Sàng lọc dược liệu Việt Nam ức chế enzyme tyrosinase: Khóa luận Dược học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

TRỊNH THỊ HẬU

SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

Người thực hiện: TRỊNH THỊ HẬU

SÀNG LỌC TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2018.Y

Người hướng dẫn 1: ThS. ĐẶNG KIM THU

Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN

HÀ NỘI – 2023

LỜI CẢM ƠN

Được làm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, tôi cảm thấy

vô cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân.

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Thị Huyền, ThS. Đặng Kim Thu – hai cô giáo đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được học tập trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường và cho phép tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược liệu – Dược học cổ truyền đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện khóa luận.

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh,

ủng hộ, động viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luận này.

Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

Trịnh Thị Hậu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ý nghĩa

Ký hiệu,

chữ viết tắt

UV Tia tử ngoại

TYR Tyrosinase

TRP-1 Protein-1 liên quan tyrosinase (Tyrosinase related protein-1)

TRP-2 Protein-2 liên quan tyrosinase (Tyrosinase related protein-2)

L-DOPA 3,4-Dihydroxy-L-phenylalamine

DCT Enzyme dopachrome tautomerase

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Admiministrati)

OTC Thuốc không kê đơn (Over The Counter)

B16F10 Tế bào sắc tố người

EtOH Ethanol

MeOH Methanol

BuOH Butanol

EtOAc Ethyl acetat

DNA Deoxyribonucleic acid

LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low density lipoprotein)

QSAR Quantitative Structure - Activity Relationship

DMSO Dimethyl sulfoxide

Half maximal inhibitory concentration IC50

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SD

% ức chế %I

A Độ hấp thụ quang (Absorbance)

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp melanin 6

Hình 1.2 8 Hai bước đầu của quá trình tổng hợp melanin xúc tác bởi enzyme tyrosinase

Hình 1.3 Nụ hoa Hòe 10

Hình 1.4 Cây Chùm ngây 12

Hình 1.5 Cây Cam thảo 14

Hình 1.6 Cây Ngải cứu 16

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất thu cao chiết dược liệu 21

Hình 2.2 24 Quy trình thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tyrosinase in vitro

Hình 3.1 Khả năng ức chế tyrosinase của acid kojic 27

Hình 3.2 Khả năng ức chế tyrosinase của các cao EtOH 28

Hình 3.3 29 Giá trị IC50 của các cao EtOH hoa Hòe, Chùm ngây, Cam thảo và chứng dương acid kojic

Hình 3.4 30 Tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn dịch chiết Cam thảo

Hình 3.5 31 Giá trị IC50 ức chế tyrosinase của các các phân đoạn dịch chiết Cam thảo và acid kojic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Các thuốc thử và hóa chất cần thiết 19

Bảng 2.2 23 Bố trí thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các mẫu thử

Bảng 3.1 Khối lượng và hiệu suất cao chiết EtOH các dược liệu 26

Bảng 3.2 Hiệu suất chiết cao phân đoạn Cam thảo 26

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ............................................................................... 3

1.1. Tổng quan về melanin ......................................................................................... 3

1.1.1. Các rối loạn tăng sắc tố da ................................................................... 3

1.1.2. Vai trò của melanin .............................................................................. 4

1.1.3. Quá trình sinh tổng hợp melanin .......................................................... 5

1.2. Tổng quan về enzyme tyrosinase ....................................................................... 6

1.2.1. Khái niệm enzyme tyrosinase .............................................................. 6

1.2.2. Vai trò của tyrosinase trong quá trình tổng hợp melanin .................... 7

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme tyrosinase ............. 8

1.2.4. Một số chất ức chế enzym tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp đã được sử dụng ........................................................................................................... 9

1.2.5. Các dược liệu có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase ........................ 10

1.3. Tổng quan về phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase .... 16

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 18

2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 18

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ......................................................................... 18

2.1.2. Mẫu nghiên cứu .................................................................................. 18

2.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm ............................................................................... 18

2.2.1. Thuốc thử, hóa chất ............................................................................ 18

2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ ................................................................ 19

2.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 20

2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20

2.4.1. Xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu ........................................... 20

2.4.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao chiết các dược liệu ................................................................................................ 22

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................. 25

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 26

3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu ............................................................................. 26

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao EtOH các dược liệu .......................................................................................................................... 27

3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các cao phân đoạn từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase tốt nhất ...................................... 30

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN ................................................................................ 32

4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao EtOH ........ 32

4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao phân đoạn Cam thảo ................................................................................................................... 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 36

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 36

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Melanin là một hợp chất phenolic sinh học cao phân tử có vai trò quan trọng trong việc tạo nên sắc tố ở da người. Tuy nhiên, việc gia tăng lượng melanin tổng hợp ở biểu mô sẽ gây ra hiện tượng nám da, sạm da. Ngoài ra, một số bệnh về da có thể dẫn đến việc tích lũy vượt mức lượng melanin ở biểu mô. Các bệnh này bao gồm sạm da, rám má, ung thư tế bào hắc tố và tăng sắc tố sau viêm [1]. Những biểu hiện bên ngoài của những bệnh này có thể tác động mạnh đến tâm lý người bệnh cũng như làm giảm các hoạt động xã hội, hiệu quả trong công việc hay tự kỷ [2]. Do đó, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm kiếm hoạt chất có khả năng làm trắng da.

Hầu hết các sản phẩm làm sáng da được bán trên thị trường đều sử dụng thành phần hoạt chất là chất ức chế tyrosinase – enzyme đóng vai trò quan trọng, xúc tác cho hai phản ứng đầu tiên của quá trình tổng hợp melanin. Tuy nhiên, việc sử dụng các sản phẩm này bị ảnh hưởng bởi các mối lo ngại về tính an toàn và hiệu quả. Mặc dù vậy, tại nhiều quốc gia, các chất làm trắng da như hydroquinone, corticosteroids, các hợp chất chứa thủy ngân vẫn còn được sử dụng bất chấp tác dụng nguy hại của chúng [3-5]. Một số chất khác như arbutin, acid kojic, vitamin C cũng được sử dụng nhưng những chất này có nhược điểm là hiệu quả không cao hoặc không bền. Do đó, nhiều công trình đang được tiến hành để tìm ra các hợp chất làm trắng da mới, an toàn và hiệu quả hơn.

Những hợp chất làm trắng da lý tưởng để sử dụng trong mỹ phẩm là những hợp chất có thể ức chế quá trình sản xuất melanin nhưng không gây chết tế bào. Trong bối cảnh đó, các dược liệu và hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng do đặc tính an toàn so với các hóa chất tổng hợp [6-8].

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm, do vậy mà hệ thống thực vật tương đối đa dạng và phong phú, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc chữa bệnh từ các loại thảo dược. Trên cơ sở đó, đề tài “Sàng lọc tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của một số dược liệu Việt Nam” được thực hiện với mục tiêu:

1. Sàng lọc tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của cao toàn phần một số

dược liệu Việt Nam.

2. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của các cao phân đoạn từ

dược liệu có tác dụng tốt nhất.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về melanin

1.1.1. Các rối loạn tăng sắc tố da

Nám da được đề cập đến như là một tình trạng tăng sắc tố da mắc phải, trong đó các mảng da không đều màu từ sáng đến nâu sẫm hoặc nâu xám xuất hiện trên các phần da tiếp xúc với ánh nắng mặt trời [71]. Về mặt mô học, nám được đặc trưng bởi sự tăng sắc tố biểu bì, số lượng tế bào hắc tố không tăng. Các tế bào hắc tố phì đại, số lượng đuôi gai và bào quan tế bào chất nhiều hơn, điều này dẫn đến hoạt động trao đổi chất cao hơn và sự gia tăng lượng hắc tố trong tất cả các lớp của biểu bì, tăng số lượng melanosome trưởng thành [71].

Nguyên nhân chính xác của nám vẫn chưa được biết, tuy nhiên một số yếu tố hoạt hóa đã được mô tả, chẳng hạn như tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, mang thai, rối loạn nội tiết tố, sử dụng mỹ phẩm hoặc thuốc gây nhạy cảm với ánh sáng và tình trạng viêm da,... [72]. Điều này cho thấy rằng sự xuất hiện và phát triển của nám bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố và phụ thuộc vào sự tương tác của của cơ thể với các yếu tố này.

Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời là yếu tố kích hoạt quan trọng nhất gây nám da. UVA và UVB là những bức xạ chính gây nên sự gia tăng hoạt động tạo hắc tố, dẫn đến sự phát triển quá mức của sắc tố biểu bì và xảy ra ở những vùng bị nám nhiều hơn so với vùng da lân cận [72].

Mang thai và liệu pháp thay thế hormone là những yếu tố kích hoạt thường được nhắc tới nhất. Các hormone sinh dục như estrogen và progestin cũng liên quan đến sự xuất hiện của nám. Sự gia tăng hormone estrogen và progesterone dẫn đến tăng phiên mã của tyrosinase và dopachrom tautomerase, từ đó kích thích tế bào hắc tố tăng sinh và điều này có thể liên quan đến sự phát triển của sắc tố trong giai đoạn mang thai ở phụ nữ [72]. Trong một nghiên cứu ở Ấn Độ, tỷ lệ bị nám ở phụ nữ mang thai là 50,8% được báo cáo ở 2.000 phụ nữ mang thai được chọn ngẫu nhiên [74]. Tỷ lệ 63,5% được ghi nhận ở một quốc gia Đông Nam Á khác

[75]. Tuy nhiên, tỷ lệ thấp 5% đã được quan sát thấy ở một nhóm 60 phụ nữ mang thai từ Pháp [76].

