Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------------

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT

RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC

NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC

NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số

: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS HỒ HỮU THỌ

TS. MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hồ

Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy đã

tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong

suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS. Mai Thị Đàm Linh –

Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến

thức và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài.

Xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ gen và

Di truyền tế bào đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học và

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp

đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.

Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019

Học viên

Lê Thị Thúy

MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................... 4

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... 7

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 9

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT .............................................................. 10

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3

1.1 Bệnh sốt mò ................................................................................................ 3

1.1.1 Dịch tễ học ........................................................................................... 3

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng .............................................................................. 7

1.1.3 Điều trị ................................................................................................. 9

1.1.4 Phòng bệnh sốt mò ............................................................................ 10

1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi ............................. 10

1.2.1. Đặc điểm sinh học ............................................................................. 10

1.2.2. Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò .......................................................... 14

1.2.3. Cơ chế gây bệnh sốt mò .................................................................... 18

1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò ............................................ 22

1.3.1. Phương pháp huyết thanh học ................................................................. 22

1.3.2. Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR ................................ 24

1.3.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase

amplification (RPA) .......................................................................................... 24

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 34

2.1. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................ 34

2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA ..................................................... 34

2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo ................................................................... 35

2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm

nghiên cứu thiết kế ................................................................................................ 35

2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập .................................................................. 37

2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng ...................................................................... 37

2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng ................................................................... 38

2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) ...................................................... 39

2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện ............................................................................ 40

2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên

thị trường ............................................................................................................... 41

2.7.1. Đánh giá độ nhạy .................................................................................... 41

2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu ............................................................................... 41

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................................................ 43

3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa .......................................... 43

3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa ........... 44

3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA ........................................................................ 45

3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi ................................................... 52

3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA .................................................................. 55

3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường

(PrimerDesign) ...................................................................................................... 57

3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường

............................................................................................................................... 59

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 64

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 66

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 84

Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi ......................... 84

Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân

biệt sốt mò ................................................................................................................. 85

Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện

O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo

................................................................................................................................... 86

Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia

tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo ....................................... 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] ......................................... 4

Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt ........................................................................ 8

Hình 1.3. Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh trong tế

bào nội mô mạch máu ............................................................................................... 11

Hình 1.4. Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense .............................................. 16

Hình 1.5. Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O. tsutsugamushi

[62] ............................................................................................................................ 21

Hình 1.6. Chu trình phản ứng RPA [53] ................................................................... 29

Hình 1.7. Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53] .................................................. 31

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 34

Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo ............................................ 35

Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu ............................ 37

Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của O.

tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong

nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs [38]

................................................................................................................................... 44

Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình

mồi và probe trong nghiên cứu ................................................................................. 45

Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi ........ 47

Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi

................................................................................................................................... 49

Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O.

tsutsugamushi ............................................................................................................ 50

Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O.

tsutsugamushi ............................................................................................................ 51

Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O.

tsutsugamushi ............................................................................................................ 55

Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign)

phát hiện O. tsutsugamushi ....................................................................................... 56

Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu

dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10) ............................................... 59

Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên

các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt

mò .............................................................................................................................. 60

Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia

tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn

đoán phân biệt ........................................................................................................... 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] ........................ 4

Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng

RPA ........................................................................................................................... 26

Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ............................... 32

Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA ............... 36

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR ........................................................ 39

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt .......................................................................................... 40

Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi

................................................................................................................................... 43

Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA ....................................... 52

Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix ................................................................................. 52

Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát

hiện O. tsutsugamushi ............................................................................................... 57

Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình .................................................... 62

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

TT Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

1. : Base pair

bp

2. : Deoxyribonucleic acid

DNA

3. : Kilo base

kb

4. LAMP

: Loop-mediated isothermal amplification

5. : Nucleic acid test

NAT

6. : Polymerase chain reaction

PCR

7. : Ribonucleic acid

RNA

8. : Recombinase polymerase amplification

RPA

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt mò là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng ở khu vực châu Á-

Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam. Theo thống kê của của Cục Y tế dự phòng,

bệnh sốt mò có mặt ở hầu hết 24 tỉnh phía Bắc chiếm 38,51% số bệnh nhân sốt nhập

viện, không rõ căn nguyên. Bệnh do tác nhân Orientia tsutsugamushi gây nên; trung

gian truyền bệnh là ấu trùng mò Leptotrombidium. Nếu không được điều trị sớm với

loại kháng sinh phù hợp có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong

cao. Trong khi đó, các triệu chứng của bệnh sốt mò thường không đặc hiệu và có thể

lẫn với nhiều loại mầm bệnh khác với các phác đồ điều trị khác nhau (sốt xuyết huyết,

sốt xoắn khuẩn vàng da …). Để có thể bắt đầu phác đồ điều trị phù hợp kịp thời, việc

chẩn đoán sớm nhiễm O. tsutsugamushi đóng vai trò quyết định.

Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử như PCR/realtime PCR phát hiện

O. tsutsugamushi đã được nghiên cứu và phát triển nhằm cải thiện những hạn chế về

độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể đặc hiệu

hiện có trong chẩn đoán sốt mò. Tuy nhiên, để ứng dụng các phương pháp này vào

chẩn đoán đòi hỏi phải đào tạo vận hành máy luân nhiệt PCR, và trong điều kiện với

nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo

hoạt động ổn định là rất khó khăn. Để khắc phục những giới hạn của phương pháp

PCR/realtime PCR truyền thống trong kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng trong

chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các

phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt.

Recombinase polymerase amplification (RPA) là một trong những phương

pháp khuếch đại acid nuclecic đẳng nhiệt với nhiều ưu điểm nổi bật. Khác với PCR

truyền thống, công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân

(Escherichia coli RecA recombinase hoặc T4 UvsX protein) giúp các mồi gắn đặc

hiệu vào gen đích và enzyme DNA polymerase với hoạt tính thay thế sợi cho phép

tổng hợp liên tục DNA mà không cần biến tính sợi kép DNA ở nhiệt độ cao, do vậy

không cần đến thiết bị luân nhiệt được thiết kế tinh vi với giá thành cao. Phản ứng

RPA có thể được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C, so với các kỹ

thuật khuếch đại đẳng nhiệt khác như NASBA, SDA hay LAMP thì điều kiện nhiệt

độ của RPA khá dễ dàng thiết lập và đảm bảo. Bên cạnh đó, thời gian để có thể phát

hiện được tín hiệu từ đơn phân tử đích ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp

đẳng nhiệt khác và PCR. Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối

ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế

về nguồn lực.

Hiện nay, trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu thiết lập các quy trình RPA

nhằm phát hiện nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh sốt mò -O. tsutsugamushi. Các

quy trình được thiết lập vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, đặc biệt là khi đánh giá

trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thấp tại khu vực Đông Nam Á. Qua phân

tích tính đa hình nhận thấy trình tự mồi xuôi và probe thiết kế trong nghiên cứu đã

công bố có đến 03 vị trí chưa bổ sung hoàn toàn với trình tự gen đích 47-kDa của hầu

hết các chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dẫn đến hiệu suất chẩn đoán

bệnh sốt mò bị hạn chế khi áp dụng tại Việt Nam và các nước trong khu vực.

Với những lý do thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification

(RPA) phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò” với hai mục tiêu chính:

1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh

và chính xác O. tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao

2) Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA được thiết lập

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh sốt mò

Bệnh sốt mò hay phát ban, còn được biết đến với tên gọi là bệnh

tsutsugamushi, gây ra bởi trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội

bào bắt buộc [112, 135]. Khoảng 5 đến 14 ngày sau khi bị cắn bởi tác nhân mang

bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có những biểu hiện của nhiễm trùng

như các triệu chứng giống cúm như sốt, phát ban, sẩn ở vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho,

nổi hạch, buồn nôn, nôn và đau bụng [74, 75, 101]. Sốt và đau đầu là những đặc điểm

phổ biến nhất ở bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% các trường hợp

[74].

1.1.1 Dịch tễ học

 Dịch tễ học bệnh sốt mò trên thế giới

Bệnh sốt mò lưu hành rộng trên thế giới, gặp ở khu vực Châu Á - Thái Bình

Dương, Đông Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới

phía đông Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn

Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines... [98, 124, 141]. Trước đây, bệnh

được xác định vùng dịch tễ là tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật

Bản đến phía đông của Liên bang Nga, phía bắc của nước Úc và phía tây của Pakistan,

Afghanistan [75, 99, 138]. Tuy nhiên, các báo cáo gần đây về bệnh sốt mò cho thấy

bệnh đã vượt quá giới hạn của “Tam giác Tsutsugamushi” khi được phát hiện ở Chile,

Peru, bán đảo Ả rập, một số khu vực Châu Phi [92, 139].

Hình 1.1. Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141]

Bệnh là vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng và là một trong những bệnh truyền

nhiễm bị lãng quên. Ước tính mỗi năm có khoảng một triệu ca nhiễm bệnh sốt mò và

hơn một tỷ người trên thế giới có nguy cơ mắc bệnh hàng năm. Trong những năm

vừa qua, bệnh sốt mò đã gây dịch ở nhiều nước với số mắc và tử vong cao ở nhiều

khu vực [77, 99, 107].

Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99]

Số ca tử TT Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong

Thái Lan Chiang Mai 2007 65 0 1

Ấn Độ Bishnipur-Manipur 2007 38 2 2

Himachal Pradesh 3 Ấn Độ 2008 5 1 (northern India)

Ấn Độ Pondicherry 2008 50 1 4

Ấn Độ Meghalaya 2010 24 0 5

Ấn Độ Sikkim 2011 63 0 6

Số ca tử TT Quốc gia Khu vực Thời gian Số ca mắc vong

Ấn Độ Chennai 2011 52 0 7

Northern 8 Úc 2011 124 0 Queensland

9 Trung Quốc Guangdong 4 2012 29

Ấn Độ Meghalaya 5 2012 90 10

Ấn Độ Rajasthan 7 2012 42 11

12 Trung Quốc Jiangsu 0 2013 271

Ấn Độ Puducherry 0 2013 28 13

0 Ấn Độ Northern India 2013-2014 228 14

Quần đảo 15 0 9 Western Province 2014 Solomon

2 2014 12 Bu-tan Thimphu 16

1 2014 69 Ấn Độ Uttarakhand 17

8 Ấn Độ Andhra-pradesh 2014 176 18

2014 66 Ấn Độ Rajasthan 14 19

0 2015 23 Nepal Kathmandu 20

8 2016 264 Nepal Chaitwan 21

 Phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh sốt mò đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX. Một nghiên

cứu thực hiện ở cả miền Nam và miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh đã được ghi nhận

lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh, thành. Tuy nhiên, trong một thời gian dài, bệnh ít được

phát hiện do việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol và tetracycline trong thực hành

y khoa và thiếu các xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25]. Sau năm

1990, hàng nghìn người mắc và hàng trăm người chết do bệnh sốt mò được ghi nhận

tại các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước,... [11]. Sau thời

gian dài bệnh tạm lắng, gần đây bệnh lẻ tẻ xuất hiện ở nhiều nơi và có xu hướng ngày

càng tăng cao.

Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò.

Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò là 18 trường hợp từ các huyện:

Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên và Lục Ngạn. Trong đó có 6 bệnh nhân

nam (33,3%) và 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20].

Theo kết quả điều tra của Nguyễn Duy Quyền (2002), tại đảo Thanh Lân và

Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò là 0,14/1.000 dân [24].

Năm 2000-2002, tại Bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt

mò vào điều trị. Bệnh nhân sốt mò được phát hiện rải rác quanh năm, tập trung nhiều

từ tháng 5-10. Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mò đốt (94,2%); có sốt (100%); có nổi

hạch (98,7%) và phát ban (52,2%). Điều trị bằng chloramphenicol và tetracyclin sau

5-7 ngày hết sốt [18].

Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã

thống kê được 251 ca bệnh sốt mò (trong đó nam chiếm 50,6% và nữ chiếm 49,4%)

từ 225 xã thuộc 125 huyện của 24 tỉnh thuộc Bắc bộ và Bắc Trung bộ nhập viện điều

trị, chiếm 35,3% số các trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25].

Từ năm 1998 đến năm 2005, tại Bệnh viện 110 đã điều trị 168 ca sốt mò. Từ

năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành ở nhiều vùng trung du và rừng núi của Việt

Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng

Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên,... với số

ca bệnh lên đến hàng trăm ca mỗi năm [7, 13, 21].

Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010), kết quả điều tra sơ

bộ huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ phơi nhiễm Orientia

tsutsugamushi

trong cộng đồng dân cư tại các khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung

bộ và Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia

tsutsugamushi ở khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông

13,99% và huyện Krông Pa 7,14%), và Kon Tum 5,21% [11].

Từ 2008 đến 2010, tại miền Trung và Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mò,

trong đó ở M’ Drăk (Đăk Lăk) chỉ có 2 bệnh nhân, còn lại 469 bệnh nhân ở địa bàn

tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung ở Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang

(27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11].

Tại tỉnh Yên Bái, trong 2 năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mò tăng đột

biến, đã có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp)

đến điều trị sốt mò. Trong số đó có 7 ca tử vong. Các bệnh nhân đến từ các huyện:

Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải

157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh

nhân (7,6%); huyện Trấn Yên 1 bệnh nhân (0,4%). Bệnh nhân gặp ở nữ (61,25%)

nhiều hơn nam (38,75%). Bệnh gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó bệnh nhân trong độ

tuổi lao động nhiều nhất (51%). Bệnh nhân làm nhiều nghề khác nhau trong đó gặp

nhiều nhất là làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22].

Các thông tin trên cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam có xu

hướng ngày càng mở rộng, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều khu vực với số bệnh nhân

ngày càng tăng lên.

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng

Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình 8 - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1]. Lúc

đầu tại nơi ấu trùng mò đốt có một nốt phỏng nước kích thước khoảng 2 - 5mm, không

đau, bệnh nhân thường không chú ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát ra với những

triệu chứng sau:

Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày

nếu không điều trị; Có khi rét run 1 - 2 ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu

nặng, đau mỏi cơ.

Nốt loét đặc trưng (điển hình của sốt mò): Thường ở vùng da mềm, ẩm, như

bộ phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ…, đôi khi ở vị trí bất ngờ trong vành

tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm của nốt loét: Không đau, không

ngứa; người bệnh thường chỉ có một nốt, hiếm khi có nhiều hơn; nốt hình tròn hoặc

bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt phỏng ban đầu phát triển dần thành dịch

đục trên một nền sẩn đỏ, sau 4 - 5 ngày vỡ thành một nốt có vẩy nâu nhạt hoặc đen

tùy vào vùng da mềm hay cứng và độ non hay già của nốt loét; sau một thời gian, vẩy

bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng

đỏ hoặc thâm tùy theo bệnh đang phát triển hay đã lui; từ khi hết sốt nốt loét liền dần;

nốt loét gặp ở 65 - 80% các trường hợp [1, 15, 26].

Hình 1.2. Hình ảnh nốt loét do mò đốt

Hạch và ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng và đau, không đỏ,

vẫn di động, xuất hiện cùng với sốt hoặc sau 2 - 3 ngày, là chỉ điểm tìm nốt loét; Hạch

toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ những ca nặng. Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ nhất

đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn tại vài giờ đến 1

tuần, thưa hơn so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất hiện

ban, tùy thời điểm bệnh nhân được khám; đôi khi có đốm xuất huyết (dưới 10%).

Trong những ngày đầu, da và niêm mạc xung huyết ở đa số các trường hợp (khoảng

88%), khác với sốt rét và thương hàn [67, 113, 26].

Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với

nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi không điển

hình [2, 143].

Ngoài ra, sốt mò còn có thể ẩn và thể không điển hình (không có nốt loét).

Nếu được điều trị bằng kháng sinh thích hợp, sẽ cắt sốt nhanh. Nếu can thiệp

muộn hoặc không hiệu quả, có thể có biến chứng như viêm cơ tim, sốc nhiễm khuẩn,

viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não... dẫn đến tử vong [6, 102].

Tỷ lệ tử vong do Orientia tsutsugamushi khác nhau ở từng nước, từng vùng,

phụ thuộc vào chủng lưu hành ở địa phương. Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%,

Indonesia và Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26].

1.1.3 Điều trị

Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò là chloramphenicol, doxycycline và

tetracycline. Các bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu sẽ hết sốt sau 1 -

2 ngày. Tuy nhiên, do các kháng sinh này không có tác dụng diệt vi khuẩn mà chỉ có

tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn Orientia tsutsugamushi vẫn sống và tồn tại trong

hạch bạch huyết, ở hệ võng nội mô trong nhiều ngày, nhiều tháng và dễ tái phát bệnh

[12, 25, 26].

- Doxycycline là thuốc được lựa chọn hàng đầu. Liều thường dùng là viên

100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài 7 ngày.

- Tetracycline được sử dụng ở liều 2g/24 giờ chia 4 lần, cách nhau 6 giờ.

- Chloramphenicol được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều

khuyến cáo là 2g một ngày chia 4 lần, đến khi hết sốt 2-3 ngày.

- Các thuốc macrolide cũng có tác dụng với sốt mò, tốt nhất là azithromycin và

thuốc này có thể chỉ định cho trẻ dưới 8 tuổi và phụ nữ mang thai [40].

1.1.4 Phòng bệnh sốt mò

Thực hiện các biện pháp tuyền truyền giáo dục sức khỏe kết hợp vệ sinh phòng

bệnh.

Điều tra cơ bản phát hiện ổ dịch ở địa bàn nghi ngờ và có người ở để xử lý

(bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mò, phân loại, phân lập O. tsutsugamushi , tìm kháng thể,

phát hiện bệnh nhân).

Tại ổ dịch đã xác định hoặc nghi ngờ:

- Biện pháp ngăn ngừa mò đốt:

+ Tránh ngồi nằm phơi quần áo đặt balô trên bãi cỏ, gần bờ bụi, gốc cây; khi

đi phát nương làm rẫy, hành quân dã ngoại, trinh sát vào rừng cần mang giầy và tất,

chít ống quần.

+ Tối ưu tẩm quần áo bằng thuốc diệt mò (permethrine và benzyl benzoat)

hoặc xoa chân, tay, cổ bằng các thuốc xua mò (diethyltoluamid, DEET,...).

- Diệt mò ở môi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cây cỏ cao dưới

20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin,

chlordan.

- Diệt chuột theo mùa, chú ý rắc thuốc diệt mò trước.

- Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc các đám thực vật có nhiều

ấu trùng mò (đảo mò).

1.2. Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi

1.2.1. Đặc điểm sinh học

Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở

Việt Nam. Orientia tsutsugamushi (còn có tên Rickettsia orientalis, hoặc Rickettsia

tsutsugamushi) là một loài trong nhóm Rickettsia thuộc Giới Bacteria, Ngành

Proteobacteria, Lớp Alphaproteobacteria, Bộ Rickettsiales, Họ Rickettsiaceae, Giống

Orientia (Pinkerton, 1936) [129, 26]. Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008),

chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và chi Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia

tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi).

Vi khuẩn O. tsutsugamushi có hệ hô hấp độc lập, có hệ thống men nhưng

không hoàn chỉnh nên phải sống ký sinh trong tế bào vật chủ, vì vậy chúng lệ thuộc

hoàn toàn vào carbohydrate của tế bào vật chủ để lấy năng lượng chuyển hoá. Nhuộm

giemsa bắt màu tím xanh, có hình cầu, hình que ngắn hoặc hình sợi, kích thước dài

1,2-3 µm, rộng 0,5-0,8 µm [128, 26]. Hiện nay, Orientia tsutsugamushi được xếp vào

lớp vi khuẩn gram âm (pleomorphis) [113, 129].

Hình 1.3. Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh trong tế bào nội mô mạch máu

Orientia tsutsugamushi có sức đề kháng yếu, dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng

thông thường và nhiệt độ cao, trong môi trường bên ngoài và thuốc sát trùng thông

thường, dung dịch 0,1% formalehyde diệt trong vài giờ, sống lâu ở dạng đông khô

trong bảo quản lạnh -70℃. Sức đề kháng của Orientia tsutsugamushi là quá trình ức

chế tổng hợp peptidoglycan, kháng sinh nhóm betalactam, điều này có thể giải thích

sự thiếu hụt peptidoglycan trên thành tế bào vi khuẩn [29, 30, 112].

Nghiên cứu ở bệnh nhân sốt mò hoặc trên động vật thử nghiệm đều chỉ ra rằng

Orientia tsutsugamushi thường gây nhiễm vào các tế bào biểu mô, đại thực bào và

bạch cầu đa nhân trung tính. Sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch đối với Orientia

tsutsugamushi đã phát hiện sự suy giảm chất đánh dấu sau mỗi lần cấy chuyển trên

một dòng tế bào cảm nhiễm và sau 10 lần cấy chuyển liên tục thì không còn phát hiện

được chất đánh dấu. Tuy nhiên, khi Orientia tsutsugamushi được tiêm vào mặt sau

noãn của phôi gà, sau đó thu hồi lại cho thấy vẫn còn chất đánh dấu. Điều này cho

thấy Orientia tsutsugamushi phù hợp trong môi trường nuôi cấy invitro nhưng cấy

chuyển nhiều lần dẫn đến giảm bớt những kháng nguyên có khả năng sinh miễn dịch.

Orientia tsutsugamushi xâm nhập tế bào vật chủ nhờ quá trình thực bào của tế bào

bạch cầu [40]. Orientia tsutsugamushi bị bất hoạt bởi tia cực tím giúp chúng bám lên

màng tế bào, lúc này không có vai trò của quá trình thực bào. Sau khi bị thực bào thì

Orientia tsutsugamushi không bị tổn thương và được lưu giữ trong tế bào bạch cầu.

Trong trường hợp bạch cầu đa nhân trung tính, Orientia tsutsugamushi bị thực bào

một cách thụ động, bị hút vào tế bào bạch cầu đa nhân trung tính. Yếu tố độc lực liên

quan tới sự ly giải màng tế bào vi khuẩn của thể thực bào vẫn chưa được xác định,

cấu trúc vi khuẩn trong suốt quá trình thực bào không bị thay đổi, Orientia

tsutsugamushi không bị ảnh hưởng và trốn thoát khỏi thể thực bào và đặc biệt đi vào

trong vùng giàu glycogen trong tế bào chất của tế bào vật chủ. Tuy nhiên không thể

xác định rõ chức năng thực bào diễn ra như thế nào. Thời gian nhân đôi của Orientia

tsutsugamushi là khoảng 8 - 9 giờ. Orientia tsutsugamushi được giải phóng nhờ sự

bảo vệ của màng tế bào vật chủ ký sinh. Nó có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào hoặc

ngoài màng tế bào vật chủ ký sinh, từ đó xâm lấn vào các tế bào khác. Một số nghiên

cứu đã chứng minh sự tồn tại dai dẳng của Orientia tsutsugamushi ở mô trong thời

gian dài sau điều trị [119, 123].

Cấu trúc kháng nguyên có 2 loại:

Kháng nguyên đặc hiệu: Đặc hiệu cho từng typ riêng biệt, có nhiều typ kháng

nguyên khác nhau đại diện cho một địa phương hoặc một khu vực nào đó, giữa các

typ không có miễn dịch chéo, điều này đã gây khó khăn trong chẩn đoán và phòng

bệnh bằng văcxin.

Kháng nguyên không đặc hiệu: Orientia tsutsugamushi có một loại kháng

nguyên giống như kháng nguyên OX-K của vi khuẩn đường ruột Proteus mirabilis.

Vì vậy, các nhà khoa học đã sử dụng kháng nguyên OX-K của Proteus mirabilis để

phát hiện kháng thể ở bệnh nhân bị sốt mò (phản ứng Weil-Felix). Phản ứng này tuy

không đặc hiệu, độ hạy không cao nhưng thông dụng, dễ sản xuất, giá thành rẻ phù

hợp cho việc xét nghiệm sàng lọc phát hiện bệnh sốt mò tại tuyến cơ sở [56].

Ba kiểu gene (genotype) Orientia tsutsugamushi cổ điển là Karp, Kato và

Gilliam. Hiện nay có hơn 30 chủng huyết thanh khác đã được xác định. Các chủng

Orientia tsutsugamushi có tính chất kháng nguyên rất đa dạng, do có sự khác biệt

trong cấu trúc của các protein vỏ. Sự khác biệt về mặt kháng nguyên của các chủng

orientia có thể xác định bằng các phương pháp huyết thanh học và kỹ thuật sinh học

phân tử. Độc lực rất khác nhau tùy chủng: các chủng Orientia tsutsugamushi ở Nhật

Bản và Trung Quốc thường có độc lực cao và gây bệnh nặng hơn [84, 138].

Các nghiên cứu cho thấy Orientia tsutsugamushi chỉ có một đơn vị cấu trúc

hệ gene, với các trình tự gene lặp lại tỷ lệ rất cao, đây là sự khác biệt của vi sinh vật

ký sinh nội bào bắt buộc với các loại vi sinh vật khác. Những thông tin về hệ gene

liên quan tới sự hình thành cấu trúc tế bào Rickettsia và phương thức chuyển hóa của

Orientia tsutsugamushi là cơ sở phân tích sự khác biệt của Orientia tsutsugamushi

với các loài Rickettsia khác trong họ. Mặc dù, Orientia tsutsugamushi có kích thước

hệ gene lớn so với các loại rickettsia khác trong họ, nhưng phần lớn đó là các trình tự

lặp lại của các đoạn gene. Phương thức và con đường chuyển hóa của Orientia

tsutsugamushi tương tự như các loài rickettsia khác, nhưng đáng chú ý có sự khác

nhau trong một vài phương thức như: Chu trình chuyển hóa carbohydrate, chu trình

axit tricarboxylic và tổng hợp thành tế bào bằng hệ thống vận chuyển. Điều này liên

quan tới yếu tố độc lực và đặc điểm sinh lý của tác nhân vi sinh vật ký sinh nội bào.

Phân tích các loài rickettsia trên cơ sở kiểu hình (phenotype) và kiểu gene (genotype)

khác nhau cho thấy Orientia tsutsugamushi khác với các loài rickettsia khác trong

cấu trúc thành tế bào, kháng nguyên và kích cỡ của hệ gene. Trên cơ sở giải trình tự

hệ gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có trình tự gene lặp lại rất cao (khoảng

40% tổng số nucleotide của hệ gene) [61, 72].

Trên cơ sở dữ liệu giải trình tự gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có

trình tự hệ gene lặp lại cao tới 200 lần. Hơn nữa hệ gene của Orientia tsutsugamushi

có trên 400 gene vận chuyển, 60 phần gene DNA ngoại lai và 70 gene đóng vai trò

phiên mã ngược. Phân tích so sánh gene chuyển đổi trong hệ gene và dọc theo giải

trình tự gene cho thấy tính đồng nhất và gene chuyển đổi có tính đa dạng đó là: sự

tạo chuỗi xoắn, xóa bỏ và hợp thành trong cùng đoạn gene. Sự tương tác qua lại của

các gene với việc lặp của các đoạn gene dẫn đến sự thay đổi kích thước hệ gene của

các chủng Orientia tsutsugamushi khác nhau [45].

1.2.2. Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò

1.2.2.1. Nguồn lây bệnh

Vi khuẩn Orientia tsutsugamushi có 2 ổ chứa trong tự nhiên là mò và các loài

gặm nhấm (chủ yếu là chuột), thỏ, lợn, gà, các loài chim,... [1, 14, 23, 25]. Ổ chứa

nguồn truyền nhiễm chủ yếu là mò nhiễm Orientia tsutsugamushi, mò có khả năng

truyền mầm bệnh cho các loài gặm nhấm và thú nhỏ, hoặc truyền dọc mầm bệnh qua

trứng sang các đời sau. Mò truyền ngẫu nhiên mầm bệnh sang người qua vết cắn của

ấu trùng mò khi đốt người [25].

Mò Trombiculidae thuộc họ ve bét (Acariformes), lớp nhện (Arachnida),

ngành chân đốt (Arthropoda); kích thước bé dưới 1 mm, mầu sắc từ vàng đến da cam;

phát triển qua 4 giai đoạn: trứng ấu trùng, nhộng và mò trưởng thành; ấu trùng là giai

đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở động vật có xương sống (chuột và thú nhỏ);

thời gian đốt kéo dài trung bình 48-72 giờ; đốt xong ấu trùng trở về mặt đất, trưởng

thành,và sinh sản ra thế hệ sau; chu kỳ sinh trưởng của mò dài 2-3 tháng (vùng ấm)

và trên 8 tháng (vùng lạnh); mò trưởng thành sống trung bình 15 tháng; ấu trùng chưa

đốt động vật có thể sống 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế cho nên ổ dịch sốt

mò thường có tính chất khư trú [8, 16].

Mò và ấu trùng mò ưa sống ở nơi đất xốp, ẩm mát trong các khe hang, ven bờ

sông suối, nơi dâm mát có bụi rậm và cây thấp có quả hạt để chờ thú nhỏ - gặm nhấm

tới ăn. Người có thể bị đốt khi sinh hoạt, lao động trong ổ dịch; Phát rẫy làm nương;

Bộ đội đi dã ngoại; Ngồi, nằm nghỉ, trên bãi cỏ, để mũ nón buộc võng vào gốc cây…

Hiện nay, đã xác định được trên 45 loài mò có thể mang tác nhân Orientia

tsutsugamushi truyền bệnh trong tự nhiên, nhưng chỉ có loài Leptotrombidium

pallidum, L. akamushi, L. scutellare, L. deliense, L. arenicola, L. imphalum, L.

chiangraiensis, L. fletcheri, L. gaohuensis, và L. pavlovsky đã được chứng minh là

véc tơ truyền bệnh sốt mò [42]. Các loài véc tơ chính phân bố theo các vùng dịch tễ

khác nhau: L. akamushi, L. pallidum, và L. scutellare là véc tơ truyền bệnh sốt mò ở

vùng ôn đới, như Nhật Bản và Hàn Quốc, trong khi L. deliense và L. arenicola là các

véc tơ chính ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới hay Đông Nam Á và Tây Nam

Thái Bình Dương [46].

Ở Việt Nam, đã thống kê được 106 loài mò thuộc 23 giống, 2 phân họ của

họ Trombiculidae. Có 17 loài đặc hữu cho khu hệ mò Việt Nam. Số lượng và giống

loài của khu hệ mò ở Việt Nam phong phú nhưng tập trung chủ yếu ở phân

họ Trombiculidae có 101 loài, chiếm 95,2% và giống Leptotrombilidium có 28 loài

chiếm 26,41%, giống Gahrliepia có 20 loài chiếm 18,81%, 21 giống còn lại chỉ 1-8

loài [9, 10].

Khu hệ mò ở Việt Nam chủ yếu tập trung ở cảnh quan đồi núi có 102 loài, ở

đồng bằng có 21 loài. Có 17 loài phát hiện ở cả cảnh quan đồng bằng và đồi núi.

Trong đó, có 5 loài mò được xác định truyền bệnh sốt mò, đó là Leptotrombidium

denliense, Leptotrombidium akamushi, Leptotrombidium

scutellare, Ascoschoenggastia audyi, Ascoschoenggastia indica. Tuy nhiên, chỉ có

loài Leptotrombidium denliense phân lập được mầm bệnh [8] .

Hình 1.4. Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense

Ổ chứa nguồn truyền nhiễm thứ yếu có vai trò không đáng kể: Là các loài gặm

nhấm, thú nhỏ: Khả năng nhiễm mầm bệnh từ các loài gặm nhấm, thú nhỏ vào ấu

trùng mò thường thấp, mầm bệnh nhiễm vào thường không nhân lên được và sau đó

không được truyền sang người hoặc thú nhỏ khác vì ấu trùng mò chỉ đốt hút máu 1

lần trong đời [121]

Những loài gặm nhấm, thú nhỏ là ổ chứa mầm bệnh thứ yếu: chuột, sóc, chồn,

nhím, cầy, cáo, thỏ, chim; một số gia súc (gà, chó, lợn...) cũng có thể bị mò đốt và

chứa mầm bệnh. Các loài chuột thường gặp ở điều kiện sinh cảnh savan cây bụi gần

người ở Việt Nam là chuột nhà (R. flavipectus), chuột nhắt (Rattus exulans), chuột

rừng (R. rattus), chuột đất bé (Bandicota salivei), chuột mốc R. (Berylmus) bowersi,

chuột bóng (R. nitidus), chuột núi (R. sabanus) [4, 70, 27].

1.2.2.2. Trung gian truyền bệnh sốt mò

Sốt mò là bệnh truyền sang người qua trung gian là ấu trùng mò; như vậy mò

vừa là vật chủ vừa là vectơ truyền bệnh; người bị nhiễm bệnh khi bị ấu trùng mò đốt.

Người bệnh không có khả năng truyền bệnh sang người khác. Phương thức lây truyền

bệnh từ động vật sang người là từ họ mò trombiculid trong giai đoạn ấu trùng hút

máu và ký sinh trên các loài vật chủ phù hợp mang mầm bệnh, lúc này mò trở thành

vector mang mầm bệnh và truyền Orientia tsutsugamushi cho người qua vết đốt của

ấu trùng mò. Orientia tsutsugamushi tồn tại trong tất cả các giai đoạn phát triển của

mò, nhưng chỉ trong giai đoạn ấu trùng mò mới ký sinh và truyền bệnh. Giai đoạn

trưởng thành mò sống tự do nên khó thu thập. Do vậy, việc điều tra nghiên cứu về

mò chủ yếu thu thập được ấu trùng sống ký sinh trên các loài động vật. Ấu trùng mò

là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở các động vật có xương sống và chỉ

hút máu một lần trong đời. Ấu trùng mò thường bám vào thân cây, ngọn cỏ hoặc ở

mặt đất, khi động vật hay con người đi qua đó, chúng bám vào và hút máu, trong máu

của ấu trùng mò có vi khuẩn Orientia tsutsugamushi, vì vậy sẽ truyền mầm bệnh khi

hút máu và gây bệnh sốt mò cho người. Ấu trùng bám vào da vật chủ để kiếm ăn

trong thời gian từ 2 ngày đến 1 tháng, tùy theo từng loài. Sau đó chúng rơi xuống chui

vào đất nằm im và không hoạt động trong 2-3 ngày, phát triển thành nhộng thanh

trùng sau 2 hoặc 3 ngày. Sau 6-7 ngày, nhộng thanh trùng nở ra thanh trùng có 8 chân,

thanh trùng giống như mò trưởng thành về hình dạng ngoài, nhưng nhỏ hơn, đồng

thời chưa phân biệt đực và cái. Giai đoạn thanh trùng chiếm 20-26 ngày, sau 2-3 ngày

nữa thì phát triển thành thanh trùng giai đoạn 3. Sau 10 ngày, thanh trùng giai đoạn

3 lột xác thành mò trưởng thành, mò trưởng thành lớn hơn ấu trùng, có màu đỏ sáng

hay nâu đỏ. Thanh trùng và mò trưởng thành, trên cơ thể có hình số 8, phủ nhiều lông

phân nhánh, có 4 đôi chân và sống tự do trong đất, rác và các chất nền khác, thức ăn

của chúng là nhộng và ấu trùng của các chân đốt khác. Ấu trùng có hình ô van, phủ

ít lông, 3 đôi chân, sống ký sinh trên vật chủ [17, 19].

1.2.2.3. Các yếu tố liên quan

Bệnh sốt mò là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây đường máu do ấu trùng

mò đốt. Vector chủ yếu truyền bệnh cho người là mò Leptotrombidium deliensis, L.

akamushi và các loài có họ gần. Bệnh sốt mò thường gặp ở những vùng rừng núi, cây

cối rậm rạp, có nhiều cỏ dại, đặc biệt là những khu vực như bờ suối, hang hốc, rừng

mới phá hoặc mới trồng, vùng giáp ranh, nơi nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven

sông suối, trên nương rẫy, những nơi có bóng dâm và đất mùn ẩm ướt,... Đây là những

khu vực thường có nhiều loài thú nhỏ loài gặm nhấm sinh sống, có nhiều mò và con

người dễ tiếp xúc với ấu trùng mò và bị đốt gây nhiễm bệnh [4, 27].

Trong môi trường hoang dã, ấu trùng mò trombiculid sống ở đất ẩm ướt hoặc

cát sỏi. Ở những khu vực có dạng sinh cảnh rừng nhiệt đới, cây bụi, dạng cây gai,

cánh đồng và rừng cỏ rậm rạp chạy dọc sông và cánh đồng lúa liên quan tới sự tồn

tại của Orientia tsutsugamushi. Vecor truyền bệnh có thể tìm thấy ở nơi động vật gặm

nhấm phát triển cùng với độ ẩm phù hợp. Người nhiễm bệnh qua vết đốt của ấu trùng

mò họ trombiculidmites, mùa phát bệnh sốt mò được xác định là thời gian ấu trùng

mò phát triển [3].

