Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
1
Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
---------- o 0 o ----------
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,
khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản
phân hoá.
- Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một
cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa
một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền
của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
2
có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn
năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô)
thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có
đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản
phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế
bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực
vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu,
mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã
trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt.
+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành
các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định
chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo
mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia
liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó.
Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được
biểu diễn theo sơ đồ sau:
Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào
Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã
hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế
bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các
gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử
dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế
bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô
nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
3
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại
cây trống khác nhau.
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,
cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà
phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa
sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.
*Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp
với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm
tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các
yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào
mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn
đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh
chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
4
tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh
sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá
chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ
nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng
chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường
nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường
nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là
thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển
từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi
phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây…)
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi
với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều
kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi…
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
5
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải
chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ
dinh dưỡng thích hợp.
* Các phương pháp nhân giống in vitro
Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:
* Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây
giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong
khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải
sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch
virus
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của
cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo
ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian
ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.