Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.): Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC

ĐẶNG KIM NGÂN

NGHIÊN CỨU

HOẠT CHẤT GINSENOSID Rb1 TRONG LÁ SÂM VIỆT NAM

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC

Người thực hiện: ĐẶNG KIM NGÂN

NGHIÊN CỨU

HOẠT CHẤT GINSENOSID Rb1 TRONG LÁ SÂM VIỆT NAM

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƢỢC HỌC)

Khóa:

QH.2018.Y

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN H U T NG

2. TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

Hà Nội – 2023

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận

được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ vô cùng quý báu của Ban giám hiệu, các thầy

cô giáo của Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Trường Đại học PHENIKAA cùng với gia đình và bạn bè.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA, người thầy đã trực

tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, quan tâm chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời

cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình – Trưởng Bộ môn Hóa dược và Kiểm

nghiệm, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trao cho em cơ hội

để có thể làm và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp đồng thời dành thời gian

hướng dẫn, góp ý cho em trong quá trình hoàn thiện khóa luận.

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy TS. Vũ Văn Tuấn

và TS. Nguyễn Ngọc Hiếu, Trường Đại học PHENIKAA, hai thầy đã nhiệt tình,

giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn, góp ý cho em trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thiện đề tài ở trường Đại học PHENIKAA. Cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Y

Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền dạy cho em những

kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ,

động viên và khích lệ trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

Ngân

Đặng Kim Ngân

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CH VIẾT TẮT

STT Ký hiệu, chữ viết tắt Tên đầy đủ

1 n-butanol BuOH

2 Methylene chloride CH2Cl2

3 Chloroform CHCl3

4 Ethanol EtOH

5 Acid sulfuric H2SO4

6 Methanol MeOH

7 Mass Spectroscopy MS

8 Nuclear Magnetic Resonance NMR

9 Ginsenosid-Rb1 PV1

10 Sâm Việt Nam SVN

11 Sắc ký lớp mỏng TLC

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

STT Tên hình Trang

Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & 1 5 Grushv)

2 Hình 1.2. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam 7

Hình 1.3. (A) Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax

vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lược về nhân sâm Việt Nam và sự 3 9

phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam. (B) Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam

4 Hình 1.4. Cấu trúc của 20(S)-protopanaxadiol 10

5 Hình 1.5. Cấu trúc của 20(S)- protopanaxatriol 12

6 Hình 1.6. Cấu trúc của saponin có cấu trúc Ocotillol 13

7 Hình 1.7. Cấu trúc của saponin dẫn chất của acid oleanolic 15

8 20

Hình 1.8. (1): squalene; (2): tetradecanol; (3): α – tocopherolquinone; (4): docosanol; (5): daucosterol; (6): kaempferol; (7): panaxolide; (8) ginsenoside R10; (9): kaempferol 3– O–β–D–glucosyl (12)– β –D–galactoside; (10): junipediol A.

Hình 2.1. Mẫu lá của Sâm Việt Nam được sử dụng trong nghiên 9 22 cứu

10 Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI) 24

11 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất từ lá sâm Việt Nam 30

12 Hình 3.2. Hình ảnh phổ 1H-NMR của hợp chất 34

13 Hình 3.3. Hình ảnh phổ 13C-NMR của hợp chất 38

14 Hình 3.4. Hình ảnh phổ ESI- MS của hợp chất (positive [M+H]+) 39

15 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của PV1 40

41 16 Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC định tính hợp chất Rb1 trong lá sâm Việt

Nam

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1 Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol 10

2 Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 12

3 Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc ocotillol 14

4 Bảng 1.4. Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic 15

Bảng 1.5. Hàm lượng saponin của SVN so sánh với các loại 5 16 Panax spp

6 Bảng 1.6. Các saponin dẫn chất của 20(S) protopanaxadiol 18

7 Bảng 1.7. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 18

8 Bảng 1.8. Các saponin có cấu trúc ocotillol 19

9 Bảng 2.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 23

10 Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu 24

11 Bảng 2.3. Hóa chất dùng làm từng loại cột 27

12 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất PV1 36

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM .................................................... 3

1.1. Đặc điểm thực vật .................................................................................................. 3

1.1.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................. 3

1.1.2. Phân loại .......................................................................................................... 4

1.2. Danh pháp khoa học .............................................................................................. 5

1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................................. 6

1.4. Sinh thái và phân bố .............................................................................................. 7

1.5. Thành phần hóa học ............................................................................................... 9

1.5.1. Thành phần hoá học từ phần dưới mặt đất của cây sâm Việt Nam ................. 9

1.5.1.1. Các hợp chất saponin ................................................................................ 9

1.5.1.2. Hợp chất polyacetylen ............................................................................ 16

1.5.1..3. Thành phần acid béo .............................................................................. 16

1.5.1.4. Thành phần acid amin ............................................................................. 16

1.5.1.5. Thành phần các nguyên tố vi đa và vi lượng .......................................... 17

1.5.1.7. Hợp chất glucid ....................................................................................... 17

1.5.2. Thành phần hoá học từ phần trên mặt đất của cây sâm Việt Nam ................ 17

1.5.2.1. Các hợp chất saponin .............................................................................. 17

1.5.2.2. Một số hợp chất mới ............................................................................... 19

1.6. Công dụng trong y học cổ truyền ........................................................................ 21

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 22

2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 22

2.1.1. Mẫu lá Sâm Việt Nam ................................................................................... 22

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ............................................................................ 23

2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................... 23

2.1.3.2. Hóa chất, dung môi ................................................................................. 24

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất .............................................................. 25

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .......................................................................... 25

2.2.1.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) ................................................................. 26

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất .................................. 28

2.2.2.1. Phương pháp phân tích khối phổ (Mass Spectroscopy - MS) ................ 28

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance - NMR) .... 28

2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................ 25

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................. 30

3.1. Chiết xuất, phân lập ............................................................................................. 30

3.2. Xác định cấu trúc chất ......................................................................................... 31

3.2.1. Phổ 1H- NMR ................................................................................................ 32

3.2.2. Phổ 13C-NMR ................................................................................................ 35

3.2.3. Phổ MS .......................................................................................................... 39

3.2.4. Kết luận ......................................................................................................... 39

3.3. Định tính Rb1 trong lá sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ....... 40

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ........................................................................................... 42

4.1. Về phương pháp nghiên cứu. ............................................................................... 42

4.2. Về thành phần hóa học Ginsenoside Rb1 ............................................................. 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời gian gần đây, mọi người đang có xu hướng sử dụng các sản phẩm

có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị bệnh vì đặc tính an toàn, ít gây tác

dụng phụ và hiệu quả điều trị cao. Bởi vậy việc đi sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm các

hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được quan tâm. Đặc biệt là Việt Nam - một đất nước có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng và tiềm năng to lớn

về tài nguyên cây thuốc với 4000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 động vật làm thuốc [1]. Không ngoại lệ, sâm Việt Nam (sâm

Ngọc Linh) là một loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng. Sâm Việt Nam có

tên khoa học là Panax vietnamensis Ha & Grushv, là một trong 12 loài thuộc chi

Nhân sâm (Panax), họ Ngũ gia bì (Araliaceae) được phát hiện lần đầu trong tự

nhiên ở vùng núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Kon Tum và Quảng Nam vào năm 1973 và

được chính thức ghi nhận đầy đủ về mặt định danh thực vật học năm 1985 [2]. Đây

loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới và cho đến nay chỉ mới phát hiện ở

Việt Nam. Kể từ khi được phát hiện và ghi nhận là một loài Panax mới, SVN đã

được sự quan tâm nghiên cứu về phân loại thực vật của các nhà khoa học trên thế

giới học [3-6]. Ngoài 26 hợp chất saponin tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên,

trong sâm Việt Nam còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác như majonoside

R1-2, vinaginsenoside R1-11 và các saponin khác thuộc nhóm glycosid, các saponin chính phải kể đến như majonoside-R2, ginsenoside-Rb1, ginsenoside-Rg1 và ginsenoside-Rd [7]. Các saponin từ SVN đã được chứng minh có tác dụng bồi bổ

sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống ôxy hóa, phòng chống ung

thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận [8]…

Tuy nhiên, hiện nay các nghiên cứu được công bố chủ yếu là về các thành

phần saponin trong rễ cũng như tác dụng sinh của rễ SVN mà có ít các nghiên cứu

về thành phần hoạt chất saponin trong lá SVN. Bởi vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học, đặc biệt là saponin trong lá sâm Việt Nam là cần thiết, từ đó tạo cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu, phát triển các sản phẩm từ bộ phận lá của SVN.

Bên cạnh đó, các kỹ thuật sắc ký hiện nay được sử dụng rất rộng rãi để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường,… vì nhiều lý do như có

độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [9].

