Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

------

NGUYỄN THỊ THANH THÚY

BƯỚ C ĐẦ U XÂ Y DỰNG TIÊ U CHUẨ N CƠ SỞ DƯỢC LIỆ U

THỊT QUẢ ĐÀO TIÊN

(Crescentia cujete L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

------

NGUYỄN THỊ THANH THÚY

BƯỚ C ĐẦ U XÂ Y DỰNG TIÊ U CHUẨ N CƠ SỞ DƯỢC LIỆ U

THỊT QUẢ ĐÀO TIÊN

(Crescentia cujete L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCNGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2014

Người hướng dẫn: 1. PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI

2. TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

HÀ NỘI- 2019

Lời cảm ơn

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những

người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.

Nguyễn Thanh Hải, TS. Nguyễn Thị Hải Yến, những người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và

hoàn thành khóa luận này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các giảng viên thuộc Bộ môn Bào chế và

Công nghệ dược phẩm, Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Bộ môn Hóa

dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm tại trường.

Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện

giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Cảm ơn các thầy cô Khoa Y Dược, ĐHQGHN đã

quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua.

Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn

theo sát động viên, quan tâm và giúp tôi hoàn thành khóa luận này.

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu tôi khó tránh khỏi những

thiếu sót. Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận

thêm hoàn thiện.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Sinh viên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nguyễn Thị Thanh Thúy

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Viết đầy đủ

CD Chuẩn độ

CTCT Công thức cấu tạo

CTPT Công thức phân tử

DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

EtOH Ethanol

MS Phương pháp khối phổ

PTN Phòng thí nghiệm

STT Số thứ tự

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

TT Thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1: Danh sách thực vật chi Crescentia 2

Bảng 2: Giá trị trung bình nồng độ khoáng chất có trong trái Crescentia 7 cujete L.

Bảng 3: Các hợp chất nổi bật trong quả Crescentia cujete L. 9

Bảng 4: Các chất thuộc nhóm p-hydroxybenzoyloxy 11

Bảng 5: Các hợp chất thuộc nhóm n- alkyl glycosid 12

Bảng 6: Độ ẩm của bột thịt quả đào tiên 34

Bảng 7: Độ ẩm của thịt quả đào tiên tươi 34

Bảng 8: Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu đào tiên 35

Bảng 9: Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu đào tiên 35

Bảng 10: Kết quả định tính mẫu tươi 36

Bảng 11: Kết quả định tính mẫu khô 37

Bảng 12: Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn 39

Bảng 13: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang 40

Bảng 14: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp đo quang 40

Bảng 16: Thành phần chính trong dầu hạt đào tiên

Bảng 15: Một số chỉ số của dầu hạt đào tiên 41

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tên hình, đồ thị Trang

Hình 1: Cây đào tiên 4

Hình 2: Quả và hạt đào tiên 5

Hình 3: Công thức cấu tạo iridoid của Crescentia cujete L. 9

Hình 4: Hoạt tính chống oxi hóa của Cresscentia cujete L. trong 13 các dung môi chiết.

Hình 5: Bảng xác định đường glucoza 27

Hình 6: Ruột tươi quả Đào tiên 31

Hình 7: Ruột khô quả đào tiên 31

Hình 8: Vi phẫu thịt quả 32

Hình 9: Bột thịt quả đào tiên dưới kính hiển vi 32

Hình 10: Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng 37 từ 330-800nm

Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ 38 chất chuẩn tại bước sóng 347,5nm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 12: Sắc ký đồ các acid béo của dầu hạt đào tiên 41

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ. ................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CRESCENTIA CUJETE L. ............................ 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CRESCENTIA ................................................. 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CRESCENTIA CUJETE L. (QUẢ

ĐÀO TIÊN) .................................................................................................. 6

1.2.1 Thành phần hóa học ...................................................................... 7

1.2.2 Tác dụng dược lý ........................................................................ 15

1.2.3 Công dụng ................................................................................... 17

1.2.4 Độc tính ....................................................................................... 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 19

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị ........................................ 19

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 20

2.2.1. Mô tả .......................................................................................... 20

2.2.2 Vi phẫu ........................................................................................ 20

2.2.3 Độ ẩm .......................................................................................... 20

2.2.4 Tro toàn phần .............................................................................. 20

2.2.5 Tro không tan trong acid ............................................................. 21

2.2.6 Định tính...................................................................................... 21

2.2.7 Định lượng ................................................................................... 25

2.2.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên .................................................... 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 35

3.1 Mô tả ..................................................................................................... 35

3.2 Đặc điểm vi phẫu thịt quả và soi bột .................................................... 36

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

3.3 Độ ẩm ................................................................................................... 37

3.4 Tro toàn phần ........................................................................................ 37

3.5 Tro không tan trong acid ...................................................................... 38

3.6 Định tính ............................................................................................... 39

3.7 Định lượng. ........................................................................................... 41

3.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên ............................................................ 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 47

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tài liệu tham khảo ............................................................................................. 49

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng các sản phẩm chăm

sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh

hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên. Việt Nam chúng ta

cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây

thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loại cây trồng,

trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt để ngành Dược

phát triển thuốc từ Dược liệu [8].

Cây Đào tiên có tên khoa học là Crescentia cujete L., là loại cây thân gỗ, sống lâu năm thuộc họ Chùm Ớt (Bignoniaceae). Quả của cây đào tiên có hình

cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục bóng, đường kính 6-12 cm, có thể đến 20cm.Trong dân gian người ta hay sử dụng thịt quả đào tiên tươi

hoặc khô ngâm với rượu để uống nhằm đem lại tác dụng chữa bệnh. Công dụng

của đào tiên được biết đến như bồi bổ sức khỏe, chữa ho, nhuận tràng [9]. Theo

một số nghiên cứu nước ngoài thịt quả đào tiên còn có các tác dụng dược lý

như: hoạt tính kháng khuẩn từ chiết xuất thịt quả [28], tác dụng chống oxi hóa

[26], tác dụng hạ đường huyết được thử nghiệm trên chuột [25].… Đây là loại

quả hữu ích và tiềm năng trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu

này. Tuy nhiên, cho đến nay, ở nước ta những nghiên cứu về loại quả này là rất

ít. Vì vậy việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu này là điều cần thiết.

Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho nghiên cứu sau này, tôi thực

hiện đề tài: "Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên"

với các mục tiêu sau:

- Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với một số tiêu chí chung trong Dược điển

Việt Nam IV.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Bước đầu nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CRESCENTIA CUJETE L.

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CRESCENTIA

Chi Crescentia thuộc họ Chùm Ớt (Bignoniaceae) thuộc nhóm thực vật hạt

kín (thực vật có hoa).

Crescentia là một chi của sáu loài của thực vật có hoa thuộc họ Chùm Ớt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, châu Phi, châu Úc và vùng Đông

nam Á [5], [7]. Loài này là những cây có kích thước vừa phải, cao tới 10m và

tạo ra những quả hình cầu lớn, vỏ mỏng, cứng và cùi mềm, đường kính lên đến

25cm [41]. Cây gỗ nhỏ hay lớn, lá mọc so le, đơn. Hoa ở nách lá, có tràng hoa

hình ống lớn, phình ở bụng, quả mọng. Hạt nhiều, kích thước khoảng 8mm x 9mm, mặt ngoài nhẵn, không có cánh, nằm lẫn trong quả. [43]

Theo The Plant List [40] bao gồm 45 tên thực vật khoa học xếp hạng các

loài cho chi Crescentia. Trong số đó chỉ có 6 tên loài được chấp nhận. Dưới

đây là tên của 6 loài đó:

Bảng 1: Danh sách thực vật chi Crescentia

Mức độ tin Tên Trạng thái Nguồn cậy

Crescentia alata Kunth Chấp nhận iPlants

Crescentia amazonica Ducke Chấp nhận iPlants

Crescentia cujete L. Chấp nhận iPlants

Crescentia linearifolia Miers Chấp nhận iPlants

Crescentia mirabilis Ekmanex Urb. Chấp nhận iPlants

Crescentia portoricensis Britton Chấp nhận iPlants

Crescentia cujete L.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Theo các tài liệu thực vật trong nước và nước ngoài, vị trí của Đào tiên được sắp xếp trong các bậc taxon như sau [4, 5, 6, 14]:

Nghành Magnoliophyta (Nghành Ngọc lan)

Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)

Phân lớp Lamiadae (Phân lớp Hoa môi)

Bộ Scrophulariales (Bộ Hoa mõm chó)

Họ Bignoniaceae (Họ Chùm Ớt)

Chi: Crescentia L.

Nguồn gốc xuất xứ: Châu Mỹ nhiệt đới

Phân bố ở Việt Nam: được trồng ở gần như khắp các tỉnh thành, chủ yếu

trồng ở miền Nam.

Còn được gọi là Calabacero (Tây Ban Nha), Cujeté (Brazil), Totumo

(Panama, Colombia, Venezuela và Peru), Tutumo (Bolivia), Taparo

(Venezuela), Mate (Ecuador), Huinga (Peru), Pate (Peru), Cuyabra (Colombia),

Morro (Guatemala), Cujete (Tây Ban Nha, Philippines), Trái cây kỳ diệu

(Philippines), Kalbas (Dominica và St. Lucia), Higuera (Puerto Rico) và cây

Rum (Sri Lanka) [42].

