít máy móc, kết quả thu

được tương đổi ổn định và chính xác [24].

1.4.4. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid OH•-

- Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 - deoxyribose của gốc •OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng, hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do •OH của mẫu thử [24].

- Ưu, nhược điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc •OH có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quá ít chính xác hơn các thử nghiệm trên [24].

15

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây Gừng đen lá tím (D. Orlowii) được thu mua vào tháng 11 năm 2021 tại Nghệ An và được xác định bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST). Sau khi được giám định, rễ và củ của cây được rửa sạch để loại bỏ hết bùn đất, cắt thành từng đoạn nhỏ rồi phơi khô trong bóng mát, nhiệt độ không quá 30oC.

2.1.2. Nguyên liệu, hoá chất

- Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: Ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM / CH2Cl2), n-Hexan, DMSO (dimethyl sulfoxide) đạt tiêu chuẩn phân tích.

- Các thuốc thử: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,20-azinobis (3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS• +), thuốc thử Folin – Ciocalteu.

- Các chất hóa học tham gia phản ứng: Kali persulfat, acid gallic, quercetin, Na2CO3, NaNO2 , nước cất (H2O), AlCl3, NaOH đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP) 42.

2.1.3. Dụng cụ và thiết bị

- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi, Đức); Máy siêu âm, máy lắc; Máy quang phổ Microplate (xMark, Bio-Rad); Máy GC-MS (Thermo scientific-ISQ 7000) ( Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

- Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, giếng 96, bình định mức, bình nón, bình chiết,

cốc có mỏ, bình gạn, bình cầu, ống đong...

- Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích...

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp chiết

2.2.1.1. Phương pháp chiết Soxhlet

16

Cho 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii sau khi được sơ chế, phơi khô ᴠào trong một đầu lọᴄ (thimble). Đầu lọᴄ nàу ѕẽ đượᴄ đặt ᴠào trong ống ᴄhiết. Lắp bình cầu đã sấy khô vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Các loại dung môi được sử dụng gồm: Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Dichloromethan. Lượng dung môi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hoặc hai lần dung tích ống chiết. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh của bộ sinh hàn.

Đun từ từ dung môi trong bình cầu bằng bếp cách thủy. Khi đun nóng bình ᴄầu, dung môi ѕẽ baу hơi lên trên ᴠề phía ống ѕinh hàn. Tại đâу, dung môi ѕẽ ᴄhuуển ѕang trạng thái lỏng ᴠà rơi хuống mẫu nằm trong đầu lọᴄ. Ống ᴄhiết ᴄhứa mẫu ѕẽ dần dần đượᴄ làm đầу bằng dung môi ᴄòn ấm, ᴄho đến khi đầу thì toàn bộ dịch chiết ѕẽ đượᴄ ᴄhuуển ᴠề lại bình ᴄhứa thông qua ống ѕiphon. Quá trình này sẽ lặp lại liên tục thành các chu kì. Để tránh tổn thất dung môi, dung môi trong bình cầu không được sôi mạnh, đảm bảo khoảng 5 - 6 chu trình trong 1 giờ. Bổ sung dung môi nếu bị hao hụt.

Sau thời gian chiết 6 tiếng, tháo bộ ᴄhiết Soхhlet ᴠà phần dung môi ᴄhứa ᴄhất ᴄhiết ѕẽ đượᴄ lọc qua giấy lọc. Các dịch lọc này được đem đi cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được các cao chiết tương ứng.

2.2.1.2. Phương pháp chiết siêu âm

Sau khi sơ chế, ngâm ngập khoảng 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii trong 200 ml các loại dung môi gồm: Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Dichloromethan. Sau đó tiến hành chiết xuất bằng. Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc; sau đó được đem đi cất phương pháp siêu âm với sự hỗ trợ của sóng siêu âm tần số 20KHz trong thời gian 2 tiếng ở 37- 40ºC loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được các cao chiết tương ứng.

2.2.1.3. Phương pháp chiết lắc

Sau giai đoạn sơ chế, lấy khoảng 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii và ngâm ngập trong 200 ml các loại dung môi gồm: Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Dichloromethan. Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp lắc ở nhiệt độ phòng với tốc độ lắc 200 vòng/ phút liên tục trong vòng 6 tiếng. Dịch

17

chiết được lọc qua giấy lọc; sau đó được đem đi cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được các cao chiết tương ứng.

2.2.2. Định lượng một số hợp chất tự nhiên trong các mẫu cao chiết từ rễ củ của cây D. orlowii

2.2.2.1. Khảo sát hàm lượng polyphenol toàn phần

Nguyên tắc: Dựa trên sự khử của tungstate/molybdate trong thuốc thử Folin - Ciocalteu bởi hợp chất phenol trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm có màu xanh dương. Đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại của sản phẩm thu được. Cường độ của màu tỉ lệ với nồng độ polyphenol bị oxi hóa, từ đó xác định được hàm lượng polyphenol có trong mẫu. Hàm lượng polyphenol trong mẫu được quy về mg acid gallic/g [24]. Phép thử Folin – Ciocalteu dựa trên việc khử thuốc thử Folin – Ciocalteu với các hợp chất phenolic ở trạng thái kiềm. Phức hợp của axit phomolybdic/ phosphotungstic được khử để thu được dung dịch màu xanh lam với độ hấp thụ cực đại ở 765 nm [24].

Chuẩn bị hóa chất cần thiết:

- Thuốc thử Folin – Ciocalteu 10% và dung dịch Na2CO3 6% được pha

loãng bằng nước cất.

- Mẫu thử: Cao dược liệu được hòa tan trong DMSO, sau đó pha loãng

bằng MeOH thành các nồng độ khác nhau dùng cho thí nghiệm.

- Mẫu chuẩn: Dùng MeOH pha loãng dung dịch polyphenol chuẩn acid

gallic thành các nồng độ khác nhau (2 – 100 μg/mL).

