intTypePromotion=4

Knock-down gen Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) gây giảm biểu hiện tyrosine hydroxylase trong tế bào thần kinh sản sinh dopamine và cảm ứng apoptosis trên mô hình ruồi giấm Drosophilamelanogaster

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:8

0
29
lượt xem
1
download

Knock-down gen Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) gây giảm biểu hiện tyrosine hydroxylase trong tế bào thần kinh sản sinh dopamine và cảm ứng apoptosis trên mô hình ruồi giấm Drosophilamelanogaster

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tiến hành nghiên cứu tìm hiểu vai trò của UCH-L1 trong hệ thống sống bằng cách giảm biểu hiện gen và xem xét mức độ ảnh hưởng trên mô hình ruồi giấm chuyển gen. Mời các bạn tham khảo.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Knock-down gen Ubiquitin Carboxy-terminal Hydrolase (duch) gây giảm biểu hiện tyrosine hydroxylase trong tế bào thần kinh sản sinh dopamine và cảm ứng apoptosis trên mô hình ruồi giấm Drosophilamelanogaster

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 267­273<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> KNOCK­DOWN GEN Ubiquitin Carboxy­terminal Hydrolase (duch) <br /> GÂY GIẢM BIỂU HIỆN TYROSINE HYDROXYLASE <br /> TRONG TẾ BÀO THẦN KINH SẢN SINH DOPAMINE VÀ CẢM ỨNG <br /> APOPTOSIS TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM Drosophilamelanogaster<br /> <br /> Đặng Ngọc Ánh Sương, Trần Hoàng Hiệp, Nguyễn Thị Thanh, Đặng Thị Phương Thảo*<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *thaodp@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM TẮT: Ubiquitin Carboxy­terminal Hydrolase L1 (UCH­L1) là một enzyme thuộc hệ thống  <br /> ubiquitin proteasome, có hoạt tính thủy phân liên kết giữa hai phân tử ubiquitin. Ngoài ra, UCH­<br /> L1 còn có hoạt tính nối khi tồn tại ở dạng lưỡng phân trong điều kiện  in vitro. Protein UCH­L1 <br /> được cho là có liên quan đến bệnh Parkinson và một số  loại ung thư  nhưng cơ  chế  gây bệnh  <br /> vẫn chưa được biết rõ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng mô hình ruồi giấm  Drosophila  <br /> melonagaster để nghiên cứu chức năng của protein dUCH (protein tương đồng với UCH­L1 của <br /> người  ở  ruồi giấm) trong hệ thống sống thông qua khảo sát  ảnh hưởng của việc knock­down  <br /> gen duch. Kết quả  thực nghiệm cho thấy, knock­down gen  duch chuyên biệt trên các mô khác <br /> nhau đều dẫn đến những bất thường, cụ thể là thúc đẩy quá trình apoptosis ở mô mắt và giảm <br /> biểu hiện tyrosine hydroxylase (TH), enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp dopamine, ở <br /> mô não. Ngoài ra, knock­down gen duch trên toàn bộ cơ thể ruồi gây chết ấu trùng ở  giai đoạn  <br /> đóng kén. Những kết quả này bước đầu khẳng định protein UCH­L1 có vai trò quan trọng trong <br /> việc duy trì hoạt động bình thường của tế  bào, tạo tiền đề  cho các nghiên cứu làm rõ cơ  chế <br /> hoạt động của protein này trong cơ thể sống.