Việc sử dụng mỹ phẩm và uống một số loại thuốc như thuốc chống co giật và các chất nhạy cảm với ánh sáng khác cũng được coi là yếu tố nguy cơ gây nám bằng cách lắng đọng tế bào hắc tố ở các lớp bề mặt hoặc bằng cách kích thích quá trình tạo hắc tố.

Ngoài nám da, tàn nhang và đồi mồi cũng là hai rối loạn tăng sắc tố da thường gặp. Tàn nhang nói chung là những đốm sắc tố nhỏ (đường kính thường là 1–2 mm, nhưng có thể lớn hơn), có màu từ đỏ đến nâu nhạt, được quan sát thấy ở những người da trắng và/hoặc tóc vàng. Tàn nhang thường bắt đầu xuất hiện từ khi 2–3 tuổi, sau đó tăng lên trong thời niên thiếu và thường biến mất một phần theo tuổi tác. Tàn nhang thường xuất hiện nhiều nhất trên mặt, cánh tay, cổ và ngực và trở nên đậm màu hơn vào mùa hè. [73]

Đồi mồi lớn hơn tàn nhang, có đường kính từ vài milimet đến centimet, và màu của chúng có thể là màu nâu sẫm. Đồi mồi là rối loạn tăng sắc tố da phổ biến hơn ở nhưng người trên 50 tuổi và thường xuất hiện ở những vùng da tiếp xúc lâu dài với ánh nắng mặt trời (chủ yếu ở mặt, mu bàn tay và phần trước bên của cẳng tay) [73].

Nhìn chung các rối loạn tăng sắc tố da đều ít nguy hiểm đến tính mạng nhưng lại ảnh hưởng nhiều thẩm mỹ, nhất là vùng mặt và cổ, do đó có thể tác động tiêu cực đến trạng thái tâm lý, làm giảm sự tự tin vốn có của người bệnh cũng như giảm các hoạt động xã hội và hiệu quả trong công việc.

1.1.2. Vai trò của melanin

Melanin là một loại sắc tố màu nâu hoặc đen, được tìm thấy trong rất nhiều các sinh vật sống, từ nấm, thực vật đến động vật có vú và có chức năng khác nhau ở mỗi loài sinh vật [9]. Ở người, melanin là yếu tố chính quyết định đến màu da và màu tóc. Melanin cũng được tìm thấy trong các mô sắc tố nằm bên dưới tròng

đen của mắt, tế bào thần kinh vàc tố mang trong các khu vực của não, chẳng hạn như các locus coeruleus nằm ở cầu não và chất đen [10].

Vai trò của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím (UV) bằng cách hấp thụ UV của ánh sáng mặt trời và loại bỏ các gốc oxy hóa tự do. Các rối loạn tăng sắc tố bất thường ở da thường thấy là kết quả của sự tích tụ quá mức sắc tố ở biểu bì, bao gồm nám da, đốm nâu, tàn nhang và sạm da. Tăng sắc tố có thể do tăng tế bào tạo sắc tố hoặc do tăng hoạt động của các enzyme hình thành sắc tố [11]. Quá trình tạo hắc tố là một quá trình phức tạp được tổng hợp qua nhiều phản ứng enzym và hóa học. Có ba loại enzyme tham gia vào quá trình tạo hắc tố là tyrosinase, TRP-1 và TRP-2, nhưng các phương pháp hiện nay chủ yếu tập trung vào ức chế tyrosinase bởi vai trò quan trọng của enzyme này trong quá trình hình thành hắc tố da [12].

1.1.3. Quá trình sinh tổng hợp melanin

Ở người, melanin có thể được tìm thấy ở 2 dạng: eumelanin (sắc tố đen và nâu) và pheomelanin (sắc tố đỏ và vàng) [13]. Cả eumelanin và pheomelanin đều được tổng hợp thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa tyrosinase hoặc L-3,4- dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) thành dopaquinon, được xúc tác bởi enzyme tyrosinase.

Sau khi hình thành dopaquinone, con đường melanin được chia thành tổng hợp eumelanin và pheomelanin nơi có sự chuyển đổi tự phát thành leuco dopachrome và dopachrome.

Trong con đường eumelanin, dopachrome hoặc được chuyển đổi một cách tự nhiên thành 5,6-dihydroxyindole hoặc thành axit 5,6-dihydroxyindole-2- carboxylic nhờ enzyme dopachrome tautomerase (DCT), còn được gọi là protein liên quan đến tyrosine- 2 (TRP-2) [14]. TRP-1 và TRP-2 là hai protein có cấu trúc liên quan đến tyrosinase [15-17]. Hai protein này cư trú trong các melanosome, trải dài trên màng tế bào hắc tố giống như tyrosinase và đã được chứng minh là làm tăng tính ổn định của tyrosinase [18-20]. Tuy nhiên, vai trò của TRP-1 và

TRP-2 vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn. Cuối cùng, sự trùng hợp của indoles và quinon dẫn đến sự hình thành eumelanin [21].

Con đường pheomelanin phân nhánh từ con đường eumelanin ở bước L- DOPAquinone và phụ thuộc vào sự hiện diện của cysteine được vận chuyển tích cực qua màng hắc tố. Cysteine phản ứng với L-DOPAquinone để tạo thành cysteinyl-dopa [21]. Sau đó được chuyển đổi thành quinoleimine, alanine- hydroxyl dihydrobenzothazine và polyme hóa thành pheomelanin. (Hình 1.1).

Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp melanin [13]

1.2. Tổng quan về enzyme tyrosinase

1.2.1. Khái niệm enzyme tyrosinase

Tyrosinase (còn được gọi là monophenol monooxygenase, EC 1.14.18.1)

có hai nguyên tử đồng ở vị trí hoạt động của nó là Cu(II) A và Cu(II) B [22].

Tyrosinase xúc tác quá trình hydroxyl hóa monophenol thành o -diphenol và oxy hóa o -diphenol thành o-quinones, chất tạo ra hắc tố và được coi là enzyme chủ chốt trong quá trình tổng hợp melanin ở động vật có vú, vi khuẩn, thực vật và nấm [23, 24].

Sự ức chế tyrosinase không chỉ liên quan đến việc làm giảm chứng tăng sắc tố da mà còn liên quan đến quá trình thoái hóa thần kinh liên quan đến bệnh Parkinson. Tyrosinase oxy hóa dopamine để hình thành hắc tố trong não. Dopaquinone gây ra tổn thương tế bào thần kinh trong não do thiếu hụt tế bào thần kinh dopaminergic dẫn đến bệnh Parkinson. Do đó tyrosinase cũng đóng vai trò trong cơ chế bệnh sinh của bệnh Parkinson [25]. Mặt khác, tyrosinase có thể dẫn đến màu nâu do enzym không thuận lợi trong rau và trái cây và làm giảm giá trị dinh dưỡng và giá trị thị trường của chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm [26].

1.2.2. Vai trò của tyrosinase trong quá trình tổng hợp melanin

Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là enzyme đóng vai trò quan trọng tham gia vào

hai phản ứng chính để hình thành melanin.

Đầu tiên L-tyrosin được hydroxyl hóa thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) bởi enzyme tyrosinase và được gọi là quá trình monophenolase. Đây là bước bắt buộc của quá trình sinh tổng hợp melanin.

Tiếp theo L-DOPA được oxy hóa thành DOPA-quinon cũng bởi enzyme tyrosinase và được gọi là quá trình diphenolase. Sau đó, DOPA-quinon tham gia một loạt các phản ứng để tạo thành melanin (Hình 1.2). [27]

Hình 1.2. Hai bước đầu của quá trình tổng hợp melanin xúc tác bởi enzyme tyrosinase

1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme tyrosinase

Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất L-tyrosine hoặc L-DOPA tăng thì tốc độ phản ứng tăng, lượng DOPA-quinon tạo ra càng nhiều. Tuy nhiên đến một mức nào đó, tốc độ phản ứng sẽ không tăng thêm nữa khi enzyme đã bão hòa cơ chất [28].

Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzyme tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzyme, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [28].

Nhiệt độ: Hoạt động của enzyme phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Thông thường, khi tăng 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2-3 lần [29]. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao enzyme sẽ bị biến tính. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng trong quá trình bảo quản enzyme. Tyrosinase nên được bảo quản ở nhiệt độ -20oC [30].

pH: pH được đánh giá là có ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme. Mức tối

ưu cho hoạt động của enzyme tyrosinase là ở pH 6,0–7,0 [31].

1.2.4. Một số chất ức chế enzym tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp đã được sử dụng

Acid kojic (5-hydroxy-2(hydroxymethyl)-g-pyron), một chất chuyển hoá của nấm được sản xuất bởi nhiều loài Aspergillus và Penicillium [32], có thể được tổng hợp hóa học hoặc được chiết xuất từ sản phẩm tự nhiên. Acid kojic ức chế sự hình thành sắc tố từ phản ứng oxy hoá L-DOPA, norepinephrin và dopamin dưới sự xúc tác của tyrosinase. Điều này có nghĩa rằng acid kojic có thể giảm chuyển hoá dopaquinon thành O-dephenol ngăn cản tạo thành các sắc tố và được oxy hoá thành một sản phẩm màu vàng bằng cách tương tác hoá học với dopaquinon.