Từ những cơ sở trên, để tiến hành nghiên cứu và đánh giá thành phần hoạt

chất của lá sâm Việt Nam trong phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu hoạt chất Ginsenosid Rb1 trong lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)” với 2 mục tiêu chính:

1. Chiết xuất, phân lập thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam.

2. Xác định cấu trúc của thành phần saponin ginsenoside Rb1 trong mẫu cao lá sâm Việt Nam.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SÂM VIỆT NAM

1.1. Đặc điểm thực vật

1.1.1. Lịch sử phát hiện

Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Việt Nam đã được

các đồng bào dân tộc thiểu số Trung Trung bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc

giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Dựa trên những thông tin lưu truyền trong cộng đồng các dân tộc thiểu số Quảng Nam, Kon Tum về một

loại củ quý hiếm trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người, và

do nhu cầu của kháng chiến đã khiến ngành dược khu Trung Trung Bộ quyết phải

tìm ra cây sâm chi Panax tại miền Trung, mặc dù trước đó nhiều nhà khoa học cho

rằng chi Panax chỉ có ở miền Bắc.

Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim

Long làm trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược

sĩ Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi

Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Khi đoàn lên tỉnh Kon Tum, Ban

Dân y Kon Tum cử thêm dược tá Nguyễn Thị Lê trợ giúp cho đoàn, dẫn đường lên

núi Ngọc Linh. Sau nhiều ngày vượt suối băng rừng, đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng

03 năm 1973, ở độ cao 1.800 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây sâm

đầu tiên và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn

thuộc phía Tây núi Ngọc Linh. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh

thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác

định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm, chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác trên thế giới. Theo đánh giá của Tiến sĩ Trần Chí

Liêm, Thứ trưởng Bộ Y tế Việt Nam: đây là cống hiến quan trọng cho khoa học, bổ sung tri thức mới về vùng phân bố chi Panax xuống tới vĩ tuyến 15 và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới.

Sau khi sâm được phát hiện, Khu uỷ Khu 5 đã chỉ đạo Ban Dân y bí mật bảo

vệ và khai thác, giao cho xưởng Dược Trung Trung Bộ chế biến làm thuốc phục vụ cán bộ, chiến sĩ và nhân dân; đồng thời gửi mẫu ra Bộ Y tế, Viện Dược liệu Hà Nội.

Những năm sau khi hòa bình lập lại, tháng 10 năm 1978 một tổ công tác thứ

hai lên vùng núi Ngọc Linh với nhiệm vụ ước lượng sơ bộ diện tích sâm mọc. Kết 3

quả chuyến đi là việc tìm ra được một vùng dài hàng chục kilômét, có trữ lượng khoảng 6.000-7.000 cây sâm mọc dày đặc với mật độ từ 1 mét vuông một cây đến

7,8 mét vuông một cây.

Nǎm 1979, Trung tâm Y tế Quảng Nam tổ chức điều tra ở 5 xã của huyện

Trà My với sự giúp đỡ của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả đợt điều tra là việc tìm thấy 1.337 cây trong 211 ô tiêu chuẩn. Trọng lượng trung bình

thân rễ sâm là 5,26 gam; số thân có trọng lượng trên 25 gam là 7,39% và số thân rễ có trên 10 sẹo (ước tính trên 8 năm tuổi) là 36,9%. Đợt điều tra này đã thu được 1

thân rễ có tới 52 sẹo (ước tính cây trên 50 năm tuổi), đường kính 1,2 cm, tuy đây

chưa phải là thân rễ sống lâu nhất. Trong những đợt tìm kiếm, điều tra về sau còn

phát hiện ra cây khoảng 82 năm tuổi có rễ, củ và thân rễ dài hơn nửa mét [7,10-12].

1.1.2. Phân loại

Sâm Việt Nam với danh pháp khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv,

ngoài tên gọi chính thống là Sâm Việt Nam còn có nhiều tên khác như sâm Ngọc

Linh, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc), củ ngải rọm con, rơm con

(Xê Đăng) hay cây thuốc giấu [7,12-14], và có vị trí phân loại theo hệ thống phân

loại thực vật như sau:

Giới: Thực vật (Plantae)

Ngành: Mộc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Mộc lan (Magnoliopsida)

Bộ: Hoa tán (Apiales)

Họ: Ngũ gia bì (Araliaceae)

Chi: Sâm (Panax)

Loài: Panax vietnamensis Ha & Grushv

Hình 1.1. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv)

(https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html)

1.2. Danh pháp khoa học

Ngày 8 tháng 6 năm 1973 tại văn phòng Ban Dân y Khu 5 dược sĩ Đào Kim

Long, chủ nhiệm đề tài nghiên cứu sâm Việt Nam đã nêu rõ đặc điểm hình thái, sinh

thái học, quần thể, thảm thực vật, khả năng thích nghi, cách phát tán, khả năng tái

sinh của cây nhân sâm này, kèm theo báo cáo có các tiêu bản mẫu cây ép khô, ảnh

chụp và 3kg sâm đã phơi khô. Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây

sâm Việt Nam này là Panax articulatus KL Dao (trong kháng chiến để giữ bí mật

nên thường gọi là Sâm K5), hay Panax articulatus Kim Long Đào theo tên người

phát hiện. 12 năm sau, tên Nhân sâm Việt Nam và tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushy, họ Ngũ gia bì - Araliaceae, được công bố tại Viện Thực

vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvisky đặt tên. Áp dụng Quy tắc quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN - Tokyo code), điều 1, mục 3 phần C, danh pháp khoa học của sâm Việt Nam có thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex, và khi đó tên

khoa học của cây nhân sâm Việt Nam được viết hợp pháp theo luật quốc tế hiện nay sẽ phải là Panax articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Grushv (1985) [10-12].

1.3. Đặc điểm hình thái

Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, sống lâu năm, cao 40-80cm. Thân rễ

nạc, có đường kính từ 3,5 cm; mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không

phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng

năm để lại, căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của các cây sâm, mặt ngoài thân rễ màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối thân rễ ở một số cây

đôi khi có củ gần hình cầu, đường kính đến 5 cm. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân. Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 40 - 80cm, rỗng, có 3 mặt

hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc.

Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt, mọc vòng thường có 4

(hiếm khi 3,5 hoặc 6). Ở ngọn, mỗi lá kép gồm 5 lá chét (ít khi có 6,7), lá dài 7 -

12cm; lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 -14 cm, rộng 3 -

5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5 – 2cm, góc lá hình nêm, mép

lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên 19 (ít khi 8-11) cặp dọc theo gân chính và gân bên

ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3mm, mặt dưới ít hơn.

Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang một

tán đơn, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ hoặc một hoa đơn độc. Cuống hoa dài 1,5 – 2

cm, có nhiều lông. Tán hoa chính đường kính 2,5 - 4 cm, có 50 - 120 hoa. Hoa màu

vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm; đài 5 răng hình tam giác dài 1 – 1,5 cm;

tràng có 5 cánh hoa hình trứng dài 2mm; bao phấn hình trái xoan dài 1mm và có 5

nhị. Bầu 1 ô, 1 vòi (chiếm 80%) đôi khi có 2 ô, 2 vòi (chiếm 20%).

Quả mọng, hình trứng, khi chín màu đỏ và thường có 1 chấm đen ở trên đỉnh

quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình cầu hơi dẹt dài 7 – 10mm, rộng 4- 6mmm. Hạt lớn dài 8mm, vỏ hạt cấu tạo bởi nhiều vết xốp lồi lõm. Ra hoa vào

tháng 4 - 6, quả có vào tháng 7 – 9 [7,12,15].

Hình 1.2. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam

(https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html)

1.4. Sinh thái và phân bố

Trong số hơn 10 loài và dưới loài (var.) đã biết của chi Nhân sâm (Panax L),

ở Việt Nam có 3 loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Việt Nam là loài được phát hiện sau cùng nhất (1972), cho đến năm 1985 nó mới được công bố

là loài mới đối với khoa học (Hà Thị Dung và Grus Vitzki B, 1985).

Cho đến nay, sâm Việt Nam mới chỉ phát hiện được duy nhất ở vùng núi

Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía nam (ở 15o vĩ Bắc) của bản đồ phân bố chi Panax L trên thế giới. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ 2 của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o15’ - 108o7’ kinh độ Đông và15o0’0’’- 15o10’ vĩ độ Bắc). Đỉnh cao nhất của Ngọc Linh là 2598m. Những điểm vốn trước đây có sâm Việt Nam mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500-2000m, chủ yếu tập trung ở 1800-2000m, thuộc địa bàn 2 huyện Đắk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà

My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như mức độ phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi.