Cách tiến hành:

10 μL mẫu thử gồm các nồng độ khác nhau của cao chiết được trộn với

95 μL Folin – Ciocalteu trong 1 phút. Sau đó, 95 μL Na2CO3 được thêm vào hỗn hợp. Dung dịch cuối cùng được ủ trong vòng 15 phút ở nhiệt độ 400C. Độ hấp thụ của phức chất màu xanh lam thu được sau khi ủ sẽ được đo ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đường chuẩn của acid gallic với các nồng độ khác nhau được xây dựng để ước tính tổng hàm lượng polyphenol (TPC) trong các mẫu cao chiết.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

18

Hàm lượng polyphenol toàn phần chứa trong các mẫu cao chiết được xác

định bằng công thức:

𝐶𝐺𝐴𝐸 𝐶0

TPC = × 100%

Trong đó: TPC: Tổng hàm lượng phenonic trong mẫu (%)

CGAE : Nồng độ tương đương acid gallic (μg GAE/mL)

Co: Nồng độ của mẫu (μg/mL)

2.2.2.2. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần

Nguyên tắc: Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp tạo màu với AlCl3. Các flavonoid tạo phức màu cam với AlCl3 dưới sự có mặt của NaNO2 và hấp thụ tại bước sóng 510 nm. Sử dụng chất chuẩn quercetin, xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang (A) và nồng độ chất chuẩn (C). Từ đường chuẩn và giá trị mật độ quang của mẫu thử ở cùng điều kiện, xác định được nồng độ flavonoid trong dung dịch mẫu thử và tính được hàm lượng flavonoid tổng tương đương quercetin trong mẫu thử [24].

Chuẩn bị hóa chất cần thiết:

- Các dung dịch hóa chất NaNO2 5%, AlCl3 10%, NaOH 1M được pha

loãng bằng nước cất.

- Mẫu thử: Cao dược liệu được hòa tan trong DMSO, sau đó pha loãng

bằng MeOH thành các nồng độ khác nhau dùng cho thí nghiệm.

- Mẫu chuẩn: Dùng MeOH pha loãng dung dịch flavonoid chuẩn quercetin

thành các nồng độ khác nhau (10 – 1000 μg/mL).

Cách tiến hành:

Trộn 50 μL mẫu thử gồm các nồng độ khác nhau của cao chiết với 10 μL NaNO2 và ủ trong 6 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm lần lượt 10 μL AlCl3 10%, 80 μL NaOH 1M và 50 μL EtOH 30% vào hỗn hợp. Dung dịch cuối cùng được ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Độ hấp thụ sau khi ủ sẽ được đo ở bước sóng 510 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đường chuẩn của quercetin với

19

các nồng độ khác nhau được xây dựng để ước tính tổng hàm lượng flavonoid (TFC) trong dịch chiết.

Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

Hàm lượng flavonoid toàn phần chứa trong các mẫu cao chiết được xác

định bằng công thức:

𝐶𝑄 𝐶0

TFC = × 100%

Trong đó: TFC: Tổng hàm lượng flavonoid trong mẫu (%)

CQ : Nồng độ tương đương quercetin (μg QE/mL)

C0: Nồng độ của mẫu (μg/mL)

2.2.3. Phân tích thành phần tinh dầu bằng phương pháp GC-MS

Cân chính xác 0,5 g củ và rễ của mẫu dược liệu đã nghiền cho vào lọ thủy tinh. Sau đó, thêm tiếp 2 mL dung môi n-hexan đạt tiêu chuẩn phân tích vào lọ. Mang lọ đi siêu âm trong vòng 30 phút. Lọc nhanh dịch chiết qua ống tiêm có gắn đầu lọc PTFE 25 mm, lỗ lọc 0,45 μm. Cho dịch lọc vào vial rồi tiến hành phân tích GC-MS.

Thành phần hóa học và các cấu tử trong dịch chiết n-hexan của D. orlowii được xác định bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sử dụng máy GC-MS (Model; Thermo GC - Trace Ultra) được trang bị cột mao quản với nhiệt độ cao nhất 330/350oC, độ dài 15 m, đường kính 0,25 mm, độ dày màng 0,25 µm. Cột được lập trình nhiệt độ từ 80oC (trong 2 phút), sau đó tăng đến 180oC (giữ trong 2 phút) với tốc độ 10oC/phút. Cuối cùng tăng lên mức nhiệt 290oC (giữ trong 10 phút) với tốc độ tăng 5oC/phút. Heli (độ tinh khiết đạt chuẩn) là khí mang được cố định với tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Lượng mẫu hút là 1 µL. Dải khối lượng từ 300 – 800 m/z được quét. Tổng thời gian chạy của GC-MS là 45 phút. Tỷ lệ phần trăm tương đối của mỗi thành phần chiết xuất được biểu thị bằng phần trăm khi chuẩn hóa diện tích peak.

2.2.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các dịch chiết từ củ và rễ của D. orlowii

2.2.4.1. Phương pháp DPPH

20

Chuẩn bị các hóa chất cần thiết:

- 1,1- diphenyl – 2 –picrylhydrazyl (DDPH) được pha trong MeOH để thu

được dung dịch có nồng độ 0,1 mM.

- Mẫu thử: Các cao chiết dược liệu được hòa tan trong DMSO (dimethyl sulfoxide), sau đó pha loãng bằng MeOH thành các nồng độ khác nhau. - Chứng dương: Acid ascorbic được hòa tan trong MeOH và được pha

loãng thành các nồng độ khác nhau (12,5 – 100 μg/mL).