<br /> Từ  khóa: Drosophila melanogaster, apoptosis, cancer, Parkinson’s disease, tyrosine hydroxyalse, <br /> UCH­L1. <br /> <br /> MỞ ĐẦU thoái   hóa   thần   kinh,   đột   biến   UCH­L1I93M, <br /> được tìm thấy trên một bệnh nhân Parkinson, <br /> Ubiquitin   Carboxy­terminal   Hydrolase   L1 <br /> làm thay đổi một phần cấu trúc của UCH­L1 <br /> (UCH­L1)   là   một   protein   chưa   biết   rõ   chức <br /> và làm giảm 50% hoạt tính của UCH­L1 [10].  <br /> năng gồm 223 amino acid. UCH­L1 biểu hiện  <br /> Hơn nữa, chuột chuyển gen biểu hiện UCH­<br /> nhiều   trong   tế   bào   thần   kinh,   chiếm   1­2% <br /> L1I93M có sự tích tụ UCH­L1 và ubiquitin đồng <br /> tổng số protein trong tế bào chất [7]. UCH­L1  <br /> thời các tế  bào sản sinh dopamine chết theo <br /> vừa có hoạt tính thủy phân liên kết giữa hai <br /> thời gian, tương tự đặc điểm sinh lý của bệnh <br /> phân   tử   ubiquitin   [6]   vừa   có   hoạt   tính   nối <br /> Parkinson  [13].  Quan  trọng  hơn,  UCH­L1còn <br /> ubiquitin khi  ở  dạng lưỡng phân trên cơ  chất <br /> có vai trò thiết yếu trong việc duy trì cấu trúc <br /> là   α­synuclein [8]. Ngoài ra,  UCH­L1 còn có <br /> bình thường của synap thần kinh [2].  <br /> vai   trò   bền   hóa   phân   tử   ubiquitin,   giúp   hệ <br /> thống ubiquitin proteasome hoạt động ổn định  Vì vậy, việc tìm hiểu rõ chức năng cũng <br /> [11].  như  mối tương quan giữa protein UCH­L1 với  <br /> các bệnh có liên quan là một nhu cầu cần thiết <br /> Bất thường về chức  năng của UCH­L1 đã <br /> nhằm  cung cấp cơ   sở   cho  điều  trị  và  phòng <br /> được phát hiện ở một số loại ung thư và thoái <br /> ngừa   bệnh.   Trong   nghiên   cứu   này,   chúng   tôi <br /> hóa thần kinh, tuy nhiên vai trò của UCH­L1 <br /> bước đầu tìm hiểu vai trò của UCH­L1 trong <br /> trong cơ chế gây bệnh vẫn chưa được biết rõ.  <br /> hệ  thống sống bằng cách giảm biểu hiện gen <br /> uch­l1 vừa được cho là có vai trò như một gen <br /> và xem xét mức độ   ảnh hưởng trên mô hình <br /> phát sinh ung thư [5] vừa được cho là có vai trò <br /> ruồi giấm chuyển gen.<br /> như  một gen kháng khối u [15]. Đối với bệnh <br /> <br /> 11<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Môi trường, Trường Đại học Khoa học tự <br /> Dòng   ruồi:   Canton­S   (mã   số   1,  nhiên, tp. Hồ  Chí Minh) [14], kháng thể kháng <br /> Bloomington,   Hoa   Kỳ),   TH­GAL4   (mã   số  Tyrosine hydroxylase (Milipore, Nhật), kháng <br /> 8848,   Bloomington,   Hoa   Kỳ),   UAS­dUCH­IR  thể gắn Alexa 488 (Invitrogen, Nhật Bản).<br /> (mã số 26468, Vienna Drosophila RNAi, Áo). Knock­down gen bằng phương pháp RNAi kết  <br /> Kháng   thể:   kháng   thể   kháng   dUCH   (Bộ  hợp hệ thống GAL4/UAS<br /> môn Công nghệ sinh học phân tử và Gen  duch  được   knock­down   bằng   hệ <br /> thống GAL4/UAS [1]. Gen mã hóa cho protein <br /> GAL4 được thiết kế  nằm sau promoter biểu <br /> hiện   định   hướng   mô.  Vùng   UAS  (upstream <br /> activation   sequence)  được   gắn   với   hai   đoạn <br /> trình tự  gen  duch  sắp xếp  đảo chiều (UAS­<br /> dUCH­IR).   