Nghiên cứu thành phần hóa học rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy: Khóa luận tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC

PHÙNG TIẾN HẢI

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA MẪU RỄ TÓC NUÔI CẤY CỦA

SÂM VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC

Người thực hiện: PHÙNG TIẾN HẢI

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN

HÓA HỌC CỦA MẪU RỄ TÓC NUÔI CẤY CỦA

SÂM VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƢỢC HỌC)

Khoá: QH.2017.Y

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

2. ThS. ĐẶNG THỊ NGẦN

Hà Nội – 2022

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo, Ban giám hiệu của Trường Đại học PHENIKAA và Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, quan tâm chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Đặng Thị Ngần – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã dành thời gian hướng dẫn, góp ý cho em trong quá trình hoàn thiện khóa luận.

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy

TS. Vũ Văn Tuấn và TS. Nguyễn Ngọc Hiếu – Trường ĐH PHENIKAA, hai thầy đã nhiệt tình, giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn, góp ý cho em trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thiện đề tài ở trường ĐH PHENIKAA. Và em cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trao cho em cơ hội để em có thể làm và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới Trường ĐH PHENIKAA và Trường ĐH Y Dược – ĐHQGHN đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận của mình, cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2017.Y đã đồng hành cùng em trong suốt 5 năm học qua. Và lời cảm ơn đặc biệt nhất là tới gia đình em, em vô cùng biết ơn gia đình đã luôn ở bên động viên, khích lệ và sát cánh, giúp em có thêm động lực cố gắng để em vượt qua những giai đoạn khó khăn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022

Phùng Tiến Hải

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Acetonitrile Cacbon tetrachloride Detector mảng điốt (Diode array detector) D-galactosamine Ginsenosid-Rb1 Ginsenosid-Rd Ginsenosid-Re Ginsenosid-Rg1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) Interleukin Lipopolysaccharide Tế bào 2 lá (mitral cells) Methanol Majonosid-R2 n-butanol Occotillol Protopanaxadiol Protopanaxatriol Pseudoginsenoside RT4 Yếu tố hoại tử khối u-alpha (Tumor Necrosis Factors anpha) Chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue plasminogen activator) Sâm Việt Nam Vietnamese ginseng CH3CN CCl4 DAD D-GalN G-Rb1 G-Rd G-Re G-Rg1 HPLC IL LPS MC MeOH M-R2 n-BuOH OT PPD PPT PRT4 TNF-α TPA SVN VG

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol ............................ 9 Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol .......................... 11 Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc Ocotillol ................................................... 13 Bảng 1.4. Các saponin dẫn chất của acid oleanolic ........................................ 14 Bảng 1.5. Thành phần acid béo phần dưới mặt đất sâm Việt Nam ................ 15 Bảng 1.6. Thành phần acid amin phần dưới mặt đất sâm Việt Nam .............. 16 Bảng 1.7. Thành phần các nguyên tố đa và vi lượng ở phần dưới mặt đất sâm Việt Nam ......................................................................................................... 16 Bảng 3.1. Chương trình rửa giải pha động sắc ký lỏng hiệu năng cao ........... 32 Bảng 3.2. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn ..................... 37 Bảng 3.3. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu thử ......................... 37 Bảng 3.4. Kết quả định lượng hàm lượng các chất có trong mẫu dược liệu .. 38

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lược về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam (A). Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam (B) ............................................................................................................. 4 Hình 1.2. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) .......... 5 Hình 1.3. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam ............................................. 6 Hình 1.4. Cấu trúc dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol .................................. 8 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ginsenoside-Rb1 ........................................... 10 Hình 1.6. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol ...... 10 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenoside-Rg1 và ginsenoside-Re ........... 12 Hình 1.8. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của Ocotillol ............................ 12 Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của majonoside-R2 ............................................ 13 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Hemsloside –Ma3 ...................................... 14 Hình 2.1. Mẫu dược liệu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu .............................................................................................. 25 Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI)....................... 26 Hình 2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Butanol của mẫu rễ tóc SVN .............. 28 Hình 3.1. Hệ thống máy sắc kí lỏng cao áp Agilent 1260 Infinity LC ............ 31 Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn M-R2 ..................................................... 32 Hình 3.3. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rb1 .................................................... 33 Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rd ...................................................... 33 Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rg1 .................................................... 34 Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp các mẫu chuẩn ........................................... 35 Hình 3.7. Sắc ký đồ các chất của mẫu rễ tóc nghiên cứu trong phân đoạn Butanol ............................................................................................................ 36

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 3

1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam ............................................................. 3

1.1.1. Lịch sử phát hiện và đặc điểm phân bố .......................................... 3

1.1.2. Thực vật học của Sâm Việt Nam ................................................... 5

1.1.3. Đặc điểm thực vật và sinh thái của Sâm Việt Nam ....................... 5

1.1.4. Thành phần hóa học ....................................................................... 7

1.1.5. Tác dụng sinh học ........................................................................ 17

1.1.6. Công dụng .................................................................................... 22

1.1.7. Nguồn dược liệu thay thế ............................................................. 23

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 25

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 25

2.1.1. Mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy ................................................ 25

2.1.2. Chất chuẩn ...................................................................................... 25

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất .............................................................. 25

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 26

2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu .................................................... 26

2.2.2. Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................................................................... 28

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 31

3.1. Phân tích các thành phần saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................ 31

3.1.1. Cài đặt chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích các thành phần saponin có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam. ................................................................................................................... 31

3.1.2. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn ................................................... 32

3.1.3. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam. . 36

3.1.4. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam. . 37

3.2. Bàn luận ............................................................................................... 39

3.2.1. Phương pháp định tính một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC ................................................. 39

3.2.2. Phương pháp định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC ................................................. 40

3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu ............................................................... 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những thập kỷ gần đây, con người dần có xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị bệnh vì đặc tính an toàn, ít gây tác dụng phụ và hiệu quả điều trị cao, do đó việc đi sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được quan tâm. Đặc biệt là Việt Nam, một quốc gia có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc với 4000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 động vật làm thuốc [7].

Sâm Việt Nam là một loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng và là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới, đây là loài đặc hữu của hệ thực vật Việt Nam, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh. Ngoài 26 hợp chất saponin tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Ngọc Linh còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác như majonosid R1-2, vinaginsenosid R1-11 và các saponin khác thuộc nhóm glycosid, các saponin chính phải kể đến như majonosid-R2, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Rd. Những saponin quý này có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, phòng chống ung thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận...[16]. Loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này thuộc danh mục sách đỏ cần được bảo tồn, mặc dù nhà nước đã có chủ trương bảo vệ nguồn cây thuốc quý này nhưng nguồn sâm tự nhiên vẫn bị khai thác lén lút, trái phép một cách nghiêm trọng, ảnh hưởng đến nguồn gen quý, có thể dẫn đến cạn kiệt, đồng thời tạo áp lực cho ngành dược liệu nước ta hiện nay. Hơn nữa, việc sử dụng các hợp chất từ sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì nguồn cung cấp cây sâm Việt Nam chỉ giới hạn ở vùng núi Ngọc Linh, và việc trồng trọt phải mất nhiều thời gian, thường từ 5–7 năm trước khi thu hoạch thân rễ và rễ vì thế sâm Việt Nam khó nuôi trồng và nhân rộng [8].

Đứng trước những thách thức đó, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý hiếm này, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch

trong thời gian ngắn. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ nuôi cấy của sâm Việt Nam đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Hiện nay các kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng rãi, phổ biến dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường,… vì nhiều lý do như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [11].

Trên cơ sở đánh giá các thành phần hóa học có trong mẫu rễ được nuôi cấy của sâm Việt Nam trong phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài

“Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam” với 2 mục tiêu chính:

1. Phân tích các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của

Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.

2. Định lượng sơ bộ các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. Dựa trên những kết quả đó, bước đầu đưa ra được những kết luận sơ bộ về tiềm năng của phương pháp nuôi cấy mẫu rễ tóc của Sâm Việt Nam này trong tương lai.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam 1.1.1. Lịch sử phát hiện và đặc điểm phân bố 1.1.1.1. Lich sử phát hiện

Sâm Việt Nam được biết đến như một loại thuốc quý đặc hữu của nước ta, trước khi được phát hiện và công bố rộng rãi từ phía các nhà khoa học thì loại Sâm này đã được các đồng bào dân tộc thiểu số ở vùng Trung bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Dựa trên những thông tin được lưu truyền trong cộng đồng đồng bào dân tộc thiểu số ở Quảng Nam, Kon Tum về loại củ quý hiếm ở trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người vì thế các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu và tìm hiểu về loại cây này [6].

Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ gồm 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim Long làm trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Khi đoàn lên tỉnh Kon Tum, Ban Dân y Kon Tum cử thêm dược tá Nguyễn Thị Lê trợ giúp cho đoàn, dẫn đường lên núi Ngọc Linh. Sau nhiều ngày vượt suối băng rừng [6], đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, trên con đường đi từ làng Ku-gia theo sườn Đông Nam dãy Ngọc Linh ở độ cao 1.500 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây Panax đầu tiên, một cây 9 tuổi, một cây 11 tuổi và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh [5]. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm, chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác trên thế giới và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới [6].