Hydroquinon có khả năng ức chế 90% hoạt tính của tyrosinase [33], là một hoá chất phổ biến có trong mỹ phẩm và sản phẩm làm sáng da. Nó được coi là một trong các chất ức chế hiệu quả nhất quá trình sản xuất melanin và đã từng được sử dụng rộng rãi để điều trị các rối loạn sắc tố như làm trắng da để điều trị nám, điều trị tăng sắc tố sau viêm và các rối loạn tăng sắc tố khác. Do các tác dụng phụ liên quan tới việc sử dụng các sản phẩm không cần kê đơn có chứa hydroquinon nên hydroquinon đã bị FDA (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) quy định hạn chế sử dụng các sản phẩm OTC (thuốc không kê đơn) có chứa nồng độ hydroquinon cao. Ảnh hưởng tới sức khoẻ nghiêm trọng nhất có liên quan đến hydroquinon là ảnh hưởng đến sắc tố của mắt, và trong một số ít trường hợp hydroquinon gây tổn thương giác mạc vĩnh viễn. Vì lý do này, hydroquinon đã bị cấm sử dụng trong các chế phẩm mỹ phẩm ở châu Âu vì không an toàn khi sử dụng trong thời gian dài [34].

Arbutin, một hợp chất chuyển hoá thứ cấp của cây Bearberry (tên khoa học là Arctostaphylos uva-ursi), được sử dụng rộng rãi với hiệu quả làm sáng da. Arbutin tự nhiên tương đối an toàn tuy nhiên lại có độ ổn định thấp và dễ dàng chuyển hoá thành hydroquinon. Vì thế vào năm 2008, Hiệp hội Mỹ phẩm Châu Âu đã cấm sử dụng các đồng dạng của β-arbutin [35].

Acid azelaic (acid 1,7-heptanedicarboxylic) hiện nay đang được sử dụng để điều trị mụn trứng cá từ nhẹ đến trung bình, điều trị bệnh tăng sắc tố da đặc biệt ở

những người sạm da. Tuy nhiên thì acid azelaic lại ức chế tyrosinase yếu và ức chế theo cơ chế cạnh tranh [36].

1.2.5. Các dược liệu có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase

Hydroquinone, axit kojic, và arbutin là những chất ức chế tyrosinase được biết đến nhiều nhất nhưng chúng có tác dụng phụ nghiêm trọng như mất sắc tố vĩnh viễn, nổi ban đỏ và viêm da tiếp xúc,... Với ưu điểm an toàn, lành tính nhiều dược liệu đã được nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase.

Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.), thuộc họ Đậu (Fabaceae) là một một vị thuốc nam quý, đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền.

Hình 1.3. Nụ hoa Hòe

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của hoa Hòe, các thành phần chính mang lại tác dụng của cây bao gồm triglycoside flavonol, isoflavone, coumaronochromone, saponin, triterpene glycoside, phospholipid, alkaloid, axit amin, polysacarit và axit béo [37].

Hoa và nụ hoa của cây Hòe thường được sử dụng để điều trị các rối loạn liên quan đến chảy máu như đại tiện ra máu, chảy máu trĩ, chảy máu do rối loạn

chức năng tử cung và tiêu chảy [37]. Các đặc tính chức năng của nụ hoa Hòe như chống oxy hóa, loại bỏ gốc tự do, chống viêm, cầm máu, hạ đường huyết, hạ axit uric,... đã được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu sâu rộng [38]. Ngoài ra, chiết xuất của nụ hoa Hòe cũng thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh và độc tính tế bào thấp. Theo kết quả nghiên cứu của Wang KH và cộng sự, IC50 của chiết xuất EtOH 95% nụ hoa Hòe là 92,51 ± 1,73 µg/mL, bên cạnh đó khả năng ức chế tyrosinase của cao chiết MeOH ở nồng độ 100 μg/mL là 38,7% cũng được Kim Soo Jin và cộng sự báo cáo [39, 40]. Từ các kết quả nghiên cứu này có thể thấy hoa Hòe có rất nhiều triển vọng ứng dụng trong mỹ phẩm như là một thành phần an toàn trong các sản phẩm chăm sóc và làm trắng da.

Hắc kỷ tử (Lycium ruthenicum Murr.) là một loài thuộc chi Lycium, họ Solanaceae. Các hợp chất chính được tìm thấy trong quả Hắc kỷ tử bao gồm carotenoid, vitamin C và các hợp chất phenolic như anthocyanin, axit phenolic, stilben và flavonol. Nghiên cứu dược lý hiện đại đã khẳng định rằng Hắc kỷ tử có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch và chống lão hóa [41]. Ngoài ra, hoạt động ức chế tyrosinase của dịch chiết với dung môi nước và anthocyanins phân lập từ quả khô Hắc kỷ tử đã được tiến hành nghiên cứu bởi Shen M và cộng sự [42]. Kết quả là anthocyanins tinh khiết có tác dụng ức chế cạnh tranh đối với tyrosinase monophenolase (IC50 = 1,483 ± 0,058 mg/mL) tốt hơn so với dịch chiết nước (IC50 = 2,948 ± 0,022 mg/mL) nhưng kém hơn so với acid kojic (IC50 = 2,974 ± 0,015 µg/mL). Do đó, anthocyanins từ quả khô hắc kỷ tử có thể được sử dụng như chất ức chế tyrosinase để điều trị hiệu quả các rối loạn tăng sắc tố da.

Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là một loại thảo dược thuộc họ Chùm ngây (Moringaceae). Tác dụng của Chùm ngây đã được công nhận để điều trị các bệnh nhiễm trùng khác nhau, điều chỉnh hệ thống miễn dịch và thể hiện tác dụng chống oxy hóa, chống bệnh tiểu đường hoặc chống khối u [43].

Hình 1.4. Cây Chùm ngây

Năm 2021, Ni Putu Linda Laksmiani và cộng sự đã nghiên cứu và cho thấy hợp chất quercetin chiết xuất từ lá Moringa oleifera L. có tác dụng ức chế tyrosinase và là một chất tiềm năng giúp làm sáng da [44]. Cũng trong thử nghiệm này, cao chiết MeOH của lá Chùm ngây cũng được ghi nhận là có tác dụng ức chế tyrosinase tốt với IC50 là 115,36 µg/mL, trong khi đó đối chứng là acid kojic có IC50 là 48,90 µg/mL. Bên cạnh đó, năm 2022 An Nisaa Nurzak và cộng sự đã đánh giá và cho thấy dịch chiết lá Chùm ngây có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase tốt, có thể phát triển thành kem làm trắng da [45].

Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp (Saururaceae). Diếp cá là một loại cây thảo mọc rất phổ biến ở Việt Nam và một số nước châu Á khác. Ngoài việc dùng để làm rau ăn, Diếp cá còn là một loài cây có khả năng chữa được nhiều bệnh như lỵ, cảm, sốt, viêm, thanh nhiệt, giải độc,... Trong các nghiên cứu dược lý, Diếp cá cho thấy hoạt động bảo vệ các cơ quan trong cơ thể , chẳng hạn như giảm giải phóng các yếu tố gây viêm để giảm bớt tổn

thương phổi, tăng cường hàng rào miễn dịch của âm đạo, khoang miệng và đường ruột [46]. Ngoài ra, hoạt tính làm trắng da cũng như độc tính của cây Diếp cá trên dòng tế bào da u sắc tố B16F10 đã được nghiên cứu bởi Nguyễn Hoàng Dũng và cộng sự, năm 2016. Kết quả nhận được đã cho thấy cây Diếp cá có rất nhiều triển vọng ứng dụng trong mỹ phẩm như là một thành phần an toàn và làm trắng da [47].

Cây mỏ quạ còn được gọi là xuyên phá thạch, hoàng lồ hoặc móc câu, tên khoa học là Cudrania cochinchinensis, thuộc họ Dâu tằm (Moraceae). Trong bài thuốc dân gian của Việt Nam, lá cây mỏ quạ được cho là một tác nhân giúp chữa lành vết thương. Đặc tính dược lý này của lá cây mỏ quả được chứng minh thông qua các nghiên cứu trên động vật và quan sát lâm sàng tại Việt Nam [48]. Trong nghiên cứu của Zheng ZP và cộng sự năm 2011 [49], các thành phần hóa học trong chiết xuất 95% EtOH của thân cây mỏ quạ đã được phân lập và đánh giá hoạt động ức chế của chúng trên tyrosinase nấm. Kết quả cho thấy hoạt động ức chế tyrosinase của 2,3-cis-dihydromorin (IC50 = 31,1 μM), 2,3-trans-dihydromorin (IC50= 21,1 μM) và oxyresveratrol (IC50= 2,33 μM) mạnh hơn axit kojic (IC50= 50,8 μM). Do đó, chiết xuất từ thân cây mỏ quạ có thể là một ứng cử viên đầy hứa hẹn cho các sản phẩm mỹ phẩm làm trắng da.

Thảo quyết minh còn gọi là quyết minh, muồng, có tên khoa học là Cassia tora L., thuộc họ Đậu (Fabaceae). Chiết xuất methanol thô, n-hexan, EtOAc, BuOH và phân đoạn nước của hạt cây C.tora có tỷ lệ ức chế tyrosinase tương ứng là 35,9%; 58,1%; 90,0%; 52,3% và 27,7% ở nồng độ 300 μg/mL. Các hợp chất chryso-obtusin, 7-methoxy-obtusifolium và obtusifolin-2-O-glucoside được phân lập từ hạt của cây C.tora đã thể hiện khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase như một chất ức chế cạnh tranh. Kết quả này cho thấy rằng các hợp chất này có thể là các ứng cử viên tiềm năng trong việc sử dụng chiết xuất từ thực vật tự nhiên để làm trắng da [50].