- Chứng âm: Methanol

Cách tiến hành:

Cao dược liệu được hòa tan trong DMSO sau đó được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Trong mỗi giếng của đĩa 96 giếng chứa 190 μL dung dịch DPPH (0,1 mM trong MeOH) và 10 μL các mẫu thử với nồng độ khác nhau của cao chiết. Giếng được ủ ở 370C trong 30 phút, sau đó đem đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ Microplate (xMark, Bio-Rad) ở bước sóng 517 nm. Tiến hành đo các mẫu chứng âm và chứng dương với cùng điều kiện và thành phần gồm 190 μL dung dịch DPPH với 10 μL MeOH hoặc acid ascorbic với các nồng độ khác nhau.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Cách đánh giá:

Kết quả hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị

A0−At

phần trăm ức chế (I%) theo công thức:

A0

I% = × 100%

Trong đó: I%: Phần trăm ức chế

At: Độ hấp thụ của mẫu thử

A0: Độ hấp thụ của mẫu trắng

Giá trị IC50 của mẫu thử được tính dựa theo đồ thị tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa nồng độ (C) và phần trăm ức chế (I%); từ đó xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính: y = ax + b để xác định giá trị IC50.

2.2.4.2. Phương pháp ABTS+

21

Chuẩn bị hóa chất cần thiết:

- Kali persulfat pha trong nước cất nồng độ 2,45 mM. - 2,20 -azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS • +) pha

trong MeOH để đạt nồng độ 7mM.

- Mẫu thử: Các cao chiết dược liệu được hòa tan trong DMSO (dimethyl sulfoxide), sau đó pha loãng bằng MeOH thành các nồng độ khác nhau. - Chứng dương: Trolox được hòa tan trong EtOH tuyệt đối và được pha

loãng thành các nồng độ khác nhau (50 – 200 μg/mL).

- Chứng âm: Methanol đối với các cao chiết và Ethanol tuyệt đối đối với

Trolox.

Cách tiến hành:

Cation ABTS+ được tạo ra bằng cách trộn dung dịch nước của Kali persulfat (2,45 mM) và ABTS+(7 mM) với thể tích bằng nhau. Sau đó ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng từ 12 đến 16 giờ trước khi sử dụng. Pha loãng dung dịch ABTS+ được điều chế trên trong Ethanol tuyệt đối đến khi độ hấp thụ của dung dịch đạt giá trị khoảng 0,7 ± 0,02 ở bước sóng 734 nm.

Cao dược liệu được hòa tan trong DMSO, sau đó được pha loãng bằng dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau. Trong mỗi giếng của đĩa 96 giếng chứa 190 μL dung dịch ABTS+ và 10 μL các mẫu thử với nồng độ khác nhau của cao chiết. Giếng được ủ ở nhiệt độ phòng trong chính xác 10 phút trong bóng tối. Sau đó, tiến hành đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ Microplate (xMark, Bio-Rad) ở bước sóng 734 nm. Tiến hành đo độ hấp thụ của các mẫu chứng âm và chứng dương với cùng điều kiện và thành phần gồm 190 μL dung dịch ABTS+ với 10 μL MeOH hoặc EtOH hoặc Trolox với các nồng độ khác nhau.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

Cách đánh giá:

Kết quả khả năng bắt giữ gốc tự do ABTS+ được đánh giá thông qua giá

A0−At

trị phần trăm ức chế (I%) theo công thức:

A0

I% = × 100%

22

Trong đó: I%: Phần trăm ức chế

At: Độ hấp thụ của mẫu thử

A0: Độ hấp thụ của mẫu trắng

Giá trị IC50 của mẫu thử được tính dựa theo đồ thị tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa nồng độ (C) và phần trăm ức chế (I%); từ đó xây dựng được phương trình hồi quy tuyến tính: y = ax + b để xác định giá trị IC50.

2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình  độ lệch chuẩn (mean 

SD). Phần mềm Microsoft Excel 2016 được sử dụng để tính toán số liệu và vẽ đồ thị. Giá trị trung bình của các mẫu được so sánh sử dụng phân tích ANOVA và t-test. Giá trị P < 0,05 chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

23

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ

3.1. Kết quả chiết xuất và định lượng một số hợp chất tự nhiên trong các mẫu cao chiết từ rễ và củ của D.orlowii

3.1.1. Kết quả chiết xuất

Kết quả sau khi tiến hành chiết 10g dược liệu bằng các dung môi MeOH, EtOH, EtOAc, DCM với ba phương pháp chiết soxhlet, siêu âm, lắc thu được như bảng 3.1. Dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất ở cả ba phương pháp chiết và đạt cao nhất ở phương pháp chiết siêu âm với khối lượng 227,58 mg và hiệu suất 2,28 %. Dung môi dichloromethan cho hiệu suất chiết thấp nhất ở cả 3 phương pháp và thấp nhất ở phương pháp lắc, hiệu suất thu được chỉ có 0,27%.

Bảng 3.1. Khối lượng cao chiết thu được (mg) và hiệu suất chiết (%)

Chiết soxhlet

Chiết siêu âm

Chiết lắc

Khối

Hiệu

Khối

Hiệu

Khối

Hiệu

lượng

suất

lượng

suất

lượng

suất

(mg)

(%)

(mg)

(%)

(mg)

(%)

MeOH

177,4

1,77

227,58

2,28

155,04

1,55

EtOH

139,6

1,4

149

1,49

144,4

1,44

EtOAc

62,9

0,63

126,85

1,27

36,9

0,37

DCM

32,5

0,33

51,4

0,51

26,5

0,27

3.1.2. Định lượng một số hợp chất tự nhiên trong các mẫu cao chiết từ rễ và củ của D.orlowii

Acid gallic là một acid hữu cơ thuộc nhóm polyphenol. Đường chuẩn acid gallic được sử dụng để xác định sự hiện diện của nhóm chất polyphenol, có hệ số R2 = 0,9957 và phương trình đường chuẩn là: y = 0,0232x + 0,1262 (trục y tương ứng giá trị quang phổ hấp thụ (OD: optical density), trục x tương ứng với nồng độ chất chuẩn acid gallic).