* Đặc điểm hình thái [12, 30, 34, 46]:

Thân, tán, lá: Cây gỗ nhỏ hay nhỡ, sống lâu năm, cao từ 4-5m. Tán lá hình

tháp, vỏ thân màu xám. Lá mọc so le, thường thu tập 3 cái ở một mấu, lá hình

trái xoan ngược, thon hẹp dài ở gốc, dài 10-15cm, rộng 3-4cm, mọc khít nhau

thành chùm 3 cái hay hơn, màu xanh đậm, bóng, cứng, tán dày, lá rụng vào

mùa khô. (Hình 1)

Hoa, quả, hạt: Hoa to thường mọc đơn độc ở đầu cành hay kẽ lá, màu trắng đục, mùi hôi, dài hình chuông, nhẵn, dễ rụng, chia 2 thùy không đều; tràng gần hình

chuông, ống rộng loe ở đầu, dài 5cm, 5 cánh không đều, mép uốn lượn; nhị 4,

chỉ nhị dính ở gốc ống tràng; bầu hình chóp, 1 ô. Quả mọng, hình cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục bóng, đường kính 6-12 cm, có thể đến 20cm, vỏ xanh cứng, thịt màu trắng có vị hơi chua. Hạt nhiều, phẳng nhỏ, không cánh, nằm lẫn chìm trong thịt. Trái chín phải mất vào khoảng 6 tháng. Mùa hoa quả gần như quanh năm [39]. (Hình 2,3)

*Đặc điểm sinh lý, sinh thái:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tốc độ sinh trưởng: Trung bình

Phù hợp với: Cây ưa sáng, nhu cầu nước trung bình. Nhân giống từ hạt. Đào tiên ở Việt Nam được trồng bằng cách cắm cành hay tách các nhánh con mọc

từ chồi rễ. Cây có thể ra hoa và trái trong bất cứ mùa nào trong năm. Có khả

năng chịu mặn và có thể trồng những nơi có nước thoát tốt. Cây cần trồng

những nơi không có sương lạnh bởi vì nó không thích ứng với những độ lạnh cao. [45]

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 1: Cây đào tiên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.2 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU CRESCENTIA CUJETE L. (QUẢ ĐÀO TIÊN)

Mô tả: Quả hình cầu trông giống quả bưởi vừa phải, màu xanh lục, đường

kính từ 6-12cm, có thể đến 20cm, cuống ngắn, vỏ láng, quả bì dày, ngoại quả

rất cứng. Thịt quả có màu trắng, hơi nhớt, có vị chua, có nhiều hạt dẹt nhỏ, không cánh cũng màu trắng nằm lẫn trong thịt quả. Trái chín phải mất khoảng

6 tháng. Thịt quả khi nạo ra để ngoài trời nhanh chóng bị chuyển sang màu đen

và biến thành màu nâu khi khô [9, 12].

Hình 2: Quả và hạt đào tiên

Chú thích: 1: Quả đào tiên non

2: Quả trưởng thành

3: Quả già rụng, ruột chuyển sang màu đen

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

4: Hạt đào tiên

1.2.1 Thành phần hóa học

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của quả

Crescentia cujete L. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào lá và vỏ cây. Trong

thịt quả đào tiên người ta phát hiện có một số acid hữu cơ như axit xitric, axit

tactric, axit clorogenic, axit creosentic...[9]. Trong trái còn chứa vitamin B1, và giàu lượng vitamin C [45].

Nghiên cứu hóa chất thực vật trên trái cây thu được saponin, flavonoid,

cardenolides, tannin và phenol, cũng như sự hiện diện của hydro xyanua. Kết

quả cũng cho thấy nồng độ trung bình tương đối thấp đối với kim loại nặng,

nhưng nồng độ trung bình cao đối với mangan, sắt, kẽm và đồng. Giá trị cho chất béo, protein, nitơ, chất xơ thô, độ ẩm, sucrose, fructose, galactose và hàm

lượng năng lượng khá cao tương ứng: 1,13; 8,35; 1,34; 4,28; 84,92; 59,86, 25,09; 18,24 và 88,69%. [23]

Bảng 2: Giá trị trung bình của nồng độ khoáng chất có trong trái Crescentia

cujete L.

Khoáng chất Nồng độ

Calcium (%) Magnesium (%) Potassium (%) Sodium (ppm) Manganese (ppm) Iron (ppm) Zinc (ppm) Copper (ppm) Phosphorus (ppm) Lead (ppm) Chromium (ppm) Nickel (ppm) Cobalt (ppm) Cadmium (ppm) Selenium (ppm) Arsenic (ppm) Tin (ppm) HCN (ppm) 0,04 0,01 0,02 59,77 21,74 7,88 3,97 6,90 53,01 0,17 0,07 0,10 0,03 0,01 0,02 0,00 0,01 0,11

Các hợp chất của chiết xuất trái cây Crescentia cujete L. được phân tích

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

bằng phương pháp GC-MS chỉ ra sự hiện diện của 12 thành phần hóa học [27]. Được biểu diễn trong hình 6.

Bảng 3: Các hợp chất nổi bật trong quả Crescentia cujete L.

Pubchem STT Tên hợp chất CTHH CTCT CID

I II III IV V

1 Furfuran 7362 C5H4O2

2 1174 2,4(1h,3h)-pyrimidinedion C4H4N2O2

Pyrazole, 1,4-dimethyl, 3 6210 C5H8N2 3,5-dimethyl-1H-pyrazole

4 1.2.3 Benzenetriol 10787 C6H6O3

5 4H-pyran-4-one 7968 C5H4O2

6 10920925 2,5-diflourophenylhydrazine C6H6F2N2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

7 49863143 1,2,4,5-tetrazine-3,6-diamine C2H4N6

I II III IV V

8 Furancarbonxaldehyde 7968 C5H4O2

9 4-mercaptophenol 240147 C6H6OS

10 2-propenoic acid, 3-phenyl 444539 C9H8O2

11 61176 1,3,5-Triazine-2,4,6-Triamine C2H4N6

12 Trans-Cinnamic acid 444539 C9H8O2

Một nghiên cứu khác của Tetsuo Kaneko và các cộng sự [16], bằng phương

pháp phân tích dữ liệu quang phổ xác định trong thành phần quả đào tiên có đủ

16 iridoid và iridoid glycosid (hình 5) gồm:

➢ Crescentins I, II, III, IV, V

➢ Crescentins A, B, C

➢ Aucubin (5)

➢ 6-O-p-hydroxybenzoyl-6-epiaucubin (6)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

➢ Agluside (7)

➢ 5,7-bisdeoxy-cynanchoside (8)

➢ Ajugol (9)

➢ 6-O-p-hydroxy-benzoylajugol (10)

➢ Ningpogenin (11)

➢ Crescentoside C; 6ß, 7ß- epoxide (16)

Trong đó, có 5 loại iridoid mới được đặt tên là crescentins I (l), II (2), III

(3), IV (4) và V (13) và 3 loại iridoid glycosid mới được đặt tên là

crescentosides A (12), B (14) và C (15) [11].

Các nhà khoa học đã phân lập được các chất từ quả của loài Crescentia

cujete L., trong đó các hợp chất chủ yếu thuộc nhóm iridoid, ngoài ra còn có các nhóm chất chính như nhóm n-alkyl glycosid, nhóm p-hydroxybenzoyloxy

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

(bảng 3,4) [17].

Hình 3: Công thức cấu tạo iridoid và iridoid glycosid của

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Crescentia cujete L.

Bảng 4: Các chất thuộc nhóm p-hydroxybenzoyloxy

STT Tên chất CTPT CTCT

6- O-(p-hydroxybenzoy)- D- 1 C13H16O8 Glucose

2 Acanthosid D C34H46O18

Beta- D- Glucopyranosyl 3 C13H16O7 benzoat

Beta-D-fructofuranosyl-6-O-

4 (p-hydroxybenzoyl)-α-D- C19H26O12

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

glucopyranosid

Bảng 5: Các hợp chất thuộc nhóm n- alkyl glycosid

STT Tên chất CTPT CTCT

1 C11H22O7 (2R, 4S)- 2 - O- Beta- D- Glucopyranosyl- 2,4-Pentanediol

(2R, 4S) -2- O- Beta- D-

2 C17H32O12

Glucopyranosyl- (1→ 6) - Beta- D-Glucopyranosyl- 2,4- Pentanediol

(2R, 4S) -2- O- Beta- D-

3 C16H30O11

Xylopyransyl- (1→6) -Beta- D- Glucopyranosyl- 2,4- Pentanediol

4 C11H20O7 (R)- 4 - O-Beta- D- Glucopyranosyl- 4- hydroxy- 2- pentanol

(R)- 4- O- Beta- D-

5 C17H30O12

Glucopyranosyl- (1→ 6) - Beta- D- Glucopyranosyl- 4- hydroxy- 2- pentanol

6 C17H32O12

(R)- 1- O- Beta- D- apiofuranosyl- (1→2)- Beta- D- Glucopyranosyl- 1,3- octanediol

7 C20H38O12

(R)- 1- O- Beta- D- Glucopyranosyl- (1→ 6) - Beta- D- Glucopyranosyl- 1,3- octanediol

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

8 C14H22O12 (R)- 1- O- Beta- D- Glucopyranosyl- 1,3- octanediol

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

1.2.2 Tác dụng dược lý

Tác dụng nổi bật của thịt quả đào tiên được biết đến trong y học cổ truyền ở

nước ta như: bồi bổ cơ thể, nhuận tràng, long đờm [45]. Tác dụng kháng khuẩn,

chống oxi hóa, hạ đường huyết được nghiên cứu bởi các nhà khoa học ở nước

ngoài [23, 25, 26, 27] . Và còn có nhiều tác dụng khác nhờ thành phần hóa học đa dạng, chứa nhiều các hợp chất hữu ích với cơ thể con người.

1.2.2.1 Tác dụng chống viêm, kháng khuẩn

Sinval Garcia Pereira và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính chống lại vi

khuẩn Rhipicephalus bằng phương pháp in vitro và cho rằng Crescentia cujete

L. đóng vai trò quan trọng trong việc giảm sử dụng hóa chất để kiểm soát

Rhipicephalus [23].

Chiết xuất ethanol từ thịt quả có khả năng kháng khuẩn đối với Vibrio harveyi ở nồng độ 10mg/ml. Trong báo cáo của Sri Rahmaningsih và cộng sự

còn giải thích rằng flavonoid có trong thịt quả ức chế sự tăng trưởng của vi

khuẩn bằng cách can thiệp vào tính thấm tế bào của chúng, làm cho các hợp

chất khác như saponin, tanin, phenol, triterpenoid, alkaloid xâm nhập vào và

làm hỏng thành tế bào vi khuẩn [27].

1.2.2.2 Tác dụng chống oxi hóa

Flavonoid có trong Crescentia cujete L. có thể hoạt động như chất chống

oxy hóa và bảo vệ các tế bào của cơ thể khỏi gốc tự do hư hại; gốc tự do được

cho là làm hỏng tế bào.