Khi   hệ   thống   GAL4/UAS   hoạt  <br /> động,   GAL4   được   tạo   ra   sẽ   bám   lên   vùng <br /> UAS và kích hoạt phiên mã đoạn gen này. Do <br /> có trình tự bổ sung ngược chiều nên sợi RNA <br /> được tạo ra sẽ  tự  động bắt cặp thành RNA <br /> mạch đôi, từ  đó kích hoạt quá trình RNAi tự <br /> nhiên giúp phân cắt mRNA của gen duch, kết <br /> quả  là sự  knock­down gen  duch  tại mô đích <br /> (hình 1a).<br /> <br /> Hình   1.  Knockdown   gen   duch <br /> trên mô mắt và mô não ruồi giấm<br /> <br /> a.  Sơ   đồ  mô hình knock­down gen <br /> duch chuyên biệt mô trên ruồi giấm; <br /> b.  Kết   quả   knock­down   gen  duch <br /> trên mô mắt và mô não ruồi giấm 1,  <br /> 2, 5, 6:  Đĩa tiền phân sinh mắt và  <br /> não của  ấu trùng ruồi đối chứng (1, <br /> 5) và  ấu trùng ruồi knock­down gen <br /> duch  (2,   6)   nhuộm   với   kháng   thể <br /> kháng dUCH. 3, 7: Sơ đồ  vùng hoạt <br /> động   của   promoter   GMR   (c)   và <br /> promoter   TH   (g).   4,   8:   Biểu   đồ <br /> tương quan tín hiệu dUCH trên đĩa <br /> mắt (4) với p=0,0002 và trên não ấu <br /> trùng   (8)   với   p   =   0,04   (Welch’s  t­<br /> test). Thước đo tỷ lệ 50 μm.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Nhuộm miễn dịch huỳnh quang (PBST) 0,3%, khóa mô bằng 10% huyết thanh  <br /> Tách mô trong dung dịch PBS lạnh và cố  dê và PBST 0,15% trong 30 phút ở 25oC, sau đó <br /> định bằng paraformaldehyde 4% trong 15 phút  ủ  với kháng thể  sơ  cấp trong 16 giờ   ở  4oC. <br /> ở  25oC.  Sau khi  rửa  bằng PBS­Triton  X­100   Kháng  thể   được  pha   trong 10%  huyết  thanh  <br /> <br /> <br /> 12<br /> dê/PBST   0,15%   với   tỷ   lệ:   kháng   thể   dUCH  nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể <br /> 1:500,   kháng   thể   TH   1:500.   Sau   đó,   rửa   mô  kháng   dUCH   cho   thấy   tín   hiệu   dUCH   giảm <br /> bằng PBST 0,3% rồi  ủ với kháng thể  thứ  cấp  trên đĩa tiền phân sinh mắt của  ấu trùng bậc <br /> gắn Alexa 488 (1:500) trong 2 giờ  ở 25oC. Sau  ba   dòng   ruồi   knock­down   so   với   dòng   đối <br /> khi rửa mô bằng PBST 0,3%, cố định mô trên  chứng (hình 1a­1, 2). Tương tự, tín hiệu dUCH <br /> lam kính với dung dịch bảo quản.  trên não ấu trùng bậc ba cũng giảm (hình 1b­4, <br /> Khảo sát khả  năng leo trèo của ruồi trưởng   5). Như  vậy, chúng tôi đã knock­down thành <br /> thành (climbing) công   gen  duch,   với   hiệu   quả   knock­down <br /> Ruồi 20 ngày tuổi được cho vào các  ống  34,4% trên đĩa mắt (hình 1b­3) và 23,6% trên <br /> nhựa có đánh dấu mức 20cm (10con/lần, mỗi  não (hình 1b­6), tỷ  lệ  này vừa đủ  để  gây ra <br /> ̉ ̉ ̉ ́ ̉<br /> dòng 30 con). Đê đam bao tinh ôn đinh cua kêt ̣ ̉ ́  những bất thường trong tế  bào mà không gây <br /> ̉ ́ ̣ ̉<br /> qua, thi nghiêm chi quan sat trên ruôi đ ́ ̀ ực, vì  chết,   giúp   tiến   hành   những   thí   nghiệm   tiếp <br /> ̉ ̉<br /> chu ky sinh san cua ruôi cai co kha năng anh<br /> ̀ ̀ ́ ́ ̉ ̉   theo thuận lợi hơn. <br /> hưởng tơi s ́ ưc sông va kha năng leo treo. Ð<br /> ́ ́ ̀ ̉ ̀ ập  Knock­down   gen   