12 năm sau vào khoảng tháng 9 - 1985, tên Nhân sâm Việt Nam với tên khoa học là Panax vietnamesis Ha et Grushy, họ Ngũ gia bì Araliaceae, được công bố tại Viện Thực vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên sau khi đã nghiên cứu 50 mẫu vật đối chiếu với

những mẫu vật của thế giới và đã kết luận sâm Ngọc Linh là một loài mới, một loài Panax đặc hữu của khu hệ thực vật Việt Nam [5, 6]. 1.1.1.2. Đặc điểm phân bố

(A) (B)

Hình 1.1. Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lƣợc về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam (A). Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam (B) [30]

Cây sâm được phát hiện mọc tự nhiên từ độ cao 1500m đến 2200m, đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.800-2.000m dưới tán rừng già, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) [4]. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.598m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh vì thế ngoài tên riêng là Sâm Việt Nam ra loại cây này còn có tên thường gọi khác là Sâm Ngọc Linh [4, 6], tuy nhiên giới hạn phân bố của Sâm Việt Nam hiện nay đã có những thay đổi, những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kon Tum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này [1, 6].

1.1.2. Thực vật học của Sâm Việt Nam

Sâm Việt Nam với danh pháp khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, ngoài tên gọi chính thống là Sâm Việt Nam ra loài sâm này còn có những tên gọi khác như sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm), củ ngải rọm con, rơm con (Xê Đăng) hay cây thuốc giấu [1, 4-6], và có vị trí phân loại theo hệ thống phân loại thực vật như sau: Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Mộc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Mộc lan (Magnoliopsida)

Bộ: Hoa tán (Apiales)

Họ: Ngũ gia bì (Araliaceae)

Chi: Sâm (Panax)

Loài: Panax vietnamensis Ha et Grushv

Hình 1.2. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) (https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html)

1.1.3. Đặc điểm thực vật và sinh thái của Sâm Việt Nam 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật

Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, sống lâu năm, cao đến 1m. Thân rễ nạc, có đường kính từ 1,5 - 3,5 cm, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí

sinh lụi hàng năm để lại, căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của các cây sâm, mặt ngoài thân rễ màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối thân rễ ở một số cây đôi khi có củ gần hình cầu, đường kính đến 5 cm [4, 5, 15].

Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân. Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 40 - 80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc [4-6, 15].

Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt, mọc vòng thường có 4 (hiếm khi 3,5 hoặc 6), ở ngọn, mỗi lá kép gồm 5 lá chét (ít khi có 6,7), lá dài 7 - 12 cm; lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5 – 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn [4, 5, 15].

Hình 1.3. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam

(https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html)

Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang một tán đơn, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ [4, 5]. Cuống hoa dài 1,5 – 2 cm, có nhiều lông. Tán hoa chính đường kính 2,5 - 4 cm, có 50 - 120 hoa, hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm; đài 5 răng hình tam giác dài 1 – 1,5 cm; tràng có 5 cánh hoa hình trứng dài 2 mm; bao phấn hình trái xoan dài 1 mm và có 5 nhị [4, 5, 15]. Quả mọng, hình trứng, khi chín màu đỏ và thường có 1 chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình

cầu hơi dẹt dài 7 – 10 mm. Hạt lớn dài 8 mm, vỏ hạt cấu tạo bởi nhiều vết xốp lồi lõm [5, 15].

Ra hoa vào tháng 4 - 6, quả có vào tháng 7 – 9 [4, 15].

1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái

Sâm Việt Nam là loại cây thảo đặc biệt sinh trưởng ở độ cao từ

1500 – 2200 m so với mặt nước biển, cây đặc biệt ưa ẩm và bóng, thường mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, nhất là dọc theo hành lang ven suối ở độ cao từ 1900 m. Môi trường rừng nơi có sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù. Nhiệt độ trung bình ước tính từ 15⁰C đến 18⁰C; lượng mưa xấp xỉ khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo từ lá cây mục lâu ngày nên đất có màu nâu rêu, tơi xốp, độ mùn cao và chứa nhiều nước trong đất. Sâm Việt Nam sinh trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ mùa xuân đến hè. Cây ra hoa quả thường từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm, tương đối đều. Khi quả chín sẽ rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông và nảy mầm vào mùa xuân năm sau [1, 4].

1.1.4. Thành phần hóa học

Sâm Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu ngay từ khi loài này được phát hiện ở Việt Nam vào những năm cuối của thế kỉ XX. Từ 1974 đến 1990, các tác giả Nguyễn Thời Nhâm và Trần Công Luận đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam hoang dại, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện hơn và sâu hơn của các thành phần hóa học có ở loài cây này [5, 9, 15]. Kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1993, cho đến nay đã có 52 hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam đã được phân lập và xác định cấu trúc [9, 30]. Các hợp chất này chủ yếu được phân lập từ rễ và thân rễ của Sâm Việt Nam. Ngoài saponin, trong Sâm Việt Nam các tác giả cũng xác định được trong sâm có chứa các polyacetylen, acid béo, acid amin, glucid, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng khác có trong loài sâm này [4, 9, 15]. 1.1.4.1. Các hợp chất saponin trong sâm Việt Nam

Saponin là một nhóm glycosid lớn mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon, gặp rộng rãi

trong thực vật. Và không ngoại lệ Saponin cũng là thành phần hoạt chất chủ yếu của Sâm Việt Nam cũng như của các loài sâm khác trên thế giới.

Từ những nghiên cứu về phần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới đã phát hiện trong Sâm Việt Nam được đặt tên là vina – ginsenosid-R1-R25 và 20-O-Me-G.Rh1 [9, 10].

Các saponin của Sâm Việt Nam được xác định hầu hết thuộc loại dammarane triterpene chúng có thể được phân loại thêm thành các nhóm protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT) và occotillol (OT) ngoại trừ cho hai saponin loại oleanane (ginsenosid Ro và hemslosid Ma3) [15, 30].

Các saponin dammaran này là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học, chiếm tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần saponin của Sâm Việt Nam. Trong đó, các saponin dẫn chất của 20(S)- protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là G-Rb1 chiếm 2,0% về hàm lượng [9, 20].

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol

Hình 1.4. Cấu trúc dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol

Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol [4, 9, 15, 19, 20, 30]

STT Tên Kiểu R1 R2 Hàm lƣợng (%)

1 (A) 2.0

2 (A) 0.012

3 (A) 0.11

4 G-Rb1* G-Rb2 G-Rb3* G-Rc (A) 0.013

5 (A) -Glc6-Glc -Glc6-Ara(P) -Glc6-Xyl - Glc6-Ara(f) -Glc 0.87

6 (A) 0.001

7 G-Rd* PG-Rc1 GY-IX (A) -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc6-Ac -Glc 0.002

8 (A) 0.036

9 (A) 0.012

10 GY-XVII Q-R1 N-Fa (A) 0.072

11 M-F1 (B) -Glc -Glc6-Xyl -Glc6-Glc -Glc6-Glc -Glc6-Glc -Glc 0.001

12 VG-R3 (H) -Glc 0.009

13 VG-R7 (A) -Glc 0.01

14 VG-R8 (C) -Glc 0.004

15 VG-R9 (B) -Glc 0.004

16 VG-R13 (E) -Glc 0.002

17 VG-R24 (A) -Glc 0.001

18 VG-R23 (A) -Ara 0.001

19 VG-R22 (A) -Xyl 0.001

20 VG-R16 (D) -Glc 0.003

21 VG-R21 (G) -Glc 0.001

Ghi chú: G = ginsenosid; PG = pseudo-ginsenosid; GY=gypenosid

Q = quinquenosid; N = notoginsenosid; M = majonosid; VG = vina ginsenosid. *: các saponin chính

22 VG-R20 (F) -Glc -Glc2-Glc6-Ac -Glc2-Glc2-Xyl -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc2-Xyl -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Xyl -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc2-Glc -Glc 0.003

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rb1 [25]

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện là: Ge-Re, -Rg1. Trong đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất 1,37% và G-Re chiếm 0,17% [9, 20].

Hình 1.6. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol

Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol [4, 9, 15, 19, 20]

STT Tên Kiểu R1 R2 R3

Hàm lƣợng (%) 0.17

-H -Glc2-Rha -Glc (I) 23

-H -Glc2-Glc -Glc (I) 0.01 24

-H -Glc -Glc 1.37 25 G-Re* 20-Glc-G- Rf G-Rg1*

-H -Glc -H 0.008 26 G-Rh1

(I) (I) 20(R),20(S) (I) -H -H 0.021 27 G-Rh1

28 -Glc 0.013 -H (I) PG-RS1

-H -Glc Glc2-Glc 6 Ac -Glc2-Xyl (I) 0.36 29 N-R1*

-H -Glc (I) 0.01 30 N-R6 -Glc -Glc6- αGlc

-H -Glc (I) 0.004 31 VG-R4

-Glc -Glc -Glc -Glc -H -Glc -Glc -Glc (K) (J) (K) (K) 0.005 0.003 0.002 0.002 32 VG-R12 33 VG-R15 34 VG-R17 35 VG-R18

-H -Glc (L) 0.006 36 VG-R19 -Glc2- Glc -H -H -H -H -Glc2- Glc

-H -Glc (I) 0.015 37 -CH3 OMe- GRh1

-H -H -Glc -Glc -Glc -H (G) (M) 0.003 0.014 38 VG-R25 39 G-Rh4

Ghi chú: *: các saponin chính

trong

thành phần saponin dẫn chất

protppanaxatriol. Glc: β-D-glucopyranosyl; α-Glc: α-glucopyranosyl; GlcA: β-D- glucoronopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Ara: α- arabinopyranosyl; Ara(f): α-L-arabinofuranosyl; Ara(p): α-L-arabinopyranosyl; Ac:

acetyl.