Cây Rau má (Centella asiatica Urban) thuộc chi Centella của họ Apiaceae. Ở Việt Nam, cây Rau má mọc hoang hoặc được trồng phổ biến khắp nơi. Chiết

xuất của Rau má được sử dụng rộng rãi để điều trị các rối loạn viêm da, bao gồm bệnh phong, lupus, loét giãn tĩnh mạch, chàm, viêm da dị ứng và bệnh vẩy nến [51]. Ngoài ra, axit asiatic, axit madecassic và asiaticoside là các thành phần chính trong chiết xuất Rau má được nghiên cứu là có tác dụng kích thích tổng hợp collagen [52]. Gần đây, nghiên cứu của Saraf và cộng sự đã chỉ ra rằng một công thức mỹ phẩm chứa Rau má có khả năng làm trắng da [53].

Cam thảo có tên khoa học là Glycyrrhiza glaba L., thuộc chi Glycyrrhiza, họ Fabaceae. Thân rễ Cam thảo đã được ứng dụng từ xa xưa để điều trị các bệnh hệ tiêu hóa, loại bỏ đờm, giảm ho, dưỡng khí, giải lo âu và giảm đau. Điều này được cho là nhờ đặc tính chống viêm từ các triterpene saponin, flavonoid, coumarin của Cam thảo [54].

Hình 1.5. Cây Cam thảo

Ngoài ra, Glabridin – pyranoisoflavan - một trong những thành phần chính của Cam thảo đã cho thấy hoạt động chống hình thành hắc tố đầy hứa hẹn trên các tế bào u ác tính B16 của chuột. Glabridin ức chế hoạt động tyrosinase của tế bào u ác tính ở nồng độ 1,0 µg/ml mà không ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp DNA. Glabridin cũng được chứng minh ức chế tác dụng của tia UVB gây ra sắc tố và viêm trên da chuột lang ở nồng độ 0,5% w/v [55].

Dâu tằm (Morus alba L.) hay dâu tằm trắng, dâu tằm thường, dâu trắng, dâu ta là loài thực vật có hoa thuộc chi Dâu tằm (Morus), họ Moraceae. Chiết xuất dâu tằm hoặc các thành phần đặc biệt là flavonoid như quercetin , rutin và isoquercitrin giúp loại bỏ các gốc tự do cho thấy khả năng chống lại stress oxy hóa [56]. Ngoài ra, các chất chống oxy hóa này giúp bảo vệ tim mạch vì chúng ức chế quá trình oxy hóa LDL và do đó gây xơ vữa động mạch [56]. Ngoài ra, chiết xuất ethanol từ cành của cây dâu tằm và các thành phần hoạt tính có trong chiết xuất đã thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh mẽ qua nghiên cứu của Zhang L và cộng sự, năm 2016. Theo kết quả thử nghiệm thử nghiệm, các hợp chất steppogenin (IC50 = 0,98 ± 0,01 µM); 2,4,2,4'-tetrahydroxychalcone (IC50 = 0,07 ± 0,02 µM); morachalcone A (IC50 = 0,08 ± 0,02 µM); oxyresveratrol (IC50 = 0,10 ± 0,01 µM) và moracin M (IC50 = 8,00 ± 0,22 µM) thể hiện hoạt động ức chế tyrosinase mạnh hơn nhiều so với axit kojic (IC50 = 58,30 ± 1,60 µM) [57].

Nho (Vitis vinifera L.) không chỉ được biết đến như một loại cây ăn quả mà còn là dược liệu. Các hoạt động chống oxy hóa, chống viêm và giảm đau của chiết xuất nước Nho đã được nghiên cứu bằng phương pháp in vitro và in vivo [58]. Hoạt động ức chế tyrosinase của chiết xuất nước lá cây nho đỏ (RVLE) có chứa axit gallic, axit chlorogenic, epicatechin, rutin và resveratrol cũng đã được nghiên cứu là có hiệu quả đối với chứng tăng sắc tố da. Nghiên cứu động học cho thấy sự ức chế tyrosinase của RVLE thông qua cơ chế phản ứng cạnh tranh với L-DOPA. Mặc dù RVLE có tác dụng ức chế tyrosinase không tốt bằng axit kojic, nhưng nó vẫn được công nhận là một thành phần tự nhiên an toàn và có thể được sử dụng một cách an toàn trong các sản phẩm mỹ phẩm [59].

Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) còn có tên thuốc cứu, nhả ngải, bắc ngải, thuộc chi Artemisia, họ Asteraceae. Cây Ngải cứu có một lịch sử lâu dài được sử dụng để chữa bệnh cho con người. Những tác dụng dược lý nổi bật của Ngải cứu đã được nghiên cứu sâu rộng là chống sốt rét, chống viêm, chống tăng huyết áp, chống oxy hóa, chống ung thư, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, chống co thắt, chống nhiễm trùng và chống ung thư [60, 61]. Tác dụng ức chế tyrosinae của Ngải cứu cũng đang được nghiên cứu và phát triển như là một thành chính

trong các sản phẩm chăm sóc da như là một chất giữ ẩm, chất bảo vệ da và làm trắng da [62].

Hình 1.6. Cây Ngải cứu

1.3. Tổng quan về phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase

Quá trình nghiên cứu, phát triển thuốc mới nói chung và chất ức chế tyrosinase nói riêng cần phải trải qua rất nhiều giai đoạn và một trong những giai đoạn của quá trình là nghiên cứu sàng lọc tác dụng.

Có nhiều phương pháp được sử dụng trong giai đoạn này. Tuy nhiên, hai phương pháp cơ bản được dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase phổ biến nhất là thử nghiệm in vitro và thử nghiệm in vivo.

Thử nghiệm in vivo là phương pháp đo hoạt tính của tyrosinase thông qua đo sự tích tụ melanin trong tế bào ở chuột hoặc ở người. Ưu điểm nổi bật của phương pháp in vivo là đánh giá được chính xác tác động của chất thử nghiệm lên cơ thể sinh vật. Tuy nhiên phương pháp này khó thực hiện, tốn nhiều thời gian và cần sự theo dõi chặt chẽ của người làm thí nghiệm.

Thử nghiệm in vitro được tiến hành bằng cách sử dụng enzyme tyrosinase của nấm làm chất xúc tác cho quá trình chuyển hoá L-tyrosine thành L- DOPAquinone sau đó tiến hành đo mức độ tạo thành sản phẩm màu L- DOPAquinone để đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase của chất thử. Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase bởi thời gian nghiên cứu ngắn, khả năng tự động hóa cao và cho phép quan sát trực tiếp diễn biến trạng thái bệnh lý của tế bào. Đồng thời, có thể thực hiện cùng lúc nhiều mẫu thử khác nhau với dải nồng độ rộng.

Một số máy quang phổ, sắc ký, điện di, đo phóng xạ và điện hóa đã được các nhà nghiên cứu áp dụng và phát triển. Gần đây, phương pháp cảm biến sinh học huỳnh quang và sắc ký lớp mỏng dựa cũng đã được đề xuất để sàng lọc chất ức chế tyrosinase. Ngoài ra, có thể sàng lọc nhanh các chất ức chế tyrosinase thông qua sử dụng sàng lọc ảo và xây dựng mô hình liên quan đến cấu trúc và tác dụng của chất ức chế (QSAR) [12].

Như vậy, việc sử dụng bất kỳ phương pháp nào cũng có những ưu và nhược điểm riêng. Dựa trên mục đích của đề tài, chúng tôi xây dựng mô hình thử nghiệm in vitro đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase.

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu

Dược liệu dùng trong nghiên cứu là:

+ Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.)

+ Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.)

+ Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

+ Rau má (Centella asiatica Urban.)

+ Cam thảo (Glycyrrhiza glabra L.)

+ Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.)

Các dược liệu được thu hái tại Thái Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc,... và được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền - Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN.

2.1.2. Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu trong khóa luận xin được gọi tắt là cao chiết. Bao gồm:

 Cao chiết EtOH toàn phần của lá Chùm ngây, nụ hoa Hòe, cây Diếp

cá, cây Rau má, thân rễ Cam thảo và ngọn thân cây Ngải cứu.

 Cao chiết phân đoạn của Cam thảo.

2.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm

2.2.1. Thuốc thử, hóa chất

Bảng 2.1. Các thuốc thử và hóa chất cần thiết

STT Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc, xuất xứ Ghi chú

Sigma Aldrich, 1 Enzyme tyrosinase Singapore Tyrosinase T3824- 25KU, 6540 units/mg; 3,82mg

Sigma Aldrich, 3,4-Dihydroxy-L- phenylalamine 2 Singapore (L-DOPA)

Sigma Aldrich, MW: 142,11 g/mol Acid kojic 3 Singapore W: 25g

Sigma Aldrich MW: 177,99 g/mol 4 Na2HPO4 .12H2O

Sigma Aldrich MW: 136,08 g/mol 5 KH2PO4

MW: 46,07 g/mol Ghtech, Trung Quốc 6 Ethanol tuyệt đối (>99,7%) Dung tích: 500 mL

MW: 78,13 g/mol DMSO 7 VWR Chemicals BDH

n-Hexan Ghtech, Trung Quốc 8

Ethyl acetat Ghtech, Trung Quốc 9

n-Butanol Ghtech, Trung Quốc 10

Nước cất Việt Nam 11

2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Cân kĩ thuật Sartorius PRACTUM612 – 1S (Đức).

- Cân phân tích Sartorius QUINTIX224 – 1S (Đức).

- Máy đo hàm ẩm MB 45 (Ohaus- Mỹ).

- Máy siêu âm Elmasonic S100H (Đức).

- Phễu lọc Buchner.

- Máy quang phổ miễn dịch Epoch 2C

- Máy đo pH

- Máy cô quay

- Máy Vortex

- Micro pipet đa kênh 30-300µL, 100-1000µL

- Micro pipet đơn kênh 20-200µL, 100-1000µL

- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiện: cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình chiết, đầu côn, ống falcon, ống eppendorf, đĩa 96 giếng,...

2.3. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được

thiết kế với các nội dung sau:

Nội dung 1: Sàng lọc tác dụng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao

EtOH các dược liệu đã chọn.

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các cao

phân đoạn từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase tốt nhất.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu

- Dược liệu: Cam thảo, hoa Hòe, Rau má, Ngải cứu, Chùm ngây, Diếp cá.

- Dựa vào kết quả nghiên cứu sơ bộ, dược liệu được chiết xuất như sau:

+ Dược liệu được rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ, thu được nguyên liệu dược

liệu

+ 500g dược liệu được chiết bằng EtOH 70% theo tỷ lệ hỗn hợp bột dược liệu: dung môi là 100:1 (g/L), ngâm trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng và việc chiết này được lặp lại 3 lần. Gom các dịch chiết thu được, lọc hút chân không và thu lấy phần dịch lọc, cất loại dung môi dưới áp suất giảm rồi sấy trong tủ sấy ở 500C tới khối lượng không đổi, thu được cao EtOH 70%.

+ Phân tán trong nước nóng, sau đó chiết lỏng - lỏng tỉ lệ 1:2, mỗi lần 0,5 lít x 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc và BuOH. Gộp các dịch chiết và cất thu hồi dung môi dưới áp xuất giảm thu được cao n- hexan, cao EtOAc, cao BuOH và cắn nước.

Hình 2.1. Quy trình chiết xuất thu cao chiết dược liệu

2.4.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao chiết các dược liệu

Phương pháp in vitro là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để đánh giá hoạt động ức chế enzyme tyrosinase vì tính đơn giản và nhanh chóng, chỉ yêu cầu máy quang phổ UV-VIS để thực hiện.

Nguyên lý

Khả năng ức chế enzym tyrosinase được thực hiện bằng phương pháp in vitro sử dụng cơ chất là L-DOPA. Enzym tyrosinase của nấm làm chất xúc tác cho quá trình chuyển hoá L-DOPA thành L-DOPAquinon.

Trong môi trường pH = 6,5, L-DOPAquinon sẽ chuyển thành L-

DOPAchrome.

Sau đó tiến hành đo mức độ tạo thành sản phẩm màu L-DOPAchrome ở

bước sóng 475nm để đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase của mẫu thử.

Chuẩn bị hóa chất cần thiết

- Dung dịch đệm phosphat pH 6,5

- Mẫu thử: Cao chiết EtOH các dược liệu được pha trong DMSO tạo thành

dung dịch gốc có nồng độ 10000 g/mL. Sau đó dung dịch gốc này được pha loãng

bằng dung dịch đệm phosphat pH 6,5 với các nồng độ 500 g/ml; 200 g/ml; 80

g/ml; 40 g/ml; 20 g/ml; 8 g/ml dùng cho thí nghiệm.

- Chất chuẩn dương acid kojic được hòa tan trong đệm phosphat pH 6,5 với

nồng độ 80 g/ml; 40 g/ml; 20 g/ml; 8 g/ml; 4 µg/ml và 2 g/ml.

- 3,4-Dihydroxy-L-phenylalamine (L-DOPA) pha trong nước cất được nồng

độ 1 mg/ml.

- Dung dịch tyrosinase 125 Units/mL (Sigma Chemical) pha trong đệm

phosphat pH 6,5.

Cách tiến hành

- Mẫu thử: Tiến hành thêm 20 μL dung dịch mẫu cần thử nghiệm, 50 μL enzym tyrosinase 125U/mL với một thể tích đệm pH 6,5 phù hợp trong đĩa 96 giếng, ủ 10 phút trong bóng tối. Thêm tiếp 50 μL dung dịch L-DOPA và ủ 30 phút trong bóng tối để phản ứng xảy ra. Sau đó, đo độ hấp thụ quang ở 475 nm (Máy quang phổ miễn dịch Epoch 2C).

- Song song với mẫu thử, làm các mẫu đối chứng dương, mẫu chứng, mẫu

trắng thử và mẫu trắng chứng với các thành phần được bố trí như bảng sau:

Bảng 2.2. Bố trí thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các mẫu thử

Mẫu thử Mẫu trắng Thành phần Mẫu chứng thử Mẫu chứng trắng (μL) (μL) (μL) (μL)

20 20 0 0 Dung dịch mẫu thử / acid kojic

50 0 50 0 Dung dịch tyrosinase 125U/mL

50 50 50 50 Dung dịch L-DOPA 1mg/mL

80 130 100 150 Dung dịch đệm phosphat pH 6,5

Tổng (μL) 200 200 200 200

Thử nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần.

Quy trình thí nghiệm được mô tả ở Hình 2.2

Hình 2.2. Quy trình thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tyrosinase in vitro

Thông số đánh giá kết quả:

Tác dụng ức chế tyrosinase được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức

chế (I%) theo công thức:

(𝐴𝑐−𝐴𝑐′)−(𝐴𝑡−𝐴𝑡′) 𝐴𝑐−𝐴𝑐′

I% = 𝑥100%

Trong đó:

+ Ac: độ hấp thụ quang của mẫu trắng

+ Ac’: độ hấp thụ quang của mẫu chứng trắng

+ At: độ hấp thụ quang của mẫu thử

+ At’: độ hấp thụ quang của mẫu chứng thử

Tác dụng ức chế tyrosinase của cao chiết dược liệu được so sánh với chất

chứng dương là acid kojic.

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.

Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch

chuẩn).

Giá trị IC50 được xác định dựa trên tỷ lệ phần trăm ức chế (I%) tại các nồng độ khác nhau, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến tính bằng mô hình sigmoid trên phần mềm Graphpad Prism 9.5.0.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu

Sau khi tiến hành chiết xuất dược liệu theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1.

Khối lượng và hiệu suất các cao chiết thu được được thể hiện trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khối lượng và hiệu suất cao chiết EtOH các dược liệu

Hiệu suất (%) Hàm ẩm Dược liệu Khối lượng cao chiết (g)

50,75

10,15

3,67

Hòe

41,8

8,37

5,35

Chùm ngây

43,27

8,87

4,90

Diếp cá

45,86

9,16

3,85

Rau má

42,15

8,43

8,68

Cam thảo

38,96

7,27

7,25

Ngải cứu

Sau khi tiến hành sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase, lựa chọn Cam thảo để tiếp tục nghiên cứu. Tiến hành chiết xuất phân đoạn Cam thảo theo quy trình ở Hình 2.1 thu được cao phân đoạn với hiệu suất như trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Hiệu suất chiết cao phân đoạn Cam thảo

Cao phân đoạn Khối lượng cao chiết (g) Hiệu suất

10,36% 4,36 n-hexan

13,62% 5,74 EtOAc

8,84% 3,72 n-BuOH

11,27% 4,75 Cắn nước

3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao EtOH các dược liệu

Kết quả đánh giá khả năng ức chế tyrosinase của acid kojic và cao toàn phần

EtOH các dược liệu được biểu diễn qua Hình 3.1 và Hình 3.2

Hình 3.1. Khả năng ức chế tyrosinase của acid kojic

Hình 3.2. Khả năng ức chế tyrosinase của các cao EtOH

Hình 3.3. Giá trị IC50 ức chế tyrosinase của các cao chiết hoa Hòe, Chùm ngây, Cam thảo và chứng dương acid kojic

Theo kết quả thu được, tác dụng ức chế tyrosinase của các cao chiết tăng dần theo nồng độ. Trong các dược liệu khảo sát, Cam thảo, Hòe và Chùm ngây có

tác dụng ức chế enzym tyrosinase tốt nhất với IC50 lần lượt là 63,78 ± 0,52 g/mL;

92,51 ± 1,73 g/mL và 116,38 ± 2,6 g/mL so với chứng dương acid kojic có giá

trị IC50 là 13,94 ± 0,30 g/mL. Rau má, Diếp cá và Ngải cứu có tác dụng ức chế

tyrosinase yếu hơn với % tyrosinase bị ức chế ở nồng độ cao chiết 500 g/mL lần

lượt là 11,90 ± 0,79 %; 20,96 ± 0,71 %; 33,77 ± 1,14 %. Chất đối chứng dương acid kojic hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Từ kết quả trên, lựa chọn Cam thảo để chiết xuất phân đoạn.

3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các cao phân đoạn từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase tốt nhất

Tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn dịch chiết thân rễ Cam thảo

được thể hiện qua Hình 3.4

Hình 3.4. Tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn dịch chiết Cam thảo

Hình 3.5. Giá trị IC50 ức chế tyrosinase của các phân đoạn dịch chiết Cam thảo và acid kojic

Giá trị phần trăm ức chế (I%) của cao chiết phân đoạn thân rễ được thể hiện

qua Hình 3.4. Theo sự tăng dần của nồng độ từ 4 đến 200 g/ml, phần trăm ức

chế tyrosinase của các cao chiết đều tăng dần. Chứng tỏ, tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của cao toàn phần và các cao phân đoạn của Cam thảo tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Trong đó, phân đoạn EtOAc có giá trị IC50 thấp nhất là 75,81 ±

0,97 g/ml, thể hiện tác dụng ức chế tyrosinase mạnh nhất, tiếp theo là phân đoạn

n-BuOH (IC50 =134,22 ± 3,79 g/ml), phân đoạn n-Hexan (IC50 =198,27 ± 1,30

g/mL). Phân đoạn nước dường như không có tác dụng. Thứ tự tác dụng ức chế

tyrosinase của các phân đoạn tăng lần lượt như sau: Nước < n- Hexan < n-BuOH < EtOAc.

CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN

4.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao EtOH

Xu hướng đối với việc sử dụng các chất ức chế tyrosinase tự nhiên có trong các thảo dược, rau, trái cây và các loại hạt đã và đang ngày một gia tăng. Thảo dược đã và đang trở thành nguồn tài nguyên tiềm năng cho việc tìm kiếm các loại thuốc mới với nhiều loài cây có chứa các thành phần hóa học đã được chứng minh hoạt tính ức chế tyrosinase.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của cao chiết EtOH lá Chùm ngây, nụ hoa Hòe, cây Diếp cá, cây Rau má, thân rễ Cam thảo và ngọn thân cây Ngải cứu. Hoạt tính ức chế tyrosinase được đánh giá bởi phương pháp xác định mức độ tạo thành sản phẩm màu L- DOPAchrome dựa vào độ hấp thụ quang A (Absorbance) đo được ở bước sóng 475nm để đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase của các mẫu thử.

Theo đó, cao EtOH của Cam thảo thể hiện khả năng ức chế tyrosinase mạnh

nhất với IC50 là 63,78 ± 0,52 g/mL tuy nhiên vẫn nhỏ hơn 4 lần so với acid kojic (IC50 là 13,94 ± 0,30 µg/mL) – chất đối chứng trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, trong mẫu cao chiết chứa nhiều hợp chất khác nhau còn acid kojic là một hợp chất duy nhất, do đó tác dụng ức chế tyrosinase của cao dược liệu này là khá tốt. Sau

đó là cao chiết hoa Hòe và Chùm ngây với IC50 lần lượt là 92,51 ± 1,73 g/mL và

116,38 ± 2,6 g/mL. Cao EtOH của Diếp cá, Rau má và Ngải cứu thể hiện hoạt

tính ức chế tyrosinase yếu hơn.

Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của chiết xuất EtOH 95% nụ hoa Hòe của Wang KH và cộng sự (2006), kết quả thu được giá trị IC50 là 95,6 μg/mL và ở nồng độ 100 μg/mL, khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết

là 54.4 ± 1.3% [39]. Kết quả chúng tôi thu được (IC50 là 92,51 ± 1,73 g/mL) khá tương đồng so với kết quả thử nghiệm của Wang KH và cộng sự. Theo đó, chiết xuất EtOH 95% nụ hoa Hòe có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh.

Kết quả thử nghiệm của chúng tôi về tác dụng ức chế tyrosinase của cao

chiết EtOH lá Chùm ngây cho giá trị IC50 là 116,38 ± 2,6 g/mL. Kết quả này khá tương đồng với kết quả nghiên cứu của Hashim, F.J. và cộng sự (2021), dịch chiết của lá Chùm ngây cũng thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh theo cơ chế ức chế không cạnh tranh với giá trị IC50 là 121,3 ± 0,4 µg/mL [63]. Sự ức chế không cạnh tranh và giá trị Kii rất thấp được xác định từ chiết xuất lá Chùm ngây gợi ý mạnh mẽ về sự hiện diện của chất ức chế tyrosinase mạnh trong dịch chiết. Điều này sau đó đã được giải thích bởi trong lá Chùm ngây chứa hàm lượng lớn luteolin - được biết là hợp chất có tác dụng ức chế hoạt động tyrosinase không cạnh tranh [64].

Theo kết quả thử nghiệm của chúng tôi, cao chiết EtOH toàn phần của Diếp cá thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase yếu (ức chế 20,96 ± 0,71% hoạt tính tyrosinase ở nồng độ 500 µg/mL). Tuy nhiên, trong kết quả nghiên cứu của Shu Chen Chou và cộng sự (2009), Cepharadione B được phân lập từ chiết xuất MeOH của Diếp cá đã thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh mẽ với giá trị IC50 là 170 µM [65]. Kết quả giữa hai thử nghiệm có sự khác biệt có thể được giải thích do sự ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất như loại dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi, địa điểm thu hái dược liệu. Do đó, các nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất là cần thiết để có thêm bằng chứng trong việc lựa chọn dược liệu tốt phục vụ việc phát triển các sản phẩm làm trắng da trong tương lai.

Kết quả thử nghiệm cho thấy Rau má có hoạt tính ức chế tyrosinase yếu (ức chế 11,90% hoạt tính tyrosinase ở nồng độ 500 µg/mL). Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Sungthong và cộng sự (2015), cao chiết Rau má với EtOH 95% ở nồng độ 1,67 mg/mL có khả năng ức chế 31,25% hoạt tính của tyrosinase [66]. Kết quả của hai thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế tyrosinase của cao chiết EtOH Rau má không rõ rệt.

4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của cao phân đoạn Cam thảo

Theo kết quả đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase của cao tổng EtOH các dược liệu của chúng tôi, Cam thảo cho thấy tác dụng mạnh mẽ nhất với IC50 là

63,78 ± 0,52 g/mL. Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu của Chaita E [67] đã tiến

hành sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase của thân rễ Cam thảo trong điều kiện chiết xuất với MeOH bằng phương pháp chiết xuất dung môi tăng tốc (ASE). Kết quả cho thấy cao chiết MeOH của thân rễ Cam thảo có tác dụng ức chế tyrosinase

mạnh với giá trị IC50 là 2,1 ± 0,1 g/mL. Dựa trên kết quả của hai nghiên cứu này, có thể thấy việc lựa chọn dung môi chiết xuất có thể ảnh hưởng đến thành phần hợp chất trong mẫu thử, từ đó gián tiếp ảnh hưởng đến tác dụng ức chế tyrosinase của cao chiết Cam thảo.

Cũng trong nghiên cứu của chúng tôi, hoạt tính ức chế tyrosinase của các cao phân đoạn khác nhau từ thân rễ Cam thảo đã được nghiên cứu và xác định. Theo đó, phân đoạn EtOAc của Cam thảo thể hiện khả năng ức chế tyrosinase

mạnh nhất với IC50 là 75,81 ± 0,97 g/mL, lớn hơn 5 lần so với acid kojic (IC50 là

13,94 ± 0,30 g/mL) và lớn hơn 1,2 lần so với cao tổng EtOH (IC50 là 63,78 ± 0,2

g/mL). Sau đó là phân đoạn n-BuOH, n-Hexan với giá trị IC50 lần lượt là 134,22

± 3,79; 198,27 ± 1,30 g/ml. Phân đoạn nước không có tác dụng ức chế tyrosinase.

Như vậy, các cao phân đoạn thân rễ Cam thảo có hoạt tính ức chế tyrosinase khác nhau, trong đó các chất có hoạt tính ức chế tyrosinase chủ yếu nằm trong phân đoạn EtOAc.

Tác dụng ức chế tyrosinase mạnh mẽ của phân đoạn EtOAc thân rễ Cam thảo cũng đã được chứng minh bởi thử nghiệm của Chaita E và cộng sự, với giá trị IC50 là 4,7 ± 0,3 μg/mL, lớn hơn 2 lần so với chứng dương là acid kojic có IC50 là 1,9 ± 0,1 μg/mL [67].

Cùng với các tác dụng được thể hiện bởi chiết xuất Cam thảo, các hợp chất được phân lập từ lá và thân rễ Cam thảo cho thấy hoạt động chống lại sự hình thành hắc tố. Lin và đồng nghiệp đã báo cáo về hoạt tính ức chế tyrosinase đáng

chú ý của semilicoisoflavone B, allolicoisoflavone B và glabridin được phân lập từ Cam thảo với IC50 lần lượt là 0,25; 0,80; 0,10 µM [68].

Các hợp chất khác chẳng hạn như glabrene, isoliquiritigenin, licuraside, isoliquiritin và licochalcone A được phân lập từ chiết xuất Cam thảo cũng cho thấy tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase. Theo báo cáo của Ohad Nerya và cộng sự, glabrene và isoliquiritigenin có khả năng ức chế cả hoạt động monophenolase và diphenolase của tyrosinase [70]. Giá trị IC50 của glabrene và isoliquiritigenin lần lượt là 3,5 và 8,1 µM khi L-tyrosine được sử dụng làm cơ chất. Tác dụng ức chế hoạt động tyrosinase của glabrene và isoliquiritigenin phụ thuộc vào liều lượng và tương quan với khả năng ức chế sự hình thành hắc tố trong tế bào hắc tố. Bên cạnh đó, báo cáo của Boqiang Fu và cộng sự đã chỉ ra rằng licuraside, isoliquiritin và licochalcone A được phân lập từ Cam thảo có khả năng ức chế hoạt động monophenolase của tyrosinase như một chất ức chế cạnh tranh với giá trị IC50 lần lượt là 0,072, 0,038 và 0,0258 mM [69]. Điều này cho thấy rằng licuraside, isoliquiritin và licochalcone A có tiềm năng cao để tiếp tục phát triển thành các chất chống sạm da và khử sắc tố hiệu quả.

