I. KHÁI QUÁT CHUNG:
1. KHÁI NI M:Ệ
- K thu t chuy n gen là k thu t đ a 1 hay nhi u gen l đã đ c thi t k d ng DNA tái t h p vào t bào chỹ ậ ể ỹ ậ ư ề ạ ượ ế ế ở ạ ổ ợ ế ủ
c a đ ng v t làm cho gen l có th t n t i d ng plasmix tái t h p ho c g n vào b gen t bào ch . Trong t bàoủ ộ ậ ạ ể ồ ạ ở ạ ổ ợ ặ ắ ộ ế ủ ế
ch ,các gen này ho t đ ng t ng h p nên các protein đ c tr ng d n t i vi c xu t hi n các đ c tính m i c a c thủ ạ ộ ổ ợ ặ ư ẫ ớ ệ ấ ệ ặ ớ ủ ơ ể
chuy n gen.ể
- Đ i v i các th nhân chu n, vi c chuy n gen đ c xem là thành công khi gen chuy n vào đ c t h p vàoố ớ ể ẩ ệ ể ượ ể ượ ổ ợ
genome c a t bào ch , đ c tính c a gen chuy n n p đ c duy trì n đ nh qua các th h con cháu.ủ ế ủ ặ ủ ể ạ ượ ổ ị ế ệ
2. L CH S PHÁT TRI NỊ Ử Ể
3. M C ĐÍCH CHUY N GENE:Ụ Ể
- Chuy n gen vào các dòng t bào đ ng v t nuôi đ s n xu t protein tái t h p.ể ế ộ ậ ể ả ấ ổ ợ
- T o v t nuôi chuy n gen v i đ c tính c i ti n m i v các s n ph m s a, th t, lông…ạ ậ ể ớ ặ ả ế ớ ề ả ẩ ữ ị
- Bi n v t nuôi thành bioreacter s n xu t protein tái t h p.ế ậ ả ấ ổ ợ
- T o v t nuôi chuy n gen “knock out” làm mô hình nguyên c u v y sinh h c các b nh di truy n.ạ ậ ể ứ ề ọ ệ ề
- Chuy n gen li u pháp nh m ch a tr các b nh di truy n (c a ng i).ể ệ ằ ữ ị ệ ề ủ ườ
4. Đ I T NG CHUY N GENE:Ố ƯỢ Ể
- H u h t các ph ng pháp chuy n gen đ u đ c phát tri n trên mô hình chu t và sau đó chúng đ c ng d ng trênầ ế ươ ể ề ượ ể ộ ượ ứ ụ
gia súc, gia c m.ầ
- Vi c chuy n gen th ng đ c thao tác trên:ệ ể ườ ượ
+ T bào tr ng đã th tinh.ế ứ ụ
+ T bào tinh trùng.ế
+ Mô phôi giai đo n s m.ở ạ ớ
+ T bào g c phôi.ế ố
II. CÔNG NGH T O Đ NG V T CHUY N GENE:Ệ Ạ Ộ Ậ Ể
G m các b c c b n sau:ồ ướ ơ ả
-Tách chi t, phân l p gene mong mu n.ế ậ ố
-T o t h p gene bi u hi n trong t bào đ ng v t.ạ ổ ợ ể ệ ế ộ ậ
-T o c s v t li u bi n n p gene.ạ ơ ở ậ ệ ế ạ
-Bi n n p gene t o phôi đông v t.ế ạ ạ ậ
-Nuôi c y phôi và c y truy n h p t ( đ i v i ĐV b c cao).ấ ấ ề ợ ử ố ớ ậ
-Phân tích đánh giá tính n đ nh và s bi u hi n c a gene l và t o ra dòng đ ng v t chuy n geneổ ị ự ể ệ ủ ạ ạ ộ ậ ể
g c m t cách liên t c.ố ộ ụ
-S n xu t đ ng v t chuy n gene.ả ấ ộ ậ ể
B c 1: Tách chi t, phân l p gene mong mu n:ướ ế ậ ố
-Gen ngo i lai tr c khi đ c chuy n vào genome c a t bào v t ch đ t o ra đ ng v t chuy nạ ướ ượ ể ủ ế ậ ủ ể ạ ộ ậ ể
gen ph i đ c phân l p và tinh ch (t o dòng).ả ượ ậ ế ạ
-Công c s d ng đ t o dòng:ụ ử ụ ể ạ
+ Enzyme c t và n i DNA (enzyme h n ch và ligase).ắ ố ạ ế
+ Các m u dò (probe).ẫ
+ Vector.