Ginsenosid-Rg1 Ginsenosid-Re

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Re [25]

Các saponin có cấu trúc Ocotillol Các saponin có cấu trúc Ocotillol bao gồm 11 hợp chất với các đại diện là: majonosid-R1 và -R2. Đặc biệt M-R2 chiếm 5,29% hàm lượng saponin và là hợp chất chủ yếu của Sâm Việt Nam so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Panax japonicum C.A. Mey. var. major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng [9].

Hình 1.8. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của Ocotillol

Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc Ocotillol [4, 9, 15, 19, 20, 30]

STT Tên Kiểu R1 R2

40 41 42 43 (N) (N) (N) (N) Hàm lƣợng (%) 0.065 0.005 0.14 5.29 PG-RT4 24(S)-PG-F11 M-R1* M-R2* -CH3 -CH3 -CH3 -CH3

44 VG-R1 (N) 0.033 -CH3

45 VG-R2 (N) 0.014 -CH3

46 VG-R5 (N) 0.008 -CH3

-Glc -Glc2-Rha -Glc2-Glc -Glc2-Xyl -Glc2-Rha 6 Ac -Glc2-Xyl 6 Ac -Glc2-Xyl4-αGlc -Glc2-Xyl 6 47 VG-R6 (N) 0.006 -CH3

48 49 50 VG-R14 VG-R10 VG-R11 (N) (O) (O) αGlc -Glc2-Xyl -Glc -Glc2-Xyl 0.02 0.007 0.03 -CH2OH -CH3 -CH3

Ghi chú: *: các saponin chính trong thành phần có cấu trúc ocotillol.

Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của majonosid-R2 [25]

Các saponin dẫn chất của acid oleanolic

Bảng 1.4. Các saponin dẫn chất của acid oleanolic [4, 9, 15, 20, 30]

STT Tên Kiểu R1 R2 Hàm lƣợng

(%)

51 (P) 0.038 G-R0 -Glc

52 H-Ma3 (P) -Glc2-Glc -Glc2-Glc-3Ara(p) -Glc 0.05

Ghi chú: H= hemslosid

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Hemslosid –Ma3 [25]

1.1.4.2. Hợp chất polyacetylen

Từ phần dưới mặt đất của SVN đã phân lập được 7 hợp chất ở phân đoạn ít phân cực. 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca- 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen và hai hợp chất mới là 10- acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E), 10(E) trien- 4,6-diyn-3,10-diol [4, 9, 15]. 7 hợp chất polyacetylen đó là:

Pv1= panaxynol, Pv2= 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol, Pv3= stereoisomer của Pv5, Pv4= Dẫn xuất của Pv5, Pv5= heptadeca-1,8(E)-dien- 4,6-diyn-3,10-diol, Pv6= heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol, Pv7= Heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol.

1.1.4.3. Thành phần acid béo

Trong Sâm Việt Nam đã xác định được 17 acid béo từ 8 - 20 cacbon, trong đó những acid béo chiếm tỷ lệ lớn nhất là acid linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%) và acid linolenic (2,61%).

Bảng 1.5. Thành phần acid béo phần dƣới mặt đất sâm Việt Nam[4, 9, 15]

Tên của acid béo Acid palmitic Acid stearic Acid oleic Acid linoleic Acid linolenic STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Số cacbon của hợp chất 8C 10C 11C 12C 13C 14C 15C 15C1= 16C 16C1= 17C 17C1= 18C 18C1= 18C2= 18C3= 20C (%) Vết Vết Vết 0.22 0.31 1.33 0.40 0.31 29.62 Vết 1.13 Vết 4.48 13.26 46.04 2.61 1.51

1.1.4.4. Thành phần acid amin

Dựa trên phương pháp sắc ký lỏng trên máy Beckman multichrom đã xác định được 18 acid amin. Thành phần này bao gồm đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ thể, trong đó một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và trytophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào [9].

Bảng 1.6. Thành phần acid amin phần dƣới mặt đất sâm Việt Nam [4, 9, 15]

Acid amin tự do (%) Acid amin thủy giải (%)

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Acid amin Tryptophan Lysin Histidin Arginin Acid Aspartic Threonin Serin Acid Glutamic Prolin Glycin Alanin Cystin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylanin 10.20 17.90 1.02 46.66 7.60 1.20 5.12 2.05 3.07 4.10 _ 1.53 0.51 0.51 1.02 1.02 0.51 0.51 5.29 2.59 12.90 10.38 5.19 5.19 6.49 15.58 5.19 5.19 Vết 1.29 Vết 2.59 5.19 6.49 6.49

1.1.4.5. Thành phần các nguyên tố vi đa và vi lượng

Dựa trên phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quang tia X đã xác định được 20 nguyên tố đa và vi lượng của phần dưới mặt đất trong Sâm Việt Nam. Trong đó bao gồm một số nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu, Fe, Co, Zn, Se [9].

Bảng 1.7. Thành phần các nguyên tố đa và vi lƣợng ở phần dƣới mặt đất

sâm Việt Nam[4, 9, 15]

STT STT

1 2 3 4 5 6 Nguyên tố vi lƣợng K Ca Mg Fe Sr Ti Hàm lƣợng (ppm) 9349.19 2844.74 1950.19 491.21 169.87 120.65 Nguyên tố vi lƣợng Br Ni Cu Cr Y I Hàm lƣợng (ppm) 17.27 10.61 6.23 4.10 1.51 0.24 11 12 13 14 15 16

Bảng 1.7 (Tiếp) B Rb Mn Zn 7 8 9 10 140.00 91.62 68.10 26.11 17 18 19 20 Co As Se Hg 0.15 0.10 0.05 0.04

1.1.4.6. Hợp chất sterol

Trong sâm Việt Nam có chưa hai hợp chất sterol là β-sitosterol và

daucosterin (β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid) [4, 15]. 1.1.4.7. Hợp chất glucid

Bằng phương pháp Bertran đã xác định hàm lượng đường có trong sâm

Việt Nam gồm [4, 15]:

- Đường tự do: 6,19% - Đường toàn phần: 26,77%

1.1.4.8. Các thành phần khác (trong thân rễ và rễ củ tươi) [4, 15]:

- Tinh dầu: 0,05-0,10% - Vitamin C: 0,059%

1.1.5. Tác dụng sinh học

Sâm Việt Nam là một loại sâm quý với nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, trong đó phần rễ và thân rễ được coi là bộ phận chính được sử dụng cho mục đích trong y học còn các bộ phận thân lá được sử dụng như một loại trà thảo mộc [32]. 1.1.5.1. Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương:

Ginsenosids là thành phần hoạt động chính trong sâm Việt Nam và đã được báo cáo là có tác dụng có lợi trên thần kinh trung ương [4, 34]. Ocotillol là một dẫn xuất của pseudoginsenosid-F11, là một ginsenosid loại ocotillol được tìm thấy trong Sâm Việt Nam. Từ các thử nghiệm kiểm tra tác động của ocotillol lên tế bào thần kinh trung ương và tế bào hai lá (mitral cells-MC) trong thử nghiệm in vivo trên chuột chỉ ra rằng hoạt động kích thích của ocotillol trên MC được điều hòa bởi sự giải phóng glutamate tăng cường. Các thí nghiệm về hành vi đã chứng minh rằng ocotillol làm tăng các hoạt động vận động của chuột. Kết quả này cho thấy rằng sự hưng phấn của tế bào thần kinh do ocotillol gây ra là do tăng giải phóng glutamate, có thể là nguyên nhân làm tăng các hoạt động vận động cơ địa tự phát trong cơ thể sống [34].

Là một

loại ocotillol, thành viên chính của ginsenosides pseudoginsenosid - F11 làm tăng khả năng hưng phấn của tế bào tim chuột, và có tác dụng hữu ích đối với chứng suy giảm trí nhớ, ngộ độc thần kinh và sự phụ thuộc do morphin gây ra [4, 34], nhưng ở liều cao lại ức chế thần kinh [4]. 1.1.5.2. Tác dụng chống trầm cảm, giảm cămg thẳng, lo âu:

Nhân sâm Việt Nam có tác dụng trong việc chống trầm cảm [4]. Bằng thí nghiệm kiểm tra bơi trong nước lạnh để đo khả năng chịu căng thẳng sinh lý và tâm lý của những loài động vật gặm nhấm. Những kết quả này đã chứng minh rằng sâm Việt Nam có các đặc tính chống mệt mỏi và chống trầm cảm. Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng nhân sâm tăng cường sức chịu đựng, thúc đẩy khả năng tồn tại trước thời tiết lạnh và mệt mỏi, và các tình trạng căng thẳng khác. Vì vậy, những phát hiện của thử nghiệm bơi trong nước lạnh cho thấy rõ ràng rằng sâm Việt Nam có thể cải thiện sức chịu đựng sinh lý và có tác dụng chống trầm cảm [18].