24

3

2.5

y = 0.0232x + 0.1262 R² = 0.9957

)

2

D O ( ụ h

t

p ấ h

1.5

ổ h p

1

g n a u Q

0.5

0

20

40

80

100

120

0

60 Nồng độ (C μg/mL)

Hình 3.1. Đường chuẩn của acid gallic

2.5

y = 0.0021x + 0.1162 R² = 0.9956

2

1.5

D O

1

0.5

0

0

200

400

800

1000

1200

600 Nồng độ C (μg/mL)

Quercetin là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid. Đường chuẩn quercetin được sử dụng để xác định sự hiện diện của nhóm chất flavonoid, có hệ số R2= 0,9956 và phương trình đường chuẩn là: y= 0,0021x + 0,1162 (trục y tương ứng giá trị quang phổ hấp thụ (OD: optical density), trục x tương ứng với nồng độ chất chuẩn quercetin).

Hình 3.2. Đường chuẩn của quercetin

25

Kết quả xác định hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid tổng của cao chiết methanol (ME), cao chiết ethanol (ET), cao chiết ethyl acetat (EA) và cao chiết dichloromethan (DC) từ cây D. orlowii được trình bày trong Bảng 3.2 và Hình 3.3.

Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần trong cao chiết của cây D. Orlowii (%)

Phương pháp chiết Cao chiết của các dung môi Hàm lượng polyphenol toàn phần (%) Hàm lượng flavonoid toàn phần (%)

DCM 21,92 ± 0,60a 12,43 ± 0,14a

EtOAc 15,59 ± 0,89b 18,52 ± 0,53b Soxhlet MeOH 29,1 ± 0,55c 14,5 ± 0,2a

EtOH 12,05 ± 0,79b 4,42 ± 0,28c

DCM 25,94 ± 0,49a 13,95 ± 0,4a

EtOAc 17,25 ± 1,28b 18,33 ± 0,72b Siêu âm MeOH 37,67 ± 0,99c 18,29 ± 0,43b

EtOH 12,81 ± 0,23b 11,77 ± 0,14a

DCM 13,78 ± 0,44a 12,38 ± 1,00a

EtOAc 15,96 ± 1,21a 16,85 ±1,48a Lắc MeOH 20,33 ± 0,89b 10,09 ± 0,6a

EtOH 10,45 ± 0,73c 4,12 ± 0,39b

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột của từng phương pháp biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

26

Hình 3.3. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần của rễ củ của cây D. Orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D).

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cột (TPC hoặc TFC) chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)

Hàm lượng phenolic tổng của các cao nghiên cứu khác nhau có ý nghĩa thống kê (ANOVA, p < 0,05). Kết quả cho thấy cao chiết methanol bằng phương pháp chiết siêu âm có hàm lượng TPC lớn nhất, tương đương với 37,67

27

± 0,99% và cao chiết ethanol bằng phương pháp lắc có hàm lượng TPC thấp nhất, tương đương với 10,45 ± 0,73% (Bảng 3.2).

Với dung môi chiết ethylacetat và dung môi dichloromethan, không có

sự khác biệt khi sử dụng ba phương pháp chiết tới tổng hàm lượng flavonoid (p > 0,05). Với các dung môi còn lại, chiết bằng phương pháp chiết siêu âm, các cao chiết có tổng hàm lượng TFC cao hơn so với hai phương pháp chiết lắc và soxhlet (Hình 3.3).

Ở các dung môi khác nhau, có một vài sự so sánh không mang lại ý nghĩa thống kê, nhưng nhìn chung, khi chiết bằng phương pháp siêu âm, các cao chiết có tổng hàm lượng TPC cao hơn so với hai phương pháp còn lại (Hình 3.3). Cụ thể, bằng phương pháp này, tổng hàm lượng polyphenol thu được tương ứng với các dung môi DCM, EtOAc, MeOH, EtOH lần lượt có giá trị là 25,94 ± 0,49%; 17,25 ± 1,28%; 37,67 ± 0,99%; 12,81 ± 0,23%.

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết từ rễ và củ của D. orlowii

3.2.1. Theo mô hình trung hòa gốc tự do DPPH

Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết methanol (ME), cao chiết ethanol (ET), cao chiết ethyl acetat (EA) và cao chiết dichloromethan (DC) từ rễ và củ cây Distichochlamys orlowii bằng ba phương pháp chiết khác nhau được đánh giá thông qua mô hình trung hòa gốc tự do DPPH. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3 và Hình 3.4. Khả năng bắt giữ gốc tự do càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.

Dung môi là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu tự nhiên. Trong bài nghiên cứu này, các loại dung môi chiết có độ phân cực khác nhau bao gồm MeOH, EtOH, DCM, EtOAc đã được sử dụng.

28

Bảng 3.3. Hoạt tính trung hòa DPPH (IC50, µg/mL) của cao chiết

Siêu âm Soxhlet Lắc

DOD 170,9 ± 4,5a 365,57 ± 19,81a 531,825 ± 22,41a

DOEA 342,98 ± 17,11b 418,7 ± 12,05a 632,645 ± 13,37b

DOM 168,635 ± 5,92c 249,05 ± 10c 318,06 ± 15,49c

DOE 271,73 ± 10,34b 1702,27 ± 134,59d 2311,75 ± 103,59d

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05).

Phân tích ANOVA cho thấy có sự khác biệt về giá trị IC50 giữa các cao chiết khác nhau (p < 0,05). Kết quả cho thấy, bằng phương pháp chiết siêu âm, cao chiết MeOH thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 đo được là 168,635 ± 5,92 μg/mL và cao chiết EtOAc thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu nhất với giá trị IC50 là 342,98 ± 17,11 μg/mL. Với phương pháp chiết soxhlet, cao chiết methanol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 đo được là 249,05 ± 10 μg/mL và cao chiết EtOH thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu nhất với giá trị IC50 là 1702,27 ± 134,59 μg/mL. Với phương pháp lắc, cao chiết MeOH thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 đo được là 318,06 ± 15,49 μg/mL và cao chiết EtOH thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu nhất với giá trị IC50 = 2311,75 ± 103,59 μg/mL (Bảng 3.3).