+ T bào v t ch ( th ng là E.coli).ế ậ ủ ườ
QUY TRÌNH TÁCH CHI T, PHÂN L P :Ế Ậ
-C t DNA m u và plasmid đ c c t b i cùng m t enzyme h n ch .ắ ẫ ượ ắ ở ộ ạ ế
-Chèn gene mong mu n vào plasmid. T o plasmid tái t h p.ố ạ ổ ợ
-Bi n n p plasmid tái t h p vào t bào v t ch .ế ạ ổ ợ ế ậ ủ
-T o đi u ki n thu n l i cho v t ch sinh tr ng phát tri n.ạ ề ệ ậ ợ ậ ủ ưở ể
Ng i ta cũng có th phân l p đ c gen mong mu n t s n ph m bi u hi n c a nó nh mRNA ho c protein.ườ ể ậ ượ ố ừ ả ẩ ể ệ ủ ư ặ
+ T mRNA d i tác đ ng c a enzyme sao chép ng c s t ng h p ra DNA b sung m ch đ n (single strandừ ướ ộ ủ ượ ẽ ổ ợ ổ ạ ơ
complement DNA-ss cDNA), ti p theo là DNA b sung m ch kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA bế ổ ạ ổ
sung (complement DNA- cDNA) này khác v i DNA g c là không ch a các intron mà ch bao g m các exon (Hình 4.2).ớ ố ứ ỉ ồ
+ T s n ph m protein,có th suy ra trình t nucleotid c a gen c u trúc trên c s trình t các axit amin trong phânừ ả ẩ ể ự ủ ấ ơ ở ự
t protein.Sau đó có th thi t k c p m i (primer) đ dò tìm đo n gen mong mu n.ử ể ế ế ặ ồ ể ạ ố
Hình 4.2: So sánh hai d ng gen chuy nạ ể
D ng genome bao g m t t c các đo n exon và intron xu t hi n m t cách t nhiên. Các đo n intron liên quan đ nạ ồ ấ ả ạ ấ ệ ộ ự ạ ế
vi c c t ghép mRNA và bi u hi n c a gen. D ng cDNA là m t trình t ch bao g m các đo n exon mã hoá proteinệ ắ ể ệ ủ ạ ộ ự ỉ ồ ạ
c a gen.ủ
B c 2 : T o t h p gene bi u hi n trong t bào đ ng v t:ướ ạ ổ ợ ể ệ ế ộ ậ
-Các vùng ch c năng khác nhau c a gen có ngu n g c t các loài khác nhau có th đ c k t h pứ ủ ồ ố ừ ể ượ ế ợ
l i v i nhau trong ng nghi m b ng cách s d ng enzyme h n ch và ligase.ạ ớ ố ệ ằ ử ụ ạ ế
-B sung các trình t polylinker ch a m t s v trí nh n bi t các enzyme h n ch khác nhauổ ự ứ ộ ố ị ậ ế ạ ế
-Gen chuy n đ c đi kèm v i các trình t không mã hoá có vai trò đi u hoà s bi u hi n c a gen.ể ượ ớ ự ề ự ể ệ ủ
Các y u t đi u hoà cũng có th n m trong đo n intron. Y u t đi u hoà g n đ u 5’ c a gen làế ố ề ể ằ ở ạ ế ố ề ở ầ ầ ủ
promoter, có vai trò quy t đ nh trong vi c đi u hoà s bi u hi n c a gen.ế ị ệ ề ự ể ệ ủ
-Ph ng pháp chuy n gene tr c ti p:ươ ể ự ế
. Chuy n gene nh calcium phosphateể ờ
. Chuy n gene nh xung đi nể ờ ệ
. Chuy n gene nh vi tiêmể ờ
. Chuy n gene nh liposome,…ể ờ
-Ph ng pháp chuy n gene gián ti p:ươ ể ế
Chuy n gene nh virus:ể ờ
+ vector retrovirus ( RNA )
+ vector adenovirus ( DNA s i kép )ợ
+ vector adeno-associated virus ( DNA s i đ n )ợ ơ
+ vector herpes simplex virus ( DNA s i kép )ợ
+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),….