Mọi lứa tuổi đều có thể bị bệnh nhưng chủ yếu bệnh phân bố ở lứa tuổi lao

động, có tính chất nghề nghiệp (lâm nghiệp, nông nghiệp, bộ đội), bệnh gặp chủ yếu

ở vùng nông thôn, rừng núi (80%), hiếm ở thành thị. Ở vùng ôn đới và nhiệt đới bệnh

phát triển về mùa hè và những tháng mưa, độ ẩm cao là thời gian chỉ số mò cao. Bệnh

xuất hiện ở Việt Nam quanh năm nhưng chủ yếu về mùa mưa từ tháng 4 - 5 đến tháng

9 - 10, đỉnh cao vào những tháng 6 - 7. Bệnh thường tản phát nhưng dịch có thể bùng

phát khi có nhiều người chưa có miễn dịch với Orientia tsutsugamushi đi vào vùng

có bệnh lưu hành (người dân đi khai hoang, bộ đội hành quân tập luyện, dã ngoại...)

[5].

1.2.3. Cơ chế gây bệnh sốt mò

 Đặc điểm thụ thể tế bào chủ và ligand của vi khuẩn

Để có thể bắt đầu xâm nhập vào tế bào chủ, O. tsutsugamushi cần tương tác

với các thụ thể đặc hiệu có trên bề mặt của tế bào chủ.

Cho đến nay, các nghiên cứu về các thụ thể của tế bào vật chủ tương tác với

O. tsutsugamushi thường tập trung vào các phân tử có trên bề mặt tế bào như heparan

sulfate proteoglycans (HSPGs) và integrins. Đối với nhiều mầm bệnh nội bào, HSPG

ở bề mặt tế bào đóng vai trò là đồng thụ thể, chúng tạo điều kiện cho sự gắn kết ban

đầu của vi sinh vật với các thụ thể thứ cấp, giúp vi sinh vật xâm nhập vào tế bào chủ

[43]. Đối với quá trình xâm nhiễm của O.tsutsugamushi, HSPG là đồng thụ thể, góp

phần hỗ trợ tương tác của tế bào vi khuẩn với các tế bào L929 [71].

HSPG là các protein được glycosyl hóa mạnh bao gồm một coreprotein được

liên kết cộng hóa trị với một hoặc nhiều chuỗi heparan sulfate (HS)

glycosaminoglycan (GAG), là các sulfated disaccharide polymers. Chúng được biểu

hiện ở khắp nơi trên bề mặt tế bào cũng như trong chất nền ngoại bào (ECM) [43].

Việc tiền xử lý với heparan sulfate ức chế sự lây nhiễm O. tsutsugamushi vào các

nguyên bào sợi L929 ở chuột [71]. Nhiều nghiên cứu về các cơ chế tương tác chỉ ra

rằng O. tsutsugamushi có thể tương tác với nhóm HS của HSPGs [71]

Syndecans là các HSPG xuyên màng chính được biểu hiện trên bề mặt của hầu

hết các loại tế bào động vật có vú [140]. Trong số bốn thành viên họ syndecan ở động

vật có xương sống, syndecan-4 thể hiện sự phân bố rộng nhất trong các loại tế bào

[140]. Syndecan-4 đóng một vai trò quan trọng trong nhiễm trùng định hướng [86].

Sự lây nhiễm của O. tsutsugamushi trong các tế bào HeLa, REF hoặc REFSyn4 bị

giảm đáng kể khi O. tsutsugamushi được xử lý trước với protein lõi tái tổ hợp của

syndecan-4 [86]. Do đó, bên cạnh heparin/ heparan sulfate, protein lõi của syndecan-

4 cũng có thể liên quan đến việc định hướng trung gian gắn ligand vào tế bào chủ

[86]. Bên cạnh khả năng hoạt động như các đồng thụ thể phối hợp với các thụ thể tín

hiệu, syndecans có khả năng truyền tín hiệu độc lập, như tương tác với protein liên

kết với actin,…

O. tsutsugamushi liên kết với fibronectin của tế bào chủ thông qua kháng

nguyên đặc hiệu 56-kDa (TSA56) cũng như kháng nguyên bề mặt tế bào C (ScaC)

[66, 79]. O. tsutsugamushi có thể liên kết với fibronectin cố định trong ống nghiệm,

và fibronectin ngoại sinh tạo điều kiện cho sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào L929

[79]. TSA56, một protein màng ngoài chính, đã được chứng minh là một phối tử góp

phần vào sự tương tác định hướng của vi khuẩn với fibronectin.

Vùng liên kết với fibronectin được đánh giá là hiệu quả là từ vị trí axit amin

312 đến axut amin 341 trong vùng ngoại bào của TSA56 [44]. Ngoài TSA56, gần đây

các nghiên cứu đã chứng minh rằng ScaC cũng đóng vai trò trung gian gắn kết O.

tsutsugamushi vào các tế bào nhưng không xâm lấn các tế bào động vật có vú không

thực bào, ví dụ như các tế bào HeLa, Vero và ECV304 [66]; và fibronectin đã được

xác định là một trong những thụ thể tế bào chủ tiềm năng cho ScaC. ScaC thuộc họ

autotransporter protein, có tính bảo tồn cao trong họ Rickettsiaceae [33, 66]. Một số

thành viên khác trong họ protein Sca, ví dụ, Sca1, Sca2 và rOmpB (Sca5) của

Rickettsia conorii cũng đã được chứng minh là trung gian định hướng gắn rickettsial

với tế bào chủ [37, 38, 103, 120].

Fibronectin là một trong những thành phần chính của chất nền ngoại bào, là

một glycoprotein được tiết ra dưới dạng disulfide-bonded dimer [94]. Fibronectin có

liên quan đến sự kết dính và xâm nhập vào tế bào chủ của một số vi khuẩn khác,

chẳng hạn như R. conorii [103], N. gonorrhoeae [73] và Bartonella henselae [52].

Fibronectin chứa một số vùng chức năng (functional domain), chẳng hạn như vùng

liên kết với heparin, mô típ để tương tác với syndecans và mô típ Arg-Gly-Asp (RGD)

cần thiết cho tương tác với integrins [94].

Các integrins là một họ các glycoprotein xuyên màng tạo thành các non-

covalent heterodimers [105]. Các domain ngoại bào của integrins tương tác với các

phối tử khác nhau, bao gồm ECM glycoprotein và các protein bề mặt, và domain tế

bào chất của chúng tương tác với các thành phần của actin cytoskeleton [105]. Gần

đây, người ta đã chứng minh được rằng O. tsutsugamushi đồng cứ trú với integrin

a5b1 trong các tế bào HeLa và các yếu tố truyền tín hiệu integrin, bao gồm adhesion

kinase, Src kinase và RhoA GTPase, có thể được kích hoạt bởi việc nhiễm O.

tsutsugamushi [44]. O. tsutsugamushi ưu tiên kích hoạt RhoA GTPase thay vì Cdc42

/ Rac1 [44].

Các nghiên cứu gợi ý rằng sự tương tác giữa TSA56 của O. tsutsugamushi và

fibronectin của tế bào chủ có thể làm trung gian cho sự tham gia của các integrin, sau

đó có thể kích hoạt các phân tử tín hiệu xuôi dòng và tạo ra sự xâm nhập của vi khuẩn

vào các tế bào không thực bào [44].

Mối liên quan về sự tương tác giữa fibronectin và syndecan có liên quan đến

sự gắn kết và sự hấp thu tế bào của O. tsutsugamushi hay không đến nay vẫn chưa

được làm rõ. Như vậy, O. tsutsugamushi sẽ tương tác đặc hiệu với các thụ thể

fibronectin và integrin, cũng như cả HS và protein cốt lõi của syndecans để giúp vi

khuẩn bám và xâm nhập vào tế bào chủ [44, 86, 91]. Bên cạnh đó, O. tsutsugamushi

cũng có khả năng phá vỡ tổ hợp truyền tín hiệu bằng cách tác động vào các integrins

và syndecans để xâm chiếm một cách hiệu quả nhiều loại tế bào chủ.

Hình 1.5. Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O. tsutsugamushi [62]

 Chu trình phát triển

Sau khi gắn vào bề mặt tế bào chủ và liên kết với các thụ thể đặc hiệu nhờ các

protein đặc hiệu (TSA56 và ScaC), O. tsutsugamushi thâm nhập vào bên trong tế bào

nhờ trung gian clathrin, hiện tượng nhập bào xảy ra trong các tế bào ECV304, dòng

tế bào nội mô ở người [47].

Các adapter nhận tín hiệu, chẳng hạn như Talin và paxillin sau đó sẽ có mặt

tại vị trí nhiễm trùng [26]. Các sự kiện tín hiệu này gây ra sự xâm nhập của O.

tsutsugamushi vào các tế bào không thực bào, liên quan đến con đường nhập bào qua

trung gian clathrin [47]. O. tsutsugamushi đồng liên kết với các marker nội sinh sớm

EEA1 và marker nội sinh muộn LAMP2 [47]. Có giả thuyết cho rằng Hemolysin,

TlyC và phospholipase D (PLD) của O. tsutsugamushi đóng vai trò kích hoạt giúp vi

khuẩn thoát khỏi sự thực bào. Các phân tử kháng nguyên polysacarit NT19 được giải

phóng bởi O. tsutsugamushi và đóng vai trò trong hình thành nhóm khuẩn lạc các vi

khuẩn [93]

 Nảy chồi từ màng tế bào vật chủ

Các vi khuẩn O. tsutsugamushi sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ và nhân

lên trong tế bào chất. Chúng thoát ra bằng cách nảy chồi từ màng tế bào vật chủ và

xâm nhập vào các tế bào liền kề. Quá trình nảy chồi này được chứng minh là phụ

thuộc vào màng lipit giàu cholesterol (protein HtrA) [87], giống với sự hình thành vỏ

bọc của virus. Sự hình thành của vi khuẩn ngoại bào từ màng tế bào có tác động đến

cơ chế lây nhiễm tiếp theo vào các tế bào chủ xung quanh, cũng như đưa ra một chiến

lược khả thi cho vi khuẩn có thể lẩn trốn khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ.

1.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò

1.3.1. Phương pháp huyết thanh học

 Phương pháp Weil – Felix

Phương pháp Weil – Felix được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 bởi

Edmund Weil và Arthur Felix áp dụng để chẩn đoán Rickettsiaceae trong một khoảng

thời gian dài trên toàn thế giới [12]. Phương pháp này đơn giản dựa trên sự phản ứng

chéo xảy ra giữa các kháng thể được tạo ra trong giai đoạn nhiễm O. tsutsugamushi

cấp tính với các kháng nguyên dòng OXK của loài P. mirabilis. Có 2 cách để thực

hiện phương pháp này.

Cách thứ nhất: Chuẩn bị một lam kính, nhỏ một giọt (50-100 μl) huyết thanh

bệnh nhân lên bề mặt lam kính. Bổ sung 1 giọt kháng nguyên muốn kiểm tra, trộn lẫn

hỗn hợp trong 1 phút. Kết quả dương tính khi có xuất hiện sự kết dính, tương ứng

ngưỡng khảng 1:20.

Cách thứ hai: Sử dụng 0,25% phenol làm chất pha loãng, pha loãng một dãy

các ống 1ml có nồng độ huyết thanh bệnh nhân hơn kém nhau hai lần. Một giọt dung

dịch kháng nguyên được thêm vào mỗi ống, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 50-55oC trong

4-6 giờ. Các ống xuất hiện sựa kết tủa hay tạo hạt được cho là dương tính, với nồng

độ ngưỡng phát hiện khoảng 1:320.

Ưu điểm của phương pháp là không tốn kém, dễ thực hiện và thời gian có kết

quả thường là sau một đêm. Tuy nhiên phương pháp hạn chế về độ đặc hiệu và độ

nhạy không cao [81]. Chính vì thế phương pháp Weil – Felix dần bị thay thế bằng

các phương pháp huyết thanh học khác, bao gồm xét nghiệm miễn dịch miễn dịch

huỳnh quang (IFA)

 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent

Antibody – IFA) lần đầu tiên được Bozeman và cộng sự mô tả vào năm 1963 [35].

Sau đó đã được thay đổi để cho phép sử dụng lượng huyết thanh và kháng nguyên

nhỏ hơn. Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán nhanh

chóng bệnh nhân nhiễm O. tsutsugamushi

Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) có độ nhạy

cao hơn phản ứng Weil-Felix và kết quả xét nghiệm thường có sau vài giờ; tuy nhiên,

giá thành xét nghiệm cao và đòi hỏi người thực hiện có chuyên môn cao. IFA sử dụng

kháng thể fluorescent anti-human để phát hiện kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh bệnh

nhân có gắn với kháng nguyên của bệnh sốt mò và hiện đang được đánh giá là phương

pháp tiêu chuẩn vàng [88]

Mặc dù được sử dụng rộng rãi các xét nghiệm huyết thanh học đặc hiệu

kháng thể có thể không phù hợp để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn cấp vì nồng độ

kháng thể có thể dưới ngưỡng phát hiện lúc bệnh khởi phát

1.3.2. Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR

Hầu hết các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên/ mầm bệnh hiện nay dựa vào

phương pháp PCR, realtime PCR định lượng hay nested PCR nhắm vào các gen đích

khác nhau bao gồm 56 kDa, 47 kDa, groEL của O. tsutsugamushi [85, 127, 130]. Ưu

điểm của các phương pháp này là độ nhạy, độ đặc hiệu khá cao:

Nghiên cứu khác của Prakash và cộng sự (năm 2011), thiết lập quy trình nested

PCR trên vùng gen 56kDa phát hiện O. tsutsugamushi, kết quả cho thấy độ đặc hiệu của

kĩ thuật này là 100% cao hơn so với hai phương pháp ELISA và Weil-Felix với độ đặc

hiệu lần lượt là 73% và 94% [118].

Năm 2009, Kramme và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật real-time PCR trên vùng gen

56kDa để phát hiện O. tsutsugamushi trong các bệnh nhân sốt mò ở Việt Nam. Độ nhạy

phân tích của quy trình đạt được của quy trình là 1062 bản sao/ml, độ đặc hiệu 100% khi

đánh giá trên 50 mẫu máu của người khỏe mạnh và các chủng vi sinh vật khác (bao gồm

cả các loài Rickettsia spp khác) [89].

Trong một nghiên cứu mới đây năm 2017, kỹ thuật realtime PCR cũng được

Nhiem và cộng sự áp dụng để chẩn đoán O. tsutsugamushi trên mẫu bệnh phẩm vết loét

tại Việt Nam [70]. Trong số 20 bệnh nhân đã lấy được cả vết loét và mẫu máu toàn phần,

17 mẫu vết loét (85%) và 5 mẫu máu toàn phần (25%) cho kết quả dương tính với O.

tsutsugamushi [90].

Tuy nhiên, tất cả các xét nghiệm đòi hỏi phải đào tạo người dùng để vận hành

máy luân nhiệt PCR và trong các môi trường với nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo

dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định là rất khó khăn.

1.3.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase

amplification (RPA)

Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống dùng trong

chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các

phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt. Các phương pháp khuếch đại đẳng

nhiệt sử dụng các enzyme hay cấu trúc DNA dạng vòng để thực hiện bước tách sợi,

khác với phương pháp PCR truyền thống buộc phải sử dụng nhiệt độ cao. Những kỹ

thuật khuếch đại đẳng nhiệt này là công cụ rất mạnh mẽ để phát triển các mô hình

chẩn đoán tại thực địa có khả năng khuếch đại acid nucleic mà không cần các bước

luân nhiệt và các cơ chế điều khiển liên quan.

Một trong những phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đáng chú ý dựa vào các

cấu trúc DNA dạng vòng (Loop-mediated isothermal amplification – LAMP) đã được

phát triển thành một phương pháp rất triển vọng có khả năng thay thế cho PCR. Ngoài

gen đích groEL [111], Hubber và cs đã mô tả việc sử dụng vùng gen bảo tồn 47 kDa

làm gen đích của xét nghiệm LAMP và đạt được độ nhạy tương đương với realtime

PCR [57]. Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ để thực hiện kỹ thuật LAMP là khoảng 60-

65℃, chưa phải là điều kiện dễ dàng thiết lập và đảm bảo ở các khu vực hạn chế về

nguồn lực. Thời gian phát hiện của LAMP là khoảng 60 phút, nếu có thể cải thiện

hơn nữa thời gian phát hiện, xét nghiệm sẽ có ý nghĩa thực địa cao hơn trong chẩn

đoán lâm sàng

Được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 2006, kỹ thuật recombinase polymerase

amplification (RPA) khá được quan tâm phát triển bởi nhiều ưu điểm nổi bật; bằng

chứng là đã có 75 công bố trên thế giới tính từ năm 2006 đến tháng 10 năm 2015

[53]. RPA đang trở thành một công cụ phân tử được lựa chọn để xác định mầm bệnh

một cách nhanh chóng, đặc hiệu và hiệu quả cũng như tiết kiệm chi phí. Yêu cầu

chuẩn bị mẫu tối thiểu, nhiệt độ vận hành thấp (25 - 42°C), phương pháp này đã được

áp dụng bên ngoài các phòng thí nghiệm, ở những vùng sâu vùng xa, trên các thiết bị

ủ nhiệt đơn giản. Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối ưu để áp

dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế về nguồn

lực.

 Thành phần phản ứng RPA

Chìa khóa dẫn đến thành công của phản ứng RPA cơ bản gồm 3 loại protein

(recombinase, recombinase loading factor và single-stranded binding protein), và các

thành phần phụ khác như DNA polymerase, crowding agent, các thành phần năng

lượng (adenosine triphosphatem, ATP) và các phân tử muối. Thành phần phản ứng

chi tiết, nồng độ thường được sử dụng và chức năng của các thành phần được trình

bày cụ thể ở bảng sau:

Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng RPA

Thành phần Nồng độ thường Vai trò Tài liệu

sử dụng tham khảo phản ứng

T4 UvsX protein 120 ng/µl Là recombinase có hoạt [31, 65]

tính ghép cặp và đẩy sợi,

vốn là đặc tính quan trọng

trong tái bản và sửa chữa

DNA

T4 UvsY protein 60 ng/µl Yếu tố tải tái tổ hợp [34]

(recombinase loading

factor) được phân loại

protein trung gian tái tổ

hợp kích thích hoạt động

ATPase phụ thuộc DNA

sợi đơn của T4 UvsX và có

nồng độ thấp hơn nồng độ

cần thiết cho hoạt động

của T4 UvsX.