Như vậy, với các kết quả ghi nhận được, Cam thảo (Glycyrrhiza glabra L.) là một trong những dược liệu tiềm năng, thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh mẽ. Điều này góp phần không nhỏ vào việc cung cấp những dẫn liệu khoa học cho các ứng dụng trong y học sau này, nhất là trong việc tìm kiếm các hoạt chất cũng như phát triển các sản phẩm thảo dược có công dụng điều trị các bệnh lý tăng sắc tố da và làm trắng da.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Trong phạm vi đề tài “Sàng lọc tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của

một số dược liệu Việt Nam”, chúng tôi đã thu được những kết quả như sau:

1. Đã đánh giá được tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của một số dược liệu Việt Nam

Trong các cao dược liệu đã đánh giá, cao Cam thảo có tác dụng ức chế

tyrosinase tốt nhất với IC50 là 63,78 ± 0,52 g/mL, sau đó là cao hoa Hòe và Chùm

ngây với IC50 lần lượt là 92,51 ± 1,73 µg/mL và 116,38 ± 2,6 g/mL.

Cao Diếp cá, Rau má và Ngải cứu thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase thấp.

Song song làm với mẫu chứng dương là Acid kojic cho IC50 là 13,94 ± 0,30 g/ml.

2. Đã đánh giá được tác dụng ức chế tyrosinase in vitro của các phân đoạn khác nhau của cao chiết thân rễ Cam thảo.

Trong các cao chiết phân đoạn, phân đoạn EtOAc có giá trị IC50 thấp nhất là 75,81 ± 0,97 µg/mL, thể hiện tác dụng ức chế enzyme tyrosinase mạnh nhất, tiếp theo là phân đoạn n-BuOH, n-Hexan. Phân đoạn nước dường như không có tác dụng ức chế tyrosinase. Thứ tự tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của các phân đoạn Cam thảo giảm dần theo thứ tự như sau: EtOH > EtOAc > n- BuOH > n- Hexan.

KIẾN NGHỊ

Đề tài đã đánh giá được tác dụng ức chế tyrosinase của các cao phân đoạn thân rễ Cam thảo. Tuy nhiên, để có thể khai thác và sử dụng dược liệu này hiệu quả hơn trong việc phòng và điều trị các bệnh tăng sắc tố trên da và làm trắng da, chúng tôi xin đề xuất một số nội dung nghiên cứu tiếp theo:

 Phân lập chất, xác định hoạt tính và cơ chế ức chế tyrosinase in vitro của Cam

thảo.

 Đánh giá tác dụng ức chế tyrosinase in vivo của Cam thảo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Briganti S, Camera E, Picardo M: Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation. Pigment cell research 2003, 16:101-110. Slominski A, Tobin DJ, Shibahara S, Wortsman J: Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation. Physiological reviews 2004, 84:1155-1228.

Kooyers T, Westerhof W: Toxicology and health risks of hydroquinone in skin lightening formulations. Journal of the European academy of Dermatology Venereology 2006, 20:777-780.

4. Nakagawa M, Kawai K, Kawai K: Contact allergy to kojic acid in

skin care products. Contact dermatitis 1995, 32:9-13.

Parvez S, Kang M, Chung HS, Cho C, Hong MC, Shin MK, Bae H: Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents. Phytotherapy research : PTR 2006, 20:921-934.

6. Chang TS: An updated review of tyrosinase inhibitors. International

journal of molecular sciences 2009, 10:2440-2475.

Hamed SH, Sriwiriyanont P, deLong MA, Visscher MO, Wickett RR, Boissy RE: Comparative efficacy and safety of deoxyarbutin, a new tyrosinase-inhibiting agent. Journal of cosmetic science 2006, 57:291-308.

Baurin N, Arnoult E, Scior T, Do QT, Bernard P: Preliminary screening of some tropical plants for anti-tyrosinase activity. Journal of ethnopharmacology 2002, 82:155-158.

9. Cesarini JJAiSR: Melanins and their possible roles through

biological evolution. Advances in Space Research 1996, 18:35-40.

10. Raible DW, Wood A, Hodsdon W, Henion PD, Weston JA, Eisen JS: Segregation and early dispersal of neural crest cells in the embryonic zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 1992, 195:29-42.

11. Urabe K, Nakayama J, Hori Y, Norlund J, Biossy R, Hearing V, King R, Ortonne J: The pigmentary system: physiology and pathophysiology. by

Norlund JJ, Boissy RE, Hearing VJ, King RA, Ortonne JP, Oxford University Press, New York 1998:909-911.

12. Zolghadri S, Bahrami A, Hassan Khan MT, Munoz-Munoz J, Garcia- Molina F, Garcia-Canovas F, Saboury AA: A comprehensive review on tyrosinase inhibitors. Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry 2019, 34:279- 309.

13. D'Alba L, Shawkey MD: Melanosomes: Biogenesis, Properties, and

Evolution of an Ancient Organelle. Physiological reviews 2019, 99:1-19.

14. Gillbro JM, Olsson MJ: The melanogenesis and mechanisms of skin- lightening agents--existing and new approaches. International journal of cosmetic science 2011, 33:210-221.

15. Natale CA, Duperret EK, Zhang J, Sadeghi R, Dahal A, O'Brien KT, Cookson R, Winkler JD, Ridky TW: Sex steroids regulate skin pigmentation through nonclassical membrane-bound receptors. eLife 2016, 5.

16. Snell RS, Bischitz PG: The effect of large doses of estrogen and estrogen and progesterone on melanin pigmentation. The Journal of investigative dermatology 1960, 35:73-82.

17. Chwalisz K, Perez MC, Demanno D, Winkel C, Schubert G, Elger W: Selective progesterone receptor modulator development and use in the treatment of leiomyomata and endometriosis. Endocrine reviews 2005, 26:423- 438.

18. Schubert G, Elger W, Kaufmann G, Schneider B, Reddersen G, Chwalisz K: Discovery, chemistry, and reproductive pharmacology of asoprisnil and related 11beta-benzaldoxime substituted selective progesterone receptor modulators (SPRMs). Seminars in reproductive medicine 2005, 23:58-73.

19. DeManno D, Elger W, Garg R, Lee R, Schneider B, Hess-Stumpp H, Schubert G, Chwalisz K: Asoprisnil (J867): a selective progesterone receptor modulator for gynecological therapy. Steroids 2003, 68:1019-1032.

20. Sasaki H, Ohara N, Xu Q, Wang J, DeManno DA, Chwalisz K, Yoshida S, Maruo T: A novel selective progesterone receptor modulator asoprisnil

activates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)- mediated signaling pathway in cultured human uterine leiomyoma cells in the absence of comparable effects on myometrial cells. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 2007, 92:616-623.

21. Prota G: Progress in the chemistry of melanins and related

metabolites. Medicinal research reviews 1988, 8:525-556.

22. Şöhretoğlu D, Kırmızıbekmez H: Polyphenols from Potentilla recta.

Biochemical Systematics Ecology 2011, 39:132-134.

23. Schallreuter KU, Kothari S, Chavan B, Spencer JD: Regulation of melanogenesis--controversies and new concepts. Experimental dermatology 2008, 17:395-404.

24. Tan X, Song YH, Park C, Lee KW, Kim JY, Kim DW, Kim KD, Lee KW, Curtis-Long MJ, Park KH: Highly potent tyrosinase inhibitor, neorauflavane from Campylotropis hirtella and inhibitory mechanism with molecular docking. Bioorganic & medicinal chemistry 2016, 24:153-159.

25. Strothkamp KG, Jolley RL, Mason HS: Quaternary structure of mushroom tyrosinase. Biochemical and biophysical research communications 1976, 70:519-524.

26. Fan M, Zhang G, Hu X, Xu X, Gong D: Quercetin as a tyrosinase inhibitor: Inhibitory activity, conformational change and mechanism. Food research international (Ottawa, Ont) 2017, 100:226-233.

27. Goenka S, S RS: Asoprisnil, a Selective Progesterone Receptor Modulator (SPRM), Inhibits Melanosome Export in B16F10 Cells and HEMn-DP Melanocytes. Molecules (Basel, Switzerland) 2020, 25.

28. Nguyễn Nghiêm Luật: Hóa Sinh. NXB Y học; 2010. 29. Kotov N, Baker RE, Dawidov D, Platov K, Valeyev NV, Skorinkin A, Maini P: A study of the temperature dependence of bienzyme systems and enzymatic chains. Computational Mathematical Methods in Medicine 2007, 8:93- 112.

30. Sigma-Aldrich Product Information: TYROSINASE

from mushroom, 05/05/2023, Accessed [https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents /125/073/t7755pis.pdf]

31. Barber MJ, Siegel LM: Oxidation-Reduction Potentials of Molybdenum, Flavin, and Iron-Sulfur Centers in Milk Xanthine Oxidase: Variation with pH. Biochemistry 1982, 21:1638-1647.

32. Kahn V: Effect of kojic acid on the oxidation of DL-DOPA, norepinephrine, and dopamine by mushroom tyrosinase. Pigment cell research 1995, 8:234-240.

33. Verallo-Rowell VM, Verallo V, Graupe K, Lopez-Villafuerte L, Garcia-Lopez M: Double-blind comparison of azelaic acid and hydroquinone in the treatment of melasma. Acta dermato-venereologica Supplementum 1989, 143:58-61.

34. DeCaprio AP: The toxicology of hydroquinone--relevance to occupational and environmental exposure. Critical reviews in toxicology 1999, 29:283-330.

35. Yagi A, Kanbara T, Morinobu N: Inhibition of mushroom-tyrosinase

by aloe extract. Planta medica 1987, 53:515-517.