Mô hình khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để

đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của hợp chất tự nhiên và chiết xuất thực

vật. Giá trị độ hấp thụ được đo tại bước sóng là 517 nm. Axit ascobic được sử

dụng làm chất chuẩn, trong khi dung dịch trắng sử dụng 70 μL metanol, 70μl của dung dịch đệm Tris-HCl và 70μL DPPH 0,1mM. Hoạt tính chống oxy hóa

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

được xác định bởi IC50. Kết quả cho thấy các giá trị IC50 thấp nhất là được tìm thấy trong chiết xuất dichloromethane với 95,83 μg / mL, trong khi giá trị cao nhất được tìm thấy ở chiết xuất ethyl acetat với 174,56 μg / ml [26].

Hình 4: Hoạt tính chống oxi hóa của Cresscentia cujete L. trong các dung

môi chiết.

1.2.2.3 Tác dụng hạ đường huyết

Nghiên cứu đánh giá nước ép trái cây của Crescentia cujete L. về tác dụng

hạ đường huyết tiềm tàng ở chuột Sprague-Dawley. Không có độc tính được

ghi nhận ở mức 2000 mg/kg liều uống ở chuột sử dụng hướng dẫn

OECD. Crescentia cujete L. gây ra sự gia tăng nồng độ glucose ban đầu sau đó

giảm đáng kể vào lúc 4h và 6h (P <0,05). Hiệu quả không khác biệt đáng kể so

với metformin [25].

1.2.2.4 Các tác dụng khác

Saponin có mặt trong Crescentia cujete L. được biết đến như là thuốc kháng

sinh tự nhiên và cũng tăng cường năng lượng. Nó cũng hữu ích trong việc giảm

viêm đường hô hấp trên và như chất tạo bọt, nhũ hóa, chất tẩy rửa. Saponin

trong Crescentia cujete L. có thể sử dụng như chất chống viêm và kháng sinh

trong điều trị bệnh [18, 37].

Cardenolide và anthraquinone cũng có mặt trong các mẫu trái cây. Cardenolides là chất kích thích tim [38]. Điều đó cho thấy rằng nó có thể hữu

ích trong việc điều trị một số bệnh liên quan đến tim. Sự hiện diện của anthraquinone trong Crescentia cujete L. có thể giải thích tại sao nó được sử dụng như thuốc nhuận tràng [18].

Alkaloid đã được quan sát thấy trong các mẫu trái cây. Các alkaloid rất quan trọng trong y học bởi vì một số alkaloid đã được sử dụng để giảm đau, chống

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

co thắt và tác dụng diệt khuẩn [37]. Vì thế nó được sử dụng làm thuốc giảm đau trong điều trị ho và các chất chống viêm [23].

Tannin có chất làm se đặc tính đẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương, ngăn ngừa sâu răng và có hoạt tính kháng khuẩn. Tannin và các hợp chất của

chúng được biết đến là chịu trách nhiệm phòng ngừa và điều trị đường tiết niệu

nhiễm trùng và nhiễm khuẩn khác [23]. Sự hiện diện của tannin trong trái cây

cho thấy nó có thể phục vụ như một tác nhân kháng khuẩn hữu ích.

1.2.3 Công dụng

Bộ phận dùng: Thịt quả hay còn gọi là cơm hay nạc.

Quả có vị chua tính mát, vào 2 kinh phế và đại tràng.

Công dụng: Trị đau nhức xương khớp, thải độc tố ở hệ tiêu hóa, trị tình

trạng ăn uống kém, mất ngủ và dùng làm thuốc bổ.

Bổ quả đào tiên, cạo lấy phần thịt trắng thái nhỏ, cho vào chảo hay nồi đung

nóng và đảo chín rồi chế thành siro dùng để chữa ho. Thịt quả đào tiên chưa

chín, được dùng làm thuốc tẩy và nhuận tràng. Cơm quả đào tiên ngâm rượu

dùng với liều nhỏ (với liều 10 centigam) làm thuốc khai vị, với liều 60

centigam làm thuốc tẩy mạnh do tác dụng tăng cường co bóp [9].

Hạt trái cây Crescentia cujete L. đốt cháy thành bột và làm thành bột nhão được ăn để chữa ho ở Curacao. Người Panama sử dụng bột Crescentia cujete L.

để nhuộm vải đen. [18]

Nước ép của trái cây được sử dụng để điều trị tiêu chảy, viêm phổi và rối

loạn đường ruột. Nó được pha thành một loại trà mạnh và say để phá thai, để dễ

sinh con và được sử dụng trong hỗn hợp để giảm đau bụng kinh nghiêm trọng

bằng cách loại bỏ cục máu đông [23].

Ở một số quốc gia, vỏ quả khô được sử dụng để làm bát đựng nước uống, rượu, trà hoặc giữ trái cây hoặc thực phẩm. Vỏ được sử dụng trong thủ công, trang trí bằng tranh hoặc chạm khắc. Công dụng được biết đến ở các quốc gia

như: [33], [44]

✓ Antilles và Tây Phi: bột trái cây được ngâm trong nước được coi là thuốc

khử trùng, làm mát, và được áp dụng cho bỏng và đau đầu.

✓ Tây Phi: trái cây rang trong tro là thuốc tẩy và lợi tiểu. Khắp vùng

Caribbean, được sử dụng làm thuốc giảm đau và chống viêm.

✓ Côte-d'Ivoire: được sử dụng cho bệnh cao huyết áp vì tác dụng lợi tiểu của

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

nó.

✓ Columbia: được sử dụng cho các vấn đề về hô hấp.

✓ Việt Nam: được sử dụng như thuốc trừ sâu, chống ho, nhuận tràng và dạ dày. Thuốc sắc trái cây dùng để điều trị tiêu chảy, đau dạ dày, cảm lạnh,

viêm phế quản, ho, hen suyễn và viêm niệu đạo.

✓ Haiti: trái cây của Crescentia cujete L. là một phần của hỗn hợp thảo dược được báo cáo trong y học cổ truyền. Tại tỉnh Camaguey ở Cuba, được coi

là thuốc chữa bách bệnh. Panam: nơi được gọi là totumo, trái cây được sử

dụng cho bệnh tiêu chảy và đau dạ dày. Ngoài ra đối với các bệnh về

đường hô hấp, viêm phế quản, ho, cảm lạnh, đau răng. đau đầu, kinh

nguyệt không đều; như thuốc nhuận tràng, chống viêm [33].

✓ Xi-rô làm từ trái cây dùng để điều trị bệnh kiết lỵ và đau dạ dày.

1.2.4 Độc tính

Thịt quả sống gây nôn, gây sổ, gây độc với các loài chim, gây sảy thai ở các

loài động vật có sừng. Trong thịt quả chứa acid HCN [35, 36]. Một loại siro

chế từ thịt quả đào tiên được thêm vào nước uống của chuột nhắt thấy gây ung

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

thư hạch thể bạch cầu trong nhiều trường hợp [14].

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị

* Nguyên liệu

-Thịt quả đào tiên (Crescentia cujete L.) tươi và khô, hạt quả đào tiên đã sấy

khô.

- Nơi thu hái: Lạng Sơn

- Thời gian thu hái: Tháng 3/2019

* Hóa chất

- Các loại thuốc thử dùng trong định tính: TT Mayer, Dragendoft, Buncharat,

Balijet, thuốc thử vannilin-sulfuric, TT Fehling…

-Dung môi hóa chất: EtOH 96̊, EtOH 90̊, Cloroform, MeOH, FeCl3, AlCl3, NaOH 40 %, NaOH 5%, H2SO4 đặc, HCL đặc, nước cất, dung dịch HCl, dung dịch gelatin, butanol, n-hexan…và các hóa chất khác thuộc khoa Y Dược Đại

học Quốc Gia Hà Nội và khoa Hóa Đại học khoa học tự nhiên [1, 2, 3].

* Trang thiết bị, dụng cụ

❖ Máy Quang phổ UV-VIS Cary 60

❖ Máy đo độ ẩm Precisa HA 60

❖ Máy siêu âm Utrasonic cleaner- MRC

❖ Máy đo pH AL20 pH-Aqualitic

❖ Cân phân tích AUW 220

❖ Nồi cách thủy

❖ Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc có mỏ, đũa thủy tinh ,…

❖ Micropipet

❖ Các máy xay dược liệu, bếp điện, bếp đun cách thủy, kính hiển vi…

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

❖ Các dụng cụ thí nghiệm khác thuộc khoa Y Dược Đại học Quốc Gia Hà Nội. [1]

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Mô tả

Dựa vào cảm quan. Kiểm tra hình thái, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng

cách đo trực tiếp. Mẫu dược liệu phải đạt tiêu chuẩn đã yêu cầu.

2.2.2 Vi phẫu

Cắt vi phẩu: Cắt xuyên tâm bằng tay với lưỡi lam. Chọn lát cắt thật mỏng để

nhuộm.

Nhuộm vi phẩu tiến hành tuần tự như sau:

- Ngâm lát cắt vào dung dịch Javel từ 15-30 phút, rửa bằng nước cất nhiều lần.

- Ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic 1-3% trong 2 phút để tẩy Javel còn sót

lại. Rửa bằng nước cất. - Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch cloral hydrat (nếu thấy lát cắt chưa thật trắng

và trong) khoảng 10-15 phút nữa. Rửa lại bằng nước cất.

- Ngâm vào dung dịch xanh methylen từ 5-10 giây. Rửa lại bằng nước cất.

2.2.3 Độ ẩm

Sử du ̣ng câ n xác đi ̣nh độ ẩm Precisa HA 60: cân chính xác khoảng 1g phần

thịt quả khô đã cắt nhỏ , khởi động máy và đọc kết quả khi máy dừng.