duch   cảm   ứng   apoptosis <br /> nhẹ   ống nhựa để  đưa ruồi về  cùng mức xuất  trên đĩa tiền phân sinh mắt ruồi giấm<br /> phát và ghi nhận số ruồi vượt mức 20cm trong   Quan sát ban đầu cho thấy dòng ruồi có sự <br /> 20 giây. Lặp lại ba lần cho mỗi lần đo. knock­down  duch  trên   mô   mắt   có   kiểu   hình <br /> Xử lý dữ liệu mắt   nhám,   cấu   trúc   mắt   có   nhiều   sai   hỏng <br /> Kêt́   quả   nhuôm ̣   miên ̃   dich ̣   huynh ̀   quang  (hình   2a,b).   Để   giải   thích   hiện   tượng   này, <br /> được quan sat d ́ ươi kinh hiên vi Axio Scope<br /> ́ ́ ̉   chúng tôi tiến hành nhuộm đĩa mắt với kháng <br /> A1 (Carl Zeiss, Hoa Kỳ) va ghi nhân băng phân ̀ ̣ ̀ ̀   thể   kháng   caspase­3,   một   marker   nhận   diện <br /> mêm̀   Axiovision   4.8.   Sau   đo,́   cường   độ   tín  hiện tượng apoptosis. Đĩa mắt của dòng ruồi <br /> hiệu   huỳnh   quang   khi   nhuôm ̣   vơí   khang ́   thể  knock­down cho thấy có sự  gia tăng đáng kể <br /> khang ́   dUCH   và  cas­3   trên   các   mô   được   đo  của các tín hiệu caspase­3  ở vùng posterior so  <br /> bằng công cu Measure cua phân mêm ImageJ<br /> ̣ ̉ ̀ ̀   với   đối   chứng   (hình   2a’,   b’).   Bên   cạnh   đó, <br /> ̉ ́<br /> (so sanh chi sô IntDen). Sô l<br /> ́ ́ ượng tê bao sinh<br /> ́ ̀   chúng tôi đồng biểu hiện protein P35 trên dòng <br /> dopamine   được   đanh ́   dâu ́   huynh ̀   quang   băng ̀   ruồi knock­down gen duch, P35 là một protein <br /> ́ ̉<br /> khang thê khang TH, sau đo đêm băng công cu<br /> ́ ́ ́ ̀ ̣  của   virus   đã   được   chứng   minh  có   khả   năng <br /> ̉<br /> Cell counter cua phân mêm ImageJ. T ̀ ̀ ất cả  dữ  bất hoạt hoàn toàn quá trình apoptosis []. Dòng <br /> liệu   trên   được   xử   lý   và   phân   tích   thông ́   kê  ruồi   knock­down  duch  và   biểu   hiện   P35   có <br /> kiểu hình mắt trở  về  bình thường  (hình 2c)  <br /> bằng phần mềm Graphpad Prism 6.0.<br /> đồng thời tín hiệu apoptosis trên đĩa mắt cũng <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN không   còn   được   ghi   nhận   (hình   2c’).   Hiện  <br /> tượng   này   không   xảy   ra   ở   dòng   ruồi   đồng <br /> Knock­down gen duch chuyên biệt mô trên  biểu   hiện   một   protein   ngoại   lai   khác   là   β­<br /> mô hình ruồi giấm galactosidase   (hình   2d,   d’).   Như   vậy,   knock­<br /> Trước tiên, chúng tôi knock­down gen duch  down gen duch cảm ứng apoptosis trên đĩa mắt <br /> trên hai mô đích là mắt và não ruồi. Kết quả  của  ấu trùng và dẫn đến kiểu hình mắt nhám <br /> ở ruồi trưởng thành.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 13<br /> Hình 2. Knockdown gen duch cảm ứng apoptosis trên đĩa tiền phân sinh mắt <br /> và gây ra kiểu hình mắt nhám<br /> a­d: Mắt kép các dòng ruồi giấm trong thí nghiệm; a’­d’: Đĩa mắt nhuộm kháng thể  kháng caspase­3, tín  <br /> hiệu  caspase­3  được quan  sát   ở   vùng posterior  (vùng  khoanh  lại);   e:  Biểu  đồ   tương quan  cường  độ <br /> caspase­3 trên các đĩa mắt, với p
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2