Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vật

Chia sẻ: Nguyễn Thuần | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

393
lượt xem 36
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vật

I. KHÁI QUÁT CHUNG: 1. KHÁI NIỆM: - Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen l ạ đã đ ược thi ết k ế ở d ạng DNA tái t ổ h ợp vào t ế bào ch ủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc g ắn vào b ộ gen t ế bào ch ủ. Trong t ế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn t ới việc xuất hi ện các đ ặc tính m ới c ủa c ơ th ể chuyển gen. - Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuy ển vào đ ược t ổ h ợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các th ế h ệ con cháu. 2. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 3. MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE: - Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi để sản xuất protein tái t ổ h ợp. - Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các s ản phẩm s ữa, thịt, lông… - Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái t ổ hợp. - Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nguyên cứu về y sinh học các b ệnh di truy ền. - Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của người). 4. ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE: - Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng đ ược ứng d ụng trên gia súc, gia cầm. - Việc chuyển gen thường được thao tác trên: + Tế bào trứng đã thụ tinh. + Tế bào tinh trùng. + Mô phôi ở giai đoạn sớm. + Tế bào gốc phôi. II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE: Gồm các bước cơ bản sau: - Tách chiết, phân lập gene mong muốn. - Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật. - Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene. - Biến nạp gene tạo phôi đông vật. - Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao). - Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene lạ và t ạo ra dòng đ ộng v ật chuy ển gene gốc một cách liên tục. - Sản xuất động vật chuyển gene. Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn: - Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật ch ủ đ ể t ạo ra đ ộng v ật chuy ển gen phải được phân lập và tinh chế(tạo dòng). - Công cụ sử dụng để tạo dòng: + Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase). + Các mẫu dò (probe). + Vector. + Tế bào vật chủ( thường là E.coli). QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP : - Cắt DNA mẫu và plasmid được cắt bởi cùng một enzyme hạn chế. - Chèn gene mong muốn vào plasmid. Tạo plasmid tái t ổ hợp. - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vật chủ. - Tạo điều kiện thuận lợi cho vật chủ sinh trưởng phát triển.
Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn t ừ s ản phẩm bi ểu hi ện của nó nh ư mRNA hoặc protein. + Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung m ạch đ ơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA b ổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà ch ỉ bao g ồm các exon (Hình 4.2). + Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình t ự nucleotid của gen cấu trúc trên c ơ s ở trình t ự các axit amin trong phân tử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn. Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hi ện một cách t ự nhiên. Các đo ạn intron liên quan đ ến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen. Dạng cDNA là một trình t ự ch ỉ bao g ồm các đoạn exon mã hoá protein của gen. Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật: - Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc t ừ các loài khác nhau có thể đ ược k ết h ợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn ch ế và ligase. - Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn ch ế khác nhau - Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò đi ều hoà s ự bi ểu hi ện c ủa gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố đi ều hoà ở g ần đ ầu 5’ c ủa gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà s ự biểu hi ện của gen. - Phương pháp chuyển gene trực tiếp: . Chuyển gene nhờ calcium phosphate . Chuyển gene nhờ xung điện . Chuyển gene nhờ vi tiêm . Chuyển gene nhờ liposome,… - Phương pháp chuyển gene gián tiếp: Chuyển gene nhờ virus: + vector retrovirus ( RNA ) + vector adenovirus ( DNA sợi kép ) + vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn ) + vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép ) + vector baculovirus ( DNA vòng kép ),…. a. Phương pháp vi tiêm: Nguyên tắc: - Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm r ất m ảnh.