T4 gp32 600 ng/µl Protein liên kết đơn (SSB) [28, 126]

liên quan đến quá trình sao

chép, sửa chữa, tái tổ hợp

DNA và liên kết tốt với

DNA sợi đơn. Các protein

T4 UvsX, T4 UvsY và T4

gp32 hoạt động phối hợp

để bắt đầu phản ứng RPA

thông qua việc tháo gỡ,

hình thành cấu trúc D-loop

và ổn định khuôn DNA.

Bacillus subtilis Bsu: 30 µg DNA polymerase tổng [58, 110]

DNA polymerase I hợp khuôn DNA mới Sau: 8.6 hoặc 12.8

tương đồng với trình tự (Bsu) hoặc µg

đích Staphylococcus

aureus polymerase

(Sau)

dNTP, N = A, T, G, 200 µM DNA polymerase sử dụng

C dATP, dCTP, dGTP để

tổng hợp sợi mới.

Mồi xuôi và mồi 420nM mỗi mồi, Sau khi bám vào trình tự [122]

ngược (dải nồng độ tối gen đích nhờ ở vị trí tương

ưu 150nM đến đồng, đầu 3′-OH của các

600nM) mồi là vị trí nhận viết cho

DNA polymerase kép dài

và tổng hợp sợi DNA mới.

Khuôn DNA _ Trình tự oligonucleotide

mà các mồi liên kết để

tổng hợp các

oligonucleotide mới chính

xác

Carbowax20M PEG 35K (5%) Tạo điều kiện cho quá [39, 116,

(polyethylene trình khuếch đại, vì các 125]

glycon) crowding agent có thể tăng

cường hoạt động xúc tác

của các enzyme.

Dithiothreitol 2mM Ổn định các enzyme bằng [60]

cách thêm các nhóm

sulfhydryl tự do.

Phosphocreatine 50mM Ba thành phần tạo nên hệ [50]

thống cung cấp năng Creatine kinase 100 ng/ µL

lượng cho các hoạt động ATP 3 mM của recombinase và DNA

polymerase.

Tris(hydroxymethyl 50 mM (pH 7.9) Hai thành phần đóng vai [36, 133]

)aminomethane trò ổn định và hòa tan

(Tris) DNA trong dung dịch.

Potassium acetate 100 mM

Magnesium acetate 14 mM Đóng vai trò là cofactor [122]

cho các enzyme. Phản ứng (MgOAc)

RPA bắt đầu khi MgOAc

được thêm vào phản ứng

 Nguyên lý:

Trong phản ứng RPA, các recombinase (Escherichia coli RecA recombinase

hoặc T4 UvsX protein) với sự hỗ trợ bởi các loading factor sẽ hình thành các sợi

nucleoprotein với các mồi và probe có trong phản ứng. Các sợi nucleoprotein này có

khả năng trượt trên DNA sợi kép (dsDNA) để tìm kiếm các trình tự tương đồng để

bắt cặp bổ sung với trình tự trên dsDNA, hình thành cấu trúc vòng D, dẫn đến phân

tách các chuỗi DNA cục bộ trong đó chuỗi bổ sung được ổn định bởi SSB protein và

trình tự gen đích được lai với mồi. Sự phân tách Recombinase từ sợi nucleoprotein

được gây ra bởi quá trình thủy phân ATP của protein RecA, cho phép kéo dài bằng

DNA polymerase có hoạt tính thay thế sợi. Các chuỗi DNA mới được tạo ra được sử

dụng cho một vòng RPA khác [53]. Do đó, sự khuếch đại theo cấp số nhân được thực

hiện bằng cách lặp lại chu trình RPA, phản ứng được thực hiện cho đến khi cạn kiệt

nhóm phosphocreatine (Hình 1.6)

Hình 1.6. Chu trình phản ứng RPA [53]

 Mồi và probe trong kỹ thuật RPA

Không giống như PCR, mồi sử dụng trong kỹ thuật RPA thường có chiều dài

khoảng 30-35 nucleotide. Với chiều dài mồi như vậy sẽ làm tăng khả năng kích hoạt

và gắn/ tái tổ hợp của các recombinase protein với oligonucleotide trong môi trường

phản ứng. Không có quy định nào để dự đoán một mồi khuếch đại tốt/ không tốt; nhất

định sẽ làm việc hiệu quả nếu dựa trên thứ tự và thành phần các nucleotide. Tuy

nhiên, một số hướng dẫn đã được xây dựng dựa trên những quan sát thực nghiệm

(khuyến cáo của nhà sản xuất TwistAmp):

- Khi thiết kế mồi cho phản ứng RPA, các guanines ở đầu 5’ (3-5 nucleotide

đầu tiên) nên tránh, trong khi cytidines (và có lẽ là các pyrimidine nói chung) có thể

có lợi, vì chúng khuyến khích sự hình thành của các sợi recombinase .

- Ngoài ra, guanines và cytidines ở đầu 3' của mồi (3 nucleotide cuối cùng) có

xu hướng cải thiện hiệu suất (có thể như vậy sẽ cung cấp độ ổn định hơn cho

polymerase khi gắn vào gen đích)

- Nếu có thể, tốt nhất là tránh các yếu tố trình tự bất thường trong đoạn mồi,

chẳng hạn như các đoạn dài của một nucleotide nào đó.

- Hàm lượng GC quá cao (> 70%) hoặc thấp (<30%) có thể gây bất lợi. Vì các

tương tác gắn giữa các base trong trình tự mồi và giữa các mồi có thể góp phần tạo

ra các sản phẩm không đặc hiệu (mồi bắt cặp)

Để phát hiện real-time có hai loại probe được sử dụng là RPA-exo hoặc fpg.

Probe thông thường như Taq-man không thể sử dụng trong phản ứng RPA, và Taq

polymerase sử dụng trong PCR không tương thích với hệ thống khuếch đại của RPA.

Hoạt tính exonuclease 5-3’ của Taq polymerase sẽ cắt các mạch được thay thế trong

suốt quá trình thay thế sợi, do đó ức chế khuếch đại DNA. Do vậy, phản ứng RPA sử

dụng các polymerase với hoạt tính đẩy sợi và không có hoạt tính exonuclease 5’-3’

(Ví dụ: Bsu DNA polymerase,…)

Exo probe là một trình tự oligonucleotide dài (46-52 base) có chứa một internal

base analog (tetrahydrofuran (THF)) nằm ở giữa chất phát huỳnh quang (fluorophore

(Fam hoặc TAMRA)) và chất thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ fluorophore

(quencher (Black Hole Quencher 1 hoặc Black Hole Quencher 2)) với đầu khóa

(block) ở đầu 3’ (3’ phosphate group hoặc dideoxynucleotide). THF đóng vai trò là

cơ chất cho E. coli exonuclease III, enzyme sẽ chỉ cắt ở vị trí THF sau khi probe gắn

vào trình tự gen đích, do đó phân tách fluorophore ra khỏi quencher [114]; giải phóng

tín hiệu huỳnh quang, thường tín hiệu sẽ được phát hiện sau 5-10 phút trong suốt phản

ứng RPA. Enzyme exonuclease cắt sẽ tạo ra đầu 3’OH tự do cho probe, do vậy probe

có khả năng hoạt động như một mồi xuôi thứ hai [116].

Hình 1.7. Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53]

So sánh với exo probe, fpg probe thường ngắn hơn (32-35 base) và sau khi bị

cắt bởi enzyme fpg probe không thể hoạt động như một mồi thứ hai trong phản ứng

RPA. Cấu trúc của fpg probe gồm 5’ quencher, fluorophore cách đó 5-6 base liên kết

với ribose nhờ liên kết C-O-C, herein deoxyribose (dR) – fluorophore. Enzyme

glycosylase/lyase E. coli fpg sẽ cắt probe tại vị trí dR và giải phóng 2 đoạn trình tự

không có nhóm OH ở đầu 3’ như exo probe, do đó các trình tự này không được kéo

dài bởi DNA polymerase [114]

Để đảm bảo độ đặc hiệu và phát hiện sản phẩm khuếch đại real-time, probe sử

dụng trong nghiên cứu được thiết kế phù hợp với hóa chất sử dụng bộ kit TwistAmp

™ exo: exo probe

 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật RPA

Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật RPA so với các phương pháp đẳng nhiệt

khác hiện có được trình bày chi tiết ở bảng sau:

Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt

Đích

Kỹ thuật1

Nhiệt độ (℃)

Multip -lex

Tham khảo

Thời gian (phút)

Số lượng mồi

Nguồn hóa chất thương mại

Biến tính ban đầu2

FDA đã phê duyệt test3

DNA

30-120

HDA

Y (Biohelix)

DNA

37-42

20-40

RPA

Y (TwistDx)

60-180

NASBA

RNA (DNA)

60-180

TMA

RNA (DNA)

Y (Organon Teknika Corporation/ bioMérieux) Y (Hologic/Ge n-Probe)

DNA

60-65

4-6

LAMP

Y (Meridian Bioscience)

DNA

30-65

60-240

N/A

RCA

DNA

30-55

60-120

SDA

Y (BD)

DNA

55-60

60-120

NEAR

DNA

60-90

RMA

Y (Alere) Y (Great Basin)

DNA

63-65

N/A

5-8

N/A

CPA

[134, 137, 55, 76, 109] [55, 100, 109, 115] [63, 134, 55, 109, 142] [134, 55, 69, 109] [134, 51, 55, 106, 109] [55, 78, 109] [134, 55, 68, 104, 142] [49, 55, 136] [64, 109] [59, 109]

1HDA= Helicase-dependent amplification, RPA= Recombinase polymerase amplification,

NASBA= Nucleic acid sequence-based amplification, TMA= Transcription-mediated

amplification, LAMP= Loop-mediated amplification, RCA= Rolling circle amplification,

SDA= Strand displacement amplification, NEAR= Nicking enzyme amplification reaction,

RMA= ribonuclease-mediated amplification, and CPA= Cross priming amplification. 2

Các công nghệ đẳng nhiệt yêu cầu bước biến tính DNA ban đầu ở 95°C (N= No; Y=Yes;

N/A= not applicable). 3 FDA đã phê duyệt test cho HDA= quy trình IsoAmp HSV;

NASBA= NucliSens CMV pp67, quy trình NucliSens EasyQ Enterovirus vl.1, và quy trình

NucliSens EasyQ MRSA; TMA= quy trình Aptima Combo 2, quy trình Aptima Combo 2

(Panther System), và bộ kit Gen-Probe AMPLIFIED Chlamydia trachomatis; LAMP= quy

trình Illumigene C. difficile DNA amplification, quy trình Illumigene C. difficile, quy trình

Illumigene Mycoplasma DNA Amplification, quy trình Illumigene Group A Streptococcus

(GAS) DNA Amplification, và quy trình Illumigene Group B Streptococcus (GBS) DNA

Amplification; SDA= quy trình BD ProbeTec Chlamydia trachomatis (CT) Qx Amplified

DNA, các quy trình BD ProbeTec ET Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae

Amplified DNA, quy trình BD ProbeTec Neisseria gonorrhoeae (GC) Qx Amplified DNA,

và các quy trình BD ProbeTec Herpes Simplex viruses (HSV 1 & 2) Qx Amplified DNA;

NEAR= quy trình Alere I Influenza A&B assay [134]

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Sơ đồ nghiên cứu

Nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện nghiên cứu theo sơ đồ nghiên cứu sau:

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu

2.2. Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA

Nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập cơ sở dữ liệu của các trình tự gen 47-kDa

của các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông

Nam Á từ ngân hàng gen NCBI, kết quả có tất cả 37 trình tự đã được tìm thấy (trong

đó có 17 trình tự của các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam (số truy cập:

LC431268.1, LC431269.1, LC431270.1, LC431271.1, LC431272.1, LC431273.1,

LC431274.1, LC431275.1, LC431276.1, LC431277.1, LC431278.1, LC431279.1,

LC431280.1, LC431281.1, LC431282.1, LC431283.1, LC431284.1), 18 trình tự của

Thái Lan (số truy cập: HM595489.1, HM595490.1, HM156064.1, HM156058.1,

HM156057.1, HM156053.1, HM156048.1, HM156047.1, HM156059.1,

HM156056.1, HM156055.1, HM156052.1, HM156051.1, HM156050.1,

HM156049.1, HM156054.1, HM156060.1, HM156061.1) và 2 trình tự của Lào (số

truy cập: NZ_LYMB01000234.1 và NZ_LYMT01000188.1)).

Các trình tự này sau đó được đánh giá tính đa hình bằng phần mềm ClusterW

nhằm chọn ra vùng gen có tính đa hình thấp và độ tương đồng cao giữa các chủng trong

nước và khu vực Đông Nam Á.

Mồi ngược được nhóm nghiên cứu tham khảo theo thiết kế trước đó bởi Chao

et al., 2015 [42]; mồi xuôi và probe được thiết kế lại đảm bảo đặc hiệu 100% với các

chủng O. tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á Các trình mồi và probe được tổng

hợp bởi IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.).

2.2. Tổng hợp chứng dương nhân tạo

Chứng dương nhân tạo chứa trình tự gen đích 47-kDa của O. tsustugamushi

được tổng hợp bởi IDT (Coralville, IA). Đoạn trình tự có kích thước khoảng 500bp

47-kDa gene được tổng hợp tương đồng hoàn toàn với hầu hết các trình tự của các

chủng O. tsustugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dữ liệu thu thập từ Genbank. Sau

khi nhận về, lyophilized plasmid DNA được xử lý theo đề xuất của nhà sản xuất và

được pha với TE để tạo ra dải các nồng độ DNA O. tsutsugamushi khác nhau.

Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo

2.3. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm

nghiên cứu thiết kế

Nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra hiệu suất khuếch đại của các trình tự mồi/

probe do nhóm nghiên cứu thiết kế bằng phản ứng real-time RPA theo đề xuất của

nhà sản xuất (TwistAmp exo). Nồng độ và thành phần phản ứng chi tiết được trình

bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA

STT Thành phần C_f Đơn vị Thể tích

Reaction Buffer 1 x 10 1

dNTPs 1,8 mM 1,44 2

H2O 0,24 3

Probe E-mix 1 x 2 4

Mồi xuôi 0,42 µM 0,48 5

Mồi ngược 0,42 µM 0,48 6

Probe 0,12 µM 0,24 7

Core Reaction Mix 1 x 1 8

Exo 1 x 0,4 9

Template 2 10

MgOAc 14 mM 1 11

Phản ứng được thực hiện ở 37℃ trong 30 phút trên thiết bị máy Genie®II

(Hình 2.3 ). Thiết bị Genie® II được thiết kế nhỏ gọn, nhẹ và dễ dàng mang đi, phù

hợp để thực hiện bất kỳ phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt nào phát hiện sản phẩm

khuếch đại qua thu nhận tín hiệu huỳnh quang. Thiết bị này yêu cầu năng lượng thấp

và sử dụng pin Lithium-polymer có thể sạc lại và giữ cho máy hoạt động cả ngày nên

có thể dễ dàng mang đi, phù hợp với các khu vực thường xuyên xảy ra bệnh sốt mò

như vùng trung du, núi đá vôi không gần với các trung tâm y tế lớn.

Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu

2.4. Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập

2.4.1. Tối ưu điều kiện phản ứng

Phản ứng RPA có thể hoạt động ở nhiệt độ từ 22 đến 45°C và không giới hạn

về kiểm soát nhiệt độ [83], tuy nhiên, hầu hết các bài báo được công bố về tối ưu hóa

cho nhiệt độ phản ứng RPA là từ 37 đến 41°C. Để kiểm soát nhiệt độ phản ứng, các

thiết bị khác nhau có thể được sử dụng, bao gồm máy ủ, lò sưởi, lò sưởi hóa học [96]

và nhiệt độ cơ thể [48], và cũng có các ví dụ về RPA hoạt động ở nhiệt độ môi trường

xung quanh ở những vùng ấm (trên 30°C) [96].

Bộ kit TwistAmpTM chuẩn được thiết lập để hoạt động tối ưu ở dải nhiệt độ từ

37°C đến 41°C. Ở nhiệt độ cao hơn, hệ thống sẽ bị tổn hại khi các enzyme dần dần

mất hoạt động. Ở nhiệt độ dưới mức tối ưu, Recombinase Polymerase Amplification

(RPA) vẫn có thể hoạt động tốt tuy nhiên tốc độ phản ứng giảm.

- Nguyên lý: Để tối ưu nhiệt độ phản ứng, chúng tôi tiến hành đồng thời các

phản ứng RPA giống hệt nhau về các thành phần tham gia (như Bảng 2.1) chỉ khác

nhau nhiệt độ phản ứng. Sau khi thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân

tích để tìm nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất với thời gian phát hiện sớm nhất và

tín hiệu huỳnh quang thu được là tốt nhất.

- Dải gradient nhiệt độ sử dụng tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi: Chúng tôi sử dụng

dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C theo đề xuất của nhà sản xuất TwistAmpTM và

một vài nhiệt độ nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất (45℃ và 50℃) nhằm khảo sát hiệu

suất của phản ứng RPA ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau và chọn ra nhiệt độ phản

ứng tối ưu.

2.4.2. Tối ưu thành phần phản ứng

Các điều kiện phản ứng tiêu chuẩn được cung cấp bởi nhà sản xuất

TwistAmpTM tạo ra một môi trường phản ứng ‘thỏa hiệp’ khá tốt để khuếch đại

nhanh và nhạy DNA. Tuy nhiên, tối ưu hóa các thành phần phản ứng sẽ giúp cải thiện

hiệu suất khuếch đại đáng kể. Các thông số có thể dễ dàng được thay đổi trong quá

trình nghiên cứu là nồng độ mồi/probe, nồng độ Magnesium-Acetate (MgOAc).

 Tối ưu nồng độ mồi:

- Nguyên lý: Để tối ưu nồng độ các mồi,chúng tôi tiến hành đồng thời các

phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã tối ưu và các thành

phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ mồi. Sau khi thực hiện xong một loạt

phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát hiện và cường độ tín hiệu

huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ mồi cho kết quả tốt nhất

- Dải nồng độ: Chúng tôi sử dụng dải nồng độ mồi đề xuất từ nhà sản xuất

để tiến hành chọn lọc nồng độ mồi tối ưu nhất cho phản ứng. Dải nồng độ

được sử dụng là 0,24; 0,36; 0,42; 0,54 µM.