36. Schallreuter KU, Wood JW: A possible mechanism of action for azelaic acid in the human epidermis. Archives of dermatological research 1990, 282:168-171.

37. Zhongzhen Z: An illustrated Chinese materia medica in Hong Kong.

World Scientific; 2004.

38. Gong Y, Fan L, Wang L, Li J: Flos Sophorae Immaturus: Phytochemistry, bioactivities, and its potential applications. Food Reviews International 2021:1-19.

39. Wang KH, Lin RD, Hsu FL, Huang YH, Chang HC, Huang CY, Lee MH: Cosmetic applications of selected traditional Chinese herbal medicines. Journal of ethnopharmacology 2006, 106:353-359.

40. Lê Văn Minh, Phùng Bảo Chi, Nguyễn Hoàng Dũng: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TỔNG HỢP HẮC TỐ CỦA CÂY HOA HÒE (Sophora japonica L.) TRÊN DÒNG TẾ BÀO U HẮC TỐ B16F10 ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM.

41. Wang H, Li J, Tao W, Zhang X, Gao X, Yong J, Zhao J, Zhang L, Li Y, Duan JA: Lycium ruthenicum studies: Molecular biology, Phytochemistry and pharmacology. Food chemistry 2018, 240:759-766.

42. Shen M, Liu K, Liang Y, Liu G, Sang J, Li C: Extraction optimization and purification of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr. and evaluation of tyrosinase inhibitory activity of the anthocyanins. Journal of food science 2020, 85:696-706.

43. Dhakad AK, Ikram M, Sharma S, Khan S, Pandey VV, Singh A: Biological, nutritional, and therapeutic significance of Moringa oleifera Lam. Phytotherapy research : PTR 2019, 33:2870-2903.

44. Laksmiani NPL, Widiantara IWA, Pawarrangan ABS: Potency of moringa (Moringa oleifera L.) leaves extract containing quercetin as a depigmentation agent inhibiting the tyrosinase enzyme using in-silico and in-vitro assay. Pharmacia 2022, 69:85-92.

45. Nurzak AN, Baso FF: Skin Brightening Cream Formulation and Tyrosinase Inhibition Assay of Moringa Leaf Extract. International Journal of Pharmaceutical Bio Medical Science 2022, 2:187-190.

46. Wu Z, Deng X, Hu Q, Xiao X, Jiang J, Ma X, Wu M: Houttuynia cordata Thunb: An Ethnopharmacological Review. Frontiers in pharmacology 2021, 12:714694.

47. Nguyễn Hoàng Dũng, Lê Quỳnh Loan, Ki KE, Lê Văn Minh, Đặng Trần Quân: Khảo sát hoạt tính làm trắng da của rau Diếp cá (HOUTTUYNIA CORDATA THUNB.) Trên dòng tế bào U hắc tố B16F10 ứng dụng trong mỹ phẩm. 2016.

48. Van Hien T, Cherry GW: In vitro studies on the antioxidant and growth stimulatory activities of a polyphenolic extract from Cudrania

cochinchinensis used in the treatment of wounds in Vietnam. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society 1997, 5:159-167.

49. Zheng ZP, Zhu Q, Fan CL, Tan HY, Wang M: Phenolic tyrosinase inhibitors from the stems of Cudrania cochinchinensis. Food & function 2011, 2:259-264.

50. Lee GY, Cho BO, Shin JY, Jang SI, Cho IS, Kim HY, Park JS, Cho CW, Kang JS, Kim JH, Kim YH: Tyrosinase inhibitory components from the seeds of Cassia tora. Archives of pharmacal research 2018, 41:490-496.

51. Belcaro G, Maquart FX, Scoccianti M, Dugall M, Hosoi M, Cesarone MR, Luzzi R, Cornelli U, Ledda A, Feragalli B: TECA (Titrated Extract of Centella Asiatica): new microcirculatory, biomolecular, and vascular application in preventive and clinical medicine. A status paper. Panminerva medica 2011, 53:105-118.

52. Bonte F, Dumas M, Chaudagne C, Meybeck A: Influence of asiatic acid, madecassic acid, and asiaticoside on human collagen I synthesis. Planta medica 1994, 60:133-135.

53. Kwon MC, Choi WY, Seo YC, Kim JS, Yoon CS, Lim HW, Kim HS, Ahn J, Lee HY: Enhancement of the skin-protective activities of Centella asiatica L. Urban by a nano-encapsulation process. Journal of biotechnology 2012, 157:100-106.

54. Li WD, Hou JL, Wang WQ, Tang XM, Liu CL, Xing D: Effect of water deficit on biomass production and accumulation of secondary metabolites in roots of Glycyrrhiza uralensis. Russian journal of plant physiology: a comprehensive Russian journal on modern phytophysiology 2011, 58:538-542.

55. Mukherjee PK, Biswas R, Sharma A, Banerjee S, Biswas S, Katiyar C: Validation of medicinal herbs for anti-tyrosinase potential. Journal of herbal medicine 2018, 14:1-16.

56. Butt MS, Nazir A, Sultan MT, Schroën K: Morus alba L. nature's

functional tonic. Trends in food science technology 2008, 19:505-512.

57. Zhang L, Tao G, Chen J, Zheng ZP: Characterization of a New Flavone and Tyrosinase Inhibition Constituents from the Twigs of Morus alba L. Molecules (Basel, Switzerland) 2016, 21.

58. Kosar M, Küpeli E, Malyer H, Uylaser V, Türkben C, Baser KH: Effect of brining on biological activity of leaves of Vitis vinifera L. (Cv. Sultani Cekirdeksiz) from Turkey. Journal of agricultural and food chemistry 2007, 55:4596-4603.

59. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, Huang WY: Kinetics of Tyrosinase Inhibitory Activity Using Vitis vinifera Leaf Extracts. BioMed research international 2017, 2017:5232680.

60. Abiri R, Silva ALM, de Mesquita LSS, de Mesquita JWC, Atabaki N, de Almeida EB, Jr., Shaharuddin NA, Malik S: Towards a better understanding of Artemisia vulgaris: Botany, phytochemistry, pharmacological and biotechnological potential. Food research international (Ottawa, Ont) 2018, 109:403-415.

61. Chi HT, Ly BTK: Artemisia vulgaris inhibits BCR/ABL and promotes apoptosis in chronic myeloid leukemia cells. Biomedical reports 2022, 17:92.

62. Ekiert H, Pajor J, Klin P, Rzepiela A, Ślesak H, Szopa A: Significance of Artemisia Vulgaris L. (Common Mugwort) in the History of Medicine and Its Possible Contemporary Applications Substantiated by Phytochemical and Pharmacological Studies. Molecules (Basel, Switzerland) 2020, 25.

63. Hashim FJ, Vichitphan S, Han J, Vichitphan K: Alternative Approach for Specific Tyrosinase Inhibitor Screening: Uncompetitive Inhibition of Tyrosinase by Moringa oleifera. Molecules (Basel, Switzerland) 2021, 26.

64. Xie LP, Chen QX, Huang H, Wang HZ, Zhang RQ: Inhibitory effects of some flavonoids on the activity of mushroom tyrosinase. Biochemistry Biokhimiia 2003, 68:487-491.

65. Chou SC, Su CR, Ku YC, Wu TS: The constituents and their bioactivities of Houttuynia cordata. Chemical & pharmaceutical bulletin 2009, 57:1227-1230.

66. Sungthong B, Phadungkit M: Anti-tyrosinase and DPPH radical scavenging activities of selected Thai herbal extracts traditionally used as skin toner. Pharmacognosy Journal 2015, 7.

67. Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, Agalou A, Beis D, Trougakos I, Mikros E, Skaltsounis A-L, Aligiannis N: Anti-Melanogenic Properties of Greek Plants. A Novel Depigmenting Agent from Morus alba Wood. Molecules 2017, 22:514.

68. Cerulli A, Masullo M, Montoro P, Piacente S: Licorice (Glycyrrhiza glabra, G. uralensis, and G. inflata) and Their Constituents as Active Cosmeceutical Ingredients. Cosmetics 2022, 9:7.

69. Fu B, Li H, Wang X, Lee FS, Cui S: Isolation and identification of flavonoids in licorice and a study of their inhibitory effects on tyrosinase. J Agric Food Chem 2005, 53:7408-7414.

70. Nerya O, Vaya J, Musa R, Izrael S, Ben-Arie R, Tamir S: Glabrene and isoliquiritigenin as tyrosinase inhibitors from licorice roots. J Agric Food Chem 2003, 51:1201-1207.

71. Nautiyal A, Wairkar S: Management of hyperpigmentation: Current treatments and emerging therapies. Pigment Cell Melanoma Res 2021, 34:1000- 1014.

72. Handel AC, Miot LD, Miot HA: Melasma: a clinical and

epidemiological review. An Bras Dermatol 2014, 89:771-782.

73. Praetorius C, Sturm RA, Steingrimsson E: Sun-induced freckling:

ephelides and solar lentigines. Pigment Cell Melanoma Rre 2014, 27:339-350.

74. Rathore SP, Gupta S, Gupta V: Pattern and prevalence of physiological cutaneous changes in pregnancy: a study of 2000 antenatal women. Indian J Dermatol Venereol Leprol 2011, 77:403.

75. Esteve E, Saudeau L, Pierre F, Barruet K, Vaillant L, Lorette G: Physiological cutaneous signs in normal pregnancy: a study of 60 pregnant women. Ann Dermatol Venereol 1994, 121:227-231.

76. Martin AG, Leal-Khouri S: Physiologic skin changes associated with

pregnancy. Int J Dermatol 1992, 31:375-378.