Cũng trong một thử nghiệm khác được thực hiện trên chuột nghiên cứu về tác dụng của nhân sâm Việt Nam (VG) và saponin chính của nó, Majonosid-R2 (M-R2), đối với các phản ứng hành vi và sinh lý bệnh gây ra bởi căng thẳng tâm lý. Đặc điểm của phương pháp này là một con vật được tiếp xúc với căng thẳng về thể chất, chẳng hạn như bị giật điện ở chân và có thể gây ra căng thẳng tâm lý xã hội với đồng loại bằng cách sử dụng giao tiếp cảm xúc trong loài. Ngưỡng cảm thụ được ước tính bằng phương pháp kẹp đuôi. Kết quả cho thấy ở những con chuột bị căng thẳng về tâm lý, thành phần saponin M-R2 của sâm Việt Nam làm giảm đáng kể các rối loạn liên quan đến căng thẳng [35]. Các kết quả hiện tại đã chứng minh rằng hàm lượng saponin của sâm Việt Nam và M-R2, có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương lipid màng não do căng thẳng tâm lý ở chuột và tác dụng của M-R2 một phần được hỗ trợ bởi sự thúc đẩy các hệ thống GABAergic trong não [36]. Những phát hiện này cho thấy tác dụng chống trầm cảm của chiết xuất VG, và đặc biệt là M-R2, trong các rối loạn tâm thần do căng thẳng tâm lý gây ra [30].

Ngoài ra, trong sâm Việt Nam có chứa saponin ginsenosid-Rb1, Rg1 là một trong những thành phần tác động lên thần kinh, có hoạt tính giải lo âu được cho là có lợi vì nó không gây suy giảm vận động [17, 18]. 1.1.5.3. Tác dụng chống ung thư:

Tác dụng dược lý chống ung thư được nghiên cứu nhiều nhất của sâm Việt Nam là cả tác dụng phòng ngừa ung thư và hóa trị liệu ung thư tương quan với các ginsenosids ocotillol [30].

Theo báo cáo của Yamasaki, chiết xuất của SVN thô và các thành phần saponin chính của nó (M-R2, G-Rb1, G-Re, G-Rg1…) đã cho thấy tác dụng ức chế sự hoạt hóa kháng nguyên của virus Epstein-Barr (EBVEA) gây ra bởi độc tố gây ung thư 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) và fumonisin B1 mà không có độc tính trên tế bào bình thường [30, 35]. Đáng chú ý Majonosid-R2 (M-R2), một saponin loại ocotillol, là thành phần chính từ thân rễ và rễ của cây Panax vietnamensis có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. M-R2 thể hiện ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt động thúc đẩy kháng u trên mô hình sinh ung thư hai nhánh của khối u gan chuột. Hơn nữa, M-R2 cũng thể hiện khả năng ức chế đáng chú ý trên mô hình sinh ung thư hai nhánh của da chuột gây ra bởi chất cho nitric oxide / 12-O- tetradecanoylphorbol-13-acetate hoặc peroxynitrite / TPA. Tác dụng ức chế của M-R2 đối với kháng nguyên sớm của virus Epstein-Barr gây ra bởi phorbol acetate thúc đẩy khối u cũng được đánh giá bởi Kazuo. Bằng chứng về khả năng ổn định của saponin loại ocotillol không có gốc glycosyl ở C-20 trong quá trình hấp được phát triển và kết quả cho thấy có sự gia tăng liên tục hoạt động loại bỏ gốc trong 20 giờ hấp; hoạt động chống tăng sinh chống lại tế bào ung thư phổi A549 cũng được cải thiện. [24]. Cũng trong một nghiên cứu khác trên mô hình in vivo, và xét nghiệm chất sinh ung thư hai giai đoạn trên da chuột bằng cách sử dụng 7,12- dimethylbenz/a/anthracene (DMBA)/12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) và DMBA/fumonisin B1, nitric oxide (NO) hoặc peroxynitrite và quá trình sinh ung thư gan ở chuột bằng cách sử dụng N-nitrosodiethylamin (DEN) như một chất khơi mào và phenobarbital (PB) như một chất thúc đẩy. Từ kết quả xét nghiệm chất sinh ung thư trong hai giai đoạn này, người ta kết luận rằng Majonosid-R2 ức chế

cả giai đoạn khởi đầu và thúc đẩy trên quá trình hình thành ung thư hai giai đoạn và nó có thể có giá trị như một tác nhân ngăn ngừa hóa học trong quá trình sinh ung thư hóa học [23]. 1.1.5.4. Tác dụng bảo vệ gan:

Một trong những tác dụng khác của sâm Việt Nam và thành phần của

nó là tác dụng bảo vệ gan.

Năm 2000 Nguyen và các cộng sự nhận thấy rằng chiết xuất saponin của VG đã ngăn chặn phần nào độc tính trên gan do CCl4 gây ra ở chuột, và Panax vietnamensis có thể được sử dụng như một chất bảo vệ gan mạnh [26, 30]. Cũng trong một nghiên cứu khác, bằng cách chiết xuất methanol của nhân sâm Việt Nam được phát hiện có tác dụng bảo vệ tế bào gan đối với D-galactosamine (D-GalN) / yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α) gây chết tế bào ở tế bào gan chuột nuôi cấy sơ cấp và chứng minh thêm rằng tác dụng bảo vệ tế bào gan của VG là do sự hiện diện của saponin triterpene loại dammarane có chuỗi bên là ocotillol [29].

Trong các nghiên cứu sâu hơn, M-R2 cho thấy hoạt tính bảo vệ mạnh mẽ chống lại sự chết tế bào do D-GalN / TNF-α gây ra ở tế bào gan chuột được nuôi cấy, đóng vai trò quan trọng đối với tổn thương gan, cùng với việc cải thiện khả năng tồn tại của tế bào gan [29]. Tổng hợp lại, có thể kết luận rằng M-R2 cho thấy hoạt động bảo vệ gan thông qua cả việc ức chế sản xuất TNF-α bởi các đại thực bào được hoạt hóa và ức chế trực tiếp quá trình chết tế bào do TNF-α gây ra [30]. 1.1.5.5. Tác dụng chống viêm:

tế bào chống lại các đại thực bào

Gần đây, một số hợp chất được phân lập từ Panax vietnamensis được phát hiện có hiệu quả chống lại các phản ứng viêm. Trong một nghiên cứu, vina-ginsenosid-R2 (V-R2) và Majonosid-R2 (M-R2) được phân lập từ Panax vietnamensis đã được sàng lọc về khả năng chống viêm và các chất chuyển hóa của chúng trong mô hình đại thực bào phúc mạc của chuột được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) và kết quả cho thấy V-R2 thể hiện độc tính trong phúc mạc. M-R2, pseudoginsenosid RT4 (PRT4), và ocotillol ức chế hoạt hóa yếu tố phiên mã do LPS (NF) -κB kích thích, và biểu hiện của yếu tố hoại tử khối u cytokine

tiền viêm-α (TNF-α) và interleukin (IL) -1. Ba ginsenoside này cũng ức chế cyclooxygenase-2 kích thích LPS và biểu hiện tổng hợp NO có thể chỉ định, và phosphoryl hóa các phân tử tín hiệu NF-κB IL-1 thu được kinase1 và yếu tố tăng trưởng khối u-β-kinase 1 được kích hoạt trong đại thực bào phúc mạc [22, 24]. Những phát hiện này cho thấy V-R2 và M-R2 của sâm Việt Nam dùng đường uống có thể được chuyển hóa thành ocotillol qua PRT4, do đó có thể cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức chế sự gắn kết của LPS với TLR4, là một thụ thể nhận dạng mẫu đáp ứng với LPS trên các đại thực bào [22]. 1.1.5.6. Tác dụng tăng sinh lực:

Sâm Việt Nam có tác dụng tăng lực trong thí nghiệm chuột bơi, làm tăng sinh lực chống lại sực mệt mỏi, giúp phục hồi sức lực [4]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành phần nhân sâm và chiết xuất của chúng có thể làm tăng hoạt động vận động. Những con chuột được điều trị sâu bằng chiết xuất Panax vietnamensis cho thấy khoảng cách di chuyển và thời gian di chuyển tăng lên so với nhóm đối chứng [18]. Ginsenosid-Rb1 giúp tăng cường sức mạnh cơ bắp và tăng hoạt động vận động cơ tự phát ở chuột. Cơ chế cơ bản có thể liên quan đến sự gia tăng hàm lượng ATP và tăng cường hoạt động của các enzym chuyển hóa năng lượng như Na+-K+-ATPase và SDH (Succinate dehydrogenase) trong cơ xương của chuột [27]. 1.1.5.7. Tác dụng phục hồi máu:

Trong thí nghiệm làm giảm hồng cầu và bạch cầu ở động vật thí nghiệm, sâm Việt Nam có tác dụng làm phục hồi số lượng hồng cầu và bạch cầu đã bị giảm [4]. 1.1.5.8. Các tác dụng dược lý khác:

+ Tác dụng chống oxy hóa: Trong một nghiên cứu, M-R2 được chiết xuất từ sâm Việt Nam cho thấy tác dụng bảo vệ tế bào H9C2 chống lại tình trạng thiếu oxy/tổn thương tái oxy hóa thông qua điều chỉnh chức năng ty thể [28]. Trong một thí nghiệm in vitro ở chuột, saponin trong sâm Việt Nam ở nồng độ 0,05 - 0,5 mg/kg có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA (malonyl chaldehyd) là sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng sinh học [4].