a. Ph ng pháp vi tiêm:ươ
Nguyên t c:ắ
-Tiêm tr c ti p DNA ngo i lai vào nhân t bào đ ng v t nh d ng c vi tiêm v i kim tiêm r t m nh.ự ế ạ ế ộ ậ ờ ụ ụ ớ ấ ả
-Ph ng pháp này cho k t qu r t cao nh ng s l ng t bào đ c x lý nh do ph i thao tác trênươ ế ả ấ ư ố ượ ế ượ ử ỏ ả
t ng t bào.ừ ế
-Th ng đ c dùng đ đ a DNA vào h p t ho c các t bào phôi s m.ườ ượ ể ư ợ ử ặ ế ớ
-Chuy n gene vào tinh trung ho c tr ng khi đã th tinh nh ng ch a k t h p thành h p t l ng b i.ể ặ ứ ụ ư ư ế ợ ợ ử ưỡ ộ
-Vi c chuy n gene ch thành công khi gene chuy n vào di truy n cho các th h sau.ệ ể ỉ ể ề ế ệ
Qui trình:
-Thi t k c u trúc gene chuy n, l a ch n gene thích h p và t o dòng.ế ế ấ ể ự ọ ợ ạ
-Thu nh n tr ng đã thu tinhậ ứ
-Chu n b dung d ch DNA cho vi tiêm, n ng đ t 1-5 µm/mlẩ ị ị ồ ộ ừ
-Chu n b t bào h p tẩ ị ế ợ ử
-Vi tiêm DNA vào ti n nhânề
-Chuy n phôi vi tiêm vào c th nh nể ơ ể ậ
-Ki m tra gene chuy n con non. Lai t o đ c ng c di truy n.ể ể ở ạ ể ủ ố ề
b. Chuy n gene nh xung đi n:ể ờ ệ
Nguyên t c:ắ
-Khi trong đi n tr ng có m t m t đ t bào cao và t o ra m t xung đi n ( đi n cao th trong m tệ ườ ộ ậ ộ ế ạ ộ ệ ệ ế ộ
th i gian r t ng n) lúc đó trên t bào xu t hi n các l nh .ờ ấ ắ ế ấ ệ ỗ ỏ
-Qua các l này, DNA có th đi sâu vào trong t bào và m t s t bào chúng có th t ng tác v iỗ ể ế ở ộ ố ế ể ươ ớ
genome c a t bào ủ ế t bào chuy n gene.ế ể
-Máy t o xung đi n có công su t n đ nh,đi n th t 500-1500 v/cmạ ệ ấ ổ ị ệ ế ừ
-Sau m i l n th c nghi m thì có 20-50% t bào còn s ng.ỗ ầ ự ệ ế ố
Chú ý:
-Các DNA du i th ng cho hi u qu chuy n gene cao h n, do kh năng dung h p v i genome c a tỗ ẳ ệ ả ể ơ ả ợ ớ ủ ế
bào đích.
-Tránh đ t bào dính vào nhau, nên th c hi n trong dung d ch huy n phù đ nể ế ự ệ ị ề ơ
-C n dùng nhi u DNA và t bào đ nầ ề ế ơ
-Các t bào khác nhau thì các thông s s d ng khác nhau.ế ố ử ụ
Chuy n gene nh vector retrovirus:ể ờ
1. Đ c đi m c u t o và di truy n c a retrovirus:ặ ể ấ ạ ề ủ
-Là lo i virus RNA, có kh năng xâm nhi m vào t bào v t ch và g n b gene virus vào genome tạ ả ễ ế ậ ủ ắ ộ ế
bào ch .ủ
-C u trúc g m :ấ ồ
+ Có c u t o v g m: v ngoài cùng glycoprotein, v trong là lipide kép, v trong cùng là capside.ấ ạ ỏ ồ ỏ ỏ ỏ
+ Ph n lõi RNA g m 2 s i đ ng d ng và các enzyme.ầ ồ ợ ồ ạ
+ Enzyme phiên mã ng c ( reverseượ
Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho quá trình cài xen b gene c a virus v i genome t bào v tộ ủ ớ ế ậ
ch nh ng đi m t ng đ ng.ủ ở ữ ể ươ ồ
2. C ch ho t đ ng c a vector:ơ ế ạ ộ ủ
-RNA c a virus đ c lo i b các gene gag, pol, env và thay vào đó là gene c n chuy n.ủ ượ ạ ỏ ầ ể
-Vector retrovirus đ c đ a vào t bào v t ch b ng nhi u ph ng pháp khác nhau.ượ ư ế ậ ủ ằ ề ươ
-Khi vào trong t bào ch t thì ph n v c a vector b phân h y, gi i phóng RNA.ế ấ ầ ỏ ủ ị ủ ả
-Enzyme phiên mã ng c xúc tác RNA ượ cDNA vào trong nhân t bào ế enzyme cài xen giúp
g n cDNA vào genome t bào v t ch ắ ế ậ ủ các s n ph m protein c a gene m c tiêu trong t bào đích.ả ẩ ủ ụ ế
-B c 5: nuôi c y phôi trong ng nghi mướ ấ ố ệ
-T bào tr ng ti n nhân ế ứ ề phôi dâu ( morula ) ho c túi phôi ( blastocyst ) ặ c y chuy n vào conấ ề
nh n đ c gây ch a gi .ậ ượ ữ ả
B c 6: Các ph ng pháp đánh giá đ ng v t sau khi sinh ra t phôi chuy n gene:ướ ươ ộ ậ ừ ể
-Southern blot
-Northern blot
-Western blot.
-PCR
-RT-PCR
-Mi n d ch Elisa.ễ ị
-B c 7: t o ngu n đ ng v t chuy n gene m t cách liên t c.ướ ạ ồ ộ ậ ể ộ ụ
Ph ng pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay )ươ
1. Nguyên t c:ắ
-Thông qua s k t h p c a kháng th và kháng nguyên trong huy t thanh.ự ế ợ ủ ể ế
-Kháng th không g n kháng nguyên s b r a trôi.ể ắ ẽ ị ữ
-Nh n bi t s g n này b ng m t c ch t đ c bi t làm thay đ i màuậ ế ự ắ ằ ộ ơ ấ ặ ệ ổ