 Tối ưu nồng độ probe:

- Nguyên lý: Giữ nguyên nồng độ mồi đã tối ưu, chúng tôi tiến hành đồng

thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã tối ưu và

các thành phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ probe. Sau khi thực hiện

xong một loạt phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát hiện và cường

độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ probe cho kết quả

tốt nhất

- Dải nồng độ: Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ probe gồm 0,06; 0,08;

0,1; 0,12 và 0,15 µM.

 Tối ưu nồng độ MgOAc

- Nguyên lý: Giữ nguyên nồng độ mồi và probe đã tối ưu, chúng tôi tiến

hành đồng thời các phản ứng RPA giống hệt nhau về điều kiện nhiệt độ đã

tối ưu và các thành phần tham gia chỉ khác nhau nồng độ MgOAc. Sau khi

thực hiện xong một loạt phản ứng, tiến hành phân tích về thời gian phát

hiện và cường độ tín hiệu huỳnh quang thu nhận được để tìm nồng độ probe

cho kết quả tốt nhất

- Dải nồng độ: Chúng tôi sử dụng dải nồng độ MgOAc lần lượt là 12 mM;

14 mM; 16mM; 18mM và 20mM.

2.5. Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại)

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit Orientia tsutsugamushi

Membrane Protease (htrA) gene (Primerdesign) được thiết kế có khả năng định lượng

in vitro bộ gen O. tsutsugamushi. Bộ kit Primerdesign có thể phát hiện rộng rãi và

đặc hiệu với hầu hết hệ gen của các loài O. tsutsugamushi. Mồi và probe trong bộ kit

này có độ tương đồng 100% với một loạt các trình tự gen O. tsutsugamushi. Trong

điều kiện PCR tối ưu, bộ kit Primerdesign phát hiện O. tsutsugamushi có hiệu suất

bắt cặp rất cao > 95% và có thể phát hiện được ở mức ít hơn 100 bản sao gen

đích/phản ứng

Nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện các phản ứng realtime PCR trên thiết bị

máy Roto-GeneQ. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR

được trình bày ở các bảng sau:

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR

STT Thành phần V/mẫu

Ghi chú Cung cấp bởi bộ kit 1 Đệm qPCR 2X 5µl

2 Hỗn hợp mồi và probe 0,5 µl Cung cấp bởi bộ kit

khử RNase/ 2,5µl 3 Nước DNase

4 Khuôn 2 DNA/ Nước khử nuclease

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt

Các bước T.gian đ.vị T°

95 2 phút Hoạt hóa enzyme

Biến tính 95 10 giây Khuếch đại

chu kỳ: 50 Thu nhận tín hiệu 60 60 giây

25 ∞ Lưu mẫu trên máy

2.6. Đánh giá ngưỡng phát hiện

Ngưỡng phát hiện của quy trình đẳng nhiệt RPA phát hiện O. tsutsugamushi

được đánh giá trên panel dải nồng độ plasmid tổng hợp nhân tạo 102 – 104 copy/p.ư,

mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị

trường - Orientia tsutsugamushi Membrane Protease (htrA).

Sử dụng quy trình RPA đã tối ưu thực hiện một loạt phản ứng RPA trên các

mẫu chứa nồng độ DNA đã chuẩn bị. Ở mỗi nồng độ qua 6 lần lặp lại phải đảm bảo

6/6 lần mẫu phải cho đường tín hiệu khuếch đại tách biệt với tín hiệu nền trong thời

gian thực hiện các phản ứng đánh giá ngưỡng phát hiện. Ngưỡng phát hiện quy trình

RPA là nồng độ thấp nhất mà quy trình RPA có thể phát hiện được ở tất cả các lần

lặp lại.

2.7. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên

thị trường

2.7.1. Đánh giá độ nhạy

 Chuẩn bị các mẫu dương tính giả định

Các mẫu bệnh phẩm dương tính giả định được chuẩn bị bằng cách bổ sung

100µl DNA O. tsutsugamushi tổng hợp nhân tạo với các nồng độ khác nhau (8 x 108,

5 x 108, 5 x 107, 8 x 105, 5 x 105, 8 x 104, 5 x 104, 5 x 103, 8 x 102, 5 x 102 copy/p.ư)

vào 1ml máu của người khỏe mạnh. DNA sau đó được tách chiết theo hướng dẫn của

nhà sản xuất QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) (ký hiệu mẫu tp1-tp10)

 Phương pháp đánh giá

Độ nhạy là tỷ lệ những trường hợp thực sự có bệnh và có kết quả xét nghiệm

dương tính trong tổng số các trường hợp có bệnh. Độ nhạy được xác định bằng công

thức sau:

Độ nhạy = số ca dương tính thật số ca dương tính thật + số ca âm tính giả

2.7.2. Đánh giá độ đặc hiệu

 Chuẩn bị các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật khác

Các mẫu âm tính với O. tsutsugamushi (10 mẫu) là DNA tách từ máu toàn

phần của người khỏe mạnh sử dụng bộ kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN). Các

mẫu âm tính được thu thập tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào, Viện Nghiên

cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân Y.

Các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò, gồm 10

chủng: Leptospira biflexa serovar Patoc, Leptospira interrogan serovar Pomona,

Leptospira interrogan serovar Australis do Viện Y học dự phòng Quân đội cung cấp,

Dengue virrus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Proteus

mirabiles, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli do khoa Vi sinh

Y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân Y cung cấp.

 Phương pháp đánh giá

Độ đặc hiệu là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét

nghiệm âm tính trong tổng số các trường hợp không bị bệnh. Độ đặc hiệu được xác

định bằng công thức sau:

Độ đặc hiệu = số ca âm tính thật số ca âm tính thật + số ca dương tính giả

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa

Trình tự mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa của hầu hết các chủng O.

tsutsugamushi ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á do nhóm

nghiên cứu thiết kế:

Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O. tsutsugamushi

Mồi/ probe Trình tự (5’-3’)

Mồi xuôi TAAAGTTGCATGATGGTTCAGAACTGATAGCA

Mồi ngược TATTGCAATAACCTGATCTCCTACTCTAGA

5’dATTAAAAATTAATTCTTCAGCAGCATTATCTTA-(FAM- Probe dT)-GC-(THF)-AC-(BHQ1-dT)-TTTGGCGATTCA-3’ blocker

Kết quả đánh giá và so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen đích 47-

kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu vực Đông Nam Á với trình tự mồi và

probe trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao

và cs cho thấy các trình tự mồi xuôi và probe do nhóm nghiên cứu thiết kế là tương

đồng 100% với các trình tự gen đích 47-kDa ở Việt Nam và một số nước thuộc khu

vực Đông Nam Á

Hình 3.1. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của O. tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs [38]

3.2. Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa

Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình tự

mồi/ probe do nhóm nghiên cứu chế tạo được trình bày trên Hình 3.2. Kết quả cho thấy

các trình tự oligos hoạt động tốt với đối chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm

(khoảng 11 phút), đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại chứng tỏ phản ứng là

đặc hiệu, không có hiện tương mồi bắt cặp hay nhiễm chéo diễn ra trong quá trình phản

ứng.

Hình 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu

Đối chứng dương O. tsutsugamushi: (+) (màu cam) và đối chứng âm: NTC (màu

xanh)

3.3. Kết quả tối ưu quy trình RPA

 Tối ưu điều kiện phản ứng

Dải nhiệt độ phản ứng từ 37°C - 41°C được khảo sát để chọn ra nhiệt độ phản

ứng RPA tối ưu. Kết quả chỉ ra trong Hình 3.3 cho thấy nhiệt độ phản ứng tối ưu là

37°C với thời gian thu nhận tín hiệu sớm nhất.

Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)

37+ Nhiệt độ phản ứng 37℃ 10

38+

Nhiệt độ phản ứng 38℃ 11

39+ Nhiệt độ phản ứng 39℃ 11

40+ Nhiệt độ phản ứng 40℃ 12

41+ Nhiệt độ phản ứng 41℃ 12

45+ Nhiệt độ phản ứng 45℃ 12

50+ Nhiệt độ phản ứng 50℃ NA

37-, 38-, 39-, 40-, Đối chứng âm ở nhiệt độ phản ứng NA

41-, 45-, 50- 37-41℃, 45℃ và 50℃

Hình 3.3. Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi

Các phản ứng chứng dương cùng lượng khuôn DNA; phản ứng chứng âm không có

khuôn DNA với nồng độ mồi là 0,42 µM, nồng độ probe là 0.1 µM.

Nằm ngoài dải nhiệt độ đề xuất của nhà sản xuất, các nhiệt độ 45 và 50℃ cũng

được nhóm nghiên cứu thử nghiệm và đánh giá. Ở nhiệt độ 45℃, hoạt tính của

enzyme không bị ảnh hưởng đáng kể, đối chứng dương vẫn cho tín hiệu khá sớm,

tương đương với các nhiệt độ khác trong dải nhiệt độ tối ưu. Hoạt tính của các enzyme

bị mất hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 50℃, đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại

chứng dương giờ chỉ là tín hiệu nhiễu, không quá khác biệt so với tín hiệu chứng âm

được thu nhận bởi thiết bị GenieII.

Kết quả thử nghiệm ở các nhiệt độ khác nhau với cùng một nồng độ mẫu chứng

dương cho thấy, thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại sớm nhất ở nhiệt độ

37°C (khoảng 10 phút). Do hạn chế về thời gian, trong nghiên cứu này chúng tôi sử

dụng thiết bị GenieII, nhóm nghiên cứu chưa tiến hành các thử nghiệm trên các thiết

bị giữ nhiệt hoặc ủ ấm thông thường. Nhưng với các kết quả nghiên cứu trên cũng

cho thấy, kỹ thuật RPA hoàn toàn có thể được ứng dụng trên các thiết bị thông thường

như tủ giữ nhiệt, bể ổn nhiệt hoặc các block giữ nhiệt. Trên thế giới đã có những công

bố thiết lập phản ứng RPA trên các thiết bị tương tự như trên [97].

Zachary Austin Crannell và cộng sự (2014) đã báo cáo kết quả nghiên cứu về

thiết lập phản ứng RPA không sử dụng thiết bị giữ nhiệt chuyên dụng [48]. Trong

công bố này, nhóm tác giả đã chứng minh nhiệt độ cơ thể người và nhiệt độ môi

trường ở khu vực khí hậu ấm áp (khoảng 30oC) có thể được sử dụng cho phản ứng

RPA khuếch đại đẳng nhiệt bộ gen của HIV-1.

Nhiệt độ cơ thể người trung bình tại nách, bụng, túi quần và bàn tay lần lượt

là 34,8 ± 0,6, 31,3 ± 1,7, 33,1 ± 0,5 và 33,4 ± 2,7 độ C. Hỗn hợp phản ứng sau khi tạo

ra được ủ ấm tại các vị trí trên một cách đơn giản. Trong vòng chưa đầy ba phút, tất

cả các phản ứng giả đều đạt đến nhiệt độ 31 độ C, tất cả các phản ứng RPA đều xuất

hiện tín hiệu khuếch đại DNA đến mức có thể phát hiện được. Kết quả nghiên cứu

cũng chứng minh, nhiệt độ cơ thể ở khu vực hố nách tương đối ổn định và đạt gần

nhất với nhiệt độ được khuyến nghị cho RPA (37oC).

 Tối ưu thành phần phản ứng RPA

- Tối ưu nồng độ mồi:

Kết quả tối ưu được trình bày trên Hình 3.4. Ở tất cả các nồng độ mồi, đối

chứng dương đều cho tín hiệu khuếch đại tốt tương đương nhau, đối chứng âm không

có tín hiệu khuếch đại. Ở nồng độ mồi 0,54 µM, thời gian phát hiện đối chứng dương

là sớm nhất nên nhóm nghiên cứu lựa chọn 0,54 µM là nồng độ tối ưu cho phản ứng

RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi

Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)

Nồng độ mồi 0,54 0.54 10

Nồng độ mồi 0,42 0.42 12

Nồng độ mồi 0,36 0.36 15

Nồng độ mồi 0,24 0.24 16

Đối chứng âm NTC NA

Hình 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi

- Tối ưu nồng độ probe

Khi thay đổi nồng độ probe theo dải nồng độ đề xuất của nhà sản xuất (0,06-

0,15µM), kết quả cho thấy nồng độ probe 0,1µM là nồng độ thấp cho tín hiệu khuếch

đại sớm tương đương với các nồng độ cao khác (0,12 và 0,15µM). Do vậy chúng tôi

lựa chọn nồng độ probe 0,1µM là tối ưu và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo trong

nghiên cứu này. Kết quả chi tiết ở hình sau:

Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)

Nồng độ probe 0,15 0.15 9

Nồng độ probe 0,12 0.12 9

Nồng độ probe 0,1 0.1 9

Nồng độ probe 0,08 0.08 10

Nồng độ probe 0,06 0.06 15

Đối chứng âm NTC NA

Hình 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi

- Tối ưu nồng độ MgOAc:

Việc tăng nồng độ MgOAc có thể làm cải thiện tốc độ phản ứng. Thật vậy, đối

với nồng độ MgOAc quá thấp (12mM), tốc độ phản ứng bị giảm đi đáng kể, biểu hiện

ở thời gian phát hiện tín hiệu huỳnh quang khá muộn so với các nồng độ khác (khoảng

13 phút). Khi tăng nồng độ MgOAc lên 14mM, 18mM và 20mM, thời gian phát hiện

đối chứng dương thu được là tương đối sớm hơn (chưa đến 10 phút). Tuy nhiên,

không có sự khác biệt quá lớn về mặt thời gian khi thực hiện phản ứng RPA với các

nồng độ MgOAc 14mM, 18mM và 20mM. Do vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn nồng

độ 14mM, cũng là nồng độ ban đầu theo đề xuất của nhà sản xuất là nồng độ tối ưu

cho phản ứng RPA phát hiện O. tsutsugamushi.

Ký hiệu Chú giải Thời gian (phút)

20mM Nồng độ MgOAc 20mM 9

18mM Nồng độ MgOAc 18mM 9

14mM Nồng độ MgOAc 14mM 9

12mM Nồng độ MgOAc 12mM 13

NTC Đối chứng âm NA

Hình 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O. tsutsugamushi

Như vậy, nhóm nghiên cứu đã tối ưu thành công thành phần phản ứng RPA

khuếch đại acid nucleic Orientia tsutsugamushi, cụ thể như sau:

Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA

STT Thành phần Nồng độ Đơn vị

1 Mồi 0,54 µM

2 Probe 0,10 µM

3 MgOAc 14,00 mM

Trong các thành phần tạo nên hệ đệm thích hợp cho các enzyme hoạt động,

ion Mg2+ có vai trò rất quan trọng không chỉ trong liên quan đến độ đặc hiệu và khả

năng khuếch đại của phản ứng, mà còn đóng vai trò kích hoạt các enzyme tái tổ hợp

tham gia kéo dài chuỗi trong quá trình tổng hợp DNA. Với điều kiện nhiệt độ 37oC

và không đòi hỏi một sự kiểm soát chặt chẽ về độ dao động về nhiệt, phản ứng RPA

thậm chí có thể hoạt động ở trong điều kiện nhiệt độ môi trường ở những khu vực

khí hậu ấm áp (khoảng 30oC). Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu trong quá trình mix

trộn hỗn hợp phản ứng, đã tiến hành chuyển dung dịch MgOAc vào phần nắp của

tube phản ứng, và chỉ được hòa trộn vào hỗn hợp phản ứng bằng cách sử dụng máy

spin down trước khi bước ủ nhiệt độ bắt đầu. Chi tiết kỹ thuật này cũng được các tác

giả trên thế giới sử dụng nhằm đảm bảo hiệu suất của phản ứng khuếch đại, góp phần

tăng độ nhạy của thử nghiệm [117].

3.4. Quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi

Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình đẳng nhiệt RPA

phát hiện O. tsutsugamushi, các bước thực hiện chi tiết của quy trình cụ thể như sau:

 Rã đông hoàn toàn các thành phần phản ứng và mẫu DNA đã tách chiết

(nếu đông) và giữ chúng ở trên đá.

 Trộn đều và spin down các thành phần phản ứng để được các hỗn hợp

đồng nhất, sau đó giữ chúng ở trên đá để có hiệu quả xét nghiệm cao nhất.

 Chuẩn bị master mix theo Bảng 3.3:

Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix

Thể tích cho 1 phản STT Thành phần Nồng độ gốc ứng (µl)

Reaction Buffer 1 2 X 10

dNTPs 2 25 mM 1,44

Nuclease-freewater 3 0,52

Probe E-mix 10 X 4 2

Mồi xuôi 5 15 0,72

Mồi ngược 6 15 0,72

Probe 7 10 0,2

Core Reaction Mix 8 20 X 1

Exo 9 50 X 0,4

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng 17

10 MgOAc 280 mM 1

11 Mẫu DNA 2

Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 20

 Đối với các thành phần Core Reaction Mix và Exo: bổ sung lần lượt

từng thành phần lên nắp tube sau đó đảo trộn lên xuống 10 lần và spin down

nhanh.

 Đảo trộn bằng pipet các thành phần của dung dich đệm trước khi chia

17 µl ra từng ống phản ứng 0,2 ml.

 Bổ sung MgOAc và mẫu DNA với thể tích tương ứng lên nắp tube phản

ứng.

 Spin down nhanh để MgOAc và mẫu DNA rơi xuống đáy ống phản ứng

ngay khi bắt đầu ủ.

Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn ra. Phản ứng RPA sẽ xảy ra khi

MgOAc được thêm vào ngay cả khi ở nhiệt độ phòng. Do đó, hạn chế cho

MgOAc tiếp xúc với master mix khi chưa tiến hành ủ.

 Cài đặt máy Genie II ở 37℃ trong 30 phút

 Chuyển các ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt và bắt đầu phản ứng

theo điều kiện phản ứng đã cài đặt.

 Đọc kết quả

- Kết quả quy trình phát hiện O. tsutsugamushi do nhóm nghiên cứu thiết

lập được xác định dựa tín hiệu huỳnh quang thu được từ hệ thống thu nhận tín

hiệu huỳnh quang.