Căn cứ vào các kết quả thu được, phương pháp chiết siêu âm cho thấy khả năng trung hòa gốc tự do cao hơn so với các phương pháp khác (Hình 3.4). Cụ thể, bằng phương pháp này, cao chiết methanol, dichloromethan, ethanol và ethyl acetat có khả năng trung hòa DPPH với các giá trị IC50 lần lượt là 168,635 ± 5,92 μg/mL; 170,9 ± 4,5 μg/mL; 271,73 ± 10,34 μg/mL và 342,98 ± 17,11 μg/mL.

29

Hình 3.4. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của rễ và củ cây D. orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D).

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

3.2.2. Theo mô hình trung hòa gốc tự do ABTS+

Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết methanol (ME), cao chiết ethanol (ET), cao chiết ethyl acetat (EA) và cao chiết dichloromethan (DC) từ rễ và củ cây Distichochlamys orlowii bằng ba phương pháp chiết khác nhau được đánh giá thông qua mô hình trung hòa gốc tự do ABTS+. Kết quả được trình bày

30

trong Bảng 3.4 và Hình 3.5. Khả năng trung hòa gốc tự do tỷ lệ nghịch với giá trị IC50.

Bảng 3.4. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ (IC50 , μg/mL) của

các cao chiết

Siêu âm Soxhlet LẮC

DOD 170,04 ± 4,04a 245,19 ± 6,1a 332,03 ± 13,24a

DOEA 144,61 ± 3,05b 180,05 ± 2,02b 246,54 ± 16,74b

DOM 153,81 ± 8,45ab 227,59 ± 5,63a 340,16 ± 14,25a

DOE 215,52 ± 6,71c 376,03 ± 5,56c 667,48 ± 13,41c

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Các giá trị trung hòa 50% gốc tự do ABTS+ (IC50) của các cao chiết được nghiên cứu khác nhau có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05. Kết quả cho thấy, chiết siêu âm cho khả năng chống oxy hóa mạnh nhất ở cao chiết ethyl acetat với giá trị IC50 = 144,61 ± 3,05 μg/mL; thấp nhất ở cao chiết ethanol với giá trị IC50 = 215,52 ± 6,71 μg/mL. Phương pháp chiết lắc thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở cao chiết ethyl acetat với giá trị IC50 = 246,54 ± 16,74 μg/mL; thấp nhất ở cao chiết ethanol với giá trị IC50 = 667,48 ± 13,41 μg/mL. Phương pháp chiết soxhlet thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở cao chiết ethyl acetat với giá trị IC50 = 180,05 ± 2,02 μg/mL; yếu nhất ở cao chiết ethanol với giá trị IC50 = 376,03 ± 5,56 μg/mL (Bảng 3.4).

31

Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trung hòa ABTS+ tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D).

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với (P < 0,05).

Phương pháp chiết siêu âm cho thấy khả năng trung hòa gốc tự do cao hơn so với các phương pháp khác (Hình 3.5). Bằng phương pháp này, cao chiết methanol, dichloromethan, ethanol và ethyl acetat có khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+ với các giá trị IC50 lần lượt là 153,81 ± 8,45 μg/mL; 170,04 ± 4,04

32

μg/mL; 215,52 ± 6,71 μg/mL và 144,61 ± 3,05 μg/mL. Phương pháp chiết lắc thể hiện khả năng chống oxy hóa yếu nhất đối với cao chiết ethanol với giá trị IC50 = 667,48 ± 13,41 μg/mL.

3.3. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ dịch chiết rễ củ cây D. orlowii

Bảng 3.5 và hình 3.6 cho biết các thành phần hóa học trong dịch chiết n- hexan từ thân rễ và củ của cây D.orlowii, tỷ lệ phần trăm của chúng cũng như là thời gian lưu ở cột.

Bảng 3.5. Các thành phần tinh dầu trong dịch chiết n-hexan từ rễ và củ của cây D.orlowii

STT Tên các hợp chất Công thức phân tử Phần trăm (%) Thời gian lưu (phút)