+ Tác dụng kích thích miễn dịch:

Trong một thí nghiệm được thực hiện trên chuột trắng, dùng liều Escherichia coli gây chết chuột nhắt trắng.nhưng khi kết hợp dùng sâm và M-R2 với liều uống 500 mg/kg sẽ làm tăng tỷ lệ số chuột sống sót. Cũng với liều này khi được tiêm trong màng bụng trong chuột nhắt trắng có tác dụng làm tăng chỉ số thực bào trong thí nghiệm in vitro và in vivo [4].

+ Tác dụng chống tạo hắc tố Melanin: Trong một nghiên cứu của Vu Huynh Kim Long và các cộng sự, trong một thí nghiệm thực nghiệm chống tạo hắc tố melanin trên tế bào u ác tính của chuột, kết quả thu được 5 loại ocotillol (OCT) saponin là: majonosid-R2, vina-ginsenosid-R2, majonosid-R1, pseudoginsenosid RT4, vina-ginsenosid- R11 ức chế sản xuất melanin trong các tế bào u ác tính, mà không cho thấy bất kỳ độc tính tế bào nào. Đáng chú ý, M-R2 là thành phần saponin chính làm giảm sản xuất melanin nhiều nhất. Bên cạnh đó trong VG notoginsenosid-R1, saponin loại PPT cũng hiển thị hoạt động chống tạo hắc tố chống lại các tế bào u ác tính. Các hợp chất còn lại gồm ba saponin loại PPD (ginsenosid-Rd, ginsenosid-Rb1, và ginsenosid-Rg3) và saponin loại PPT (ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Re và ginsenosid-Rh1) cũng ức chế việc sản xuất melanin đã được báo cáo trước đây [33].

Ngoài ra, Panaxynol là thành phần chính của tinh dầu được phân lập từ sâm Việt Nam được cho là có lợi cho việc ngăn ngừa tổn thương thận do thuốc chống ung thư Cisplatin gây ra trên cả in vitro và in vivo [26]. Bên cạnh những tác dụng trên, sâm Việt Nam còn có tác dụng ác dụng tăng cường nội tiết tố sinh dục, chống phóng xạ, hiệp lực với thuốc hạ đường huyết, hạ cholesterol, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu [4, 15]. Các tác dụng trên đã được kiểm chứng trên lâm sàng [15].

1.1.6. Công dụng

Nhân sâm Việt Nam, Panax vietnamensis Ha et Grushv được sử dụng như một loại thuốc bổ và thực phẩm chữa bệnh trong y học dân gian cổ truyền vì nó có những lợi ích sức khỏe tuyệt vời [24].

Theo y học cổ truyền, sâm Việt Nam có tính vị: khổ, cam; quy kinh vào: hai kinh phổ và tỳ. Với công năng bổ khí, bổ phế. Chủ trị: cơ thể suy nhược, phế hư viêm họng, đau họng [3].

Sâm Việt Nam thường được sử dụng phối hợp với các vị thuốc bổ khí hoặc bổ huyết khác trong một thang thuốc hay một dạng bào chế. Thân rễ và rễ củ của sâm Việt Nam được dùng làm thuốc bổ toàn thân, tăng lực, chữa suy nhược, mệt mỏi, chống xơ vữa động mạch, giải độc và bảo vệ gan, lại có thể dùng làm thuốc trị viêm họng và hen phế quản mạn tính, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, giảm đường huyết [3, 15].

1.1.7. Nguồn dược liệu thay thế

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là cây thuốc có giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao. Loài sâm này được đánh giá có thành phần ginsenosides nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng minh loài sâm này có giá trị cao về mặt dược liệu với những tác dụng như: bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, phòng chống ung thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận..., và các nhà khoa học đã xếp sâm Việt Nam vào nhóm sâm quý của thế giới cùng với nhân sâm Triều Tiên, sâm Mỹ và sâm Tam thất [16].

Loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này thuộc danh mục sách đỏ cần được bảo tồn, mặc dù nhà nước đã có chủ trương bảo vệ nguồn cây thuốc quý này nhưng nguồn sâm tự nhiên vẫn bị khai thác lén lút, trái phép một cách nghiêm trọng, ảnh hưởng đến nguồn gen quý, có thể dẫn đến cạn kiệt, đồng thời tạo áp lực cho ngành dược liệu nước ta hiện nay. Hơn nữa, việc sử dụng các hợp chất từ sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì nguồn cung cấp cây Panax vietnamensis chỉ giới hạn ở vùng núi Ngọc Linh, và việc trồng trọt phải mất nhiều thời gian, thường từ 5–7 năm trước khi thu hoạch thân rễ và rễ vì thế sâm Việt Nam khó nuôi trồng và nhân rộng [8, 21].

Đứng trước những thực trạng đó, tìm một nguồn dược liệu thay thế là một biện pháp cấp thiết, việc cây sâm cấy mô là phương pháp được kỳ vọng sẽ mở ra hướng nghiên cứu giàu tính khoa học và thực tiễn. Nhân giống từ nuôi cấy mô sẽ đem lại tỷ lệ nhân giống cao, giảm chi phí đầu tư so với nhân giống theo kiểu truyền thống, góp phần bảo tồn loại Sâm quý này trong tự

nhiên và cung cấp một nguồn dược liệu dồi dào với chất lượng tốt đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Một số phương pháp nuôi cấy mô như [14]: - Nuôi cấy mô phôi vô tính (somatic embryo) Là kỹ thuật lần đầu được xây dựng nên có tính mới cao. Loại mô này ít nhiều ở trạng thái biệt hóa nên hàm chứa lượng hoạt chất cao hơn so với hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù (cell suspension), có thể nuôi thu hợp chất thứ cấp ở mức chấp nhận được mà không cần qua xử lý elicitor đặc trưng; có thể sử dụng trong sản xuất sinh khối nhằm thu hoạt chất, ăn tươi trực tiếp (do không dùng chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp) và nhân giống vô tính – cây từ phôi vô tính tương tự cây gieo từ hạt nên dễ dàng tạo vi củ (microrhizome) trong điều kiện in vitro và thuận lợi trong tạo củ khi cây được trồng ở ngoài đất.

- Nuôi cấy rễ bất định (adventitious root) Là hệ thống nuôi cấy rễ bất định, hệ thống mô phỏng việc thu sinh khối rễ từ cây trồng trong điều kiện tự nhiên – nơi tích tụ nhiều hợp chất thứ cấp, được thực hiện để nhân sinh khối dùng chiết xuất hợp chất thứ cấp. Hiện loại mô này đang được nghiên cứu nuôi cấy trong môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp nhằm tăng phổ ứng dụng sản xuất.

- Nuôi cấy rễ tóc (hairy root) Điểm đặc biệt là có thể nhân sinh khối quy mô lớn loại mô này trong môi trường không bổ sung tác nhân kích thích sinh trưởng tổng hợp nhằm tạo sản phẩm “sạch” dư lượng chất điều hòa sinh trưởng (dùng chiết xuất hợp chất thứ cấp). Thực tế cho thấy rễ tóc là hệ thống nuôi cấy sản sinh nhiều hoạt chất nhất so với hai hệ thống nuôi trên. Bên cạnh đó rễ tóc tổng hợp saponin cũng tương tự như ở rễ sâm ngoài tự nhiên và gấp đôi so với rễ nuôi cấy thông thường. Việc nuôi cấy rễ tóc như vậy cho thấy những đặc điểm đầy hứa hẹn để tiếp tục sản xuất sinh khối bằng công nghệ sinh học với hàm lượng ginsenosids cao [14, 21]. Phương pháp nuôi cấy rễ tóc được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý hiếm này, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn, và phân lập các thành phần hoạt tính.

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy

Mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu của khóa luận được cung cấp bởi PGS TS Lê Hùng Lĩnh, Bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội tháng 12 năm 2021. Mẫu nghiên cứu được sơ chế bảo quản trong túi bọc kín, tránh ẩm và nhiệt độ 4oC. Mẫu tiêu bản của mẫu nghiên cứu được lưu giữ tại Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA.

Hình 2.1. Mẫu dƣợc liệu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam đƣợc sử

dụng trong nghiên cứu

2.1.2. Chất chuẩn

Các mẫu chất chuẩn Majonosid R2 (M-R2), Ginsenosid Rb1 (G-Rb1), Ginsenosid Rg1 (G-Rg1) và Ginsenosid Rd (G-Rd) là các chất tinh khiết đạt chuẩn phòng thí nghiệm được cung cấp bởi Viện dược liệu. Các mẫu chất chuẩn có độ tinh khiết không thấp hơn 95% theo HPLC.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ

+ Thiết bị:  Tủ sấy Memmert (Memmert, Đức), tủ hút  Máy siêu âm Power Sonic 405 (Hàn Quốc)  Máy ly tâm Dlab DM0412S (Mỹ)

 Máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI, Thụy Sĩ)  Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa-Thụy Sĩ).  Màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm.  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 Infinity LC (Agilent Tech, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.

Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI)

+ Dụng cụ: bình nón, cốc có mỏ, phễu lọc, ống đong, pipet chính xác,

bình định mức, lọ đựng mẫu thủy tinh 20 ml, lọ vial đựng mẫu chạy HPLC.

+ Thiết bị và dụng cụ được sử dụng tại phòng thí nghiệm bộ môn Hóa

dược, Trường Đại học PHENIKAA. 2.1.3.2. Hóa chất

- Các dung môi dùng để chiết xuất cao từ mẫu rễ tóc của sâm: methanol (MeOH), n-butanol (n-BuOH) và nước cất hai lần đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết (PA).

- Dung môi chạy HPLC: acetonitril (Merck, Đức), nước cất hai lần

dùng cho phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Sâm Việt Nam chứa thành phần chính là saponin, trong thực nghiệm của đề tài này bước đầu đánh giá các saponin có trong mẫu rễ tóc được nuôi cấy, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin trong dược liệu để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam [3].

Phương pháp chiết mẫu: Mẫu rễ tóc được nuôi cấy của Sâm Việt Nam được chiết xuất bằng phương pháp ngâm với dung môi methanol. Tiến hành lọc loại bã dược liệu, gộp dịch lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng methanol. Cao khô này đem phân tán trong nước rồi lắc với dung môi butanol, cô dưới áp suất thấp ta thu được phân đoạn butanol.

Quy trình chiết mẫu: Cân 200 mg mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam (sâm Ngọc Linh) bằng cân phân tích, sau đó mẫu dược liệu được ngâm chiết kỹ bằng dung môi methanol (2 lần) với thể tích 4 ml, sử dụng thiết bị lắc siêu âm trong 1 giờ. Sau mỗi 30 phút siêu âm ta thu lấy dịch chiết, tiếp tục thêm lượng dung môi methanol như ban đầu và chiết (lần 2). Gộp các dịch chiết methanol vào cốc có mỏ, lọc qua giấy lọc, gom dịch chiết đã lọc vào bình cầu và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 50 oC bằng máy cất quay ta thu được cao chiết methanol.

Hòa tan cao chiết trong nước cất, rồi lắc với dung môi n-BuOH, sau đó

cô dưới áp suất thấp ta thu được phân đoạn n-BuOH (11.4 mg) tương ứng.

1, Chiết dung môi MeOH (2 lần x 4 ml x 30

phút/ lần bằng máy siêu âm) 2, Gom dịch chiết, lọc

3, Cất quay áp suất giảm

Mẫu rễ tóc nuôi cấy của SVN (200 mg)

Cao tổng methanol

1, Phân tán trong nước 2, n-butanol, lắc, gạn

3, Cất quay áp suất giảm

Cao BuOH (11.4 mg)

Hình 2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Butanol của mẫu rễ tóc SVN

Từ mẫu chuẩn nhận từ Viện dược liệu đã có sẵn nồng độ các chất

2.2.2. Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2.2.2.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn chuẩn lần lượt là: + G-Rd: 1,1 mg/ml + G-Rb1: 1,5 mg/ml + G-Rg1: 1,3 mg/ml + M-R2: 1,78 mg/ml Từ nồng độ các chất chuẩn ban đầu, dựa vào dược điển Việt Nam [3]: để thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ mỗi chuẩn lần lượt chính xác khoảng 0,1 mg/ml (G-Rd), 0,1 mg/ml (G-Rb1), 0,3 mg/ml (G-Rg1) và 0,5 mg/ml (M-R2) ta pha hỗn hợp chuẩn như sau: Từ nồng độ các chất chuẩn ban đầu ta lấy lượng vừa đủ các chất chuẩn lần lượt chính xác khoảng 20 ml chất chuẩn G-Rd, 15 ml chất chuẩn G-Rb1,

50 ml chất chuẩn G-Rg1, 60 ml chất chuẩn M-R2 cho vào bình định mức và thêm MeOH vừa đủ 200 ml. Ta thu được hỗn hợp dung dịch chuẩn có thể tích 200 ml dùng để chạy HPLC. 2.2.2.2. Chuẩn bị mẫu thử

Pha dung dịch mẫu thử: lấy lượng cao butanol (11,4 mg) của mẫu rễ tóc nuôi cấy của SVN cho vào bình định mức 10 ml, thêm 1 ml methanol, lắc siêu âm 10 phút để hòa tan, ta thu được dung dịch có nồng độ 11,4 mg/ml. Lắc đều, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm. 2.2.2.3. Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong nghiên cứu này, phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Infinity LC, Mỹ với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động.

+ Nguyên tắc của HPLC [2, 13]: Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao, pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân.

Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó.

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng detector. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic.

Quá trình sắc ký tốt thì hỗn hợp gồm nhiều thành phần sẽ có bấy nhiêu

pic riêng biệt được tách ra trên sắc ký đồ. + Lựa chọn điều kiện sắc ký: Tham khảo một số tài liệu [3, 31] và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký để đảm bảo điều kiện phân tích định tính các chất chuẩn và thành phần hóa học có trong mẫu thử là sâm Việt Nam. + Ứng dụng của phương pháp HPLC trong nghiên cứu này:

 Định tính: dựa vào thời gian lưu, hình dạng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.

 Xác định tạp: kiểm tra tạp chất trong mẫu thử trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.

 Định lượng: dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều

cao hoặc diện tích pic của nó. Với công thức tính:

: Nồng độ chất thử : Diện tích pic của mẫu thử Trong đó: Cchuẩn : Nồng độ chất chuẩn liên kết Schuẩn : Diện tích pic của mẫu chuẩn liên kết Cthử Sthử

Từ nồng độ của các chất có trong mẫu thử, định lượng được hàm lượng các chất có trong dược liệu dựa vào % các chất đó chiếm trong mẫu thử đã chiết và tỷ lệ giữa mẫu thử so với khối lượng dược liệu có trong thử nghiệm. Với công thức:

x x 100% % mchất =

Trong đó:

% mchất : Hàm lượng các chất có trong mẫu dược liệu Cchất thử : Nồng độ chất thử trong cao đã chiết Cmẫu thử : Nồng độ cao chiết để chạy HPLC mmẫu thử : Khối lượng cao đã chiết để chạy HPLC mdược liệu : Khối lượng dược liệu ban đầu trong thực nghiệm

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Phân tích các thành phần saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 3.1.1. Cài đặt chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích các thành phần saponin có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam.

Qua phân tích tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm [3, 31], nhóm nghiên cứu đã cài đặt chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau: - Hệ thống máy: Agilent 1260 Infinity LC, Mỹ - Detector: UV-DAD (G7115A) - Cột sắc ký: ZORBAX Eclipse XDB- C18 (Φ 4,6 x 250 mm; cỡ hạt 5 μm) - UV detection: 196 nm - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 oC - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL - Pha động: Acetonitril - nước

Hình 3.1. Hệ thống máy sắc kí lỏng cao áp Agilent 1260 Infinity LC

Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình rửa giải như bảng 3.1

Bảng 3.1. Chƣơng trình rửa giải pha động sắc ký lỏng hiệu năng cao [3]

0 - 11

11 - 25 25 - 35 35 - 40 40 - 60 60 - 61 61 - 71

Thời gian (phút)

21%

95%

21%

21– 32%

32- 40%

40- 95%

95- 21%

%Acetonitril (trong pha động)

3.1.2. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn

Phân tích HPLC các mẫu chuẩn theo chương trình đã cài đặt ở trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả của các mẫu chuẩn thu được được thể hiện dưới đây:

M-R2

- Kết quả phân tích của mẫu chuẩn M-R2:

Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn M-R2

+ Nhận xét: Trên sắc ký đồ nhận thấy có tín hiệu của M-R2 ở khoảng thời gian 18.218 phút, từ đó xác định được thời gian lưu của mẫu chuẩn M-R2 là 18.218 phút (do M-R2 hấp thụ UV kém nên bắt tín hiệu thấp).

- Kết quả phân tích của mẫu chuẩn G-Rb1:

Hình 3.3. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rb1

+ Nhận xét: Trên sắc ký đồ nhận thấy xuất hiện 1 pic lớn cân đối, sắc nét ở khoảng thời gian 31.695 phút, dựa vào đó xác định được thời gian lưu của mẫu chuẩn G-Rb1 là 31.695 phút.

- Kết quả phân tích của mẫu chuẩn G-Rd:

Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rd

+ Nhận xét: Trên sắc ký đồ nhận thấy xuất hiện 1 pic lớn cân đối, sắc nét ở khoảng thời gian 36.342 phút, từ đó xác định được thời gian lưu của mẫu chuẩn G-Rd là 36.342 phút.

- Kết quả phân tích của mẫu chuẩn G-Rg1:

Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rg1

+ Nhận xét: Trên sắc ký đồ nhận thấy xuất hiện 1 pic lớn cân đối, sắc nét ở khoảng thời gian 16.615 phút, từ đó xác định được thời gian lưu của mẫu chuẩn G-Rg1 là 16.615 phút.

Từ kết quả phân tích và thời gian lưu của từng mẫu chuẩn đã xây dựng ở trên, ta thu được kết quả sắc ký đồ của hỗn hợp các mẫu chuẩn. Kết quả được thể hiện trong hình 3.6 dưới đây.

Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp các mẫu chuẩn

+ Nhận xét: Sau khi áp dụng chương trình HPLC đã cài đặt để chạy các mẫu chất chuẩn, thu được các sắc ký đồ của các mẫu chuẩn G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 có độ cân đối, rõ nét, đẹp. Tuy nhiên tín hiệu trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn M-R2 lại thấp do trong cấu trúc của M-R2 không có nối đôi nên bắt tín hiệu UV kém. Ngoài ra ở khoảng thời gian đầu của quá trình chạy sắc ký HPLC thấy có xuất hiện 1 số pic và dự đoán đó có thể là tạp của mẫu chuẩn.

Thời gian lưu mẫu tương ứng với các pic của các mẫu chuẩn G-Rg1 với tR= 16.528 phút, M-R2 với tR= 18.261 phút, G-Rb1 với tR= 31.514 phút và G-Rd với tR = 36.212 phút.

Và diện tích pic (mAU*s) của các mẫu chuẩn lần lượt là: G-Rg1 với Speak= 5007.2, M-R2 với Speak= 213.3, G-Rb1 với Speak= 1042.4 và G-Rd với Speak= 947.

3.1.3. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam.

Từ kết quả thời gian lưu của các mẫu chuẩn được đo ở mục 3.2.2, trên sắc ký đồ của mẫu cao của rễ tóc nuôi cấy ở phân đoạn n-Butanol xuất hiện các pic có thông số thời gian lưu mẫu tương ứng với các pic của các mẫu chuẩn G-Rg1 với tR= 16.723 phút, G-Rb1 với tR= 31.399 phút và G-Rd với tR = 36.059 phút.

Từ đó có thể kết luận sơ bộ trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam có chứa các chất G-Rg1, G-Rb1 và G-Rd. Không thấy hoặc xuất hiện tín hiệu yếu của chất M-R2 có trong mẫu thử nghiệm.

Và diện tích pic (mAU*s) của các mẫu thử lần lượt là G-Rg1 với

Speak= 4429.1, M-R2 với Speak= 0 (không có tín hiệu pic của M-R2), G-Rb1 với Speak=1040.4 và G-Rd với Speak= 656.2.

Hình 3.7. Sắc ký đồ các chất của mẫu rễ tóc nghiên cứu trong phân đoạn

Butanol

3.1.4. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam.

Áp dụng chương trình phân tích HPLC đã cài đặt ở trên và tiến hành với chất chuẩn liên kết để phân tích định lượng sơ bộ hàm lượng các saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam.

Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn:

Bảng 3.2. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn

Chất chuẩn G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd

0.325 0.534 0.1125 0.11 Cchuẩn (mg/ml)

5007.2 213.3 1042.4 947 Speak chuẩn

Nguyên tắc định lượng một chất trong HPLC dựa trên nồng độ của chất

đó tỷ lệ với diện tích pic của nó. Từ đó có công thức:

Trong đó:

Cchuẩn: Nồng độ chất chuẩn liên kết Schuẩn: Diện tích pic của mẫu chuẩn liên kết Cthử Sthử

: Nồng độ chất thử : Diện tích pic của mẫu thử Từ kết quả diện tích pic thu được khi chạy máy HPLC của mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm Việt Nam, dựa vào công thức trên ta tính được nồng độ các chất có trong mẫu thử cao chiết ở phân đoạn n-BuOH.

Bảng 3.3. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu thử

Chất thử G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd

4429.1 0 1040.4 656.2 Speak thử

0.2875 0 0.1123 0.076 Cthử (mg/ml)

Từ nồng độ của các chất có trong mẫu thử, định lượng được hàm lượng các chất có trong dược liệu dựa vào % các chất đó chiếm trong mẫu thử của

cao chiết ở phân đoạn n-BuOH và tỷ lệ giữa cao chiết phân đoạn butanol với khối lượng dược liệu có trong thử nghiệm.

Ta có công thức:

x x 100% % mchất =

Trong đó:

% mchất : Hàm lượng các chất có trong mẫu dược liệu Cthử : Nồng độ chất thử trong cao ở phân đoạn n-BuOH Ccao n-BuOH : Nồng độ cao chiết ở phân đoạn Butanol; Ccao n-BuOH = 11.4 mg/ml mcao n-BuOH : Khối lượng cao chiết ở phân đoạn Butanol; mcao n-BuOH = 11.4 mg mdược liệu : Khối lượng dược liệu ban đầu; mdược liệu = 200 mg

Từ công thức trên ta tính được hàm lượng mỗi chất có trong mẫu rễ tóc

nuôi cấy của Sâm Việt Nam.

Bảng 3.4. Kết quả định lƣợng hàm lƣợng các chất có trong mẫu dƣợc liệu

Chất G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd

Hàm lượng (%) 0.144 0 0.056 0.038

Như vậy, bước đầu định lượng được sơ bộ hàm lượng của một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Trong mẫu rễ tóc nuôi cấy hàm lượng các chất lần lượt là: + G-Rg1: 0.144% + G-Rb1: 0.056% + G-Rd: 0.038%

3.2. Bàn luận 3.2.1. Phương pháp định tính một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC Sâm Việt Nam là một loài thảo dược quý hiếm, mang lại giá trị kinh tế cao và có tiềm năng vô cùng to lớn trong y dược học hiện đại. Nhưng hiện nay loại sâm này cần được bảo tồn do việc khai thác quá mức có thể dẫn đến cạn kiệt, đồng thời ảnh hưởng đến ngành dược liệu nước ta. Hơn nữa, việc sử dụng các hợp chất từ sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì nguồn cung cấp cây Panax vietnamensis chỉ giới hạn ở vùng núi Ngọc Linh, và việc trồng trọt phải mất nhiều thời gian, thường từ 5–7 năm trước khi thu hoạch thân rễ và rễ vì thế sâm Việt Nam khó nuôi trồng và nhân rộng.

Do đó việc nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam đem lại ý nghĩa khoa học, giá trị thực tiễn cao và có tiềm năng lớn trong việc thay thế nguồn cung sâm Việt Nam trong tương lai. Sắc ký là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để tách, định tính, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường…Trong đó, HPLC được ứng dụng phổ biến nhất vì nhiều lý do như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp để tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [11].

Một số saponin chính được phân tích định tính trong mẫu rễ tóc nuôi

cấy bằng phương pháp HPLC đã cài đặt ở trên cho thấy 3 saponin G-Rb1, G-Rd, G-Rg1 có sắc ký đồ sắc nét, cân đối. Như vậy phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu cao.

Majonosid-R2 là một trong những saponin chính của SVN thuộc nhóm ocotillol, có hàm lượng khoảng 5% tính theo khối lượng khô, mang lại tác dụng chính cho loài sâm này, tuy nhiên hợp chất này không đáp ứng tốt khi phát hiện bằng đầu dò DAD do trong cấu trúc nhóm M-R2 không có nối đôi và không có nhóm mang màu nên hấp thụ UV ở bước sóng rất thấp. Do đó nhóm nghiên cứu đề xuất phân tích M-R2 bằng những phương pháp khác, ví dụ như LC-MS/MS. Đây là phương pháp phân tích hiện đại có độ nhạy và độ

đặc hiệu cao hơn, góp phần hoàn thiện cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam.

3.2.2. Phương pháp định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC

Bằng việc sử dụng máy HPLC với thông số đã cài đặt ở trên, phương pháp đã định lượng sơ bộ được hàm lượng 3 saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam với hàm lượng các chất lần lượt là:

+ G-Rg1: 0.144% + G-Rb1: 0.056% + G-Rd: 0.038% So với hàm lượng các chất này có trong sâm Việt Nam tự nhiên mọc tại

núi Ngọc Linh là:

+ G-Rg1: 1.37% + G-Rb1: 2.0% + G-Rd: 0.87% Như vậy, nhận thấy hàm lượng 3 saponin chính trong mẫu rễ tóc được nuôi cấy từ sâm Việt Nam có hàm lượng ít hơn so với loại sâm này trong tự nhiên. Mặc dù vậy, phương pháp nuôi cấy này đã cho thấy đây là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý hiếm này, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch trong thời gian ngắn.

Phương pháp nuôi cấy rễ tóc này chắc chắn có thể thay thế nguồn dược liệu từ sâm Việt Nam trong tương lai, và được bổ sung trong các loại thực phẩm chức năng, thực phẩm chức năng dưới dạng chiết xuất hoặc sản phẩm dạng viên nang để sử dụng như một loại thuốc bổ quý với giá thành thấp hơn so với các sản phẩm được chiết từ sâm ngoài tự nhiên.

3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu Nghiên cứu của đề tài mới chỉ là bước đầu định lượng sơ bộ một số saponin có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của SVN trên một mẫu nghiên cứu của mẫu rễ tóc nuôi cấy nên kết quả mang tính chất tham khảo, cần thực hiện phân tích định lượng nhiều lần và trên các mẫu tương tự để kết luận chính xác hàm lượng các chất có trong mẫu nghiên cứu rễ tóc nuôi cấy của SVN.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận:

Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra,

kết quả thu được như sau:

- Đề tài đã định tính được các thành phần saponin chính trong mẫu rễ

tóc được nuôi cấy của sâm Việt Nam.

- Đề tài đã định lượng sơ bộ được hàm lượng các saponin chính có

trong mẫu rễ tóc nuôi cấy từ sâm Việt Nam.