- Kiểm tra các mẫu đối chứng dương và đối chứng âm để đảm bảo kết

quả xét nghiệm không phải là kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả.

+ Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có thời gian thu nhận

được tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại

của mẫu đã được chuẩn độ trước đó (mẫu chứng dương cung cấp kèm bộ kít có thời

gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại là 8 – 15 phút)

+ Mẫu chứng âm phải cho kết quả âm tính.

- Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm không đúng thì

phải thực hiện lại xét nghiệm.

3.5. Ngưỡng phát hiện quy trình RPA

Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp O. tsutsugamushi nồng độ 102 – 104

copy/p.ư được sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA đã xây dựng và

quy trình Realtime PCR của bộ kit Orientia tsutsugamushi Membrane Protease gene

(Primerdesign), mỗi nồng độ được lặp lại 6 lần. Kết quả cho thấy quy trình RPA có

khả năng phát hiện 6/6 lần lặp lại nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy trình

realtime PCR (Primerdesign).

Hình 3.7. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình RPA phát hiện O. tsutsugamushi

A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D –

đối chứng âm/ đối chứng dương

Ngoài ra ngưỡng phát hiện của quy trình RPA còn được biết đến là không bị

giới hạn, nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng phát hiện sản phẩm được khuếch

đại của công nghệ RPA là chỉ từ một phân tử DNA duy nhất [80].

Trong nghiên cứu của Chao và cộng sự (2015) đã sử dụng kỹ thuật RPA dựa

trên cả hai hình thức phát hiện với gen đích là 47 kDa đối với O. tsutsugamushi.

Ngưỡng phát hiện đạt được của thử nghiệm RPA sử dụng flouresent RPA là 100-120

copies/ phản ứng (tỷ lệ cho kết quả dương tính là 100%). Trong khi ngưỡng phát hiện

của thử nghiệm RPA sử dụng Exo test khi đánh giá nồng độ là 100-120 copies/phản

ứng cho kết quả 53,8% tỷ lệ dương tính. Như vậy, việc đạt được ngưỡng phát hiện

100 copies/phản ứng của nhóm nghiên cứu là tương đương với các quy trình RPA đã

thực hiện cùng mục đích phát hiện O. tsutsugamushi gây bệnh sốt mò.

Hình 3.8. Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR (PrimerDesign) phát hiện O. tsutsugamushi

A - nồng độ 104 copy/p.ư, B - nồng độ 103 copy/p.ư, C - nồng độ 102 copy/p.ư, D –

đối chứng âm/ đối chứng dương

So sánh về thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình (Bảng

3.4) cho thấy quy trình RPA không những có ngưỡng phát hiện tương đương với quy

trình realtime PCR mà còn cho phép phân tích kết quả nhanh hơn rất nhiều (10,12

phút) ở điều kiện đẳng nhiệt (37℃).

Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O. tsutsugamushi

Thời gian khuếch đại trung bình

Copy/p.ư Realtime PCR RPA (phút)

Chu kỳ 21,5 Time (phút) 45,01 6,57

25,2 52,47 9,63

29,8 61,6 10,12 104 103 102

3.6. Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường

(PrimerDesign)

Đánh giá trên các mẫu dương tính giả định các nồng độ khác nhau (tp1-tp10)

cho thấy quy trình RPA có khả năng phát hiện 10/10 mẫu bệnh phẩm dương tính giả

định, tương đương với độ nhạy 100% (Hình 3.9a). Độ nhạy này là tương đương với

quy trình realtime PCR bộ kit thương mại hiện hành (PrimerDesign) (Hình 3.9b)

Trước đó, đã có nhiều công bố trên thế giới sử dụng các công nghệ khác nhau

phát hiện O. tsutsugamushi. Vào năm 2008 và 2012, các quy trình LAMP đặc hiệu gen

đích groEL phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò đã được xây dựng thành công tuy nhiên

độ nhạy đạt được chưa cao [32, 111]. Các quy trình PCR, multiplex PCR đặc hiệu gen

đích groEL cũng đã được thiết lập, độ nhạy quy trình đạt 94,5% và 86,5% [131]. Như

vậy, độ nhạy của quy trình RPA do nhóm nghiên cứu thiết lập là tương đương với các

quy trình sử dụng các công nghệ khuếch đại acid nucleic khác nhau phát hiện O.

tsutsugamushi đã được công bố.

Tính đến thời điểm hiện tại, mới chỉ có một quy trình RPA phát hiện O.

tsutsugamushi được thiết lập và đánh giá bởi Chien-Chung Chao và cs vào năm 2015

[41, 95]. Tuy nhiên, độ nhạy đạt được của nghiên cứu khi đánh giá trên các mẫu DNA

tách chiết từ nhiều nguồn gốc khác nhau, bao gồm mẫu bệnh phẩm bệnh nhân sốt mò

thu thập tại một bệnh viện ở Thái Lan, các mẫu máu của chuột được gây nhiễm O.

tsutsugamushi là 80%, độ nhạy này là chưa cao. Độ nhạy của quy trình RPA có thể bị

ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thiết kế mồi, probe; quy trình lấy mẫu, bảo quản; tách

chiết DNA hay cũng có thể bị ảnh hưởng bởi quá trình thực hiện quy trình phản ứng

RPA,… Trong nghiên cứu của Chien-Chung Chao và cs, các tác giả thiết kế mồi và

probe đặc hiệu gen đích 47-kDa của chủng chuẩn Orientia tsutsugamushi, tuy nhiên

trình tự gen đích 47-kDa lại có tính đa hình tương đối cao ở các khu vực địa lý khác

nhau, dẫn đến các trình tự do các tác giả thiết kế bao gồm probe có tới 02 vị trí

mismatches, trong đó có 1 vị trí ở gần đầu 5’ và 1 vị trí ở gần đầu 3’ (Hình 3.1b), trình

tự mồi xuôi có 1 vị trí mismatches ở gần đầu 3’ (Hình 3.1a) so với trình tự gen đích 47-

kDa của các chủng O. tsutsugamushi được phân lập tại khu vực Đông Nam Á. Trong

khi đó, nếu có nhiều hơn một điểm không bắt cặp ở đầu 3’ của mồi hoặc ba điểm

không bắt cặp ở cả hai đầu 5’ và 3’ hoặc trong trung tâm của mồi thì sẽ làm suy giảm

khả năng khuếch đại và ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng [54]. Trong nghiên

cứu này, trình tự mồi xuôi và probe do nhóm nghiên cứu thiết kế có khả năng bắt cặp

đặc hiệu và bổ sung hoàn toàn với hầu hết các chủng O. tsutsugamushi ở Việt Nam và

các nước trong khu vực nên độ nhạy đạt được là khá cao (100%).

Hình 3.9a. Quy trình RPA khuếch đại các mẫu dương tính giả định

Hình 3.9b. Quy trình Realtime PCR khuếch đại các mẫu dương tính giả định

Hình 3.9. Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu dương tính giả định với O. tsutsugamushi (tp1-tp10)

Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và điều kiện tiếp cận với bệnh nhân sốt mò

nên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng dương tính với O. tsutsugamushi chưa được đánh

giá trong nghiên cứu. Cần thiết phải tiến hành thử nghiệm trên các mẫu máu của bệnh

nhân đã được xác chẩn sốt mò trên lâm sàng bằng các phương pháp khác với số lượng

mẫu lớn hơn và tại các thời điểm lấy mẫu khác nhau. Việc này không chỉ có ý nghĩa

trong việc đánh giá ngưỡng phát hiện hay độ nhạy thực sự của quy trình, mà còn đánh

giá thời điểm thích hợp nhất trên lâm sàng nhằm thu thập mẫu bệnh phẩm cũng như

các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau.

3.7. Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường

Chúng tôi sử dụng 10 chủng vi sinh vật (đã mô tả) và 10 mẫu âm tính với

O. tsutsugamushi (nhóm người khỏe mạnh) để đánh giá độ đặc hiệu của quy trình

RPA đã thiết lập và quy trình realtime PCR (PrimerDesign).

Hình 3.10a. Đánh giá trên các mẫu âm tính

Hình 3.10b. Đánh giá trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán

phân biệt sốt mò

Hình 3.10. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò

Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR trên các chủng vi sinh vật

thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò và các mẫu âm tính cho thấy kỹ thuật

có độ đặc hiệu cao: chứng dương cho tín hiệu khuếch đại sớm, chứng âm không có

tín hiệu khuếch đại chứng tỏ quá trình phản ứng không có nhiễm chéo hay hiện tượng

mồi bắt cặp, các ống bổ sung DNA các chủng vi sinh vật khác không cho tín hiệu

khuếch đại (Hình 3.10). Vậy độ đặc hiệu của kỹ thuật realtime PCR khuếch đại DNA

O. tsutsugamushi là 20/(20+0) = 1, hay có thể nhận định rằng độ đặc hiệu kỹ thuật bộ

kit thương mại khi đánh giá trên các mẫu âm tính với O. tsutsugamushi là 100%.

Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA được trình bày trên HÌnh 3.11.

Quy trình RPA đã xây dựng không phát hiện bất kỳ mẫu nào trong 10 mẫu âm tính

với O. tsutsugamushi và trên 10 mẫu DNA các chủng vi sinh vật khác thường gặp

trong chẩn đoán phân biệt sốt mò, tương đương với độ đặc hiệu 100%. Quy trình

realtime PCR (PrimerDesign) cũng cho kết quả đánh giá độ đặc hiệu tương đương

(Bảng 3.5).

Hình 3.11a. Đánh giá trên các mẫu âm tính (tn1-tn10) và một số chủng vi sinh vật

khác (b1-b4)

Hình 3.11b. Đánh giá trên các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân

biệt sốt mò (b5-b10)

Hình 3.11. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt

Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình

Độ đặc hiệu (%) Mẫu đánh giá Realtime PCR RPA

Đánh giá trên mẫu bệnh phẩm âm tính 100 100 với Orientia tsutsugamushi

Đánh giá trên các mẫu vi sinh vật có 100 100 thể gây triệu chứng tương tự.

Như vậy, nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công trình khuếch đại đẳng nhiệt

RPA phát hiện O. tsutsugamushi có độ nhạy, độ đặc hiệu cao với các chủng O.

tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Quy trình RPA đã

thiết lập được thực hiện ở điều kiện đẳng nhiệt 37℃, trên thiết bị máy Genie® II chỉ

trong vòng 30 phút mà không cần sử dụng đến thiết bị luân nhiệt tinh vi nào với giá

thành cao như PCR. Nếu quy trình realtime PCR cần ít nhất tới 2 giờ để phân tích kết

quả thì quy trình RPA chỉ cần 30 phút để đưa ra kết quả chính xác cho một mẫu cần

phân tích, rút ngắn đáng kể thời gian phát hiện tác nhân gây bệnh.

Mặc dù quy trình RPA được tối ưu trong nghiên cứu này mới ở mức phát hiện

định tính mà chưa phải là định lượng, tuy nhiên với ngưỡng phát hiện đạt được rất tốt

và độ nhạy, độ đặc hiệu cao gợi ý rằng có thể sử dụng quy trình này ở các điều kiện

thực tế mà không cần trải qua các công đoạn làm giàu mẫu bệnh phẩm nhằm tăng độ

nhạy như các kỹ thuật khuếch đại gen dựa trên phản ứng luân nhiệt đang sử dụng.

Với thời gian phát hiện nhanh chóng và các thông số kỹ thuật tương đương với bộ kit

hiện hành, quy trình đẳng nhiệt đã thiết lập hứa hẹn là công cụ chẩn đoán hữu hiệu có

khả năng ứng dụng trong các phòng thí nghiệm được trang bị hiện đại, phòng thí

nghiệm di động hoặc khu vực có điều kiện hạn chế về trang thiết bị cơ sở hạ tầng giúp

chẩn đoán tác nhân gây bệnh sốt mò.

KẾT LUẬN

1. Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép

phát hiện nhanh và chính xác O. tsutsugamushi trong thời gian ngắn (chỉ 30

phút) với ngưỡng phát hiện 100 copy/p.ư.

2. Quy trình RPA đã thiết lập có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đương với bộ kit

thương mại hiện có trên thị trường (100%)

KIẾN NGHỊ

1. Thử nghiệm thực địa, đánh giá quy trình RPA phát hiện Orientia

tsutsugamushi đã thiết lập trên các mẫu lâm sàng với quy mô lớn

2. Ứng dụng công nghệ RPA vào phát hiện các mầm bệnh truyền nhiễm cũng

như các mầm bệnh khác yêu cầu về thời gian chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết

kiệm chi phí và mang lại hiệu quả cao

TÀI LIỆU THAM KHẢO

* Tài liệu Tiếng Việt

1. Cục Y tế Dự phòng (2016), Bệnh sốt mò

2. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi

Kuratsuji (2006), "Biểu hiện xuất huyết và tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân

sốt mò". Tạp chí: Nghiên cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 45, số 5: tr. 42-47.

3. Bùi Trọng Chiến, Philip Buchy, Trịnh Thị Xuân Mai, Lê Viết Lô, Ngô Thị

Quyết, Ngô Lê Minh Tâm, Viên Quang Mai, Nguyễn Bảo Triệu (2014), "Một

số đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học bệnh sốt mò do Orientia tsutsugamushi ở

miền trung Việt Nam, giai đoạn 2009 - 2010", Tạp chí Y học dự phòng, tập

XXIV, số 2: tr. 9-15.

4. Cao Văn Sung, Đặng Huy Huỳnh, Bùi Kính (1980), Những loài gặm nhấm ở

Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật

5. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi

Kuratsuji (2006), "Đặc điểm dịch tễ sốt mò các trường hợp điều trị tại Viện Y

học lâm sàng các bệnh nhiệt đới, 2001 - 2003", Tạp chí Y học dự phòng, tập

XVI, số 1(79): tr. 59-64.

6. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thuỷ, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi

Kuratsuji (2006), "Một số biểu hiện thần kinh trong sốt mò", Tạp chí Nghiên

cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 43, số 4: tr. 25-30.

7. Cao Văn Viên, Lê Đăng Hà, Phạm Thanh Thủy, Shuzo Kanagawa, Tadatoshi

Kuratsuji (2006), "Biểu hiện xuất huyết và tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân

sốt mò", Tạp chí: Nghiên cứu Y học, Đại học Y Hà Nội, tập 45, số 5: tr. 42-47.

8. Nguyễn Văn Châu (1994), Khu hệ mò-họ trombiculidae (acariformes) ở Việt

Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật

9. Nguyễn Văn Châu (1997), Phân loài mò (Acariformes, Trombiculidae) ở Việt

Nam, Nhà xuất bản Y học

10. Nguyễn Văn Châu (2005), "Ba loài mò mới (Acariformes, Trombiculidae) ký

sinh trên thú, chim và bò sát ở Việt Nam", Tạp chí Sinh học, 27 (2), tr. 8-15.

11. Đoàn Trọng Tuyên, Vũ Chiến Thắng, Nguyễn Minh Tiếp, Nguyễn Viết Sự, and

Trần Quang Nguyên & cs (2008), "Khảo sát mức độ lưu hành bệnh sốt mò tại

một số khu vực thuộc Tuyên Quang, Khánh Hòa và Kon Tum", Tạp chí Y học

quân sự, tr. 30-34.

12. Lê Hồng Quang, Trần Huy Hoàng, Hồ Lê Cẩm Nhung (2012), "Nghiên cứu đặc

điểm bệnh sốt mò và đánh giá hiệu quả điều trị bằng Cloramphenicol", Tạp chí

Y học Việt Nam, số đặc biệt 2012: tr. 84-90.

13. Lê Thị Hồng Vân, Hà Minh Thư, Nguyễn Văn Châu (2014), Tình hình sốt mò

tỉnh Yên Bái năm 2014, Báo cáo khoa học toàn văn - Hội nghị ký sinh trùng

toàn quốc, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 172-179.

14. Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Minh, Trịnh Văn Toàn, Võ Viết Cường (2017),

"Tách dòng và biểu hiện đoạn gen mã hóa vùng quyết định kháng nguyên 56

kDa của vi khuẩn Orientia tsutsugamushi trong Escherichia coli", Tạp chí Khoa

học và Công nghệ nhiệt đới, tr. 67-74.

15. Nguyễn Bá Hành, Trần Huy Hoàng, Dương Tuấn Linh và cs (2009), "Nghiên

cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và điều trị sốt mò tại Bệnh viện 87, Nha

Trang - Khánh Hòa năm 2008 - 2009", Tạp chí Dược lâm sàng 108, số 10/2009:

tr. 111-118.

16. Nguyễn Văn Châu, Nguyễn Mạnh Hùng, Hồ Đình Trung (2011), Thực hành kỹ

thuật chân đốt y học, NXB Y học, Hà Nội

17. Nguyễn Văn Châu, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Sĩ Hiển (2007), Động Vật chí Việt

Nam - Fauna of Vietnam, 16: Họ mò đỏ Trombiculidae, Bộ Bọ chét

Siphonaptera, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật

18. Nguyễn Văn Châu, Phùng Xuân Bích, Nguyễn Thị Kha, Dương Thị Mùi (2005),

Tìm hiểu phân bố các loài mò (Trombiculidae) liên quan đến sự phân bố bệnh

sốt mò (Tsutsugamushi ) ở một số địa phương thuộc tỉnh Quảng Ninh, Công

trình nghiên cứu khoa học, Báo cáo tại Hội nghị khoa học toàn quốc chuyên

ngành Sốt rét - Ký sinh trùng -Côn trùng, giai đoạn 2001-2005, Nhà xuất bản Y

học, tr. 267-279.

19. Nguyễn Văn Châu, Trần Thanh Dương (2016), Tài liệu định loại ve (Ixodida:

Ixodoidea), Mò (Prostigmata: Trombiculidae), Mạt (Mesostigmat:

Gammasoidea) thường gặp ở Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội

20. Nguyễn Văn Châu, Trương Sĩ Niêm và cs (2001), Khảo sát mò và bệnh sốt mò

(Tsutsugamushi) tại một số điểm thuộc tỉnh Bắc Giang, Kỷ yếu Công trình

Nghiên cứu khoa học (1996 - 2000), Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng

Trung ương, tr. 538-546.

21. Nguyễn Văn Tình, Phạm Thị Hà Giang, Trịnh Văn Toàn, Dương Tuấn Linh,

Võ Viết Cường (2017), "Đặc điểm di truyền phân tử của vi khuẩn Orientia

tsutsugamushi gây bệnh sốt mò ở một số tỉnh phía Bắc", Tạp chí Khoa học và

Công nghệ nhiệt đới, số 13: tr. 59-66.