2.2.4 Tro toàn phần

Cho 2g đến 3g bột mẫu thử vào một chén sứ hoặc chén platin đã nung và

cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450 °c tới khi không còn carbon, làm nguội

rồi cân. Bằng cách này mà tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước

nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua

giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Tập trung dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ không quá 450 °c đến khi khối lượng không đổi. Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí [13]. (Phụ lục 9.8 DĐVN V)

2.2.5 Tro không tan trong acid

Cho vào chén nung chứa tro toàn phần hay tro Sulfat (nếu trong chuyên luận

riêng không có chỉ dẫn khác) 15 ml nước và 10 ml acid hydrocloric. (TT). Đậy

chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận 10 min rồi để nguội. Rửa

mặt kính đồng hồ với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung. Tập trung chất không tan vào một phễu lọc thủy tinh xốp đã cân bì hoặc vào một giấy lọc

không trơ, rửa bằng nước nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính. Làm

khô rồi nung tới đỏ tối, đế nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung tiếp tới khi

giữa 2 lần cân khối lượng chênh lệch nhau không vượt quá 1 mg. Tính tỷ lệ

phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã được làm khô trong không khí [13]. (Phụ lục 9.7 DĐVN V)

2.2.6 Định tính

Tiến hành định tính trên cả 2 mẫu tươi và khô

Mẫu tươi

Chuẩn bị mẫu: Thịt quả tươi sau khi lấy ra bỏ hột, nghiền nhuyễn thành hỗn

hợp đồng nhất. Sử dụng phương pháp định tính bằng các phản ứng hóa học như phương pháp được mô tả bởi Hartern (1973), Trease và Evan (1989), để định

tính các nhóm hóa chất thực vật [23].

Mẫu khô

Chiết mẫu:

Mẫu 1: Lấy 50,0g bộ t dược liệu, thê m 200 ml nước tinh khiết, đun hồi lưu

45 phút, lo ̣c, di ̣ch lo ̣c. Mẫu 1 dùng để xác định carbonhydrat, axit hữu cơ, tannin, acid hydroxycinnamic, acid amin.

Mẫu 2 tương tự: thay dung môi nước bằng rượu 70%. Mẫu 2 dùng để xác

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

định coumarin, flavonoid, saponin.

Thực hiện định tính mẫu khô bằng các phản ứng hóa học

Định tính đường khử

Phản ứng Fehling: Thêm vào ống nghiệm 2ml dịch chiết mẫu 1. Thêm 5 giọt acid H2SO4 đậm đặc đun sôi trong 5 phút. Để nguội, trung hoà acid bằng dd NaOH 10%, sau đó thêm 10 gio ̣t thuố c thử Fehling. Đun cách thủ y 10 phú t, nếu xuất hiệ n kết tủ a đỏ ga ̣ch là dươ ng tính.

Định tính polysaccharid

2ml dịch chiết 1 và 8ml rượu 96%. Nếu xuất hiện tủa bông trắng là dương

tính. Định tính flavonoid ❖ Phản ứng với dung dịch FeCl3

Thê m vài gio ̣t FeCl3 5% vào ố ng nghiệ m chứ a 1ml di ̣ch chiết mẫu 2, dung

di ̣ch màu xanh đen - phản ứ ng dươ ng tính. ❖ Phản ứng Cyanidin:

Cho vào ố ng nghiệ m 1 ml di ̣ch chiết mẫu 2, thê m mộ t ít bộ t Mg (khoảng 10mg). Nhỏ từ ng gio ̣t HCl đậ m đặ c (3-5) gio ̣t. Để yê n mộ t vài phú t, dung di ̣ch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ , phản ứ ng dươ ng tính. Sau đó cho 1 lượng butanol– quan sát màu của pha dung môi và pha nước. ❖ Phản ứng vớ I dung dịch NaOH

Cho 1ml dung di ̣ch NaOH 10% vào ố ng nghiệ m chứ a 1ml di ̣ch chiết mẫu

2, xuất hiệ n tủ a vàng. ❖ Phản ứng với dung dịch AlCl3

Cho 1ml dung di ̣ch rượu AlCl3 2% vào ố ng nghiệ m chứ a 1ml di ̣ch chiết

mẫu 2, xuất hiệ n dung dịch màu vàng xanh. ❖ Phản ứng với dung dịch chì axetat

Cho 1-2 giọt dung di ̣ch chì axetat 10% vào ố ng nghiệ m chứ a 1ml di ̣ch

chiết mẫu, xuất hiệ n tủa màu vàng.

Định tính coumarin

❖ Phản ứ ng mở đó ng vò ng lacton

Cho vào 2 ố ng nghiệ m mỗi ố ng 1ml di ̣ch chiết mẫu 2:

- Ố ng 1: thê m 0,5ml NaOH 10%.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

- Ố ng 2: để nguyê n.

Đun cả hai ố ng nghiệ m đến sô i, để nguộ i rồ i thêm mỗi ố ng 1ml nướ c cất thấy: -Ố ng 1: trong hơ n. -Ố ng 2: có tủ a đu ̣c.

Thêm vài gio ̣t HCl đặ c, ố ng 1 trở về giố ng ố ng 2 thì dươ ng tính.

Định tính saponin

❖ Phản ứng tạo bọt

Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm khoảng

25ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm nước cất đến khoảng 10ml lắc mạnh trong 5 phú t, để yê n trong 15 phú t. Nếu bo ̣t cò n bền vững sau 15 phú t thì dươ ng tính. ❖ Phản ứng với dung dịch chì axetat

Cho 1-2 giọt dung di ̣ch chì axetat 10% vào ố ng nghiệ m chứ a 1ml di ̣ch chiết

mẫu 2, xuất hiệ n tủa màu vàng. ❖ Phản ứng Lafon

Ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu 2, thêm 1 giọt dung dịch đồng sunfat

10% và 1 ml dung dịch axit-sunfuric đậm đặc, đun nóng nhẹ. Nếu có saponin,

dung dịch có màu xanh lam. ❖ Phản ứng Salkowski

Cho 1 ml chloroform và 5-6 giọt axit sulfuric đậm đặc vào 2 ml dịch chiết

mẫu 2. Xuất hiện màu cam là dương tính.

Định tính acid amin

Hòa tan 3 gio ̣t TT Ninhydrin 3% trong 2ml di ̣ch chiết Mẫu 1. Đun cách thủ y

sô i 10 phú t, dung di ̣ch có màu xanh tím là dươ ng tính.

Định tính acid hữu cơ

Thêm mộtt ít bộ t Na2CO3 vào ố ng nghiệ m chứ a 4ml di ̣ch chiết mẫu 1, phản

ứ ng dươ ng tính khi có bo ̣t khí bay lê n.

Định tính chất béo, sterol, caroten

Ngâ m 10g bộ t dươ ̣c liệ u trong n-hexan để qua đê m. Lo ̣c, thu lấy di ̣ch lo ̣c để

◆ Đi ̣nh tính chất béo: nhỏ 2 gio ̣t di ̣ch chiết lê n giấy lo ̣c. Hơ nó ng bay hơ i hết

làm phản ứ ng:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

dung mô i, nếu cò n vết mờ trê n giấy lo ̣c thì dươ ng tính.

◆ Đi ̣nh tính sterol: Cô cách thủ y bố c hơ i dung mô i đến cắn. Thê m vào ố ng nghiệ m 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ; nghiê ng ố ng 45 độ , nhỏ từ từ 3 gio ̣t acid sulfuric đặ c theo thành ố ng nghiệ m, thấy mặ t phâ n cách có vò ng tím đỏ , lớ p chất lỏ ng phía trê n có màu xanh lá thì dươ ng tính.

◆ Đi ̣nh tính caroten: Cô cách thủ y bố c hơ i dung mô i đến cắn. Thê m 2 gio ̣t

H2SO4 đặ c vào cắn. Dung di ̣ch có màu xanh đậ m thì dươ ng tính.

Định tính tanin

❖ Phản ứng tủa với gelatin

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết mẫu 2, thêm 1ml dung dịch gelatin 1% có

chứa 10% NaCl. Xuất hiện tủa là dương tính.

Định tính iridoid

Cân khoảng 1 gam dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml dung dịch HCl

1% ngâm trong 5 giờ. Lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc. Cho vào ống nghiệm nhỏ

1ml dịch lọc thêm 1ml TT Trim Hill thấy xuất hiện màu xanh ở mẫu quả thì

dương tính.

Định tính glycosid tim

❖ Vi thăng hoa

Cho một ít bột dược liệu vào 1 nắp nhôm. Đặt nắp trên lưới amiang, đun

nóng nhẹ bằng đèn cồn cho hơi nước bay đi sau đó đậy lên nắp nhôm 1 phiến

kính đã đặt sẵn 1 miếng bông thấm nước lạnh ở trên. Giữ đèn cồn đến khi bột

có mùi thơm và chuyển sang màu nâu đậm, lấy phiến kính ra để nguội và soi

lên kính hiển vi thấy có tinh thể hình kim thì dương tính.

❖ Phản ứng Borntraeger

Cân khoảng 5g dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml H2SO4 1N, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Để nguôi, lọc qua giấy lọc cho vào

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

bình gạn. Chiết bằng 10ml CHCl3, gạn lấy lớp CHCl3 vào ống nghiệm, cô cách thủy 70 ̊C đến khi lượng CHCl3 còn khoảng 1ml, thêm 1ml Amoniac 10%, lắc đều xem có xuất hiện màu hồng không, tiếp tục thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy lớp nước có màu đỏ hồng thì dương tính.

2.2.7 Định lượng

2.2.7.1 Định lượng đường trong quả đào tiên bằng phương pháp đo quang

Dựa vào tài liệu tham khảo [10, 11, 29], tôi tiến hành xây dựng phương pháp

định lượng như sau:

a, Chuẩn bị các dung dịch

Chuẩn bị dung dịch chiết:

Mẫu khô: 2g bột mẫu khô, thêm 300ml nước cất đun cách thủy 15 phút, sau đó

lọc dung dịch thu được dung dịch chiết khô.

Mẫu tươi: Nghiền nhuyễn 100g mẫu tươi bằng cối chiết lấy nước được 25ml

dịch chiết. Lấy 1,25ml dịch chiết tươi vào bình định mức 25ml thêm nước cất

đến vạch, thu được dung dịch chiết tươi.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Lấy chính xác khoảng 26,7mg chất chuẩn đường

glucose pha trong nước cất vừa đủ 10,0ml. Thu được dung dịch chuẩn có nồng

độ 2,67 (mg/ml).

Chuẩn bị dung dịch thử 1 (1,5% acid p-aminobenzoic trong acid acetic băng)

Chuẩn bị dung dịch thử 2 (1,3% acid phosphoric trong acid acetic băng)

b, Khảo sát cực đại hấp thụ quang [10, 11]

Tiến hành quét phổ với 3 dung dịch: dung dịch chuẩn, dung dịch chiết sau

khi tiến hành phản ứng với thuốc thử 1 và 2. Sau đó quét phổ trên máy đo

quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 –800nm. Cuvet thạch anh có bề dày

1cm. Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ

không chứa chất nghiên cứu.

c, Tiến hành đo quang và tính toán kết quả

Bước 1: Đo dung dịch chuẩn

Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn, 4ml dung dịch thử 1, 4ml dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch nguội tiến hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Dung dịch chuẩn đem đi đo quang có

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

nồng độ là 0,267(mg/ml).

Dung dịch so sánh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với dung dịch

chuẩn, chỉ không chứa mẫu chuẩn phân tích.

Bước 2: Đo dung dịch chiết

Làm tương tự như cách đo dung dịch chuẩn, thay 1ml dung dịch chuẩn bằng

1ml dung dịch chiết khô và khô.

Cách tính kết quả: Hàm lượng (%) của đường tính theo glucose trong nguyên

liệu khô hoàn toàn được tính theo công thức:

* Mẫu khô:

* Mẫu tươi:

Trong đó:

A1: độ hấp thụ của dung dịch chiết khô;

Ao: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn glucose;

A: độ hấp thụ của dung dịch chiết tươi;

a: khối lượng thịt quả đào tiên tươi, g;

ao: khối lượng đường glucose trong dung dịch chuẩn, g;

a1: khối lượng thịt quả đào tiên khô, g;

h: độ ẩm thịt quả đào tiên khô

w: độ ẩm thịt quả đào tiên tươi

c, Thẩm định và đánh giá phương pháp

Thực hiện thẩm định và đánh giá phương pháp được tiến hành trên mẫu khô

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

của thịt quả đào tiên.

⚫ Xác định khoảng nồng độ tuyến tính

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính

giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác

định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến

tính R.

Cách xác định: khảo sát trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên. Xác

định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và mật độ quang bằng phương trình

hồi quy tuyến tính. Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị

⚫ Độ lặp lại

hệ số tương quan R ≥ 0,99.

Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa

các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều

lần trên cùng một mẫu đồng nhất. Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD.

Tiến hành: Phân tích mẫu 6 lần. Xác định kết quả định lượng tiến hành

⚫ Độ đúng

trong cùng điều kiện và tính RSD.

Là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Để

xác định độ đúng, thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu glucose có nồng

độ chính xác 0,134g/ml. Sau đó tiến hành phân tích mẫu lặp lại 6 lần trong

cùng điều kiện.

2.2.7.2 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Bertrand [32]

a, Chuẩn bị mẫu

Cân 10g tươi hoặc 2g khô. Nghiền cẩn thận và cho vào 30mL nước cất nóng

70-80 ̊C để hoà tan mẫu, lấy nước trích ly. Cho thêm 30 mL nước vào cối chứa

xác dược liệu tiến hành trích ly như trên tới lần thứ 3. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình nón 250 mL, thê m tiếp 5ml HCl đậ m đặ c (d = 1,19g/ml). Đậ y nình bằng nú t cao su có gắn ố ng thủ y tinh dài (hoặc dùng ống sinh hàn).

- Đặ t bình vào nồ i cách thủ y, nhiệ t độ 100 ̊C, thờ i gian là 3 giờ kể từ lú c bắt

đầu sô i.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

-Lấy bình ra làm nguộ i nhanh dướ i dò ng nướ c la ̣nh đến nhiệ t độ phò ng. Trung hò a acid dư bằng NaOH 20% vớ i chỉ thi ̣ phenolphtalein đến dung di ̣ch có màu hồ ng.

-Khử tạp chất: Thê m mộ t ít axetat chì bộ t (1,5g) lắc đều và lo ̣c qua phễu có

giấy lo ̣c A. Hứ ng dung di ̣ch lo ̣c vào bình định mức dung tích 250 mL.

-Dùng nướ c cất tráng bình nó n và lọc qua giấy lọc A. Nước tráng cho vào bình không được quá 250mL. Định mức bằng nước cất tới 250mL. Đem đi xác

định hàm lượng đường.

b, Xác định hàm lượng đường

Lần lượt cho vào bình nón 250mL: Dung dịch fehling A 10 mL; Dung dịch

fehling B 10 mL; 10 ml dịch lọc đã chuẩn bị ở trên. Đun sôi trên bếp điện hỗn

hợp đúng 3 phút tính từ khi bọt nước xuất hiện đầu tiên. Sau khi đun sôi, dung

dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng.

Nếu dung dịch bị mất màu hoàn toàn, màu lục, vàng hoặc nâu chứng tỏ

lượng dung dịch feling cho vào không đủ để oxi hoá lượng đường trong mẫu. Do đó , phải làm la ̣i vớ i thể tích dung di ̣ch lo ̣c ít hơ n (5ml), nhưng phải thê m nướ c cất cho đủ 10 ml. Lấy bình ra và để nghiêng cho cặn Cu2O lắng xuống. Dung dịch bên trên lớp cặn phải có màu xanh của Cu(OH)2.

c, Ga ̣n lo ̣c kết tủ a:

Khi kết tủ a Cu2O lắng xuố ng, ga ̣n phần nướ c bê n trê n và lo ̣c qua phễu lo ̣c xố p cắ m xuyê n qua nú t cao su củ a bình lo ̣c có nhánh nố i vớ i máy hú t châ n khô ng.

Rửa kết tủ a bằng nướ c đã đun sô i và ga ̣n lo ̣c tiếp tu ̣c vào phễu cho đến khi trong bình nó n mất màu xanh. Trong quá trình ga ̣n lo ̣c, khô ng để kết tủ a Cu2O lo ̣t vào phễu và luô n luô n giữ có mộ t lớ p nướ c đã đun sô i trê n mặ t Cu2O để tránh tiếp xú c vớ i khô ng khí.

d, Hoà tan kết tủ a:

Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho ngay vào bình nón 20mL dung

dịch Fe2(SO4)3 để hòa tan kết tủa Cu2O. Rút hết nước trong phễu, thay bình hút lọc cũ bằng bình mới.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Đổ dung dịch Fe2(SO4)3 đã hòa tan hết kết tủa Cu2O trong bình nón, lên trên lớp cặn còn lại trên phễu. Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe2(SO4)3 cho đến khi không còn vệt Cu2O trong bình nón và trong phễu. Tráng phễu, rử a la ̣i bình nón bằng nướ c cất đun sô i rồ i đổ cả vào phễu và hú t hết xuố ng bình lo ̣c.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

e, Chuẩ n độ:

Lấy bình lọc ra và chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt vững bền trong 15 giây. Làm song song với mẫu kiểm chứng thay dung dịch đường bằng nước cất. Ghi nhận số mL KMnO4 đã dùng và đem tra ở bảng để có lượng nghịch chuyển tùy theo yêu cầu.

f, Tính toán kết quả

Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucoza (g) trong 100g

mẫu thịt quả khô hoặc tươi. Tính bằng công thức:

Trong đó: X: Hàm lượng đường khử tính theo %

a: Số mg đường glucoza(mg) tương ứng với số ml KMnO4 0,1N, được ghi ở trong bảng của mẫu thí nghiệm trừ đi mẫu kiểm

chứng.

Gbd: lượng mẫu cân ban đầu, g.

Vxd: lượng dung dịch thử lấy để làm thí nghiệm (mL)

Vdm: thể tích sau khi định mức.

1000: chuyển từ mg sang g.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

100: Hệ số chuyển tính thành %

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 5: Bảng xác định đường glucoza

2.2.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên [15, 24]

2.2.8.1 Đánh giá tính chất cảm quan và chỉ số lý hóa của dầu

a, Mô tả

Mô tả màu sắc, độ trong và mùi của dầu thô.

b, Chỉ số lý hóa

Chỉ số acid ( Phụ lục 7.2 DĐVN V): cân chính xác khoảng 10 g chế phẩm,

thêm 50 ml hỗn hợp đồng thể tích ethanol 96 % và ether đã được trung hòa

trước với dung dịch natri hydroxyd 0,1 N(CD), dùng 0,5 ml dung dịch

phenolphtalein (TT) làm chỉ thị. Lắc để chế phẩm tan hoàn toàn. Nếu chế phẩm

khó tan , có thể đun hồi lưu trên cách thủy. Chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (CD), lắc liên tục cho đến khi xuất hiện màu hồng bền vững

trong 15s. Tính chỉ số acid theo công thức [13]:

Chỉ số acid

Trong đó: a: là số ml NaOH 0,1N (CD) đã dùng.

P: là số lượng dầu mang đi thử (g).

Chỉ số peroxid ( Phụ lục 7.6 DĐVN V): Cân 5,00 g dầu cho vào bình nón nút

mài dung tích 250 ml, thêm 30 ml hỗn hợp gồm 3 thể tích acid axetic băng (TT)

và 2 thể tích cloroform (TT), lắc cho tan và thêm 0.5 ml dung dịch kali iodid

bão hòa (TT). Lắc đúng 1 min, thêm 30 ml nước. Chuẩn độ chậm bằng dung

dịch natri thiosulfat 0,01 N (CD), liên tục lắc mạnh, cho đến khi màu vàng gần

như biến mất. Thêm 0,5 ml dung dịch hồ tinh bột (TT) và tiếp tục chuẩn độ, lắc

mạnh, đến khi dung dịch mất màu. Song song tiến hành một mẫu trắng. Lượng dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng trong mẫu trẳng không được

vượt quá 0,1 ml. Chỉ số peroxyd của chế phẩm được tính theo công thức

sau[13]:

Chỉ số peroxyd

Trong đó: a: là số ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng

trong mẫu thử;

b: là số ml dung dịch natri thiosulfat 0,01 N (CĐ) đã dùng trong mẫu trắng;

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

P: là lượng dầu đem thử (g).

Chỉ số iod ( Phương pháp Wijs): Hòa tan phần mẫu thử trong dung môi và cho thêm thuốc thử Wijs. Sau một thời gian quy định, bổ sung dung dịch kali iodua

và nước, chuẩn độ iôt được giải phóng bằng dung dịch natri thiosulfat. Tiến

hành các bước như trong TCVN 6122-2010.