Sâm Việt Nam là loại cây thảo đặc biệt sinh trưởng ở độ cao từ 1500 – 2200

m so với mặt nước biển, cây đặc biệt ưa ẩm và bóng, thường mọc rải rác hay tập

trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, nhất là dọc theo hành lang ven suối ở độ cao từ 1900 m. Môi trường rừng nơi có sâm Việt Nam

mọc tự nhiên luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù. Nhiệt độ trung bình ước tính

từ 15⁰C đến 18⁰C; lượng mưa xấp xỉ khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo từ lá cây mục lâu ngày nên đất có màu nâu rêu, tơi xốp, độ mùn cao và chứa nhiều nước trong đất. Sâm Việt Nam sinh trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ

mùa xuân đến hè, mặc dù ở miền Nam lúc này đang là cuối mùa khô - đầu mùa mưa

nhưng ở vùng núi Ngọc Linh do có độ cao và thảm thực vật nguyên sinh nên môi

trường luôn ẩm ướt.

Loài cây này có mùa hoa vào tháng 4-5, mùa quả vào tháng 6-9, cây ra quả

tương đối đều. Khi quả chín sẽ rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông và nảy mầm

vào mùa xuân năm sau. Gieo giống tự nhiên bằng hạt. Phần thân rễ bị gãy còn lại

vẫn có thể tái sinh. Cây thường lụi hàng năm vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm

sau từ thân rễ sẽ mọc lên chồi thân mới.

Sau nhiều năm điều tra phát hiện, từ năm 1978, sâm Việt Nam bắt đầu được

phát động khai thác ồ ạt, dẫn đến việc sâm Việt Nam rơi vào thời kỳ bị đe dọa tuyệt

chủng, đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “Đang nguy

cấp”. Hai tỉnh Quảng Nam (trước đây là Quảng Nam- Đà Nẵng) và Kon Tum đã

kiên trì đầu tư để duy trì bảo tồn giống và hiện nay có khoảng 200.000 cây ở các lứa

tuổi khác nhau. Cây trồng bán tự nhiên dưới tán rừng, ở độ cao 1800, đã tỏ ra có kết

quả, sau 3-4 năm bắt đầu thu được hạt giống tốt để gieo trồng. Việc bảo vệ cây sâm

Việt Nam và nghiên cứu nhân trồng tại chỗ loài cây đặc biệt quý hiếm này, hiện vẫn là nhiệm vụ hàng đầu trong công tác bảo tồn cây thuốc ở Việt Nam [7,12].

(A) (B)

Hình 1.3. (A) Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha

and Grushv). Sơ lƣợc về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân

sâm Việt Nam ở Việt Nam. (B) Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam

[17]

1.5. Thành phần hóa học

1.5.1. Thành phần hoá học từ phần dưới mặt đất của cây sâm Việt Nam

Sâm Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu ngay từ khi loài này được phát

hiện ở Việt Nam vào những năm cuối của thế kỉ XX. Từ 1974 đến 1990, các tác giả

Nguyễn Thời Nhâm và Trần Công Luận đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam hoang dại, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện

hơn và sâu hơn của các thành phần hóa học có ở loài cây này [12,14,16]. Kể từ báo

cáo đầu tiên vào năm 1993, cho đến nay đã có 52 hợp chất saponin trong Sâm Việt

Nam đã được phân lập và xác định cấu trúc [14,17]. Các hợp chất này chủ yếu được

phân lập từ rễ và thân rễ của Sâm Việt Nam. Ngoài saponin, trong Sâm Việt Nam

các tác giả cũng xác định được trong sâm có chứa các polyacetylen, acid béo, acid amin, glucid, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng khác có trong loài sâm này

[7,14,16,18-20].

1.5.1.1. Các hợp chất saponin Chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt

Nam cũng như của các loài sâm khác trên thế giới.

Từ những nghiên cứu về phần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin bao gồm

26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới đã phát hiện trong Sâm Việt Nam được đặt tên là vina – ginsenosid-R1-R25 và 20-O-Me-G.Rh1 [14,21].

Các saponin của Sâm Việt Nam được xác định hầu hết thuộc loại dammarane triterpene chúng có thể được phân loại thêm thành các nhóm protopanaxadiol

(PPD), protopanaxatriol (PPT) và occotillol (OT) ngoại trừ cho hai saponin loại oleanane (ginsenosid Ro và hemslosid Ma3) [16,17,22].

Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng

sinh học có giá trị cũng chiếm một tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong

thành phần hợp chất saponin của Sâm Việt Nam (50/52 saponin được phân lập)

[14,23].

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol

Các saponin dẫn chất của 20(S)- protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại

diện chính là G-Rb1 chiếm 2,0% về hàm lượng [4,14].

Hình 1.4. Cấu trúc của 20(S)-protopanaxadiol

Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol [3,4,7,14,16,17]

STT Tên Kiểu Hàm lƣợng (%) R2 R1

(A) -Glc2- Glc -Glc6- Glc 2,0 1 G-Rb1*

(A) -Glc2- Glc -Glc6-Ara(p) 0,012 2 G-Rb2

(A) -Glc2- Glc -Glc6-Xyl 0,11 3 G-Rb3*

G-Rc (A) -Glc2- Glc -Glc6-Ara(f) 0,013 4

G-Rd* (A) -Glc2- Glc -Glc 0,87 5

(A) -Glc2- Glc6-Ac -Glc 0,001 6 PG-RC1

GY-IX (A) -Glc -Glc6-Xyl 0,002 7

GY-XVII (A) -Glc -Glc6- Glc 0,036 8

Q-R1 (A) -Glc2- Glc6-Ac -Glc6- Glc 0,012 9

Q-R1 (A) -Glc2- Glc2-Xyl -Glc6- Glc 0,072 10

M-F1 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,001 11

VG-R3 (H) -Glc2- Glc -Glc 0,009 12

VG-R7 (A) - Glc2- Glc2-Xyl -Glc 0,01 13

VG-R8 (C) -Glc2- Glc -Glc 0,004 14

VG-R9 (B) -Glc2- Glc -Glc 0,004 15

VG-R13 (E) -Glc2- Glc -Glc 0,002 16

VG-R24 (A) -Glc2-Xyl -Glc 0,001 17

VG-R23 (A) -Glc2- Glc -Ara 0,001 18

VG-R22 (A) -Glc2- Glc -Xyl 0,001 19

VG-R16 (D) -Glc2- Glc -Glc 0,003 20

VG-R21 (G) -Glc2- Glc -Glc 0,001 21

VG-R20 (F) -Glc2- Glc -Glc 0,003 22

Ghi chú: G= ginsenoside; PG= pseudo-ginsenoside; GY= gypenoside;

Q= quinquenoside; N= notoginsenoside; M= majonoside; VG= vina-ginsenoside.

*: các saponin chính

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol

Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các

đại diện chính là: ginsenoside- Re, -Rg1, notoginsenoside –R1 [7].

Hình 1.5. Cấu trúc của 20(S)- protopanaxatriol

Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol [3,4,7,14,16]

STT Tên Kiểu R2 R3 R1 Hàm lƣợng (%)

G-Re* (I) -Glc2-Rha -Glc -H 0,17 23

20-Glc-G-Rf (I) -Glc2-Glc -Glc -H 0,01 24

(I) -Glc -Glc -H 1,37 25 G-Rg1*

(I) -Glc -H -H 0,008 26 G-Rh1 20(R),20(S)

(I) -Glc -H -H 0,021 27 G-Rh1

(I) -Glc2-Rha-6Ac -Glc -H 0,013 28 PG-RS1

(I) -Glc2-Xyl -Glc -H 0,36 29 N-R1*

(I) -Glc -H 0,01 30 N-R6 -Glc6- αGlc

VG-R4 (I) -Glc2-Glc -H -Glc 0,004 31

VG-R12 (K) -H -Glc -H 0,005 32

VG-R15 (J) -H -Glc -Glc 0,003 33

VG-R17 (K) -H -Glc -Glc 0,002 34

VG-R18 (K) -H -Glc -Glc 0,002 35

VG-R19 (L) -Glc2-Glc -H -Glc 0,006 36

(I) -H -Glc 0,015 37 OMe-GRh1 -CH3

VG-R25 (G) -H -Glc -Glc 0,003 38

(M) -H -Glc -H 0,014 39 G-Rh4

Ghi chú: *: các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protppanaxatriol;Glc: b-D-glucopyranosyl; a-Glc: a-glucopyranosyl; GlcA: b-D-

glucoronopyranosyl; Rha: a-L-rhamnopyranosyl; Xyl: b-D-xylopyranosyl; Ara: a--

arabinopyranosyl; Ara(f): a-L-arabinofuranosyl; Ara(p): a-L-arabinopyranosyl;

Ac: acetyl.

Các saponin có cấu trúc Ocotillol

Các saponin có cấu trúc Ocotillol bao gồm 11 hợp chất với các đại diện là:

majonosid-R1 và -R2. Đặc biệt M-R2 chiếm 5,29% hàm lượng saponin và là hợp

chất chủ yếu của Sâm Việt Nam so với thành phần saponin trong các loài sâm khác

trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Panax japonicum C.A. Mey. var.

major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng [14].

Hình 1.6. Cấu trúc của saponin có cấu trúc Ocotillol

Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc ocotillol [3,4,7,14,16,17]

Hàm lƣợng STT Tên Kiểu R1 R2 (%)

(N) -Glc 0,065 40 PG-RT4 -CH3

(N) -Glc2-Rha 0,005 41 -CH3 24(S)-PG- F11

(N) -Glc2-Glc 0,14 42 M-R1* -CH3

(N) -Glc2-Xyl 5,29 43 M-R2 * -CH3

VG-R1 (N) -Glc2-Rha-6Ac 0,033 44 -CH3

VG-R2 (N) -Glc2-Xyl-6Ac 0,014 45 -CH3

VG-R5 (N) -Glc2-Xyl4-αGlc 0,008 46 -CH3

VG-R6 (N) -Glc2-Xyl-6Ac 0,006 47 -CH3

VG-R14 (N) -Glc2-Xyl 0,02 48 -CH2OH

VG-R10 (O) -Glc 0,007 49 -CH3

VG-R1 (O) -Glc2-Xyl 0,03 50 -CH3

Ghi chú: *: Các saponin chính trong thành phần có cấu trúc ocotillol

Các saponin dẫn chất của acid oleanolic

Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic chỉ chiếm một tỉ lệ rất thấp với

hemsloside –Ma3 được phát hiện đầu tiên trong một loài Panax thuộc họ Nhân sâm.

Hợp chất này trước đây đã được phân lập từ Hemsleya macrosperma C.Y.Wu họ

Bầu bí (Cucurbitaceae) [14].

Hình 1.7. Cấu trúc của saponin dẫn chất của acid oleanolic

Bảng 1.4. Hai saponin dẫn chất của acid oleanolic [3,4,7,14,16]

STT Tên Kiểu Hàm lƣợng (%) R1 R2

G-R0 (P) -Glc2-Glc 0,038 -Glc 51

H-Ma3 (P) -Glc2-Glc-3Ara(p) 0,05 -Glc 52

So sánh

Sâm Việt Nam chứa nhiều saponin hơn các loài Panax khác trên thế giới như

Panax ginseng (sâm Hàn Quốc), Panax quinquefolium (sâm Mỹ), Panax notoginseng (sâm Trung Quốc) và một lượng lớn saponin loại ocotillol không có trong Panax ginseng (sâm Hàn Quốc) [24].

Bảng 1.5. Hàm lƣợng saponin của SVN so sánh với các loại Panax spp [7]

Panax Panax Panax Panax Loại aglycon ginseng notoginseng quinquefolius vietnamensis

2,9 2,1 2,7 3,1 20(S)-ppd

0,6 2,4 1,2 2,0 20(S)-ppt

- - 0,04 5,6 Ocotillol

0,02 - 0,07 1,09 Oleanolic acid

Hiệu suất 3,5 4,5 4,0 10,8 toàn phần (%)

Ghi chú: 20(S)-ppd:20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol

1.5.1.2. Hợp chất polyacetylen

Từ phần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam đã phân lập được 7 hợp chất ở

phân đoạn ít phân cực. 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và

heptadeca- 1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen và hai hợp chất mới là

10- acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E), 10(E) trien- 4,6-

diyn-3,10-diol [7,14,16].

7 hợp chất polyacetylen đó là: Pv1= panaxynol, Pv2= 10-acetoxy-heptadeca-

8(E)-en-4,6-diyn-3-ol, Pv3= stereoisomer của Pv5, Pv4= Dẫn xuất của Pv5, Pv5=

heptadeca-1,8(E)-dien4,6-diyn-3,10-diol, Pv6= heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-

3,10-diol, Pv7= Heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol [25].

1.5.1.3. Thành phần acid béo

Trong Sâm Việt Nam đã xác định được 17 acid béo từ 8 - 20 cacbon, trong

đó những acid béo chiếm tỷ lệ lớn nhất là acid linoleic (40,04%); acid palmitic (29,62%); acid oleic (13,26%); acid stearic (4,48%) và acid linolenic (2,61%) [7,16].

1.5.1.4. Thành phần acid amin

Dựa trên phương pháp sắc ký lỏng trên máy Beckman multichrom đã xác

định được 18 acid amin. Thành phần này bao gồm đủ 8 acid amin cần thiết cho cơ

thể, trong đó một số acid amin có tỷ lệ rất cao như arginin 46,66%, lysin 17,90% và

trytophan 10,20% đã được xác định có tính chống lão hoá tế bào [7,16].

1.5.1.5. Thành phần các nguyên tố vi đa và vi lượng

Dựa trên phương pháp kích hoạt neutron và huỳnh quang tia X đã xác định

được 20 nguyên tố đa và vi lượng của phần dưới mặt đất trong Sâm Việt Nam.

Trong đó bao gồm một số nguyên tố có tác dụng sinh học như K, Na, Mg, Mn, Cu,

Fe, Co, Zn, Se [7,16].

1.5.1.6. Hợp chất sterol

Trong sâm Việt Nam có chưa hai hợp chất sterol là β-sitosterol và

daucosterin (β-sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranosid) [7,25].

1.5.1.7. Hợp chất glucid

Bằng phương pháp Bertran đã xác định hàm lượng đường có trong sâm Việt

Nam gồm [7,25]:

- Đường tự do: 6,19%

- Đường toàn phần: 26,77%

1.5.1.8. Các thành phần khác

Các thành phần khác (trong thân rễ và rễ củ tươi) [7,25]:

- Tinh dầu: 0,05-0,10%

- Vitamin C: 0,059%

1.5.2. Thành phần hoá học từ phần trên mặt đất của cây sâm Việt Nam

1.5.2.1. Các hợp chất saponin

Sâm Việt Nam (SVN) rất giàu saponin trong thành phần hóa học của tất cả

các bộ phận, kể cả trong thân rễ, rễ và thậm chí cả lá [13].

Từ phần trên mặt đất của SVN đã phân lập được 19 saponin damaran bao

gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới, được đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8 [7,10,11,14]. Khác với thành phần saponin từ phần dưới mặt đất của SVN, các saponin dẫn chất của 20S - protopanaxadiol chiếm tỷ lệ rất cao

trong thành phần saponin phần trên mặt đất với đại diện chính là notoginsenosid-Fc, G-Rb3, N-Fe và VG-L2. Các saponin có cấu trúc cotillol chiếm tỷ lệ thấp với đại diện chính là VG-R1 [7,14].

Bảng 1.6. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol

STT Kiểu Hiệu suất (%) Tên R1 R2

-Glc -Glc (A) 0,036 1 G-F2

G-Rd -Glc2-Glc -Glc (A) 0,005 2

N-Fe -Glc -Glc6-Ara (A) 0,134 3

GY-IX -Glc -Glc6-Xyl (A) 0,088 4

-Glc2-Glc -Glc6-Xyl (A) 0,163 5 G-Rb3*

VG-L1 -Glc2-Glc2-Xyl -H (A) 0,001 6

VG-L2* -Glc2-Glc2-Xyl -Glc6-Ara (A) 0,110 7

N-Fc* -Glc2-Glc2-Xyl -Glc6-Xyl (A) 0,341 8

VG-L3 -Glc2-Glc -Glc6-Xyl (B) 0,002 9

VG-L4 -Glc2-Glc2-Xyl -Glc6-Xyl (B) 0,001 10

VG-L5 (C) 24(R) -Glc -Glc6-Ara 0,003 11

VG-L6 (C) 24(R) -Glc -Glc6-Xyl 0,002 12

VG-L7 (C) 24(R) -Glc2-Glc -Glc6-Xyl 0,001 13

Bảng 1.7. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol

STT Tên Hiệu suất (%) Kiểu R1 R2 R3

(D) -H -Glc2-Rha-6AC -Glc 0,013 14 PG-RS1

G-Re (D) -H -Glc2-Rha -Glc 0,011 15

(D) -H -Glc -Glc 0,001 16 G-Rg1

Bảng 1.8. Các saponin có cấu trúc ocotillol

STT Tên Kiểu R Hiệu suất (%)

VG-L8 -Glc2-Rha (E) 0,001 17

-Glc2-Rha (E) 0,006 18 24(S)-PG-F11

VG-R1* -Glc2-Rha- 6Ac (E) 0,155 19

1.5.2.2. Một số hợp chất mới

Bằng các áp dụng những kỹ thuật sắc ký cột kết hợp với sắc ký lớp mỏng, từ

cao n -hexane và cao metanol của lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) đã phân

lập được sáu hợp chất tinh khiết, bao gồm: squalene (1), tetradecanol (2), α –

tocopherolquinone (3), docosanol (4), daucosterol (5), kaempferol (6) [26].

Năm 2022, năm hợp chất được phân lập từ lá cây nhân sâm Việt Nam. Trong

số đó, có một sesquiterpene lactone mới, panaxolide (7) cùng với bốn hợp chất đã biết (3, 8-10). Cấu trúc của chúng được xác định là ginsenoside R10 (8), daucosterol (3), kaempferol 3–O–β–D–glucosyl (12)– β –D–galactoside (9), junipediol A (10) [24].

Hình 1.8. (1): squalene; (2): tetradecanol; (3): α –tocopherolquinone; (4): docosanol; (5): daucosterol; (6): kaempferol; (7): panaxolide; (8) ginsenoside R10; (9): kaempferol 3–O–β–D–glucosyl(12)– β –D–galactoside, (10): junipediol A 20

1.6. Công dụng trong y học cổ truyền

Nhân sâm Việt Nam, Panax vietnamensis Ha et Grushv được sử dụng như

một loại thuốc bổ và thực phẩm chữa bệnh trong y học dân gian cổ truyền vì nó có

những lợi ích sức khỏe tuyệt vời [27]. Sâm Việt Nam là một loại sâm quý với nhiều

tác dụng có lợi cho sức khỏe, trong đó phần rễ và thân rễ được coi là bộ phận chính được sử dụng cho mục đích trong y học còn các bộ phận thân lá được sử dụng như

một loại trà thảo mộc [22]

Sâm Việt Nam có vị đắng, hơi ngọt, mùi thơm nhẹ [7,15], quy vào 2 kinh

phế, tỳ [10] và có những công năng sau: [23]

- Đại bổ nguyên khí, ích huyết, sinh tân dịch, làm khỏe tinh thần, trí não minh mẫn.

- Bổ phế bình suyễn: dùng đối với bệnh ho do phế hư như ho lao, viêm phế quản

mạn tính.

- Kiện tỳ, sinh tân dịch, chỉ khát. Ngoài ra còn dùng các bệnh huyết áp thấp, cơ thể

mệt mỏi.

Theo y học cổ truyền sâm Việt Nam cũng có tác dụng tương tự nhân sâm và

thậm chí còn có tác dụng mạnh hơn. Bổ 5 tạng (tâm, can, tỳ, phế, thận) , yếu tinh

thần, định hồn phách, làm khỏi sợ hãi, trừ tà khí, sáng mắt, uống lâu nhẹ mình, tăng

tuổi thọ [7,12].

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

2.1.1. Mẫu lá Sâm Việt Nam

Mẫu lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) sử dụng trong

nghiên cứu của khóa luận được thu hái tại núi Ngọc Linh, tỉnh Kon Tum vào tháng 5 năm 2021 và được giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học là TS

Phạm Hà Thanh Tùng thuộc Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA.

Mẫu tiêu bản của mẫu nghiên cứu được lưu giữ tại Khoa Dược, Trường Đại

học PHENIKAA.

Hình 2.1. Mẫu lá của Sâm Việt Nam đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.1.2.1. Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.1. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất xứ

Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Water - API - ISI Mỹ 1

Mỹ 2 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz)

Tủ sấy Memmert Đức 3

Máy siêu âm Elmasonic S 30 H Đức 4

Máy ly tâm Dlab DM0412S Mỹ 5

Máy cất quay Rotavapor R-100 Thụy Sỹ 6

Cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa). Thụy Sĩ 7

Màng lọc Cellulose Acetate 0,45 µm. 8

Ống đong các loại (10-2000ml) Đức 9

Bình cầu đáy tròn các loại 50-2000ml Đức 10

Bình chiết, phễu, cốc, buret… Đức 11

Các loại cột sắc ký (cột thủy tinh) Đức 12

Bình chạy sắc ký lớp mỏng Nhật Bản 13

Đèn tử ngoại Nhật Bản 14

Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI)

2.1.2.2. Hóa chất, dung môi

Bảng 2.2. Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất, dung môi sử dụng Tiêu chuẩn

DĐVN IV 1 Acid sulfuric (H2SO4)

Methanol (MeOH) DĐVN IV 2

n-butanol (BuOH) DĐVN IV 3

n- hexan (Hx) DĐVN IV 4

Ethyl acetate (EtOAc) DĐVN IV 5

Nước cất DĐVN IV 6

DĐVN IV 7 Chất nhồi cột là Silica gel GF254, cỡ hạt 60-230 µm (Merck)

Bản mỏng silicagel F254, RP18 F254s (Merck) DĐVN IV 8

Acetonitrile (Merck) DĐVN IV 9

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các cắn chiết của cây cũng như phân lập chất sạch

nhóm nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC).

2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

*Nguyên tắc:

TLC là một kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải

thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim

loại, nhựa; pha động là một hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều

dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định. Sắc ký được tiến hành khi cho pha

động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đạt các chất cần tách. Trong quá trình di

chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần) trong hỗn hợp mẫu thử di chuyển

trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách

và phân bố khác nhau trên lớp mỏng. Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp

mỏng. Ở đó, các thành phần của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi của

dung môi động. Cơ chế của sự tách có thể là hấp phụ phân bố, trao đổi ion, sàng lọc

phân tử hay phối hợp nhiều 8 cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lên ít hoặc nhiều,

tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [28].

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các

chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254nm, 365nm hoặc

phun thuốc thử hiện màu hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân

tích...Tùy thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [25,28,29].

*Các đại lượng đặc trưng:

Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động.

Trong đó:

dR là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết phân tích (tính bằng cm).

dM là khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).

Rf có giá trị từ 0 đến 1.

Việc ổn định giá trị Rf thường phụ thuộc nhiều yếu tố và gặp nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật nên quá trình phân tích thường tiến hành

song song với chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký [28].

*Áp dụng:

Sắc ký lớp mỏng được dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều

chế đều được thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn DC Alufolien 60 F254 (Merck).

Dung môi triển khai là hỗn hợp một số dung môi thông dụng là Cloroform–MeOH- H2O (65:35:10). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại bước sóng 254 và 366 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.

2.2.1.2. Phương pháp sắc ký cột (CC)

*Nguyên tắc:

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng. Trong

sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong các ống

hình trụ gọi là "cột". Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ

dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh [28].

Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân

bố) [28].

*Cột:

Cột là những ống thủy tinh hình trụ dài 30 - 70cm, đường kính 1 - 5 cm, đầu

dưới có 1 vòi thủy tinh có khóa để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi.

*Hóa chất dùng làm cột:

Bảng 2.3. Hóa chất dùng làm từng loại cột

Cột phân bố Cột hấp phụ

Xenlulozo, kieselguhr (celite), gel của acid

silic không hoạt hóa. Oxit nhôm, silica gel, polyamide, CaCO3, MgO, than hoạt.

Các hóa chất dùng cho sắc ký cột đều phải được tiêu chuẩn hóa để việc sử

dụng dễ dàng, thuận lợi. (Ví dụ: Silica Gel 60 Merck: quy định cỡ hạt 0,063 - 0,200

mm)

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở

mọi điểm trong cột thành một khối đồng nhất.

*Dung môi:

Nói chung các hệ dung môi dùng cho TLC và sắc ký giấy đều có thể ứng

dụng vào sắc ký cột. Tuy vậy đối với các dung môi có độ sôi quá thấp (ete), có mùi

khó chịu hoặc độc thì không dùng làm dung môi rửa trong sắc ký cột.

Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột là: n-hexan, benzen, cloroform,

aceton, ethanol, methanol, butanol, nước.

Sau khi rửa giải, dụng cụ dùng để hứng là các bình tam giác hoặc ống

nghiệm. Các bình tam giác hoặc ống nghiệm đều được đánh số từ 1 trở đi, và sắp

xếp sẵn trong 10 các giá theo thứ tự để khỏi nhầm lẫn trong quá trình tập hợp. Các

phân đoạn sau khi phân tích và tập hợp chung, tùy theo thể tích mỗi phân đoạn mà

xử lý bằng cách cất thu hồi trong bình cầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiên

trên nồi cách thủy.

*Áp dụng:

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 μm), dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như CH2Cl2/ MeOH, CHCl3/ MeOH/ H2O với tỷ lệ thích hợp.

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là pha đảo (cỡ hạt 40-63 μm) (Merck, Đức), dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi MeOH/ H2O với tỷ hợp. thích lệ 27

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

2.2.2.1. Phương pháp phân tích khối phổ (Mass Spectroscopy - MS)

*Nguyên tắc:

Khối phổ được thực hiện dựa trên cơ sở xác định khối lượng (thường là trị số m/e) và số lượng tương đối của các ion tạo ra từ phân tử bị ion hóa và bị phá vỡ

thành mảnh [25,29].

Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử

hữu cơ ở chân không cao (10-6 mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu cơ bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một

số vạch có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối [30].

*Áp dụng:

Xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hóa

thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép

nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR, phổ IR.

2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance - NMR)

*Nguyên tắc:

Nếu hạt nhân đã có định hướng được chiếu bởi một bức xạ điện từ có tần số

thích hợp, sẽ có sự hấp thu năng lượng xảy ra và lúc đó trạng thái spin năng lượng

thấp sẽ nhảy lên trạng thái spin năng lượng cao. Khi hiện tượng nhảy chuyển spin

như thế, người ta gọi là hạt nhân đã cộng hưởng với bức xạ chiếu vào, từ đó gọi là

cộng hưởng từ hạt nhân [9].

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối

lượng nguyên tử là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và

cho tín hiệu NMR. Các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó [25,29, 30].

*Các đại lượng đặc trưng:

Độ dịch chuyển hóa học δ: là sự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân

hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn.

( ) ( )

Trong đó:

νmAu.s: tần số cộng hưởng của proton của mẫu.

tần số cộng hưởng của proton của chất chuẩn nội

νTMS: tetramethylsilan.

νmay: tần số của phổ kế.

Hằng số tương tác spin-spin (J): là khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu

bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin. Trị số J phụ thuộc vào

tương quan không gian và mật độ e ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.

Diện tích dưới tín hiệu: diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho

tín hiệu đó. Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương

đối của proton cho tín hiệu.

*Áp dụng:

Phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc

trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và

tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất. Ngoài ra,

khi xác định cấu trúc hóa học cần dựa vào hằng số ghép cặp J do 2 proton ghép từ với nhau (còn gọi là tách spin- spin).

Phổ 13C-NMR cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton 0-240 ppp [9]. Độ chuyển dịch hóa học của phổ 13C-NMR lớn hơn 15-20 lần so với độ dịch chuyển hóa học của proton.

2.3. Địa điểm nghiên cứu - Khoa Dược, Đại học PHENIKAA.

- Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ

3.1. Chiết xuất, phân lập

Lá sâm Việt Nam (680g)

1, Chiết dung môi EtOH (3 lần x 1l) 2, Gom dịch chiết, lọc 3, Cất quay áp suất giảm

Cao tổng Ethanol

1, Phân tán trong nước 2, Chiết phân bố bằng CH2Cl2 và BuOH 3, Cất quay áp suất giảm

Cao Butanol giàu saponin (6,1g)

Silica gel pha thường: CH2Cl2 / MeOH (10:1→1:1)

Phân đoạn F4 (1,8g)

Silica gel pha thường; CHCl3 / MeOH/ H2O; SKLM

Phân đoạn F4.5 (140 mg)

Silicagel pha đảo: MeOH/ H2O

Hợp chất PV1 (8mg)

Hình 3.1. Sơ đồ phân lập hợp chất từ lá sâm Việt Nam

Mẫu nghiên cứu lá Sâm Việt Nam (bộ phận lá, 680g) sau khi rửa sạch, phơi khô (thu được 118g), xay-nghiền nhỏ được ngâm chiết kỹ bằng dung môi ethanol 80% ba lần (mỗi lần 1l) sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 45oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp

suất giảm cho 13,2g (11,19% khối lượng khô) cao chiết tổng ethanol. Lấy 12,0g cao chiết hòa tan trong nước cất (200ml) và chiết phân bố bằng CH2Cl2 và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 200ml). Các phân đoạn CH2Cl2, BuOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng CH2Cl2 (3,2g) và BuOH (6,1g) (Phân đoạn tập trung saponin).

Tiến hành sắc ký cột phân đoạn dịch chiết saponin toàn phần (BuOH) (6,0g)

trên cột sắc ký silicagel (Φ40 mm × 300mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần bao gồm CH2Cl2-MeOH (10:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 200ml) thu được 6 phân đoạn ký hiệu là F1~F6.

Từ phân đoạn F4 (1,8g), chạy sắc ký cột silicagel (Φ30 mm × 300 mm) với hệ pha động CHCl3-MeOH-H2O (4:1:0,15, v/v/v, 1500ml) thu được 6 phân đoạn nhỏ hơn là F4.1~F4.6. Sau đó, phân đoạn F4.5 (140 mg) được tinh chế bằng sắc ký pha đảo YMC C-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (7:3, v/v, 1000ml) thu được chất số 1 (Ký hiệu PV1; 8mg).

3.2. Xác định cấu trúc chất

Bột màu trắng; +12 (c 0,5, MeOH); ESI-MS: m/z 1109 [M+H]+; 1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 0,81, 0,87, 0,88, 0,96, 1,03, 1,32, 1,58, 1,69 (8 tín hiệu CH3, s, H3-30, 19, 29, 18, 26, 21, 27, 28), 3,73 (1H, dd, J=11,6, 4,8 Hz, H-3), 3,96 (1H, m, H-12), 4,31 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1''''), 4,38 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1'), 4,54 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1'''), 4,64 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1''), 5,06 (1H, br t, J=6,4 Hz, H-24); 13C- NMR (CD3OD, 100 MHz): Xem bảng 3.1.

Hợp chất PV1 này thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR của chất mang các đặc điểm đặc trưng của một

saponin có phần aglycon là một triterpen khung dammaran, nhóm hợp chất chính

trong Sâm Việt Nam và các loài thuộc chi Panax [31].

3.2.1. Phổ 1H- NMR

Phổ 1H-NMR xuất hiện 06 tín hiệu singlet của các nhóm methyl bậc ba tại δH 0,87, 0,94, 1,02, 1,37, 1,65, 1,70 (8 tín hiệu CH3-30, 19, 29, 18, 26, 21, 27, 28). Ngoài ra, phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất PV1 xác định phần đường có 4 phân tử đường có cấu hình β với 4 tín hiệu proton anomeric tại δ 4,36 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1''''), 4,44 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1'), 4,59 (1H, d, J=7,6 Hz, H-1'''), 4,68 (1H, d,

J=8,0 Hz, H-1'').

Hình 3.2. Hình ảnh phổ 1H-NMR của hợp chất

3.2.2. Phổ 13C-NMR

Phân tích phổ 13C-NMR của chất này phát hiện 54 tín hiệu cacbon, trong đó:

24 tín hiệu được xác định thuộc 04 phân tử đường, 30 tín hiệu còn lại thuộc phần

aglycon dammaran với một nối đôi đặc trưng C-24/C-25.

Đối chiếu phổ NMR của hợp chất PV1 thu được với dữ liệu phổ của hợp

chất Ginsenoside Rb1 theo tài liệu tham khảo [4]:

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ 13C-NMR của hợp chất PV1

Phần aglycon Phần đƣờng

Chất số PV1a Chất số PV1a Ginsenoside Rb1 [4] Ginsenoside Rb1 [4]

3-Glc 1 40,4 40,3

101,2 101,3 2 27,4 27,2 1′

3 91,5 91,4 78,8 79,0 2′

4 40,7 40,6 78,4 78,3 3′

5 57,7 57,6 72,1 72,2 4′

6 19,4 19,3 75,3 75,4 5′

7 36,0 35,9 65,0 64,9 6′

8 41,1 41,0 Glc

9 51,2 51,1 105,6 105,4 1''

10 38,0 37,9 75,3 75,2 2''

11 31,6 31,5 78,1 78,3 3''

12 71,8 71,5 71,8 71,8 4''

13 49,8 49,7 78,5 78,3 5''

14 52,5 52,4 62,9 62,8 6''

15 30,9 30,8 20-Glc

16 27,4 27,2 98,2 98,3 1′′′

52,5 52,7 75,3 75,4 2′′′

18 16,5 16,4 78,1 78,3 3′′′

19 16,5 16,8 71,8 71,6 4′′′

20 85,1 84,9 76,7 76,7 5′′′

21 22,6 22,4 70,4 70,2 6′′′

22 36,9 36,8 Glc

23 24,0 23,8 104,6 104,9 1''''

24 126,1 126,0 75,3 75,1 2''''

25 132,4 132,2 77,9 77,9 3''''

26 26,1 26,0 71,7 71,5 4''''

27 18,2 18,1 78,1 78,3 5''''

28 28,5 28,6 62,9 62,8 6''''

29 16,9 16,7

17,6

30 17,5 a: Đo trong CD3OD

Hình 3.3. Hình ảnh phổ 13C-NMR của hợp chất

3.2.3. Phổ MS

Trên phổ khối thấy xuất hiện píc tại m/z 1109 [M+H]+ phù hợp với công thức

phân tử C54H92O23 (KLPT = 1108).

Hình 3.4. Hình ảnh phổ ESI- MS của hợp chất (positive [M+H]+)

3.2.4. Kết luận

Từ những dữ liệu, phân tích trên và so sánh với các số liệu trong tài liệu

tham khảo [3,4,32] có thể khẳng định hợp chất PV1 là ginsenoside Rb1.

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của PV1

3.3. Định tính Rb1 trong lá Sâm Việt Nam bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành định tính hợp chất Rb1 trong lá Sâm Việt Nam bằng phương pháp

sắc ký lớp mỏng (TLC). Kết quả được trình bày trong Hình 3.6.

Hình 3.6. Sắc ký đồ TLC định tính hợp chất Rb1 trong lá Sâm Việt Nam

Ghi chú:

C: cao ethanol lá Sâm Việt Nam

Rb1: Hợp chất Ginsenoside Rb1

Bản mỏng: Silica gel pha thường 60 F254

Hệ dung môi khai triển: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10)

Thuốc thử phát hiện: H2SO4 10%/ethanol, sấy khô

Quan sát: Ánh sáng thường

Kết quả: Dựa vào hình ảnh sắc ký đồ (Hình 3.6.) và giá trị Rf của các vết có thể nhận thấy trên sắc ký đồ của cao ethanol lá sâm Việt Nam xuất hiện vết có màu sắc và giá trị Rf tương đương các chất chuẩn Rb1:

Như vậy có thể kết luận trong mẫu cao ethanol lá sâm Việt Nam có saponin

Ginsenoside Rb1.

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN

4.1. Về phƣơng pháp nghiên cứu

Phần thực nghiệm nghiên cứu đã áp dụng, kết hợp nhiều phương pháp

nghiên cứu cơ bản, thường quy đến hiện đại.

Về hóa thực vật, phương pháp nghiên cứu đã sử dụng từ các phương pháp sắc ký cổ điển như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột... đến các phương pháp hóa lý hiện

đại như: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối (MS).

- Phương pháp sắc ký lớp mỏng: dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, độ nhạy

cao...nên được sử dụng rộng rãi để định tính, theo dõi quá trình sắc ký cột, sắc ký

điều chế, chiết phân đoạn…

- Phương pháp sắc ký cột cho hiệu quả tách cao, đơn giản, chi phí thấp, phân đoạn

dễ tinh sạch không hoặc ít gây biến tính, bảo toàn được nguyên vẹn chất phân lập.

- Phương pháp hóa lý như cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối (MS) cho

kết quả chính xác, chi phí thấp hơn so với phổ 2D nhưng đủ điều kiện để so sánh với phổ Ginsenoside Rb1 trong tài liệu tham khảo và khẳng định hợp chất chiết xuất, phân lập được là Ginsenoside Rb1.

4.2. Về thành phần hóa học Ginsenoside Rb1

Ở Việt Nam, sâm Việt Nam được biết đến là một loài thảo dược quý hiếm,

mang lại giá trị kinh tế cao, có tiềm năng trong việc phòng và chữa bệnh và đã được

chứng minh trong nhiều nghiên cứu. Tuy nhiên, sâm Việt Nam khó nuôi trồng, nhân

rộng, nằm trong danh sách Đỏ Việt Nam và việc khai thác quá mức có thể dẫn đến

cạn kiệt vì vậy cần có chính sách nhân giống, bảo tồn và khai thác một cách hợp lý.

Hơn nữa, việc đưa sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì nguồn cung cấp Panax vietnamensis chỉ giới hạn ở vùng núi Ngọc

Linh, và việc trồng trọt phải mất nhiều thời gian, từ 5–7 năm và thường thu hoạch thân rễ và rễ [12].

Hiện nay các nghiên cứu được công bố chủ yếu là về các thành phần saponin

trong rễ cũng như tác dụng sinh của rễ sâm Việt Nam mà có rất ít nghiên cứu về các thành phần hoạt chất saponin trong lá sâm. Thêm vào đó, các nghiên cứu về các thành phần trên lá sâm Việt Nam cũng còn nhiều điểm chưa thống nhất. Theo sách

“Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (2004), khi khảo sát những thành phần

trong lá sâm Việt Nam tác giả chưa đề cập đến thành phần Ginsenoside Rb1 [12] nhưng trong bài báo “Đánh giá sinh trưởng và thành phần hoạt chất của Sâm việt nam (Panax vietnamensis) trồng ở Quảng Nam” (2017) Ginsenoside Rb1 đã được nhắc đến với hàm lượng cao nhất trong các ginsenoside trong lá sâm Việt Nam [33]. Bởi vậy, nghiên cứu này góp phần khẳng định sự có mặt của Ginsenoside Rb1 trong mẫu lá sâm Việt Nam, tạo cơ sở bước đầu cho quá quá trình nghiên cứu, chiết xuất,

phân lập và định lượng hợp chất này.

Bên cạnh đó, hợp chất Ginsenoside Rb1 đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học như chống viêm [34], chống oxy hóa [35], bảo vệ thần kinh [36],

chống béo phì [37], bảo vệ tim mạch [38], chống trầm cảm [39], chống lão hóa [40],

điều hòa miễn dịch [41], ... Trong đó, 02 tác dụng nổi bật là hạ đường huyết và bảo

vệ thần kinh.

- Hạ đường huyết:

Ginsenoside Rb1 không chỉ có tác dụng hạ đường huyết, tăng độ nhạy insulin và điều hòa chuyển hóa lipid, mà còn làm giảm bớt sự xuất hiện của các biến chứng

liên quan đến bệnh đái tháo đường týp 2, bao gồm cả sự suy giảm chức năng tế bào

β tiến triển , tổn thương thận, tổn thương thần kinh do đường huyết cao gây ra hoặc

bệnh não do tiểu đường và các biến chứng tim mạch do tiểu đường gây ra [42].

- Bảo vệ thần kinh:

Các bằng chứng gần đây cho thấy Ginsenosides hữu ích trong việc kiểm soát

và điều trị một số bệnh về hệ thần kinh trung ương (CNS), ví dụ như những tác

dụng liên quan đến hiệu quả điều trị bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer, bệnh

Huntington, chấn thương sọ não và thiếu máu cục bộ [43].

Bên cạnh đó, cũng có nghiên cứu cho thấy các ginsenoside, chiết xuất từ

nhân sâm đã được đánh giá về tác dụng bảo vệ chống lại độc tính của α-syn. Trong số các ginsenoside được đánh giá (tức là Rg1, Rg3, Rb1) chỉ có Rb1 được chứng minh là có vai trò trong việc phân tách các tập hợp α-syn, dẫn đến khử rung tim, do đó có thể kết luận rằng nó có thể được sử dụng làm liệu pháp điều trị bệnh

Parkinson và các bệnh liên quan [44].

Đặc biệt, nhiều nghiên cứu trên các mô hình in vitro và in vivo đã chỉ ra rằng các ginsenosid có thể giảm độc tính kích thích, stress oxy hóa và viêm thần kinh,

duy trì cân bằng chất dẫn truyền thần kinh, tác dụng chống apoptotic và tác dụng ổn định ty thể [43]. Trong đó, phải kể đến Ginsenoside Rb1 có khả năng điều chỉnh chức năng của ty thể theo nhiều cơ chế khác nhau: thúc đẩy chuyển đổi và sản xuất

năng lượng của ty thể thông qua các enzym chuyển hóa liên quan, ức chế sản xuất

và tích lũy các gốc oxy hóa (reactive oxygen species- ROS) trong ty thể khi bị căng thẳng, tăng cường hoạt động của enzym chống oxy hóa, ức chế hoạt động của

oxidase, duy trì sự ổn định tiềm năng màng ty thể [45] ...

Các kết quả của đề tài giúp gợi mở các hướng nghiên cứu về tác dụng hạ

đường huyết và bảo vệ tế bào thần kinh từ lá SVN.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

Kết luận:

Sau quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra, kết quả thu

được như sau:

- Đề tài đã chiết xuất và phân lập được thành phần saponin ginsenoside Rb1

trong mẫu cao lá sâm Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng.

- Đề tài đã xác định được cấu trúc của các saponin chính có trong mẫu lá SVN dựa trên đặc điểm vật lý, phương pháp cộng hưởng từ hạt NMR (Nuclear

Magnetic Resonance) và phổ khối MS (Mass Spectroscopy).

Kiến nghị:

Các kết quả của đề tài đã đáp ứng đầy đủ các mục tiêu đề ra. Tuy nhiên, nghiên cứu này mới chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của thành phần ginsenoside Rb1 trong lá sâm Việt Nam.

Vì vậy, em xin đưa ra đề xuất, kiến nghị về hướng phát triển tiếp theo của nghiên

cứu như sau:

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng saponin ginsenoside Rb1

trong lá SVN và khảo sát đầy đủ các yếu tố nhằm tối ưu hóa quy trình này.

- Xây dựng quy trình định lượng saponin ginsenoside Rb1 trong các mẫu lá

SVN.

- Tiếp tục nghiên cứu các thành phần saponin khác trong lá SVN

- Nghiên cứu, đánh giá môi trường nuôi cấy phù hợp hơn để tăng hàm lượng

các saponin có trong mẫu lá sâm Việt Nam.

- Nghiên cứu về tác dụng sinh học của các Ginsenoside Rb1 trong mẫu lá sâm Việt Nam, điển hình là tác dụng bảo vệ thần kinh nhằm tạo cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng dược liệu này để sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng, thuốc hóa dược nhằm chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bộ môn Dược liệu. Thực trạng nghiên cứu phát triển dược liệu ở nước ta và

trên thế giới. Trường ĐH Dược Hà Nội. 2016.

2. Dung HT, Grushvisky IV. A new species of the genus Panax L., Araliaceae

in Vietnam: Panax vietnamensis Ha et Grushv. Bot. J. Vietnam. 1985; 70: 518-522.

3. Nguyen MD, Kasai R, Ohtani K, Ito A, Nguyen TN, Yamasaki K, Tanaka

O. Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis HA et Grushv. collected in central Vietnam. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1994; 42(1): 115-122.

4. Duc Nguyen Minh và các cộng sự. Saponins from Vietnamese ginseng,

Panax vietnamensis Ha et Grushv, collected in central Vietnam I. 1993; 41(11):

2010-2014.

5. Zhu S, Fushimi H, Cai SQ, Chen HB, Komatsu K. A new variety of the

genus Panax from Southern Yunnan, China and its nucleotide sequences of 18S

ribosomal RNA gene and matK gene. J. Japanese Botany. 2003; 78: 86-94.

6. Nguyen B, Kim KH, Kim YC, Lee SC, Shin JE, Lee JK, Kim NH, Jang WJ,

Choi HI, Yang TJ. The complete chloroplast genome sequence of Panax

vietnamensis Ha et Grushv (Araliaceae). Mitochondrial DNA A DNA Mapp. Seq.

Anal. 2017; 28: 85-86.

7. Đỗ Huy Bích. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa học

kỹ thuật. 2006; 2: 702- 733.

8. Vũ Thị Hiền và các cộng sự. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào

trong nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái của cây sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv invitro. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 2015.

9. Nguyễn Thị Kim Phụng. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ. Đại học

Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 2007:11-19

10. Giới thiệu về Sâm Ngọc Linh. Cổng thông tin điện tử huyện Nam Trà My.

2021

11. Nguồn gốc, lịch sử, huyền thoại sự thật về Sâm Ngọc Linh, những giá trị kinh tế và dược tính vượt trội của Sâm Ngọc Linh. Trang thông tin điện tử sở Khoa

học và Công nghệ tỉnh Kon Tum. 2019.

12. Đỗ Tất Lợi. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Y học. 2004.

13. Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sách đỏ Việt Nam. NXB Khoa học

Tự nhiên và Công nghệ. 2007.

14. Nguyễn Thượng Dong. Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm.

NXB Khoa học và kỹ thuật. 2007.

15. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam V Tập 2. NXB Y học. 2018.

16. Viện Dược Liệu. Nghiên cứu thuốc từ thảo dược. NXB Khoa học và Kỹ

thuật. 2006

17. Tung Nguyen Huu. Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha and

Grushv.): Phylogenetic, Phytochemical, and Pharmacological Profiles. 2019;

13(26).

18. Lutomski J, Tran CL. Polyacetylenes in rhizomes and roots of Vietnamese

ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Herba Polonica. 1989; 35(4): 207–

211.

19. Lutomski J, Tran CL. Polyacetylenes in the Araliaceae family. Part I. The

isolation and identification of acetylenic compounds from rhizomes and roots of

Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Herba Polonica. 1991;

37(3-4):113–123.

20. Chirikova NK, Olennikov DN, Grigor0 ev RO, Klyushin AG, Nosov AM.

Acyl Quinic acids, flavonoids, and maltol O-glucoside from Panax vietnamensis.

Chem Nat Compd. 2019; 55(6):1161–1163.

21. Phạm Duy Linh. Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm ngọc linh

(Panax vietnamensis) đã bảo quản. Trường ĐH Nông lâm TPHCM. 2012.

22. Van Le Thi Hong và các cộng sự. Ginseng saponins in different parts of

Panax vietnamensis. 2015; 63(11): 950-954.

23. Bộ Y tế. Dược liệu học Tập 1. NXB Y học. 2006; 251-256

24. Hoang Khang Le và cs. A new sesquiterpene lactone from the leaves of Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Vietnamese ginseng). Natural Product Research. 2022.

25. Nguyễn Đình Thành. Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa

học. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 2011.

26. Le Hoang Khanh và cs. Chemical constituents of Ngoc Linh ginseng

leaves (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). VNUHCM Journal of Natural Sciences.

2021; 5(4): 1627-1632.

27. Le Quang Ung và các cộng sự. Phytoconstituents and biological activities

of Panax vietnamensis (Vietnamese Ginseng): A precious ginseng and call for further research-a systematic review. 2018; 13(10): 1934578X1801301036

28. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu. Phương pháp nghiên cứu hóa học

cây thuốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 1986.

29. Nguyễn Đình Triệu. Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá học.

NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 2001.

30. Silvertein R. M. and Webster F. X. Spectrometric identification of organic

compounds. John Wiley & Sons, Inc. 1996.

31. Yang YQ, Ju ZC, Yang YB, Zhang YH, Yang L, Wang ZT.

Phytochemical analysis of Panax species: a review, Journal of Ginseng Research.

2021; 45(1): 1-21.

32. Ma WG, Mizutani M, Malterud KE, Lu SL, Ducrey B, Tahara S. Saponins

from the roots of Panax notoginseng. Phytochemistry. 1999; 52(6): 1133-1139.

33. Trương Thị Chiên, Phạm Thế Hải, Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Thị Thanh

Mai, Trần Bảo Trâm, Phạm Hương Sơn. Đánh giá sinh trưởng và thành phần hoạt

chất của Sâm việt nam (Panax vietnamensis) trồng ở Quảng Nam. Tạp chí Khoa

học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 2017; 33(2): 227-232

34. Cai, J., Wu, Y., Li, C., Feng, M., Shi, et al. Panax ginseng polysaccharide suppresses metastasis via modulating twist expression in gastric cancer. Int. J. Biol. Macromol. , 2013; 57: 22–25.

35. Wang, L., Yu, X., Yang, X., Li, Y., Yao, Y., et al. Structural and anti- inflammatory characterization of a novel neutral polysaccharide from north american ginseng (Panax quinquefolius). Int. J. Biol. Macromol. 2015; 74: 12–17.

36. Ren, L., Le, Y., Chen, L., Huang, S. Experimental study of Panax notoginseng saponins in reparation of acute hepatic failure rats. Chin. Pharm., 2007;

16: 20–21.

37. Zhang, J., Zheng, Y., Li, X., Han, L. Effects of saponins from Panax

quinquefolium line on the metabolism of lipid. J. Jilin Agric. Univ. 2002b; 24: 62– 63.

38. Sun, K., Wang, C., Guo, J., Fang, S. Ginsenoside Rb1, ginsenoside Rgl and Panax notoginseng Rgl, the main saponins in Panax notoginseng, on the improvement of mesenteric microcirculation disorder induced by lps in rats and its

mechanism. In: The 12th Academic Conference of Microcirculation Committee of

Chinese Society of Pathophysiology. Chinese Association of Pathophysiology,

Beijing. 2007.

39. Ma, W.G., Mizutani, M., Malterud, K.E., Lu, S.L., Ducrey, B., et al.

Saponins from the roots of Panax notoginseng. Phytochemistry. 1999; 52: 1133–

1139.

40. Kang, A., Xie, T., Zhu, D., Shan, J., Di, L., et al. Suppressive effect of

ginsenoside rg3 against lipopolysaccharide-induced depression-like behavior and

neuroinflammation in mice. J. Agric. Food Chem. 2017; 65: 6861–6869.

41. Wu, W.H. Immunomodulatory Effects of Ginsenoside Rg1 in Nude

Micewith Antitumor Therapy. [Master's degree]. Jilin University, Jilin. 2017.

42. Zhou, Ping, et al. Ginsenoside Rb1 as an anti-diabetic agent and its

underlying mechanism analysis. Cells. 2019; 8(3): 204.

43. Ahmed, Touqeer, et al. Ginsenoside Rb1 as a neuroprotective agent: a

review. Brain research bulletin. 2016; 125: 30-43.

44. Ardah, Mustafa T., et al. Ginsenoside Rb1 inhibits fibrillation and toxicity of alpha-synuclein and disaggregates preformed fibrils. Neurobiology of disease. 2015; 74: 89-101.

45. Zhou, Ping, et al. Ginsenoside Rb1 and mitochondria: a short review of the

literature. Molecular and Cellular Probes. 2019; 43: 1-5.