- Phương pháp này cho kết quả rất cao nhưng số lượng tế bào được xử lý nh ỏ do ph ải thao tác trên từng tế bào. - Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm. - Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh nhưng ch ưa kết h ợp thành h ợp t ử l ưỡng b ội. - Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di truyền cho các thế h ệ sau. Qui trình: - Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng. - Thu nhận trứng đã thu tinh - Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml - Chuẩn bị tế bào hợp tử - Vi tiêm DNA vào tiền nhân - Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận - Kiểm tra gene chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền. b. Chuyển gene nhờ xung điện: Nguyên tắc: - Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung đi ện ( điện cao th ế trong m ột thời gian rất ngắn) lúc đó trên tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ. - Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số t ế bào chúng có th ể t ương tác v ới genome của tế bào  tế bào chuyển gene. - Máy tạo xung điện có công suất ổn định,điện thế từ 500-1500 v/cm - Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào còn s ống. Chú ý: - Các DNA duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gene cao hơn, do khả năng dung h ợp v ới genome c ủa t ế bào đích. - Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung dịch huyền phù đơn
- Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn - Các tế bào khác nhau thì các thông số sử dụng khác nhau. Chuyển gene nhờ vector retrovirus: 1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus: - Là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật ch ủ và g ắn b ộ gene virus vào genome t ế bào chủ. - Cấu trúc gồm : + Có cấu tạo vỏ gồm: vỏ ngoài cùng glycoprotein, vỏ trong là lipide kép, v ỏ trong cùng là capside. + Phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng dạng và các enzyme. + Enzyme phiên mã ngược ( reverse Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho quá trình cài xen b ộ gene c ủa virus v ới genome t ế bào v ật chủ ở những điểm tương đồng. 2. Cơ chế hoạt động của vector: - RNA của virus được loại bỏ các gene gag, pol, env và thay vào đó là gene c ần chuy ển. - Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ bằng nhiều phương pháp khác nhau. - Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của vector bị phân hủy, giải phóng RNA. - Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA  cDNA  vào trong nhân tế bào  enzyme cài xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ  các sản phẩm protein của gene mục tiêu trong tế bào đích. - Bước 5: nuôi cấy phôi trong ống nghiệm - Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) hoặc túi phôi ( blastocyst )  cấy chuyền vào con nhận được gây chữa giả. Bước 6: Các phương pháp đánh giá động vật sau khi sinh ra t ừ phôi chuy ển gene: - Southern blot - Northern blot - Western blot. - PCR - RT-PCR - Miễn dịch Elisa. - Bước 7: tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên t ục. Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay ) 1. Nguyên tắc: - Thông qua sự kết hợp của kháng thể và kháng nguyên trong huyết thanh. - Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rữa trôi. - Nhận biết sự gắn này bằng một cơ chất đặc biệt làm thay đổi màu
3. Ý nghĩa, thuận lợi và khó khăn : 3.1.Ý nghĩa : a. Trong nghiên cứu : - Tạo niềm tin vững chắc cho khoa học sự sống. - Ứng dụng công nghệ gene trong chọn tạo giống. - Thay cho phương pháp cổ điển trong chọn gióng vật nuôi. b.Trong sản xuất: - Tạo ra vật nuôi có thể sinh trưởng nhanh, cho chất lượng s ản ph ẩm t ốt và s ố l ượng dồi dào. - Đáp ứng được những nhu cầu ngày càng tăng của con người, cả về số l ượng và ch ất l ượng. - Đêm lại nguồn thu nhập khổng lồ cho người nông dân t ừ chăn nuôi (s ản l ượng th ịt, tr ứng, s ữa… tăng, hàm l ượng các chất cần thiết tăng, thêm nhiều chất quý… ) 3.2.Thuận lợi: - Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học - Kiến thức về kỹ thuật di truyền và công nghệ gene ngày càng phong phú, đ ầy đ ủ, s ự giao l ưu khoa h ọc qu ốc t ế giúp các nhà nghiên cứu tiết kiệm được thời gian, công s ức và tiền bạc, đ ồng thời thu đ ược hi ệu qu ả thành công cao hơn. 3.3.Khó khăn: Mỗi cơ thể sinh vật đều có tính ổn định, do đó việc chuyển những gene mong muốn là không h ề đ ơn gi ản, các nhà khoa học vẫn chưa bằng lòng với những gì đã có được vì chủ yếu chúng vẫn nằm trong đi ều ki ện phòng thí nghi ệm, khó ứng dụng đuợc ra sản xuất. SO SÁNH KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Ở VI KHUẨN, ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT GiỐNG NHAU • Mục đích tạo ra những sinh vật chuyển gene mang các đặc tính vượt trội hơn nh ững sinh v ật tr ước đó, phụ thuộc vào mục đích của con người – Như tăng năng suất. – Giảm thiểu ô nhiễm môi trường. – Tạo ra các sản phẩm sinh học ( sản lượng thịt, trứng…). • Đều dùng các vector chuyển gene
• Đều cần có sự tham gia của các enzyme. • Khả năng tiếp nhận DNA (RNA) đều phụ thuộc vào tế bào nhận và gene cần chuyển. • Sau khi gene được chuyển vào tế bào nhận đều có khả năng phân cắt b ởi các enzyme nuclease • Đều phải tạo dòng gene từ các tế bào cho bằng phương pháp PCR hoặc b ằng vi khuẩn. • Đều phụ thuộc vào hoạt động sinh lý của tế bào. • Tế bào cho không cho toàn bộ NST. • Đều phải thực hiện quá trình chọn lọc dòng. • Đều chịu tác động trực tiếp vào yếu tố con người và các điều kiện chuyển gen. • Các loài sinh vật gần gũi, có nhiều lợi ích cho con người (gà, bò, dê, thu ốc lá, ngô, bông…)