22. Nguyễn Văn Tuấn, Vũ Đức Chính, Nguyễn Văn Đạt, Nguyễn Văn Dũng, Trần

Văn Thanh (2017), Thành phần loài, mật độ mò và tình hình bệnh nhân sốt mò

tại một số xã thuộc huyện Mù Căng Chải, huyện Văn Chấn tỉnh Yên Bái năm

2016, Báo cáo khoa học Hội nghị Côn trùng học Quốc gia lần thứ IX, tr. 1004-

1010.

23. Nguyễn Xuân Quang, Đỗ Công Tấn (2011), Nghiên cứu thành phần loài, mật

độ ký sinh của mò Trombiculidae) trên thú gặm nhấm ở các sinh cảnh rừng tự

nhiên, rừng trồng tại hai tỉnh Quảng Ngãi và Thừa Thiên – Huế, Báo cáo khoa

học Hội nghị Ký sinh trùng lần thứ 38, NXB Y học, tập 2, tr. 207-214.

24. Nguyễn Duy Quyền (2002), Đặc điểm sinh thái vùng xảy ra một số bệnh lưu

hành liên quan đến sức khỏe của quân và dân trên 4 đảo tỉnh Quảng Ninh (1990-

1999), Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

25. Phạm Thị Thanh Thủy (2007), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, phương pháp

chẩn đoán và điều trị bệnh sốt mò, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.

26. Cục Y tế Dự phòng và Môi trường (2009), "Bệnh sốt mò", Cẩm nang phòng,

chống bệnh truyền nhiễm, Bộ Y tế, tr. 281.

27. Lê Võ Định Tường (1989), Một số thú nhỏ trong sinh thái - dịch học các bệnh

dịch hạch và sốt mò ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ khoa học y dược, Học viện

Quân y

* Tài liệu Tiếng Anh

28. Alberts, B. M. and L. Frey, (1970),"T4 bacteriophage gene 32: a structural

protein in the replication and recombination of DNA". Nature, 227(5265): p.

1313-8.

29. Amano, K., A. Tamura, N. Ohashi, H. Urakami, S. Kaya, and K. Fukushi,

(1987),"Deficiency of peptidoglycan and lipopolysaccharide components in

Rickettsia tsutsugamushi". Infect Immun, 55(9): p. 2290-2.

30. Atwal, S., S. Giengkam, S. Chaemchuen, J. Dorling, N. Kosaisawe, M.

VanNieuwenhze, S. Sampattavanich, P. Schumann, and J. Salje,

(2017),"Evidence for a peptidoglycan-like structure in Orientia

tsutsugamushi". Mol Microbiol, 105(3): p. 440-452.

31. Bianchi, M., B. Riboli, and G. Magni, (1985),"E. coli recA protein possesses

a strand separating activity on short duplex DNAs". EMBO J, 4(11): p. 3025-

30.

32. Blacksell, Stuart D, Daniel H Paris, Wirongrong Chierakul, Vanaporn

Wuthiekanun, Achara Teeratakul, Pacharee Kantipong, and Nicholas PJ Day,

(2012),"Prospective evaluation of commercial antibody-based rapid tests in

combination with a loop-mediated isothermal amplification PCR assay for

detection of Orientia tsutsugamushi during the acute phase of scrub typhus

infection". Clin. Vaccine Immunol., 19(3): p. 391-395.

33. Blanc, G., M. Ngwamidiba, H. Ogata, P. E. Fournier, J. M. Claverie, and D.

Raoult, (2005),"Molecular evolution of rickettsia surface antigens: evidence

of positive selection". Mol Biol Evol, 22(10): p. 2073-83.

34. Boyle, J. M. and N. Symonds, (1969),"Radiation-sensitive mutants of T4D. I.

T4y: a new radiation-sensitive mutant; effect of the mutation on radiation

survival, growth and recombination". Mutat Res, 8(3): p. 431-9.

35. Bozeman, F. M. and B. L. Elisberg, (1963),"Serological diagnosis of scrub

typhus by indirect immunofluorescence". Proc Soc Exp Biol Med, 112: p. 568-

73.

36. cambio, Lab Reagents: Smart Buﬀers and Reagents,

https://www.cambio.co.uk/24/1283/77/products/potassiumacetate/#tab-2,

(accessed July 27th, 2018)".

37. Cardwell, M. M. and J. J. Martinez, (2009),"The Sca2 autotransporter protein

from Rickettsia conorii is sufficient to mediate adherence to and invasion of

cultured mammalian cells". Infect Immun, 77(12): p. 5272-80.

38. Chan, Y. G., M. M. Cardwell, T. M. Hermanas, T. Uchiyama, and J. J.

Martinez, (2009),"Rickettsial outer-membrane protein B (rOmpB) mediates

bacterial invasion through Ku70 in an actin, c-Cbl, clathrin and caveolin 2-

dependent manner". Cell Microbiol, 11(4): p. 629-44.

39. Chandu, D., S. Paul, M. Parker, Y. Dudin, J. King-Sitzes, T. Perez, D. W.

Mittanck, M. Shah, K. C. Glenn, and O. Piepenburg, (2016),"Development of

a Rapid Point-of-Use DNA Test for the Screening of Genuity(R) Roundup

Ready 2 Yield(R) Soybean in Seed Samples". Biomed Res Int, 2016: p.

3145921.

40. Chanta, C. and P. Phloenchaiwanit, (2015),"Randomized Controlled Trial of

Azithromycin versus Doxycycline or Chloramphenicol for Treatment of

Uncomplicated Pediatric Scrub Typhus". J Med Assoc Thai, 98(8): p. 756-60.

41. Chao, C. C., T. Belinskaya, Z. Zhang, and W. M. Ching, (2015),"Development

of Recombinase Polymerase Amplification Assays for Detection of Orientia

tsutsugamushi or Rickettsia typhi". PLoS Negl Trop Dis, 9(7): p. e0003884.

42. Chao, Chien-Chung, Tatyana Belinskaya, Zhiwen Zhang, and Wei-Mei Ching,

(2015),"Development of recombinase polymerase amplification assays for

detection of Orientia tsutsugamushi or Rickettsia typhi". PLoS neglected

tropical diseases, 9(7): p. e0003884.

43. Chen, Y., M. Gotte, J. Liu, and P. W. Park, (2008),"Microbial subversion of

heparan sulfate proteoglycans". Mol Cells, 26(5): p. 415-26.

44. Cho, B. A., N. H. Cho, S. Y. Seong, M. S. Choi, and I. S. Kim,

(2010),"Intracellular invasion by Orientia tsutsugamushi is mediated by

integrin signaling and actin cytoskeleton rearrangements". Infect Immun,

78(5): p. 1915-23.

45. Cho, N. H., H. R. Kim, J. H. Lee, S. Y. Kim, J. Kim, S. Cha, S. Y. Kim, A. C.

Darby, H. H. Fuxelius, J. Yin, J. H. Kim, J. Kim, S. J. Lee, Y. S. Koh, W. J.

Jang, K. H. Park, S. G. Andersson, M. S. Choi, and I. S. Kim, (2007),"The

Orientia tsutsugamushi genome reveals massive proliferation of conjugative

type IV secretion system and host-cell interaction genes". Proc Natl Acad Sci

U S A, 104(19): p. 7981-6.

46. Chomvarin, C., W. Namwat, S. Wongwajana, M. Alam, K. Thaew-Nonngiew,

A. Sinchaturus, and C. Engchanil, (2007),"Application of duplex-PCR in rapid

and reliable detection of toxigenic Vibrio cholerae in water samples in

Thailand". J Gen Appl Microbiol, 53(4): p. 229-37.

47. Chu, H., J. H. Lee, S. H. Han, S. Y. Kim, N. H. Cho, I. S. Kim, and M. S. Choi,

(2006),"Exploitation of the endocytic pathway by Orientia tsutsugamushi in

nonprofessional phagocytes". Infect Immun, 74(7): p. 4246-53.

48. Crannell, Z. A., B. Rohrman, and R. Richards-Kortum, (2014),"Equipment-

free incubation of recombinase polymerase amplification reactions using body

heat". PLoS One, 9(11): p. e112146.

49. Craw, Pascal and Wamadeva Balachandran, (2012),"Isothermal nucleic acid

amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review".

Lab Chip, 12(14): p. 2469-2486.

50. Creatine kinase, https://en.wikipedia.org/wiki/Creatine_ kinase, (accessed Oct

4, 2018)".

51. Curtis, K. A., D. L. Rudolph, and S. M. Owen, (2009),"Sequence-specific

detection method for reverse transcription, loop-mediated isothermal

amplification of HIV-1". J Med Virol, 81(6): p. 966-72.

52. Dabo, S. M., A. W. Confer, B. E. Anderson, and S. Gupta, (2006),"Bartonella

henselae Pap31, an extracellular matrix adhesin, binds the fibronectin repeat

III13 module". Infect Immun, 74(5): p. 2513-21.

53. Daher, R. K., G. Stewart, M. Boissinot, and M. G. Bergeron,

(2016),"Recombinase Polymerase Amplification for Diagnostic

Applications". Clin Chem, 62(7): p. 947-58.

54. Daher, Rana K, Gale Stewart, Maurice Boissinot, Dominique K Boudreau, and

Michel G Bergeron, (2015),"Influence of sequence mismatches on the

specificity of recombinase polymerase amplification technology". Molecular

and cellular probes, 29(2): p. 116-121.

55. Deng, H. and Z. Gao, (2015),"Bioanalytical applications of isothermal nucleic

acid amplification techniques". Anal Chim Acta, 853: p. 30-45.

56. Eremeeva, M.E. and G.A. Dasch (2002),"Rickettsia and orientia, in Molecular

medical microbiology". Elsevier: p. 2177-2217.

57. Erin Huber1, 2, Darder Ji3, Lee Howell1,2, Zhiwen Zhang1,2, Hua-Wei

Chen1,2, Wei-Mei Ching1,2 and Chien-Chung Chao1,2,*, (2012),"Loop-

Mediated Isothermal Amplification Assay Targeting the 47-Kda Gene of

Orientia tsutsugamushi: A Rapid and Sensitive Alternative to Real-Time

PCR". Research Article Open Access.

58. Euler, M., Y. Wang, P. Otto, H. Tomaso, R. Escudero, P. Anda, F. T. Hufert,

and M. Weidmann, (2012),"Recombinase polymerase amplification assay for

rapid detection of Francisella tularensis". J Clin Microbiol, 50(7): p. 2234-8.

59. Fang, R., X. Li, L. Hu, Q. You, J. Li, J. Wu, P. Xu, H. Zhong, Y. Luo, J. Mei,

and Q. Gao, (2009),"Cross-priming amplification for rapid detection of

Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens". J Clin Microbiol, 47(3):

p. 845-7.

60. Fjelstrup, S., M. B. Andersen, J. Thomsen, J. Wang, M. Stougaard, F. S.

Pedersen, Y. P. Ho, M. S. Hede, and B. R. Knudsen, (2017),"The Effects of

Dithiothreitol on DNA". Sensors (Basel), 17(6).

61. Furuya, Y., Y. Yoshida, T. Katayama, S. Yamamoto, and A. Kawamura, Jr.,

(1993),"Serotype-specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by

nested polymerase chain reaction". J Clin Microbiol, 31(6): p. 1637-40.

62. Ge, Y. and Y. Rikihisa, (2011),"Subversion of host cell signaling by Orientia

tsutsugamushi". Microbes Infect, 13(7): p. 638-48.

63. Gracias, Kiev S. and John L. McKillip, (2007),"NUCLEIC ACID

SEQUENCE-BASED AMPLIFICATION (NASBA) IN MOLECULAR

BACTERIOLOGY: A PROCEDURAL GUIDE". Journal of Rapid Methods

& Automation in Microbiology, 15(3): p. 295-309.

64. Great Basin Corporation. Isothermal amplification. 2015 [cited 2015 15-04-

2015]; Available from: http://www.gbscience.com/technology/iso-amp/.

65. Griffith, J. and T. Formosa, (1985),"The uvsX protein of bacteriophage T4

arranges single-stranded and double-stranded DNA into similar helical

nucleoprotein filaments". J Biol Chem, 260(7): p. 4484-91.

66. Ha, N. Y., N. H. Cho, Y. S. Kim, M. S. Choi, and I. S. Kim, (2011),"An

autotransporter protein from Orientia tsutsugamushi mediates adherence to

nonphagocytic host cells". Infect Immun, 79(4): p. 1718-27.

67. Hamaguchi, S., N. C. Cuong, D. T. Tra, Y. H. Doan, K. Shimizu, N. Q. Tuan,

L. M. Yoshida, L. Q. Mai, D. Duc-Anh, S. Ando, J. Arikawa, C. M. Parry, K.

Ariyoshi, and P. T. Thuy, (2015),"Clinical and Epidemiological

Characteristics of Scrub Typhus and Murine Typhus among Hospitalized

Patients with Acute Undifferentiated Fever in Northern Vietnam". Am J Trop

Med Hyg, 92(5): p. 972-978.

68. Hellyer, T. J. and J. G. Nadeau, (2004),"Strand displacement amplification: a

versatile tool for molecular diagnostics". Expert Rev Mol Diagn, 4(2): p. 251-

61.

69. Hofmann, W. P., V. Dries, E. Herrmann, B. Gartner, S. Zeuzem, and C.

Sarrazin, (2005),"Comparison of transcription mediated amplification (TMA)

and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection

of hepatitis C virus RNA in liver tissue". J Clin Virol, 32(4): p. 289-93.

70. Hotta, K., H. T. Pham, H. T. Hoang, T. C. Trang, T. N. Vu, T. T. Ung, K.

Shimizu, J. Arikawa, A. Yamada, H. T. Nguyen, H. L. Nguyen, M. T. Le, and

D. Hayasaka, (2016),"Prevalence and Phylogenetic Analysis of Orientia

tsutsugamushi in Small Mammals in Hanoi, Vietnam". Vector Borne Zoonotic

Dis, 16(2): p. 96-102.

71. Ihn, K. S., S. H. Han, H. R. Kim, M. S. Huh, S. Y. Seong, J. S. Kang, T. H.

Han, I. S. Kim, and M. S. Choi, (2000),"Cellular invasion of Orientia

tsutsugamushi requires initial interaction with cell surface heparan sulfate".

Microb Pathog, 28(4): p. 227-33.

72. Izzard, L., A. Fuller, S. D. Blacksell, D. H. Paris, A. L. Richards, N. Aukkanit,

C. Nguyen, J. Jiang, S. Fenwick, N. P. Day, S. Graves, and J. Stenos,

(2010),"Isolation of a novel Orientia species (O. chuto sp. nov.) from a patient

infected in Dubai". J Clin Microbiol, 48(12): p. 4404-9.

73. J.P. van Putten, T.D. Duensing, R.L. Cole, (1998),"Entry of OpaAþ gonococci

into HEp-2 cells requires concerted action of glycosaminoglycans, fibronectin

and integrin receptors". Mol. Microbiol.

74. Jamil, M., K. G. Lyngrah, M. Lyngdoh, and M. Hussain, (2014),"Clinical

Manifestations and Complications of Scrub Typhus : A Hospital Based Study

from North Eastern India". J Assoc Physicians India, 62(12): p. 19-23.

75. Jeong, Y. J., S. Kim, Y. D. Wook, J. W. Lee, K. I. Kim, and S. H. Lee,

(2007),"Scrub typhus: clinical, pathologic, and imaging findings".

Radiographics, 27(1): p. 161-72.

76. Jeong, Y. J., K. Park, and D. E. Kim, (2009),"Isothermal DNA amplification

in vitro: the helicase-dependent amplification system". Cell Mol Life Sci,

66(20): p. 3325-36.

77. Jiang, J. and A. L. Richards, (2018),"Scrub Typhus: No Longer Restricted to

the Tsutsugamushi Triangle". Trop Med Infect Dis, 3(1).

78. Johne, R., H. Muller, A. Rector, M. van Ranst, and H. Stevens,

(2009),"Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29

polymerase". Trends Microbiol, 17(5): p. 205-11.

79. Jung-Hee Lee, Nam-Hyuk Cho, Se-Yoon Kim, Sun-Young Bang, Hyuk Chu,

Myung-Sik Choi, Ik-Sang Kim, (2008),"Fibronectin facilitates the invasion of

Orientia tsutsugamushi into host cells through interaction with a 56-kDa type-

specific antigen". The Journal of Infectious Diseases.

80. K.O'Sullivan, Ivan MagriñáLobatoaCiara, (2018),"Recombinase polymerase

amplification: Basics, applications and recent advances". ScienceDirect.

81. Kelly, D. J., P. W. Wong, E. Gan, and G. E. Lewis, Jr., (1988),"Comparative

evaluation of the indirect immunoperoxidase test for the serodiagnosis of

rickettsial disease". Am J Trop Med Hyg, 38(2): p. 400-6.

82. Kelly, D. J., P. A. Fuerst, W. M. Ching, and A. L. Richards, (2009),"Scrub

typhus: the geographic distribution of phenotypic and genotypic variants of

Orientia tsutsugamushi". Clin Infect Dis, 48 Suppl 3: p. S203-30.

83. Kersting, S., V. Rausch, F. F. Bier, and M. von Nickisch-Rosenegk,

(2014),"Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal

recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis". Malar J, 13:

p. 99.

84. Kim, D. M., H. L. Kim, C. Y. Park, T. Y. Yang, J. H. Lee, J. T. Yang, S. K.

Shim, and S. H. Lee, (2006),"Clinical usefulness of eschar polymerase chain

reaction for the diagnosis of scrub typhus: a prospective study". Clin Infect

Dis, 43(10): p. 1296-300.

85. Kim, D. M., G. Park, H. S. Kim, J. Y. Lee, G. P. Neupane, S. Graves, and J.

Stenos, (2011),"Comparison of conventional, nested, and real-time

quantitative PCR for diagnosis of scrub typhus". J Clin Microbiol, 49(2): p.

607-12.

86. Kim, H. R., M. S. Choi, and I. S. Kim, (2004),"Role of Syndecan-4 in the

cellular invasion of Orientia tsutsugamushi". Microb Pathog, 36(4): p. 219-

25.