1 3,37 α –pinene 0,91 C10H16

2 4,7 Eucalytol/ cineole 7,6 C10H18O

3 5,68 Linalool 0,61 C10H18O

4 6,9 Terpinen-4-ol 2,89 C10H18O

5 5,8 Terpineol-cis-β 0,15 C10H18O

7,51 Fenchyl acetate 6 0,15 C12H20O2

7 7,8 Neral 12,61 C10H16O

8 8,22 α-citral 11,85 C10H16O

9 8,79 Geraniol 2,43 C10H18O

10 9,47 Acid nerolic 1,82 C10H16O2

11 9,69 Geranyl acetat 1,37 C12H20O2

33

12 15,2 11,21 Aristolochene C15H24

13 3,5 11,28 α -Selinene C15H24

14 3,65 11,36 α -bisabolene C15H24

15 1,82 11,56 α -sesquiphellandrene C15H24

16 0,76 11,61 Limonen-10-ol C15H24O2

17 1,82 12,01 Trans sesquisabinene hydrate C15H26O

18 0,15 12,4 Iso aromadendrene epoxide C15H24O

19 0,76 12,56 Cubebol C15H26O

20 1,52 13,51 Globulol C15H26O

21 3,04 13,6 Aromadendrene oxide C15H24O

22 0,61 14,02 Ledene C15H24

23 0,3 14,22 Cuparenal C15H20O

24 0,15 14,78 Humulene epoxid 2 C15H24O

25 0,3 14,86 Myristic acid C14H28O2

26 0,3 15,36 C19H30O2

2,5-octadecadiynoic acid, methyl ester

27 0,3 15,71 Eremophila-1(10),7(11) dien C15H24

28 4,71 17,97 Cembrene A C20H32

29 1,22 17,39 Geranyllinalool C20H34O

30 18,37 3,8 C21H34O2

3-ethyl-3-hydroxyandrostan-17- one

34

31 20,88 Kaur-16-en-18-al 4,56 C20H30O

32 21,24 1-heptatriacotanol 7,29 C37H76O

Squalene 33 32,37 C30H50 1,82

Tổng

Monoterpene hydrocarbon 0,91

Monoterpene dạng oxy hóa 41,49

Sesquiterpenes hydrocarbon 25,08

Sesquiterpenes dạng oxy hóa 8,20

Diterpenes 9,73

Non-terpenes 14,59

Hình 3.6. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ củ của D. orlowii

Các hợp chất thu được trong dịch chiết n-hexan từ thân rễ và củ của D. orlowii chiếm phần lớn là monoterpene (42,3%) và sesquiterpenes (33,28%). Các thành phần hóa học chính thu được là aristolochene (15,2%), neral (12,61%), α-citral (11,85%) và một lượng đáng kể cineole (7,6%), cembrene A (4,71%), terpinen-4-ol(2,89%), geraniol (2,43%), α -bisabolene (3,65%).

35

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN

Kết quả nghiên cứu cho thấy bằng phương pháp chiết siêu âm, dưới tác dụng của sóng siêu âm cho khối lượng cao chiết nhiều nhất và đạt hiệu suất lớn nhất ở dung môi methanol (2,28%). Cùng với dung môi và phương pháp đó cũng cho hàm lượng TPC và TFC cao hơn so với các dung môi và phương pháp khác.

Ảnh hưởng của các phương pháp chiết đến hàm lượng hoạt chất sinh học thu được cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu; chẳng hạn như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng sẽ mang lại những lợi thế về thời gian chiết, lượng dung môi sử dụng và hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học được thu nhận. Từ quan điểm bảo vệ môi trường, các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, việc áp dụng các quy trình chiết xuất "xanh", chiết xuất có hỗ trợ siêu âm và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng được khuyến khích sử dụng để thu được các chiết xuất giàu polyphenol từ các nguồn thực vật khác nhau [17]. Các phương pháp chiết truyền thống như chiết soxhlet và chiết lắc có thời gian chiết xuất lâu và nhiệt độ cao, làm tăng quá trình oxy hóa các hợp chất phenol, làm giảm hàm lượng polyphenol trong dịch chiết. Nhược điểm chính của quá trình chiết hỗ trợ nhiệt đó là tiêu thụ dung môi cao, làm tăng chi phí và gây ra các vấn đề môi trường; trong khi hàm lượng polyphenol thấp hơn so với các kỹ thuật chiết xuất mới như phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm và chiết xuất có hỗ trợ vi sóng [17]. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Jovanović et al. (2019) trên cỏ xạ hương (Thymus Serpyllum) được trích ly và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của polyphenol. Trong nghiên cứu này, tác giả cũng kết luận rằng phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm thu được hàm lượng polyphenol cao hơn và hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với phương pháp trích ly truyền thống [4].

Hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần khi chiết xuất bằng dung môi methanol thu được cao hơn so với các dung môi khác. Kết quả của nghiên cứu tương tự như báo cáo của Ali et al.(2011), chỉ ra rằng dung môi methanol có hiệu quả nhất trong việc chiết xuất các thành phần phenolic từ củ gừng [12] và kết quả nghiên cứu của Rahman et al. (2013) thực hiện trên cây Cà dại hoa trắng (Solanum torvum) cũng kết luận dung môi có độ phân cực càng cao, hàm

36

lượng polyphenol và flavonoid toàn phần thu được càng nhiều [29]. Turkmen và cộng sự (2006) báo cáo rằng dung môi có độ phân cực khác nhau có ảnh hưởng đáng kể đến hợp chất phenolic và hoạt tính chống oxy hóa ở hàm lượng cao hơn trong dung môi phân cực hơn [31, 33, 34]. Các hợp chất phenolic thường liên kết với các phân tử sinh học khác (polysaccharide, protein, tecpen, chất diệp lục, các hợp chất vô cơ,...) và dung môi phải được tìm thấy thích hợp cho quá trình chiết xuất. Điều này cho thấy hàm lượng chất chiết được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất dược liệu, dung môi và điều kiện chiết xuất [23].

Về hoạt tính chống oxy hóa của D. orlowii, các kết quả thu được cho thấy dịch chiết rễ và củ của D. orlowii có khả năng chống oxy hóa tốt. Rất khó so sánh hoạt tính chống oxy hóa từ nghiên cứu này và các dữ liệu đã công bố khác do thực tế là hàm lượng của các hợp chất chống oxy hóa có thể bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết, giống cây trồng và vị trí.

Dựa trên so sánh sự tương quan, cho thấy có sự tương quan thuận giữa giá trị 1/IC50 của mô hình ABTS+ với hàm lượng TFC nhưng lại không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Hàm lượng flavonoid và polyphenol toàn phần có trong các mẫu cao chiết thể hiện tương quan thuận với giá trị 1/IC50 của mô hình DPPH. Tuy nhiên, sự tương quan này lại không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Việc không tìm thấy mối tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần với khả năng kháng oxy hóa có thể là do phản ứng không chọn lọc của các phương pháp định lượng được sử dụng [2].

Nhằm phân tích sâu hơn về thành phần hóa học của D. orlowii, bài nghiên cứu này đã tiến hành phân tích các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ. Kết quả đã nhận dạng được các thành phần chính, trong đó các chất có hàm lượng lớn như Aristolochene (15,2%), neral (12,61%), α-citral (11,85%) và một lượng đáng kể cineole (7,6%), cembrene A (4,71%), terpinen- 4-ol (2,89%), geraniol (2,43%), α -bisabolene (3,65%),...

Tuy vậy, quá trình phân lập chưa phát hiện thêm các hợp chất từ các nhóm chất khác được nhắc đến trong các nghiên cứu trước đó. Ngoài ra, có sự

37

khác biệt về một số thành phần cũng như hàm lượng các chất. Các nghiên cứu trước đã định lượng được một lượng đáng kể các hydrocarbon monoterpene (23,9%), monoterpen oxy hóa (29,4%), hydrocarbon sesquiterpene (33,7%), sesquiterpenes oxy hóa (11,2%) và xuất hiện một lượng diterpenes rất nhỏ (0,3%). Người ta quan sát thấy rằng geranyl axetat (16,5%), β-elemene (9,2%), β-pinene (9,0%) và β-caryophyllene (7,9%) là các thành phần chủ yếu của D. orlowii. Bên cạnh đó có các hợp chất định tính khác bao gồm α-humulene (4,9%), (Z) -citral (4,6%), bicyclogermacrene (3,6%), γ-gurjunene (3,4%), linalool (3,1%) và limonene (3,1% )… [9]. Nguyên nhân có thể là thời điểm thu hái không phù hợp, điều kiện môi trường sống nhiều khác biệt hay do quá trình di thực nên làm cho hàm lượng hợp chất trong mẫu D. orlowii được nghiên cứu có sự khác biệt. Ngoài ra, có thể do dung môi chiết khác nhau, các thông số được thiết lập trên hệ thống GC-MS có sự khác biệt. Các nghiên cứu của đề tài chỉ mới là bước đầu, tạo tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về D. orlowii, bổ sung tư liệu cho việc sử dụng cây thuốc trong dân gian, cũng như phục vụ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu sau này.

38

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Sau khoảng thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được những mục tiêu đề ra

và thu được một số kết quả như sau:

- Đã định lượng được một số hợp chất tự nhiên và xác định được thành phần của tinh dầu có trong cao chiết từ rễ và củ của cây Distichochlamys orlowii.

- Đã đánh giá sơ bộ được hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các loại cao chiết từ rễ và củ của cây D. orlowii. Chiết bằng phương pháp siêu âm với dung môi MeOH cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất.

Kiến nghị

- Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và phân lập thêm các hợp chất từ loài Distichochlamys orlowii ở các phân đoạn khác như phân đoạn n-hexan, phân đoạn n-butanol, phân đoạn nước…

- Tiếp tục đánh giá các tác dụng sinh học khác của dịch chiết loài D. orlowii, cụ thể như tác dụng hạ đường huyết, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm,…

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo tiếng việt

1.

Đào Thị Minh Châu, Đào Thị Thoan (2018), "Đa dạng họ Gừng (Zingiberaceae) ở Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 34(1), tr. 84-89.

Tài liệu tham khảo tiếng anh

2.

Aires Alfredo, Carvalho Rosa, Rosa Eduardo AS, Saavedra Maria J (2013), "Phytochemical characterization and antioxidant properties of baby-leaf watercress produced under organic production system", CyTA- Journal of Food, 11(4), pp. 343-351.

3.

Alberti Thaís Barbosa, Barbosa Wagner Luiz Ramos, Vieira José Luiz Fernandes, et al. (2017), "(−)-β-Caryophyllene, a CB2 receptor-selective phytocannabinoid, suppresses motor paralysis and neuroinflammation in a murine model of multiple sclerosis", International journal of molecular sciences, 18(4), pp. 691.

4.

Aleksandra Jovanović, Mihaela Skrt, Predrag Petrović, et al. (2019), "Ethanol Thymus serpyllum extracts: Evaluation of extraction conditions via total polyphenol content and radical scavenging activity", Lekovite sirovine, 39, pp. 23-29.

5.

Arad Yadon, Spadaro Louise A, Roth Marguerite, Newstein David, Guerci Alan D (2005), "Treatment of asymptomatic adults with elevated coronary calcium scores with atorvastatin, vitamin C, and vitamin E: the St. Francis Heart Study randomized clinical trial", Journal of the American College of Cardiology, 46(1), pp. 166-172.

6.

Arora Mamta, Kaur Gurjinder, Singh Satnam, Mahajan Anupama, Sembi Jaspreet K (2017), "TPC, TFC & Antioxidant activities of Crepidium acuminatum (D. Don) Szlach", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(4), pp. 811-817.

7.

Bahorun T, Soobrattee MA, Luximon-Ramma V, Aruoma OI (2006), "Free radicals and antioxidants in cardiovascular health and disease", Internet Journal of Medical Update, 1(2), pp. 25-41.

8.

Carocho Márcio, Ferreira Isabel CFR (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, pp. 15-25.

9.

Chau Dao TM, Hung Nguyen V, Dai Do N, Ogunwande Isiaka A (2017), "Volatile constituents of Distichochlamys citrea MF Newman and Distichochlamys orlowii K. Larsen MF Newman (Zingiberaceae) from Vietnam", Journal of Medicinal Plants Research, 11(9), pp. 188-193.

10. Dröge Wulf (2002), "Free radicals in the physiological control of cell

function", Physiological reviews.

11. Genestra Marcelo (2007), "Oxyl radicals, redox-sensitive signalling

cascades and antioxidants", Cellular signalling, 19(9), pp. 1807-1819.

12. Ghasemzadeh Ali, Jaafar Hawa ZE, Rahmat Asmah (2011), "Effects of solvent type on phenolics and flavonoids content and antioxidant activities in two varieties of young ginger (Zingiber officinale Roscoe) extracts", Journal of Medicinal Plants Research, 5(7), pp. 1147-1154.

13. Goncalves Maria José, Cruz Maria Teresa, Tavares Ana Cristina, et al. (2012), "Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate", Industrial Crops and Products. 35(1), 166-171.

14. Harman Denham (1992), "Free radical theory of aging: history", Free

radicals and aging, pp. 1-10.

15. Heim Jr Richard R (2002), "A review of twentieth-century drought indices used in the United States", Bulletin of the American Meteorological Society, 83(8), pp. 1149-1166.

16.

Jaradat Nidal, Adwan Lina, K’aibni Shadi, Shraim Naser, Zaid Abdel Naser (2016), "Chemical composition, anthelmintic, antibacterial and

antioxidant effects of Thymus bovei essential oil", BMC Complementary and Alternative Medicine, 16(1), pp. 1-7.

17.

Jovanović Aleksandra, Petrović Predrag, Đorđević Verica, et al. (2017), "Polyphenols extraction from plant sources", Lekovite sirovine, 37, pp. 45-49.

18. Kamatou Guy PP, Viljoen Alvaro M (2008), "Linalool–A review of a biologically active compound of commercial importance", Natural Product Communications, 3(7), pp. 1183 - 1192.

19. Larsen K. (2001), "A new species of Distichochlamys from Vietnam and some observations on generic limits in Hedychieae (Zingiberaceae)", Nat. Hist. Bull. Siam Soc, 49, pp. 77-80.

20. Li Yi, Schellhorn Herb E (2007), "New developments and novel therapeutic perspectives for vitamin C", The Journal of nutrition, 137(10), pp. 2171-2184.

21. List The Plant (2012), "Distichochlamys orlowii K.Larsen & from 30/07/2021, Retrieved

M.F.Newman", http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-241289.

22. Miller III Edgar R, Pastor-Barriuso Roberto, Dalal Darshan, et al. (2005), "Meta-analysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase all-cause mortality", Annals of internal medicine, 142(1), pp. 37-46.

23. Mohsen Sobhy M, Ammar Abdalla SM (2009), "Total phenolic contents and antioxidant activity of corn tassel extracts", Food chemistry, 112(3), pp. 595-598.

24. Munteanu Irina Georgiana, Apetrei Constantin (2021), "Analytical in determining antioxidant activity: A review",

methods used International Journal of Molecular Sciences, 22(7), pp. 3380.

25. Naidu K Akhilender (2003), "Vitamin C in human health and disease is still a mystery? An overview", Nutrition journal, 2(1), pp. 1-10.

26. Newman MF (1995), "Distichochlamys, a new genus from Vietnam",

Edinburgh Journal of Botany, 52(1), pp. 65-69.

27. Nguyen Quoc Binh, Leong-Škorničková Jana (2012), "Distichochlamys benenica (Zingiberaceae), a new species from Vietnam", Gardens’ Bulletin Singapore, 64, pp. 195-200.

28. Onawunmi Grace O (1989), "Evaluation of the antimicrobial activity of

citral", Letters in applied microbiology, 9(3), pp. 105-108.

29. Rahman Nur, Marliyati Sri Anna, Damanik Muhammad Rizal Martua, Anwar Faisal (2013), "Antioxidant activity and total phenol content of ethanol extract takokak fruit (Solanum torvum)", Pakistan Journal of Nutrition, 12(11), pp. 973.

30. Rehse T, Kress WJ "Distichochlamys (2003),

rubrostriata (Zingiberaceae), a new species from northern Vietnam", Brittonia, 55(3), pp. 205-208.

31. Siddhuraju Perumal, Becker Klaus (2003), "Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agroclimatic origins of drumstick tree (Moringa oleifera Lam.) leaves", Journal of agricultural and food chemistry, 51(8), pp. 2144- 2155.

32. Singh Sudhakar, Singh R. P. (2008), "In Vitro Methods of Assay of Antioxidants: An Overview", Food Reviews International, 24(4), pp. 392-415.

33. Sultana Bushra, Anwar Farooq, Przybylski Roman (2007), "Antioxidant activity of phenolic components present in barks of Azadirachta indica, Terminalia arjuna, Acacia nilotica, and Eugenia jambolana Lam. trees", Food chemistry, 104(3), pp. 1106-1114.

34. Turkmen Nihal, Sari Ferda, Velioglu Y Sedat (2006), "Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin– Ciocalteu methods", Food chemistry, 99(4), pp. 835-841.

35. Valko Marian, Leibfritz Dieter, Moncol Jan, et al. (2007), "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease",

The international journal of biochemistry & cell biology, 39(1), pp. 44- 84.

36. Valko Marian, Rhodes CJB, Moncol Jan, Izakovic MM, Mazur Milan (2006), "Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress- induced cancer", Chemico-biological interactions, 160(1), pp. 1-40.

37. Valko MMHCM, Morris H, Cronin MTD (2005), "Metals, toxicity and oxidative stress", Current medicinal chemistry, 12(10), pp. 1161-1208.

38. VAN CHEN TRAN, TUAN NGUYEN DUC, TRIET NGUYEN THANH, et al. (2022), "Morphological and molecular characterization of Distichochlamys citrea MF Newman in Bach Ma National Park, Thua Thien Hue Province, Vietnam", Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 23(4).

39. Wahner-Roedler Dietlind L, Elkin Peter L, Vincent Ann, et al. (2005), Use of complementary and alternative medical therapies by patients referred to a fibromyalgia treatment program at a tertiary care center, Mayo Clinic Proceedings, Elsevier, pp. 55-60.

40. Wang Jingyu, Li Heyangzi, Yao Ying, et al. (2018), "β-Elemene Enhances GAP-43 expression and neurite outgrowth by inhibiting RhoA kinase activation in rats with spinal cord injury", Neuroscience, 383, pp. 12-21.

41. Willcox Joye K, Ash Sarah L, Catignani George L (2004), "Antioxidants and prevention of chronic disease", Critical reviews in food science and nutrition. 44(4), 275-295.

42. Young IS và Woodside JV (2001), "Antioxidants in health and disease",

Journal of clinical pathology, 54(3), pp. 176-186.

43. Zhu Tingzhun, Xu Yinghui, Dong Bin, et al. (2011), "β-elemene inhibits proliferation of human glioblastoma cells through the activation of glia maturation factor β and induces sensitization to cisplatin", Oncology reports, 26(2), pp. 405-413.