- Những kết quả của đề tài bước đầu đã xác định các thành phần hoá học có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam từ đó góp phần tạo tiền đề để nghiên cứu đầy đủ hơn về thành phần saponin của mẫu rễ tóc nuôi cấy này trong phòng thí nghiệm. Về định hướng lâu dài, bên cạnh saponin, việc ứng dụng các kỹ thuật sắc ký sẽ cho phép định tính, định lượng đồng thời nhiều loại hợp chất khác có trong mẫu rễ tóc được nuôi cấy.

- Đề tài nghiên cứu này đã cho thấy phương pháp nuôi cấy rễ tóc là phương pháp đầy tiềm năng có thể là nguồn cung thay thế nguồn dược liệu từ Sâm Việt Nam trong tương lai.

Kiến nghị:

Từ những kết quả thu được, nghiên cứu sẽ tiếp tục được phát triển theo

hướng: - Khảo sát đầy đủ các yếu tố nhằm tối ưu hóa quy trình phân tích các saponin chính trong mẫu rễ tóc SVN bằng HPLC.

- Tiến tới xây dựng quy trình định lượng tiếp các saponin chính trong

mẫu rễ tóc bằng HPLC.

- Tiếp tục phân tích những hợp chất khác trong mẫu rễ tóc được nuôi

cấy của sâm Việt Nam.

- Nghiên cứu, đánh giá môi trường nuôi cầy phù hợp hơn để tăng hàm

lượng các saponin có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam.

- Đánh giá tác dụng sinh học của các saponin chính trong mẫu rễ tóc nhằm tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng dược liệu này để điều trị bệnh và chăm sóc sức khỏe.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ Việt Nam, Phần II. Thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.

Bộ môn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, Trường ĐH Dược Hà Nội.

Bộ Y tế (2006), Dược điển Việt Nam V Tập 2, NXB Y học.

Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật.

Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.

Giới thiệu về Sâm Ngọc Linh, Cổng thông tin điện tử huyện Nam Trà My, truy cập ngày, tại trang web http://namtramy.gov.vn/default.aspx?tabid=138.

liệu Bộ môn Dược (2016), Thực trạng nghiên cứu phát triển dược liệu ở nước ta và trên thế giới, Trường ĐH Dược Hà Nội.

Nguyễn Thị Nhật Linh (2017), Nghiên cứu nuôi rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự tích lũy saponin Trường ĐH Khoa Học - ĐH Huế.

Nguyễn Thượng Dong (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm, NXB Khoa học và kỹ thuật.

10.

Phạm Duy Linh (2012), Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) đã bảo quản, Trường ĐH Nông lâm TPHCM.

11.

Phụng Nguyễn Kim Phi (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.

12.

Sâm ngọc linh thảo dược đặc biệt quý hiếm, điều trị nhiều loại bệnh (2016), Trung tâm cây thuốc quý Hòa Bình, truy cập ngày, tại trang web https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html.

13.

Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế.

14.

TS. Nguyễn Hữu Hổ Nuôi nhân mô phôi vô tính, rễ bất định và rễ tơ sâm Ngọc Linh bằng hệ thống bioreactor, Viện Hàn Lâm và Công Nghệ Việt Nam, truy cập ngày, tại trang web https://vast.gov.vn/tin-chi-tiet/-/chi- tiet/nuoi-nhan-mo-phoi-vo-tinh-re-bat-%C4%91inh-va-re-to-sam-ngoc-linh- bang-he-thong-bioreactor-4011-435.html.

A. Tài liệu Tiếng Việt 1.

15. Viện Dược Liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học và

Kĩ thuật.

16. Vũ Thị Hiền và các cộng sự (2015), "Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro", Tạp chí Khoa học và Phát triển.

18.

in mice: characterization of

dela Peña Irene Joy I và các cộng sự. (2017), "The psychopharmacological activities of Vietnamese ginseng its psychomotor, sedative–hypnotic, antistress, anxiolytic, and cognitive effects". 41(2), tr. 201-208.

19. Duc Nguyen Minh và các cộng sự. (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis HA et Grushv. Collected in central Vietnam. II". 42(1), tr. 115-122.

20. Duc Nguyen Minh và các cộng sự. (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. collected in central Vietnam. I". 41(11), tr. 2010-2014.

21. Ha Loan Thi và các cộng sự. (2016), "Hairy root cultures of Panax vietnamensis, a promising approach for the production of ocotillol-type ginsenosides". 126(1), tr. 93-103.

22.

Jeong Jin-Ju và các cộng sự. (2015), "Anti-inflammatory effects of vina- ginsenoside R2 and majonoside R2 isolated from Panax vietnamensis and their metabolites in lipopolysaccharide-stimulated macrophages". 28(1), tr. 700-706.

23. Konoshima Takao và các cộng sự. (1999), "Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis". 147(1-2), tr. 11-16.

24.

review". 13(10),

systematic

research-a

further

for

Le Quang-Ung và các cộng sự. (2018), "Phytoconstituents and biological activities of Panax vietnamensis (Vietnamese Ginseng): A precious ginseng tr. and call 1934578X1801301036.

25. Medicine National Library of Compound Summary, truy cập ngày, tại trang

web https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.

B. Tài liệu Tiếng Anh 17. Carr Mellisa N, Bekku Naoko và Yoshimura Hiroyuki (2006), "Identification of anxiolytic ingredients in ginseng root using the elevated plus-maze test in mice". 531(1-3), tr. 160-165.

26. Nguyen TD và các cộng sự. (2000), "Panax vietnamensis protects mice against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity without any modification of CYP2E1 gene expression". 66(08), tr. 714-719.

27.

Tan Shan-Jun và các cộng sự. (2014), "Ginsenoside Rb1 improves energy metabolism in the skeletal muscle of an animal model of postoperative fatigue syndrome". 191(2), tr. 344-349.

28.

Thu Vu Thi và các cộng sự. (2021), "Majonoside-R2 extracted from Vietnamese ginseng protects H9C2 cells against hypoxia/reoxygenation injury via modulating mitochondrial function and biogenesis". 36, tr. 127814.

29.

Tran Quan Le và các cộng sự. (2001), "Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng (Panax v ietnamensis) and Their Hepatocytoprotective Activity". 64(4), tr. 456-461.

30.

Tung Nguyen Huu (2019), "Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha and Grushv.): Phylogenetic, Phytochemical, and Pharmacological Profiles". 13(26).

31.

Tung Nguyen Huu và các cộng sự. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus". 59(11), tr. 1417-1420.

32. Van Le Thi Hong và các cộng sự. (2015), "Ginseng saponins in different

parts of Panax vietnamensis". 63(11), tr. 950-954.

33. Vu-Huynh Kim Long và các cộng sự. (2020), "Accumulation of saponins in underground parts of Panax vietnamensis at different ages analyzed by HPLC-UV/ELSD". 25(13), tr. 3086.

34. Wang Z-J và các cộng sự. (2011), "Ginseng derivative ocotillol enhances neuronal activity through increased glutamate release: a possible mechanism underlying increased spontaneous locomotor activity of mice". 195, tr. 1-8.

35. Yamasaki Kazuo (2000), "Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax

vietnamensis". 38(sup1), tr. 16-24.

36. Yobimoto Kaori và các cộng sự. (2000), "Suppressive effects of Vietnamese ginseng saponin and its major component majonoside-R2 on psychological stress-induced enhancement of lipid peroxidation in the mouse brain". 66(3), tr. 661-665.

PHỤ LỤC 1

=============================================================================== Fraction Information =============================================================================== No Fractions found. =============================================================================== =============================================================================== ===================================================================== Area Percent Report ===================================================================== Sorted By : Signal Multiplier : 1.0000 Dilution : 1.0000 Use Multiplier & Dilution Factor with ISTDs

Kết quả đo HPLC của mẫu chuẩn ===================================================================== Acq. Operator : SYSTEM Seq. Line : 4 Sample Operator : SYSTEM Acq. Instrument : HPLC Phenikaa Location : P2-B-04 Injection Date : 5/20/2022 6:16:18 PM Inj : 1 Inj Volume : 20.000 µl Acq. Method : G:\Phenikaa\Hieu\Data\SNH_20-05-2022\Gac 250221\DDVN_Sam VN method_Shimadzu .M Last changed : 5/20/2022 5:02:03 PM by SYSTEM Analysis Method : G:\Phenikaa\Hieu\Data\SNH_20-05-2022\Gac 250221\DDVN_Sam VN method_Shimadzu .M (Sequence Method) Last changed : 5/27/2022 2:06:40 PM by SYSTEM (modified after loading) Sample Info : Rd-0.11+ Rb1-0.1125+ Rg1-0.325+ MR2-0.534

PHỤ LỤC 2

Kết quả đo HPLC của mẫu thử (trong cao chiết phân đoạn n-BuOH) Acq. Operator : SYSTEM Seq. Line : 1 Sample Operator : SYSTEM Acq. Instrument : HPLC Phenikaa Location : P2-A-01 Injection Date : 5/26/2022 2:07:33 PM Inj : 1 Inj Volume : 20.000 µl Acq. Method : G:\Phenikaa\Hieu\Data\2022-05-26_RTM\Gac 250221\DDVN_Sam VN method_Shimadzu .M Last changed : 5/20/2022 2:02:08 PM by SYSTEM Analysis Method : G:\Phenikaa\Hieu\Data\2022-05-26_RTM\Gac 250221\DDVN_Sam VN method_Shimadzu .M (Sequence Method) Last changed : 5/27/2022 2:07:51 PM by SYSTEM (modified after loading)