Trị số iôt, wi, tính bằng gam trên 100 g chất béo, theo công thức sau đây:

trong đó:

c: là nồng độ của dung dịch chuẩn natri thiosulfat (5.3) đã dùng, tính

bằng mol trên lít (mol/l);

V1: là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép thử trắng, tính bằng mililit (ml);

V2: là thể tích dung dịch chuẩn natri thiosulfat đã dùng trong phép xác định, tính bằng mililit (ml);

m: là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Chỉ số xà phòng hóa (Phụ luc 7.7 DĐVN V): Cân chính xác lượng chế phẩm

đã chỉ dẫn cho vào bình nón nút mài dung tích 250 ml. Thêm 25,0 ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CD) và vài viên bi thủy tinh. Lắp ống

sinh hàn ngược và, trừ khi có chỉ dẫn khác, đun sôi 30 min trên cách thủy, thỉnh

thoảng lắc. Thêm 1 ml dung dịch phenolphtalein (TT1) và chuẩn độ ngay (khi

dung dịch còn đang nóng) bằng dung dịch acid hydrocloric 0,5 N (CĐ). Song

song tiến hành một mẫu trắng.

Chỉ số xà phòng hóa của chế phẩm được tính theo công thức sau [13]:

Chỉ số xà phòng hóa

Trong đó: a: là số ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CĐ) đã

dùng trong mẫu trắng; b: là số ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 N trong ethanol (CĐ) đã dùng trong mẫu thử;

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

p: là lượng chế phẩm đem thử (g).

2.2.8.2 Định lượng dầu thô bằng phương pháp cân [13]

Nguyê n liệ u hạt đã đuợc làm khô , sau đó ly trích dầu thô khỏ i nguyê n liệ u

bằng hệ thống Soxhlet vớ i dung mô i n-hexan. Chiết hồi lưu trong 3 giờ.

Tách dung mô i ra khỏ i dầu thô bằng phương pháp cô quay chân không và

xác đi ̣nh khố i lươ ̣ng dầu thô.

Cân bình cầu chịu nhiệt (m1), cân khối lượng nguyên liệu (m) xác định, thực

hiện trích ly và tách dung môi. Cân khối lượng bình cầu và dầu (m2).

% chất béo =

2.2.8.3 Định tính thành phần acid béo của dầu bằng phương pháp GC/MS.

Trích ly dầu: Thực hiện trích ly dầu như được mô tả ở mục 2.2.8.2 Chuẩn bị methyl este:

Thực hiện chuẩn bị mẫu metyl este các theo tài liệu [33].

Cho 10ml dung dịch NaOH 2% trong methanol vào bình cầu chứa 1,0g

dầu. Bình cầu gắn với ống sinh hàn, đun cách thuỷ trong 15ph. Sau đó để phễu trên miệng ống sinh hàn, cho từ từ 13ml acid H2SO4 1M trong methanol, đun trong 15ph. Lấy bình cầu ra làm nguội thực hiện chiết bằng 10ml dung môi

n-hexan (2 lần), (pha nước bỏ, pha hexan giữ lại gộp chung với nhau). Rửa lại

pha hexan trong phễu chiết mỗi lần với 7ml nước cất cho đến khi hết acid

(kiểm tra bằng giấy thử pH) (pha nước bỏ, pha hexan giữ lại gộp chung với nhau). Dung dịch thu được lọc qua phễu có Na2SO4 khan để loại bỏ nước rồi tiến hành nghiên cứu.

Phân tích thành phần dầu được thực hiện trên máy GC- MS/MS 7000D

Triple Quad của hãng Aligent Technologies, thư việ n phổ NIST.

Điều kiện sắc ký khí:

- Cột: Elite-5MS kích thước 25m x 30m x 0,25 mm

- Chế độ sắc ký: nhiệt độ ban đầu của bộ điều nhiệt cột là 50 ° C, giữ nhiệt

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

trong vòng 10 phút; lập trình nhiệt độ - từ 50 đến 270 ° C với tốc độ 20 ° C / phút, giữ ở nhiệt độ cuối cùng - 10 phút. Nhiệt độ của thiết bị bay hơi là 250 ° C. Khí mang là khí heli với tốc độ nạp 0,2 ml / phút. Thể tích mẫu là 0,5 μl. Hệ số tách là 20: 1, phương pháp ion hóa ESI, bộ lọc khối là tín hiệu tứ cực có độ phân giải thấp. Tổng thời gian phân tích là 45 phút. - Phân tích định tính các metyl este bằng thư viện NIST.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Mô tả

Thịt quả có màu trắng, hơi nhớt, có vị chua, có nhiều hạt dẹt nhỏ hình trái

tim có màu nâu nhạt hoặc trắng, kích thước khoảng 8mm x 9mm, mặt ngoài

nhẵn, không có cánh. Thịt quả khi nạo ra để ngoài trời nhanh chóng bị chuyển sang màu đen

Hình 6: Ruột tươi quả đào tiên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 7: Ruột khô quả đào tiên

3.2 Đặc điểm vi phẫu thịt quả và soi bột

a, Vi phẫu thịt quả

Thịt quả màu trắng, soi dưới kính hiển vi thấy: Các mảnh mạch xoắn (1,2),

mảnh mô mềm hình đa giác (3), tế bào thịt quả trontg chứa các hạt tinh bột

(4,5), tinh thể calci oxalat hình khối (6).

Hình 8: Vi phẫu thịt quả

b, Soi bột

Bột có màu đen, mùi thơm đặc trưng, để ngoài không khí dễ hút ẩm trở nên

kết dính với nhau trông như cao. Quan sát dưới kính hiển vi nhận thấy: các

mảnh mạch (1,2), mảnh mô mềm màu vàng (3,8), rất nhiều các hạt tinh bột tập

trung trong tế bào mô mềm (4), các hạt tinh bột rải rác ở các tế bào (6), hình

dạng tế bào thịt quả (5), ngoài ra còn có các mảnh mang màu (7).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 9: Bột thịt quả đào tiên dưới kính hiển vi

3.3 Độ ẩm

Dùng phương pháp xác định hàm ẩm bằng sử dụng máy đo độ ẩm Precisa

HA 60, kết quả thu được như sau:

Bảng 6: Độ ẩm của dược liệu bột quả đào tiên

STT Hàm ẩm Giá trị trung bình (%)

1 13,16

13,91 2 13,94

3 14,63

Nhận xét : Độ ẩm các mẫu dược liệu khô của đào tiên khoảng 13,91 %. Cao

nhất là 14,63% và thấp nhất là 13,16%. Do vậy quy định độ ẩm không quá

15%.

Bảng 7: Độ ẩm của thịt quả đào tiên tươi

STT Hàm ẩm Giá trị trung bình (%)

1 83,7

2 84,56 84,12

3 84,1

Nhận xét: Độ ẩm các mẫu dược liệu khô của đào tiên khoảng 84,12 %. Cao

nhất là 84,56% và thấp nhất là 83,7%. Do vậy quy định độ ẩm không quá 85%.

3.4 Tro toàn phần

Trong đó: m: khối lượng tro (g);

Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

M: khối lượng mẫu thử (g);

A: độ ẩm của mẫu thử (%).

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Với độ ẩm mẫu mang đi thử là 14,63

Bảng 8: Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu đào tiên

Khối lượng Khối lượng Tỷ lệ tro toàn STT dược liệu(g) tro(g) phần(%)

1 1,035 0,068 7,69

2 1,056 0,070 7,76

3 1,015 0,061 7,03

Trung bình 7,49

Nhận xét: Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu trung bình là

7,49%, mẫu cao nhất là 7,76%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược liệu

không quá 8 %.

3.5 Tro không tan trong acid

Tỷ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó: m: khối lượng tro (g);

M: khối lượng mẫu thử (g);

A: Độ ẩm của mẫu thử (%).

Với độ ẩm mẫu mang đi thử là 14,63

Tiến hành theo phương pháp 2 (Phụ lục 9.7 DĐVN V), kết quả thu được như

bảng sau:

Bảng 9: Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu đào tiên

Khối lượng Khối lượng Tỷ lệ tro không tan STT dược liệu(g) trong acid(%) tro(g)

1 0,012 1,035 1,358

2 0,016 1,056 1,774

3 0.009 1.015 1,038

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Trung bình 1,39

Từ bảng trên cho thấy tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu trung bình

là 1,39%, mẫu cao nhất là 1,774%. Do vậy, qui định tỷ lệ tro toàn phần dược

liệu không quá 2%.

3.6 Định tính

* Mẫu tươi

Kết quả sơ bộ cho thấy trong mẫu tươi thịt quả có chứa tanin và phenol,

saponin, flavonoid, glycosid tim, iridoid.

Bảng 10: Kết quả định tính mẫu tươi

Thí nghiệm kiểm tra Quan sát Nhóm chất Kết luận

Tanin và phenol Quan sát thấy màu xanh đen Dương tính 10ml mẫu+ nước cất+ nhiệt và lọc + FeCl3 1%

Lắc mạnh trong 5

phút. Để nguyên sau Dương Saponin 20ml mẫu+ nước cất+ nhiệt + lọc 15 phút vẫn còn cột tính

bọt

10ml mẫu +5ml HCl 1% + nhiệt Dung dịch thu được Âm Alkaloid +lọc+ acid picric không đục tính

Quan sát Dương Flavonoid thấy có màu vàng tính 10ml mẫu + 10ml ethyl acetat + Nhiệt + Lọc + 1ml dung dịch NH3

Glycosid Quan sát Dương

tim thấy có màu nâu tính 5ml mẫu + acid acetic băng + lọc + Vài giọt FeCl3+ 1ml H2SO4 đậm đặc

Iridoid 10ml mẫu+ nước cất + nhiệt + lọc + TT Trim Hill Quan sát thấy có màu xanh Dương tính

* Mẫu khô

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Kết quả định tính mẫu khô thấy chứa đường khử, polysaccarid, flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, tanin, chất béo. Được thể hiện rõ qua bảng 11.

Bảng 11: Kết quả định tính mẫu khô

Kết quả sơ bộ Phản ứng định tính thuốc Nhóm chất thử Kết quả Kết luận

1. Đường khử Phản ứng Fehling Có +

2. Polysaccarid Rượu 96% Có +

+ FeCl3 5%

Phản ứng Cyanidin +

NaOH 10% 3. Flavonoid Có -

- Rượu AlCl3

Chì Acetat +

4. Coumarin Mở đóng vòng lacton Không có -

Phản ứng tạo bọt +

Chì acetat - 5.Saponin Có Phảng ứng lafon -

Phản ứng Salkowski +

TT Ninhydrin 6. acid amin Có +

7.Acid hữu cơ Có + Na2CO3

Phản ứng gelatin 8. Tanin Có +

TT Trim Hill 9. Iridoid Không có -

Vi thăng hoa - 10. Glycosid tim Không có Phản ứng Borntraeger -

+ 11.Chất béo Hơ trên giấy lọc Có

Cô cách thủy + Anhydryd Không có - 12.Sterol acetic + H2SO4 đặc

- 13. Caroten Không có Cô cách thủy + H2SO4 đặc

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Nhận xét: Kết quả cho thấy trong thịt quả tươi có chứa glycosid tim, iridoid còn trong thịt quả khô phần này là âm tính. Có thể do quá trình làm khô làm biến đổi chất hoặc với chiết xuất ethanol không thu được nhóm chất này so với không sử dụng dung môi chiết.

3.7 Định lượng

3.7.1 Định lượng đường trong thịt quả đào tiên bằng phương pháp đo

quang

a, Khảo sát cực đại hấp thụ quang

Từ kết quả trên thấy độ hấp thụ quang của dung dịch đạt giá trị cực đại tại

bước sóng 347,5nm. Do đó chọn bước sóng 347,5 là bước sóng khảo sát.

b, Tiến hành đo quang và tính toán kết quả

Hình 10: Phổ hấp thụ của các dung dịch trong khoảng bước sóng từ

330-800nm

Chú thích: 1. Phổ hấp thụ của dung dịch mẫu trắng

2. Phổ hấp thụ của dung dịch chiết 3. Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn glucose

Kết quả thực nghiệm thu được mật độ quang của dunng dịch chuẩn và dung dịch thử tươi và khô lần lượt là 0,990 và 0,890, 0,771. Áp dụng công thức ta tính được hàm lượng đường tính theo glucose trong nguyên liệu khô hoàn toàn

là:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

* Mẫu khô

*Mẫu tươi

⚫ Xác định khoảng tuyến tính

c, Thẩm định và đánh giá phương pháp

Tiến hành pha 1 dãy dung dịch chuẩn glucose với nồng độ như bảng . Hút

lần lượt chính xác 1ml dung dịch chuẩn, 4ml dung dịch thử 1, 4ml dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun

cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch nguội tiến

hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Mẫu trắng được chuẩn bị song song, chỉ

không chứa dung dịch chiết. Dựa trên phần mềm excel để vẽ đồ thị đường

chuẩn.

Bảng 12: Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn

0,052

0,069

0,089

0,135

0,267

0,331

Nồng độ (mg/ml)

Abs

0,198

0,250

0,310

0,480

0,990

1,188

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 3,6317x - 0,0015 Hệ số tương quan: R2= 0,9989

1.4

1.2

y = 3.6317x - 0.0015 R2 = 0.9989

) s b A

(

0.8

0.6

0.4

g n a u q ụ h t p ấ h ộ Đ

0.2

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Nồng độ glucose(mg/ml)

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 11 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 347,5nm

Từ kết quả ở bảng và hình trên cho thấy với nồng độ của chất chuẩn từ 0,052- 0,54 (mg/ml) có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang. Ta được y = 3,6317x - 0,0015 với hệ số tương quan R2= 0,9989. ⚫ Khảo sát độ lắp lại của phương pháp

Để xác đinh độ lặp lại của phương pháp tiến hành với 6 thí nghiệm riêng

biệt cho mẫu chiết khô thịt quả đào tiên trong cùng điều kiện chiết.

Tiến hành: Hút chính xác 1ml dung dịch chiết, 4ml dung dịch thử 1, 4ml

dung dịch thử 2 vào bình định mức 10ml sau đó cho nước cất đến vạch. Khuấy đều, đun cách thủy trong 1 giờ. Làm nguội dưới vòi nước. Sau khi dung dịch

nguội tiến hành đo quang tại bước sóng 347,5nm. Mẫu trắng được chuẩn bị

song song, chỉ không chứa dung dịch chiết. Kết quả thu được như sau:

Bảng 13: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang

STT 1 2 3 4 5 6

Abs 0,777 0,789 0,792 0,798 0,767 0,798

Khối lượng 2,0016 2,0034 2,0048 2,0052 2,006 2,0068 bột khô (g)

Số liệu thống kê SD= 0,0124; RSD= 1,576%

Kết quả ở bảng cho thấy phương pháp có độ lặp có thể chấp nhận được

⚫ Độ đúng của phương pháp

thông qua RSD= 1,576%.

Để xác định độ đúng thực hiện với dung dịch chuẩn glucose có nồng độ chính xác 0,135 (mg/ml). Các bước tiến hành như trên nhưng lặp lại 6 lần.

Bảng 14: Kết quả xác định độ đúng phương pháp

1

2

3

4

5

6 STT

0,480

0,482

0,489

0,491

0,0,495

0,489

Abs

Nồng

độ

0,1357

0,1366

0,1372

0,1399

0,1347

0,1355

Glucose

(mg/ml)

Ctrung bình= 0,1366 ; SD= 0.0018

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Tra bảng t(0.95;5)=2,57 > ttn=2,17

Như vậy: tc > ttn: không có sự khác nhau về kết quả của giá trị trung bình so với giá trị tham chiếu ở mức ý nghĩa 5%, tức là phương pháp có độ đúng đạt

yêu cầu.

3.7.2 Xác định hàm lượng đường tổng bằng phương pháp Bertrand

* Mẫu tươi: Khối lượng mẫu ban đầu đem đi định lượng là 10g, thể tích KMnO4 đem chuẩn độ là 24,7ml (tra bảng xác định đường glucoza tương đương với 87mg đường glucoza). Lượng dung dịch thử đem đi làm thí nghiệm là 10ml. Thể tích dung dịch sau định mức là 76,4ml. Từ đó áp dụng công thức

ta tính được hàm lượng đường toàn phần là:

* Mẫu khô: Khối lượng mẫu ban đầu đem đi định lượng là 2g, thể tích KMnO4 đem chuẩn độ là 25,5ml (tra bảng xác định đường glucoza tương

đương với 90mg đường glucoza). Lượng dung dịch thử đem đi làm thí nghiệm

là 10ml. Thể tích dung dịch sau định mức là 77,5ml. Từ đó áp dụng công thức

ta tính được hàm lượng đường toàn phần là:

Nhận xét: Hàm lượng đường trong thịt quả khô cao hơn trong thịt quả tươi.

Định lượng đường bằng phương pháp đo quang (36,23%) cho kết quả cao hơn với phương pháp Bertrand (đôi với mẫu khô) có thể do định lượng trên 2 mẫu

quả khác nhau dẫn tới kết quả khác nhau. Quá trình định lượng theo phương

pháp Bertrand thực hiện nhiều bước, kết quả sai số lớn hơn dẫn tới sự chênh lệch về kết quả. 3.8 Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên

3.8.1 Đánh giá tính chất cảm quan và chỉ số lý hóa của dầu

a, Mô tả

Dầu thô chiết từ hạt của quả đào tiên có màu vàng nâu đậm, trong suốt, có

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

mùi thơm nhẹ, đặc trưng.

b, Chỉ số lý hóa

Kết quả thực nghiệm được ghi lại trong bảng dưới đây.

Bảng 15: Một số chỉ số của dầu hạt đào tiên

Chỉ số acid (mg Chỉ số peroxid Chỉ số iod (Wijs) Chỉ số xà phòng

KOH/g) (mEq/kg) (gI2/100g) hóa (mg KOH/g)

4,02 9,6 92 188,5

Về mặt ý nghĩa của các chỉ số, chỉ số acid tương đối cao cho thấy dầu dễ bị

phân hủy hoặc oxi hóa. Còn các chỉ số còn lại đều bình thường.

3.8.2 Định lượng dầu thô bằng phương pháp cân

Sau khi trích ly dầu từ 39g hạt bằng hệ thống soxlet và cô quay chân không để

tách hết dung môi thu được dầu có màu vàng nâu đậm.

m1 = 271,74g; m2= 278,16; m = 39,04g;

% chất béo

3.8.3 Định tính thành phần acid béo của dầu bằng phương pháp GC/MS.

Từ lượng dầu đã được trích ly, tiến hành methyl hóa sau đó sử dụng phương

pháp sắc ký khí khối phổ để định tính các acid béo có trong dầu. Thu được kết

quả như sau:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

Hình 12: Sắc ký đồ các acid béo của dầu hạt đào tiên

Kết quả phân tích bằng GC- MS thấy peak có cường độ lớn nhất tại thời gian lưu 21,949, cho thấy đây là thành phần chiếm nhiều nhất trong dầu hạt đào

tiên. Qua nhận dạng cấu trúc hóa học bằng khối phổ xác định hợp chất có thời

gian lưu 21,949 là 14,17- Octadecadienoic acid.

Dưới đây là kết quả tóm tắt những thành phần hóa học chính trong dầu hạt

đào tiên được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC- MS):

Bảng 16: Thành phần chính trong dầu hạt đào tiên

STT RT Thành phần acid béo CTPT Tỉ lệ (%)

0,31 20,788 Palmitoleic acid C16: 1 1 C16H30O2

19,56 20,931 Palmitic acid C16: 0 2 C16H32O2

12,15- Octadecadienoic acid 5,9 21,884 C18: 2 3 C18H32O2 14,17- Octadecadienoic acid 67,85 21,949 C18: 2

3,85 22,044 Stearate acid C18: 0 4 C18H36O2

0,15 23,129 11-Eicosenoic acid C19: 1 5 C19H38O2

1,2 25,250 Nonadecanoic acid C19:0 6 C19H38O2

0,54 23,326 Eicosanoic acid C20:0 7 C20H40O2

Qua kết quả thấy rằng trong dầu hạt đào tiên chứa 9 thành phần, trong đó

chủ yếu là 14,17- Octadecadienoic acid, Palmitic acid. Hàm lượng acid béo

không no chiếm khá nhiều trong tổng lượng acid có trong dầu hạt đào tiên, loại

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

acid có lợi cho sức khỏe con người. Đây sẽ là nguồn nguyên liệu tiềm năng để nghiên cứu và phát triển dầu ăn.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Sau một thời gian thực hiện đề tài thu được kết quả như sau:

- Đã mô tả được hình thái thực vật quả đào tiên và đặc điểm vi phẫu thịt

quả.

- Đã định tính và xác định một số nhóm chất có trong thịt quả đào tiên là:

tanin và phenol, flavonoid, iridoid, glycosid tim trong mẫu thịt quả tươi. Trong

mẫu thịt quả khô định tính sơ bộ được: acid hữu cơ, acid amin, saponin, chất

béo, polysacarid, tanin, saponin, flavonoid, đường khử.

- Đây là nghiên cứu bước đầu góp phần từng bước hoàn thành chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu thịt quả đào tiên theo tiêu chuẩn DĐVN V.

Trong đó, độ ẩm không quá 15% với thịt quả khô và 85% với thịt quả tươi; tro toàn phần không quá 8%; tro không tan trong acid không quá 2%. Định lượng

đường tổng theo 2 phương pháp: phương pháp Bertrand và phương pháp đo

quang thu được các kết quả lần lượt là 6,72%, 7,55% với thịt quả tươi và

35,01%, 36,23% với thịt quả khô.

- Nghiên cứu dầu từ hạt đào tiên xác định được các chỉ số acid, peroxid, iod,

xà phòng hóa lần lượt là: 4,02; 9,6; 92; 188,5. Định lượng dầu thô tính được

dầu chiếm 16,44%. Định tính các chất có trong dầu bằng phương pháp GC- MS

thu được các chất là: Palmitoleic acid, Palmitic acid, 12,15- Octadecadienoic

acid, 14,17- Octadecadienoic acid, Stearate acid, 11- Eicosenoic acid,

Eicosanoic acid, Nonadecanoic acid.

Kiến nghị

Do thời gian có hạn, đề tài mới chỉ xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở với một

mẫu trồng tại Lạng Sơn. Do đó, cần tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu nhiều

hơn để việc kết luận các chỉ tiêu mới có thể mang tính đại diện cho dược liệu

thịt quả đào tiên.

- Đề xuất xây dựng chỉ tiêu định lượng thành phần chính, đặc trưng của dược liệu thịt quả đào tiên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao góp phần đánh giá chính xác hàm lượng hóa chất thực vật hữu ích có trong thịt quả đào tiên.

- Đề xuất xác định tỉ lệ tạp chất trong dược liệu, tỉ lệ vụn nát và xác định

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

hàm lượng kim loại nặng cho dược liệu thịt quả đào tiên.

- Đề xuất tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu thịt quả đào tiên để bổ sung một chuyên luận mới về dược liệu Đào tiên

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

trong Dược điển Việt Nam.

Tài liệu tham khảo

Tiếng việt

[1] Bộ môn dược liệu (2010), Thực tập dược liệu, Trường đại học dược Hà

Nội.

[2] Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr68-79.

[3] Bộ Y tế (2007), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản y học, Hà Nội,

tr857-862.

[4] Bộ môn thực vật, Trường ĐH Dược Hà Nội (2005), Thực vật học, Nhà xuất

bản Y học.

[5] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam- tập III, Nhà xuất bản trẻ,

tr83-85.

[6] Võ Văn Chi (1997), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam- tập I, Nhà xuất bản

khoa học và kỹ thuật, tr136.

[7] Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam- tập I,

Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, tr209, 305, 747- 748.

[8] Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Hoàng Thanh và Đinh Hoa Lĩnh (2004),"Luận

văn Nghiên cứu một số bài thuốc, cây thuốc dân gian của cộng đồng dân tộc

thiểu số tại buôn Đrăng Phôk –vùng lõi vườn quốc gia Yokđôn –huyện Buôn

Đôn –tỉnh Đaklak".

[9] Đỗ Tất Lợi (1962), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học,

Hà Nội, tr897.

[10] Nguyễn Quốc Tuấn (2012), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng

flavonoid trong lá và nụ vối, Luận văn thạc sĩ- Trường ĐH Khoa học tự nhiên.

[11] Nguyễn Thị Huế (2017), Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M. Feng) Trồng tại Sapa- Lào Cai, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Khoa Y Dược, ĐHQGHN.

[12] Trần Hà Ngân (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Đào tiên, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Trường ĐH Dược Hà Nội.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[13] Dược điển Việt Nam (2010), Tập IV.

[14] Nguyễn Thế Cường (2011), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của thịt quả đào tiên (Crescentia cujete Linn.), họ Núc Nác

(Bignoniaceae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học- Trường ĐH Dược Hà

Nội

[15] Trần Bích Lam, Lê Xuân Hải, Nguyễn Thị Triều My, Lâm Quốc Trình (2011), “Nghiên cứu quá trình thu nhận dầu thô bằng phương pháp ép và trích

ly từ hạt cây cao su Nam Bộ”, Science and Technology Development, Vol 14,

No.K3- 2011.

Tiếng anh

[16] Tetsuo Kaneko, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki and

Nguyen Minh Duc (1997), “Iridoid and Iridoid Glucosides from fruits of

Crescentia cujete”, Phytochemistry, 46, pp.907-910.

[17] Tetsuo Kaneko, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki and

Nguyen Minh Duc (1998), “n-alkyl glycosides and p-hydoxybenzoyloxy

glucose from fruit of Crescentia cujete”, Phytochemistry, 47, pp.259-263.

[18] Michael, 2004; Burkill, 1985; Plant Database, 2004.

[19] Khandaker Rayhan Mahbub, Md. Mojibul Hoq, Monzur Morshed Ahmed,

Animesh Sarker (2011), “In vitro Antibacterial activity of Crescentia cujete

and Moringa oleifera”.

[20] Julia F. Morton, “The Calabash (Crescentia cujete) in Folk Medicine”.

[21] Linda B. Nielsen, Riskiono Slamet, Dieter Wege (2009), “The synthesis of

3-hydroxymethylfuro[3,2-b] naphtho [2,3-furan-5,10-dione, a novel metabolite

isolated from Crescentia cujete”.

[22] Sinval Garcia Pereira1 & Sandra Alves de Araújo1 & Giselle Maria

Skelding Pinheiro Guilhon & Lourivaldo Silva Santos &Livio Martins Costa Junior (2016), “In vitro acaricidal activity of Crescentia cujete L. fruit pulp against Rhipicephalus microplus”.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[23] The chemical constituents of calabash (Crescentia cujete) / Ejelonu BC, Lasisi AA,Olaremu AG and Ejelonu OC/ African Journal of Biotechnology Vol. 10(84), pp. 19631-19636, 26 December, 2011 / DOI: 10.5897/AJB11.1518

[24] B A Smith, F G Dollear,“Oil from calabash seed, Crescentia cujete L.”, Journal of the American Oil Chemists' Society 24(2):52-54. February

1947 / DOI: 10.1007/BF02642127

[25] C Alay-ay, A Hermoso, R Li, M Quinto, P Santos, I Tan, M Villa, R

Cadiang, M Corpuz, “Hypoglycemic Effect Of Crescentia Cujete Linn. (Bignoniaceae) Fruit Juice In Normal Sprague-Dawley Rats”, Planta Med 2016;

82 - PB2 / DOI: 10.1055/s-0036-1578650.

[26] Syaefudin, D Nitami, M D M Utari , M Rafi and U Hasanah, “Antioxidant

and Antibacterial Activities of Several Fractions from Crescentia cujete L.

Stem Bark Extract”, Earth and Environmental Science 197 (2018).

[27] Sri Rahmaningsih, Arief Prajitno, Aulanni’am Aulanni’am, “Maftuch,

Bioactive Compounds From Majapahit Fruit (Crescentia cujete) As a Potential Natural Antibacterial”, International Journal of ChemTech Research, Vol.10

No.3, pp 90-99.

[28] U Hasanah, HT Widhiastuti and Syaefudin, “Potency of Ethanol Extract

from Berenuk (Crescentia cujete L.) Fruit Rind and Flesh as Antibacterial

[29] Leopold, B. (1962), “Spectrophotometric Determination of Sugars Using

Agents”, Earth and Environmental Science 187 (2018).

p-Aminobenzoic Acid”, Analytical Chemistry, 34(1), 170-171.

[30] Mesoamerica, A.F. (2008), The Mysterious Tree, Biologist mirtha cano.

[31] The stephen H.B., Crescentia alata. The Institute of Food and Agricultural

Sciences, U.S Department of Agricultural, Cooperative Extension Service,

University of Florida, IFAS, Florida A.& M.

[32] G. Bertrand, N. Gabriel. Le dosage des sucres reducteurs. Bul. Soc. Chim. Paris, 35: 1285-1299. 1906.

[33] GOST 31665-2012 Animal and vegetable fats and oils- Preparation of methyl esters of fatty acids. Euro- Asian council for standardization, metrology and certification. 2012

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the watermark

[34] The United Nations Conferencen on trade and Development (2005), Market Brief in the European Union for selected natural ingredients from native species Crescentia cujete, United Nation.

[35] David W. Nellis (1997), “Poisonous plants and animal of Florida and the Caribbean”, Pineapple Press, Inc., pp.156- 157.

[36] Ogbuagu, M.N (2008), “The nutritive and Anti-Nutritive Compositions of Calabash (Cresscentia cujete) Fruit pulp”, Journal of Food Technology, 6,

pp.267- 270.

[37] Frantisek S. (1998), “The Natural Guide to Medicinal Herb Plants”, Tiger

book Intenrational Plc, Twickers. 8:20.

[38] Finar IL (2000), “Stereochemistry and the Chemistry of Natural Products”, Organic Chemistry vol. 2 5th Edn. pp.603, 811.

[39] Turner (1965), “A screening Methods in Pharmacology”, Academic Press, New York and London, pp.66-68.

Internet

[40] The Plant List. Crescentia

[Accessed: 23/3/2019].

[41] Wikipedia. Crescentia

[Accessed: 2/4/2019].