87. Kim, M. J., M. K. Kim, and J. S. Kang, (2013),"Involvement of lipid rafts in

the budding-like exit of Orientia tsutsugamushi". Microb Pathog, 63: p. 37-

43.

88. Koh, G. C., R. J. Maude, D. H. Paris, P. N. Newton, and S. D. Blacksell,

(2010),"Diagnosis of scrub typhus". Am J Trop Med Hyg, 82(3): p. 368-70.

89. Kramme, S., V. An le, N. D. Khoa, V. Trin le, E. Tannich, J. Rybniker, B.

Fleischer, C. Drosten, and M. Panning, (2009),"Orientia tsutsugamushi

bacteremia and cytokine levels in Vietnamese scrub typhus patients". J Clin

Microbiol, 47(3): p. 586-9.

90. Le Viet, N., M. Laroche, H. L. Thi Pham, N. L. Viet, O. Mediannikov, D.

Raoult, and P. Parola, (2017),"Use of eschar swabbing for the molecular

diagnosis and genotyping of Orientia tsutsugamushi causing scrub typhus in

Quang Nam province, Vietnam". PLoS Negl Trop Dis, 11(2): p. e0005397.

91. Lee, J. H., N. H. Cho, S. Y. Kim, S. Y. Bang, H. Chu, M. S. Choi, and I. S.

Kim, (2008),"Fibronectin facilitates the invasion of Orientia tsutsugamushi

into host cells through interaction with a 56-kDa type-specific antigen". J

Infect Dis, 198(2): p. 250-7.

92. Lee, S. C., Y. J. Cheng, C. H. Lin, W. T. Lei, H. Y. Chang, M. D. Lee, J. M.

Liu, R. J. Hsu, N. C. Chiu, H. Chi, C. C. Peng, T. L. Tsai, and C. Y. Lin,

(2017),"Comparative effectiveness of azithromycin for treating scrub typhus:

A PRISMA-compliant systematic review and meta-analysis". Medicine

(Baltimore), 96(36): p. e7992.

93. Lee, S. M., M. K. Kim, M. J. Kim, and J. S. Kang, (2009),"Novel

polysaccharide antigen of Orientia tsutsugamushi revealed by a monoclonal

antibody". FEMS Microbiol Lett, 297(1): p. 95-100.

94. Leiss, M., K. Beckmann, A. Giros, M. Costell, and R. Fassler, (2008),"The

role of integrin binding sites in fibronectin matrix assembly in vivo". Curr

Opin Cell Biol, 20(5): p. 502-7.

95. Li, J., J. Macdonald, and F. von Stetten, (2018),"Review: a comprehensive

summary of a decade development of the recombinase polymerase

amplification". Analyst, 144(1): p. 31-67.

96. Lillis, L., D. Lehman, M. C. Singhal, J. Cantera, J. Singleton, P. Labarre, A.

Toyama, O. Piepenburg, M. Parker, R. Wood, J. Overbaugh, and D. S. Boyle,

(2014),"Non-instrumented incubation of a recombinase polymerase

amplification assay for the rapid and sensitive detection of proviral HIV-1

DNA". PLoS One, 9(9): p. e108189.

97. Lillis, Lorraine, Dara Lehman, Mitra C Singhal, Jason Cantera, Jered

Singleton, Paul Labarre, Anthony Toyama, Olaf Piepenburg, Mathew Parker,

and Robert Wood, (2014),"Non-instrumented incubation of a recombinase

polymerase amplification assay for the rapid and sensitive detection of

proviral HIV-1 DNA". PloS one, 9(9): p. e108189.

98. Liu, Y. X., N. Jia, J. J. Suo, Y. B. Xing, G. Liu, H. J. Xiao, N. Jia, Z. T. Zhao,

J. S. Min, P. T. Feng, S. B. Ma, J. H. Richardus, and W. C. Cao,

(2009),"Characteristics of pediatric scrub typhus in a new endemic region of

northern China". Pediatr Infect Dis J, 28(12): p. 1111-4.

99. Luce-Fedrow, A., M. L. Lehman, D. J. Kelly, K. Mullins, A. N. Maina, R. L.

Stewart, H. Ge, H. S. John, J. Jiang, and A. L. Richards, (2018),"A Review of

Scrub Typhus (Orientia tsutsugamushi and Related Organisms): Then, Now,

and Tomorrow". Trop Med Infect Dis, 3(1).

100. Lutz, S., P. Weber, M. Focke, B. Faltin, J. Hoffmann, C. Muller, D. Mark, G.

Roth, P. Munday, N. Armes, O. Piepenburg, R. Zengerle, and F. von Stetten,

(2010),"Microfluidic lab-on-a-foil for nucleic acid analysis based on

isothermal recombinase polymerase amplification (RPA)". Lab Chip, 10(7):

p. 887-93.

101. Mahajan, S. K., (2005),"Scrub typhus". J Assoc Physicians India, 53: p. 954-

102. Mahajan, S. K. and S. K. Mahajan, (2017),"Neuropsychiatric Manifestations

of Scrub Typhus". J Neurosci Rural Pract, 8(3): p. 421-426.

103. Martinez, J. J., S. Seveau, E. Veiga, S. Matsuyama, and P. Cossart,

(2005),"Ku70, a component of DNA-dependent protein kinase, is a

mammalian receptor for Rickettsia conorii". Cell, 123(6): p. 1013-23.

104. McHugh, T. D., C. F. Pope, C. L. Ling, S. Patel, O. J. Billington, R. D.

Gosling, M. C. Lipman, and S. H. Gillespie, (2004),"Prospective evaluation of

BDProbeTec strand displacement amplification (SDA) system for diagnosis

of tuberculosis in non-respiratory and respiratory samples". J Med Microbiol,

53(Pt 12): p. 1215-9.

105. Morgan, M. R., M. J. Humphries, and M. D. Bass, (2007),"Synergistic control

of cell adhesion by integrins and syndecans". Nat Rev Mol Cell Biol, 8(12): p.

957-69.

106. Mori, Y. and T. Notomi, (2009),"Loop-mediated isothermal amplification

(LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious

diseases". J Infect Chemother, 15(2): p. 62-9.

107. Murali, N., S. Pillai, T. Cherian, P. Raghupathy, V. Padmini, and E. Mathai,

(2001),"Rickettsial infections in South India - how to spot the spotted fever".

Indian Pediatr, 38(12): p. 1393-6.

108. Nadjm, B., P. T. Thuy, V. D. Trang, D. Ha le, N. V. Kinh, and H. F. Wertheim,

(2014),"Scrub typhus in the northern provinces of Vietnam: an observational

study of admissions to a national referral hospital". Trans R Soc Trop Med

Hyg, 108(11): p. 739-40.

109. Niemz, A., T. M. Ferguson, and D. S. Boyle, (2011),"Point-of-care nucleic

acid testing for infectious diseases". Trends Biotechnol, 29(5): p. 240-50.

110. Okazaki, T. and A. Kornberg, (1964),"Enzymatic Synthesis of

Deoxyribonucleic Acid. Xv. Purification and Properties of a Polymerase from

Bacillus Subtilis". J Biol Chem, 239: p. 259-68.

111. Paris, D. H., S. D. Blacksell, P. N. Newton, and N. P. Day, (2008),"Simple,

rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi by loop-isothermal

DNA amplification". Trans R Soc Trop Med Hyg, 102(12): p. 1239-46.

112. Paris, D. H., T. R. Shelite, N. P. Day, and D. H. Walker, (2013),"Unresolved

problems related to scrub typhus: a seriously neglected life-threatening

disease". Am J Trop Med Hyg, 89(2): p. 301-7.

113. Park, S. W., N. Y. Ha, B. Ryu, J. H. Bang, H. Song, Y. Kim, G. Kim, M. D.

Oh, N. H. Cho, and J. K. Lee, (2015),"Urbanization of scrub typhus disease in

South Korea". PLoS Negl Trop Dis, 9(5): p. e0003814.

114. Piepenburg O, Armes NA, (2011),"DNA glycosylase/lyase and ap

endonuclease substrates". http://www. google.com/patents/US20110053153

(Accessed February2016).

115. Piepenburg, O., C. H. Williams, D. L. Stemple, and N. A. Armes,

(2006),"DNA detection using recombination proteins". PLoS Biol, 4(7): p.

1115-21.

116. Piepenburg, O., C. H. Williams, D. L. Stemple, and N. A. Armes,

(2006),"DNA detection using recombination proteins". PLoS Biol, 4(7): p.

e204.

117. Piepenburg, Olaf, Colin H Williams, Derek L Stemple, and Niall A Armes,

(2006),"DNA detection using recombination proteins". PLoS biology, 4(7): p.

e204.

118. Prakash, J. A., M. L. Kavitha, and E. Mathai, (2011),"Nested polymerase chain

reaction on blood clots for gene encoding 56 kDa antigen and serology for the

diagnosis of scrub typhus". Indian J Med Microbiol, 29(1): p. 47-50.

119. Rikihisa, Y. and S. Ito, (1982),"Entry of Rickettsia tsutsugamushi into

polymorphonuclear leukocytes". Infect Immun, 38(1): p. 343-50.

120. Riley, S. P., K. C. Goh, T. M. Hermanas, M. M. Cardwell, Y. G. Chan, and J.

J. Martinez, (2010),"The Rickettsia conorii autotransporter protein Sca1

promotes adherence to nonphagocytic mammalian cells". Infect Immun, 78(5):

p. 1895-904.

121. Rodkvamtook, W., T. Ruang-Areerate, J. Gaywee, A. L. Richards, P.

Jeamwattanalert, D. Bodhidatta, N. Sangjun, A. Prasartvit, A. Jatisatienr, and

C. Jatisatienr, (2011),"Isolation and characterization of Orientia tsutsugamushi

from rodents captured following a scrub typhus outbreak at a military training

base, Bothong district, Chonburi province, central Thailand". Am J Trop Med

Hyg, 84(4): p. 599-607.

122. RPA Assay Design, https://www.twistdx.co.uk/en/support/ rpa-assay-design-

2, (accessed Oct 4th, 2018)".

123. Salje, J., (2017),"Orientia tsutsugamushi: A neglected but fascinating obligate

intracellular bacterial pathogen". PLoS Pathog, 13(12): p. e1006657.

124. Sarma, N. and S. Chakraborty, (2017),"Scrub Typhus in Southern Districts of

West Bengal". Indian J Dermatol, 62(5): p. 512-514.

125. Sasaki, Y., D. Miyoshi, and N. Sugimoto, (2007),"Regulation of DNA

nucleases by molecular crowding". Nucleic Acids Res, 35(12): p. 4086-93.

126. Shamoo, Y., A. M. Friedman, M. R. Parsons, W. H. Konigsberg, and T. A.

Steitz, (1995),"Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA

binding protein (T4 gp32) complexed to DNA". Nature, 376(6538): p. 362-6.

127. Singhsilarak, T., W. Leowattana, S. Looareesuwan, V. Wongchotigul, J. Jiang,

A. L. Richards, and G. Watt, (2005),"Short report: detection of Orientia

tsutsugamushi in clinical samples by quantitative real-time polymerase chain

reaction". Am J Trop Med Hyg, 72(5): p. 640-1.

128. Tamura, A., H. Urakami, and N. Ohashi, (1991),"A comparative view of

Rickettsia tsutsugamushi and the other groups of rickettsiae". Eur J Epidemiol,

7(3): p. 259-69.

129. Tamura, A., N. Ohashi, H. Urakami, and S. Miyamura, (1995),"Classification

of Rickettsia tsutsugamushi in a new genus, Orientia gen. nov., as Orientia

tsutsugamushi comb. nov". Int J Syst Bacteriol, 45(3): p. 589-91.

130. Tantibhedhyangkul, W., E. Wongsawat, S. Silpasakorn, D. Waywa, N.

Saenyasiri, J. Suesuay, W. Thipmontree, and Y. Suputtamongkol, (2017),"Use

of Multiplex Real-Time PCR To Diagnose Scrub Typhus". J Clin Microbiol,

55(5): p. 1377-1387.

131. Tantibhedhyangkul, Wiwit, Ekkarat Wongsawat, Saowaluk Silpasakorn,

Duangdao Waywa, Nuttawut Saenyasiri, Jintapa Suesuay, Wilawan

Thipmontree, and Yupin Suputtamongkol, (2017),"Use of multiplex real-time

PCR to diagnose scrub typhus". Journal of clinical microbiology, 55(5): p.

1377-1387.

132. Taylor, A. J., D. H. Paris, and P. N. Newton, (2015),"A Systematic Review of

Mortality from Untreated Scrub Typhus (Orientia tsutsugamushi)". PLoS Negl

Trop Dis, 9(8): p. e0003971.

133. Tris, https://en.wikipedia.org/wiki/Tris, (accessed Oct 4th, 2018)".

134. U.S. Food and Drug Administration. Nucleic Acid Based Tests. List of

Microbial Tests 2015 [cited 2015 08-04-2015]; Available from:

http://www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitro

Diagnostics/ucm330711.htm.

135. Valbuena, G. and D. H. Walker, (2012),"Approaches to vaccines against

Orientia tsutsugamushi". Front Cell Infect Microbiol, 2: p. 170.

136. Van Ness, J., L. K. Van Ness, and D. J. Galas, (2003),"Isothermal reactions

for the amplification of oligonucleotides". Proc Natl Acad Sci U S A, 100(8):

p. 4504-9.

137. Vincent, M., Y. Xu, and H. Kong, (2004),"Helicase-dependent isothermal

DNA amplification". EMBO Rep, 5(8): p. 795-800.

138. Watt, G. and P. Parola, (2003),"Scrub typhus and tropical rickettsioses". Curr

Opin Infect Dis, 16(5): p. 429-36.

139. Wongprompitak, P., W. Anukool, E. Wongsawat, S. Silpasakorn, V. Duong,

P. Buchy, S. Morand, R. Frutos, P. Ekpo, and Y. Suputtamongkol,

(2013),"Broad-coverage molecular epidemiology of Orientia tsutsugamushi in

Thailand". Infect Genet Evol, 15: p. 53-8.

140. Xian, X., S. Gopal, and J. R. Couchman, (2010),"Syndecans as receptors and

organizers of the extracellular matrix". Cell Tissue Res, 339(1): p. 31-46.

141. Xu, G., D. H. Walker, D. Jupiter, P. C. Melby, and C. M. Arcari, (2017),"A

review of the global epidemiology of scrub typhus". PLoS Negl Trop Dis,

11(11): p. e0006062.

142. Yan, L., J. Zhou, Y. Zheng, A. S. Gamson, B. T. Roembke, S. Nakayama, and

H. O. Sintim, (2014),"Isothermal amplified detection of DNA and RNA". Mol

Biosyst, 10(5): p. 970-1003.

143. Zhao, X., L. R. Hilliard, S. J. Mechery, Y. Wang, R. P. Bagwe, S. Jin, and W.

Tan, (2004),"A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using

bioconjugated nanoparticles". Proc Natl Acad Sci U S A, 101(42): p. 15027-

32.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi

(Nhóm người khỏe mạnh)

Ký Họ và tên Năm Giới Bệnh Ngày lấy Kết quả xét STT hiệu sinh tính mẫu nghiệm IFA phẩm

tn1 Nguyễn Bá * huyết 1 1969 nam 01/2017 Âm tính thanh

huyết tn2 Phan Hồng * 2 1964 nữ 01/2017 Âm tính thanh

huyết tn3 Trịnh Thị * 3 1950 nữ 02/2017 Âm tính thanh

huyết tn4 Tưởng Thị * 4 1949 nữ 02/2017 Âm tính thanh

huyết tn5 Nguyễn Minh 5 1963 nam 02/2017 Âm tính * thanh

huyết 6 1977 nam 02/2017 Âm tính tn6 Nguyễn Phùng * thanh

huyết tn7 Hà Thị * 7 1947 nữ 02/2017 Âm tính thanh

huyết 8 1965 nữ 02/2017 Âm tính tn8 Lưu Thị Thanh * thanh

huyết tn9 Phạm Thị * 9 1964 nữ 02/2017 Âm tính thanh

huyết tn10 Đoàn Bảo * 10 1983 nữ 03/2017 Âm tính thanh

Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn

đoán phân biệt sốt mò

STT Vi khuẩn Kí hiệu Nồng độ (ng/µL) Tỉ lệ 260/280

1 Leptospira biflexa serovar B1 11.6 1.94

Patoc

2 Leptospira interrogan B2 8.5 2.17

serovar Pomona

3 Leptospira interrogan B3 10.2 1.77

serovar Australis

Dengue virrus B4 21.2 1.68 4

Pseudomonas aeruginosa B5 33 1.88 5

Acinetobacter baumannii 55.8 1.97 B6 6

Proteus mirabiles 20.4 2.11 B7 7

Enterobacter aerogenes 21.2 1.68 B8 8

Klebsiella pneumoniae 13.5 2.26 B9 9

10 E.coli B10 100.1 2.1

Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt

phát hiện O. tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm

nghiên cứu chế tạo

(Chứng nhận được cấp bởi Viện Kiểm định Quốc Gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế, Việt Nam)

Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O. tsutsugamushi

(Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

Lê Thị Thúy

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Lê Thị Thúy

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số

: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TT Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

1.

: Base pair

bp

2.

: Deoxyribonucleic acid

DNA

3.

: Kilo base

kb

4.

LAMP

: Loop-mediated isothermal amplification

5.

: Nucleic acid test

NAT

6.

: Polymerase chain reaction

PCR

7.

: Ribonucleic acid

RNA

8.

: Recombinase polymerase amplification

RPA

Đích

Kỹ thuật1

Nhiệt độ (℃)

Multip -lex

Tham khảo

Thời gian (phút)

Số lượng mồi

Nguồn hóa chất thương mại

Biến tính ban đầu2

FDA đã phê duyệt test3

HDA

RPA

NASBA

TMA

LAMP

RCA

SDA

NEAR

RMA

CPA

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 1 - Mở đầu

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 2 - Đặc điểm hình thái và cấu tạo tế bào vi sinh vật

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 3 - Phân loại và định danh vi sinh vật

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 4 - Các đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn và chất kháng sinh

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 5 - Di truyền vi khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 6 - Miễn dịch trong nhiễm khuẩn và khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 7 - Tụ cầu và liên cầu khuẩn

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 8 - Trực khuẩn lao và trực khuẩn phong

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 9 - Salmonella và E. coli

Bài giảng Căn bản vi sinh vật học: Bài 10 - Virus gây bệnh Rubella và viêm gan B

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã