Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây đu đủ đực (Carica Papaya L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN – 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Lan

Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới

sự hướng dẫn của cô giáo TS.Vũ Thị Lan. Mọi trích dẫn trong luận văn đều

ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực

và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những gì đã cam đoan ở trên.

Thái Nguyên, ngày 21 tháng 5 năm 2019

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hương Giang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc tới TS. Vũ Thị Lan - Giảng viên Khoa Công nghệ sinh học -

Trường Đại học Khoa học, cô đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ, chỉ

dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, bộ phận Sau Đại học, Trường

Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ

sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp

đỡ của các anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học

trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh ủng

hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này.

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất

mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ vô cùng quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 21 tháng 5 năm 2019

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hương Giang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ............................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3

1.1. Giới thiệu chung về cây đu đủ ................................................................... 3

1.1.1. Nguồn gốc ........................................................................................ 3

1.1.2. Phân loại .......................................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ .................................. 4

1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây đu đủ đực .............. 9

1.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................... 15

1.3. Tình hình nghiên cứu cây đu đủ bằng phương pháp nuôi cấy mô trên

thế giới và Việt Nam ....................................................................................... 20

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................. 20

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................. 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 24

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24

2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 24

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ..................................................... 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

2.2. Địa điểm và thời gian ............................................................................... 25

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy. ................................................... 25

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ........................................................ 25

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ................. 26

2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh .......................................................... 27

2.4. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................ 27

2.5. Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................ 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 28

3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng mẫu cấy ..................... 28

3.1.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu ....... 28

3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng ...................... 31

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (IAA,

NAA, BAP và NAA) đến khả năng hình thành mô sẹo.................................. 34

3.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo .......... 34

3.2.2. Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình

thành mô sẹo .................................................................................................... 35

3.3. Nghiên cứu tái sinh chồi từ mô sẹo .......................................................... 39

3.4. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi đu đủ đực ................................... 42

3.5. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi đu đủ đực ...................................... 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối

với ngọn đu đủ ............................................................................... 27

Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng

sau 2-4 tuần nuôi cấy ..................................................................... 30

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng tạo mô sẹo ................... 32

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình

thành mô sẹo (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................................... 34

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi

của callus đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy) .......................................... 38

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh

chồi đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................... 40

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA, α-NAA đến khả năng tạo rễ của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

chồi đu đủ đực ............................................................................... 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các loại cây đu đủ ....................................................................... 5

Hình 1.2 Các loại hoa đu đủ ....................................................................... 6

Hình 1.3 Cụm hoa lưỡng tính .................................................................... 7

Hình 1.4 Cụm hoa đơn tính cái ................................................................. 7

Hình 1.5 Cụm hoa đực ............................................................................. 7

Hình 2.1 Cây đu đực dùng trong nghiên cứu. ................................................. 23

Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng ............................................................ 30

Hình 3.2 Khử trùng mẫu với các độ tuổi khác nhau .................................. 33

Hình 3.3 Nuôi mô sẹo ............................................................................ 37

Hình 3.4 Chồi tái sinh từ mô sẹo .................................................................... 40

Hình 3.5 Nhân chồi ........................................................................................ 42

Hình 3.6 Tạo cây hoàn chỉnh .................................................................. 45

Hình 3.7 Rễ cây đu đủ đực in vitro ........................................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.8 Quy trình nhân giống cây đu đủ đực ......................................... 45

vii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

2,4 D 2,4 – Dichloro phenoxy acetic acid

B5 Gamborg’s

Cs Cộng sự

CT Công thức

CĐ Chế độ

ĐC Đối chứng

IBA Indole butyric acid

MS Murashige & Skoog (1962)

NAA - Naphthalene axetic acid

NC Nhân chồi

NC Môi trường nhân chồi

MS Môi trường tạo mô sẹo

TB Trung bình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

TC Môi trường tái sinh chồi

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc họ Caricaceae là loài cây ăn trái phổ

biến ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Đu đủ phân bố ở hầu hết các nước trên

thế giới thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Latin và Châu Úc. Đu đủ có nhiều

ưu điểm thích nghi với nhiều loại đất đai và khí hậu khác nhau, cây sớm cho

trái và mang trái quanh năm, hàm lượng chất dinh dưỡng cao đặc biệt là

vitamin A (cao gấp mười lần so với chuối, dứa và gần gấp đôi xoài). Cây đu

đủ là loài đa tính, có đu đủ đực, đu đủ cái và cây đu đủ lưỡng tính. Ở Việt

Nam cây đu đủ được trồng phổ biến, nhưng hiện nay ở nước ta cũng như trên

thế giới đều chú trọng trong việc phát triển cây đu đủ theo hướng cây cho

nhiều trái, trồng cây đu đủ cái và đu đủ lưỡng tính mà chưa quan tâm đến cây

đu đủ đực.

Đu đủ đực có nhiều ứng dụng về mặt dược liệu trong các bài thuốc

đông y cổ truyền. Các bộ phận của cây đu đủ đực có nhiều giá trị về mặt y

học. Hoa đu đủ đực là thành phần không thể thiếu trong các bài thuốc đông y

chữa các bệnh như ho, viêm họng, mất tiếng, viêm cuống phổi, ho gà, chữa

tiểu dắt, tiểu buốt, đau niệu đạo, nước tiểu ít và đỏ. Lá của cây đu đủ đực

dùng rửa vết thương, tẩy vết máu trên quần áo, vải. Rễ của cây đu đủ đực

chữa rắn cắn, cá đuối cắn.... Đu đủ rất giàu enzyme tự nhiên, dễ dàng thấm

sâu vào làn da giúp đẹp da, mau lành các tổn thương trên da. Đu đủ cũng có

tác dụng tẩy tế bào da chết, hồi phục sự tươi trẻ cho làn da. Chính vì vậy, cây

đu đủ rất có giá trị về mặt kinh tế cũng như giá trị y học, giúp cải thiện đời

sống người nghèo vùng nông thôn.

Hiện nay, các giống đu đủ của Việt Nam cũng như trên thế giới đều rất

dễ bị nhiễm các bệnh virus. Malaysia đã phải đối mặt với tình trạng cây đu đủ

chết do bị nhiễm nhiều loại bệnh như: khảm đu đủ, bệnh phấn trắng, thối rễ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

do nấm..., có đến 800 ha cây đu đủ bị chết đã khiến cho nền kinh tế nước này

bị thiệt hại tới 58 triệu USD hàng năm [54]. Các nhà khoa học đã nghiên cứu

xác định được các loại virus gây bệnh ở đu đủ như bệnh khảm lá, virus gây

bệnh đốm vòng, virus gây bệnh quắt ngọn làm cho cây tàn lụi nhanh, giảm

năng suất, sản lượng nghiêm trọng ở hầu hết các nước trên thế giới. Mặt khác

giá thành hạt giống đu đủ nhập nội cao. Trong khi đó việc lai hữu tính và

nhân giống bằng hạt đã làm phân ly các đời sau, mất dần các đặc tính tốt của

cây bố mẹ dẫn đến thoái hóa giống. Đã có những nghiên cứu như lai tạo để

chọn ra giống mới chống chịu bệnh đốm vòng (Siar và cộng sự, 2005; Chan

2005); chuyển gen kháng bệnh đốm vòng vào cây đu đủ (Drew và cộng sự,

2005) hoặc sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro để sản xuất cây đu đủ

sạch bệnh [31], [34], [53], tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về

nhân giống cây đu đủ đực để phục vụ cho nhu cầu sản xuất dược liệu.

Với sự phát triển của công nghệ tế bào thực vật, trong đó phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vật đã cho thấy rõ những ưu điểm của nó là tạo ra

nguồn cây giống sạch bệnh, sinh trưởng, phát triển khỏe, độ đồng đều và hệ

số nhân giống cao. Đây là giải pháp lựa chọn phù hợp để tạo ra nguồn cây

giống đu đủ đực sạch bệnh cung cấp cho nhu cầu cây giống trong sản xuất

dược liệu ngày càng tăng hiện nay.

Chính vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây đu đủ đực (Carica Papaya L.)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Nhân giống thành công cây đu đủ đực bằng phương pháp nuôi cấy mô

tế bào nhằm cung cấp nguồn cây giống cho nhu cầu sản xuất dược liệu.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu cấy.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng đến khả

năng tạo mô sẹo.

- Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây đu đủ

1.1.1. Nguồn gốc

Cây đu đủ có tên khoa học là: Carica papaya, cây có nguồn gốc ở

vùng đất thấp từ miền nam Mexico qua miền đông Trung Mỹ và bắc Nam Mỹ.

Được người Tây Ban Nha đưa tới Philipin vào khoảng năm 1550. Từ đây cây

được đưa vào khu vực nhiệt đới châu Á, châu Phi. Hiện nay cây đu đủ phân bố ở

hầu hết các nước trên thế giới thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ Latin và Châu

Úc.Ở Việt Nam, đu đủ được trồng rộng rãi trong phạm vi cả nước.

Cây đủ đủ là cây rất quen thuộc được trồng ở khắp mọi nơi, từ một vài

cây quanh nhà, bờ đê đến xen canh cây lâu năm. Cây đu đủ còn có tên gọi

khác là phan qua thụ, phiên mộc, mác rẩu (dân tộc Tày) [14]. Xét về mặt giới

tính, đu đủ có ba loại giới tính là:cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Cây đu

đủ đực có nhiều ứng dụng về mặt dược liệu trong các bài thuốc đông y cổ

truyền, tuy nhiên hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về loại cây đu đủ đực

này. Các giống được trồng hiện nay chủ yếu là giống địa phương đã bị lai tạp

nhiều nên không còn giữ đúng đặc tính ban đầu của giống.

1.1.2. Phân loại

Cây đu đủ được phân loại theo quyển Medicinal- Plants (1887) của

Koehler như sau:

Tên Việt Nam: Đu Đủ

Danh pháp hai phần Carica papaya L.

Loài: C.papaya

Chi Carica

Họ: Đu đủ Caricaceae

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Bộ: Brassicales

Lớp: Hai lá mầm

Nhiều loài đu đủ khác cũng được trồng ở một vài nơi để lai tuyển

chọn giống như: C. candamarcencis Hook (đu đủ núi); C. cundinamarcensis

Linden; C. quercifolia Benth and Hook (đu đủ lá cây giẽ); C. chryso pétala

Heilb; C. pentagona Heilb (đu đủ năm góc, còn có tên là Babacao, tái dài,

không hột, ruột vàng, mùi vị giống như dưa gang tây (melon); C.

microcarpa Jacq (đu đủ nhỏ trái); C. cauliflora Jacq; gracilis Sohms; C.

perythrocarpa Linden and André [17].

1.1.3. Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ

a) Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây đu đủ

Đu đủ (Carica papaya L.). Loài cây ăn quả thuộc họ đu đủ

(Caricaeae). Cây thân cột mềm, mang nhiều sẹo lá to; lá lớn, tập trung ở đỉnh,

cuống dài rỗng, phiến lá xẻ thùy chân vịt; toàn cây có nhựa mủ trắng đục. Hoa

tạp tính: trên cùng một cây có hoa đực và hoa lưỡng tính hoặc hoa cái và hoa

lưỡng tính [9].

Đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây

lưỡng tính và cây cái. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết

gây ra ví dụ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ. Nhiệt độ càng cao thì khuynh

hướng sản xuất hoa đực càng lớn. Đu đủ đực chỉ mang toàn hoa đực trên phát

hoa. Phát hoa có cuống dài và phân nhánh. Hoa đực không cuống, nhỏ, đường

kính 0,4 - 0,5 cm, dài 4-5 cm, không bầu noãn, có 10 nhị đực với 2 túi phấn

trên mỗi nhị [10].

Hoa của đu đủ: hoa trắng nhạt hay xanh nhạt, khác gốc. Hoa đực mọc ở

kẽ lá thành chùy có cuống hoa rất dài. Hoa cái có tràng dài hơn tràng của hoa

đực, mọc thành chùy ở kẽ lá. Theo khung phân loại của Storey (1941), hoa đu

đủ được chia ra thành 6 kiểu cơ bản:

Hoa đơn tính cái: có bầu nhụy và không có nhị đực.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Hoa lưỡng tính 5 nhị (pentandria) có 5 chỉ nhị, bầu nhụy có 5 rãnh.

Hoa lưỡng tính dị hình (carpelloid) có từ 6 đến 9 nhị, bầu nhụy có rãnh dị hình.

Hoa lưỡng tính thon dài (elongata) có bầu nhụy kéo dài, bề mặt

trơn, phẳng.

Cây đu đủ đực

Cây đu đủ cái

Cây đu đủ lưỡng tính

Hoa lưỡng tính nhụy thoái hóa (barren) có 10 nhị, không có bầu nhụy.

Hình 1.1. Các loại cây đu đủ

Theo phân loại của Oschae và cộng sự (1975), trích trong tài liệu của

Singh (1990), cụm hoa đu đủ được phân thành 3 nhóm: Cụm hoa đơn tính cái

(cụm hoa ngắn, chỉ mang hoa đơn tính cái), cụm hoa lưỡng tính (cụm hoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

ngắn, có thể mang hoa lưỡng tính 5 nhị, hoa lưỡng tính thon dài, hoa lưỡng

tính bất dục và hoa lưỡng tính dị hình), Cụm hoa đực (cụm hoa có cuống dài,

mang chủ yếu là hoa đực, có thể mang một vài hoa lưỡng tính thon dài ở đầu

Hoa đơn tính cái

Hoa lưỡng tính năm nhị

Hoa lưỡng tính dị hình

Hoa lưỡng tính thon dài

Hoa đực

Hoa lưỡng tính bất dục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

ngọn cành hoặc nhánh của cụm hoa).

Hình 1.2. Các loại hoa đu đủ [7]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.3. Cụm hoa lưỡng tính ( B1 – B4) [7].

Hình 1.4. Cụm hoa đơn tính cái ( A1, A2) [7].

Hình 1.5. Cụm hoa đực (C1, C2) [7].

Quả đu đủ: Quả thịt, hình trứng to, dài 20-30 cm, đường kính 15-20

cm. Thịt quả dày, lúc đầu có màu xanh lục, sau ngả màu vàng cam. Trong

ruột quả có rất nhiều hạt đen to bằng hạt tiêu, xung quanh có lớp nhầy [13].

Thân, rễ: đu đủ thuộc loại thân mềm, bản mộc, thân già có màu xám xanh,

nâu xám hay nâu đỏ. Thân mang nhiều sẹo lá, sẹo phát hoa và dễ bị bọng ruột.

Độ bọng ruột càng lớn khi cây càng già, do đó dù thân có đường kính khá lớn

(đôi khi đường kính đạt 15-20cm) nhưng khá giòn và mọng nước nên cây dễ

bị gió mạnh làm gãy cây. Hầu hết rễ đu đủ đâm nhánh ngang mạnh khi gặp

điều kiện thuận lợi, nhưng mọc xuống sâu kém, rễ mềm và rất sợ đọng hoặc

úng nước.

b) Đặc điểm sinh thái của cây đu đủ:

Cây đu đủ phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ấm và ẩm, lượng mưa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

100mm/tháng, không bị che bóng mát. Đu đủ rất nhạy cảm với nhiệt độ và ẩm

độ, khi nhiệt độ cao 30-35oC hoặc ẩm độ cao, lượng mưa nhiều 250-

300mm/tháng, cây sẽ sinh trưởng kém. Nhiệt độ dưới 0oC làm cây chết, hư

hại nặng nề. Nếu tưới quá nhiều nước thì rễ, lá bị hư hại nhiều, cây phát triển

chậm, yếu. Cây đu đủ không chịu đựng được gió to. Đu đủ dễ tính có thể

trồng trên đất có độ chua thích hợp pH từ 5,5- 6,5. Đất trồng đu đủ phải giàu

chất hữu cơ, tơi xốp, đất không hoặc ít phèn, thuận tiện cho việc tưới nước và

thoát nước tốt khi có mưa lớn. Vùng đồng bằng phải lên luống thật cao và

đường mương thoát nước phải sâu để dễ thoát nước. Chuẩn bị đất: Đất trước

khi trồng nên đánh luống rộng 2-2,5m. Giữa các luống có rãnh sâu 30cm để

thoát nước.

Thời vụ: Đu đủ có khả năng trổ hoa và đậu trái quanh năm, tuy nhiên

hạn chế sâu bệnh có thể bố trí trồng đu đủ vào đầu mùa mưa (tháng 4-5).

Những vùng chủ động tưới tiêu trồng vào cuối mùa mưa (tháng 10- 11) [5].

1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây đu đủ đực

Thành phần hóa học của đu đủ: Trong các thành phần của cây như thân,

rễ, lá đều chứa một chất nhựa mủ (latex). Trong nhựa mủ có enzyme papain,

các axit amin: leuxin, tyrosin, chất béo, axit malic và enzyme thủy phân,

enzyme papain có tác dụng phân giải các chất đạm, protein để giải phóng các

axit amin như alanin, arginin, tryptophan. Tác dụng phân huỷ các chất đạm

của enzyme papain tiến hành ở môi trường axit, trung tính hoặc hơi kiềm, tốt

nhất ở pH 6,4-6,5. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme khá cao, có

thể tới 80-85oC, nhưng cao hơn 90oC sẽ mất hoạt tính. Ở nhiệt độ thường, khi

cho enzyme papain tiếp xúc với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng mất tính

sánh sền sệt. Trong lá, hạt (chủ yếu ở lá) có một chất ancaloit đắng gọi là

cacpain và glucoxit gọi là cacpozit. Cacpain kết tinh dưới dạng khối lăng trụ

đơn (prisme monoclinique) nóng chảy ở 121oC, không tan trong nước, tan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

trong các dung môi hữu cơ. Tác dụng của cacpain gần như digitalin là thuốc

trợ tim. Trong hạt và các bộ phận khác, người ta còn thấy các tế bào chứa

myrozin và các tế bào khác chứa kali myronat. Khi giã hạt với nước, myrozin

và kali myronat tiếp xúc với nhau sẽ cho tinh dầu có mùi diêm sinh, hắc giống

chất isothioxynat alyl. Trong rễ, người ta thấy có nhiều kali myronat, trong lá

nhiều myrozin, trong vỏ hạt nhiều myrozin và không có kali myronat. Theo

Hooper hạt đu đủ có: 26,3% dầu; 24,3% chất anbuminoit; 17% sợi; 15,5%

hydrat cacbon; 8,8% tro và 8,2% nước [13].

Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của

đu đủ như: Khảo sát tinh sạch Enzyme Chymopapain trong mủ trái đu đủ Việt

Nam [18]; Nghiên cứu hoạt tính sinh học của flavonoid từ lá đu đủ cho thấy

hàm lượng flavonoid chiếm khoảng 0,78 % trọng lượng lá khô. Ngoài tác

dụng kháng khuẩn các flavonoid còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển và

tiêu diệt tế bào ung thư biểu mô người mà không gây tác hại xấu đối với tế

bào lympho bình thường [11]. Hồ Thị Hà và cộng sự đã phân lập và xác định

cấu trúc hóa học, đồng thời đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, kháng khuẩn

và chống oxy hóa của hợp chất alkaloid mới được đặt tên là

Carpainone (1) từ lá cây Đu đủ [5].

Từ xa xưa, ông cha ta đã biết dùng các thành phần của cây đu đủ đực để

chữa bệnh. Vị của lá và hoa đu đủ đực rất đắng nhưng vẫn hoàn toàn có thể

dùng nấu canh ăn hoặc làm rau trộn gỏi...

Tác dụng dược lý của các thành phần của cây đu đủ như sau: Enzyme

papain có tác dụng như enzyme pepsin của dạ dày và nhất là giống enzyme

trypsin của tụy tạng trong sự tiêu hóa đạm. Enzyme papain làm cho một số vi

khuẩn Gram dương và Gram âm ngừng phát triển. Những vi khuẩn như

Staphylococci, vi khuẩn Salmonella rất nhạy cảm đối với tác dụng của papain.

Papain còn có tác dụng làm đông sữa và tác dụng giảm độc đối với toxin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

và toxanbumin. Chất cacpain làm chậm nhịp tim, có người đã dùng thay thế

thuốc chữa tim. Gần đây, người ta đã phát hiện thấy hạt đu đủ có chất kháng

sinh mạnh [13].

Hoa đu đủ đực trị ho cho trẻ sơ sinh và người lớn là cách chữa trị ho

được lan truyền rộng dãi trong dân gian và được rất nhiều người tin dùng.

Hoa đu đủ đực trị ho hiệu suất cao và bảo đảm an toàn đặc biệt là cho trẻ sơ

sinh. Hoa đu đủ đực trị ho có phản ứng rất nhanh, với nguyên vật liệu dễ tìm

kiếm và hoàn toàn có thể phối kết hợp với nhiều loại thảo dược khác để tạo

nên một hỗn hợp trị ho hiệu quả.

Theo tài liệu Rau ngon thuốc quý của nhà xuất bản Dân trí (năm 2015)

[14], bác sỹ Đoàn Lư đã sưu tầm được bốn bài thuốc đông y có thành phần

chính là hoa đu đủ đực chữa ho như sau:

Bài thuốc 1: Hoa đu đủ đực 30g nấu lấy nửa chén nước, hòa tan với

đường cho trẻ em uống ngày 2 lần.

Bài thuốc thứ 2: Hoa đu đủ đực 20g, tẩm mật sao, bách bộ 12g, phèn phi

12g. Tất cả tán nhỏ, rây bột mịn. Trẻ em 1-5 tuổi ngày uống 3 lần, mỗi lần 1-

4g. Trẻ 6-10 tuổi mỗi lần 5-8g.

Bài thuốc thứ 3: Hoa đu đủ đực 15g, trần bì 20g tẩm nước gừng, sao, lá

lốt 40g, nghệ vàng 15g, chua me đất hoa vàng 30g, cam thảo đất 20g, lá chanh

non 30g, rau má 40g, vỏ rễ dâu 30g tẩm mật sao vàng, vỏ cây khế chua 30g

sao vàng. Sắc với 400ml nước còn 100ml, chia 2 lần uống trong ngày.

Dùng 5-7 ngày.

Bài thuốc thứ 4: Hoa đu đủ đực 50g, dây tơ hồng 50g, rau má 35g, lá

xương sông 20g, lá hẹ 15g. Tất cả sắc với 1500ml lít nước còn 500ml. Lọc,

thêm 75g đường trắng. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 100ml.

Ho gà là đường hô hấp bị nhiễm trùng bởi một loại vi khuẩn có tên là

Bordetella, căn bệnh này nguy hiểm và nó xảy ra ở mọi lứa tuổi, chính vì như

vậy chúng ta rất cần được điều trị thật sớm, cũng như cần điều trị dứt điểm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Trị ho bằng hoa đu đủ đực phối kết hợp một số ít loại thảo dược, sẽ đem đến

lợi ích lớn trong công việc điều trị dứt điểm bệnh ho gà. Theo tài liệu Đông y

trị bách bệnh của nhà xuất bản Văn hóa- thông tin năm 2009 [19], Ngọc

Phương và Hồng Hà đã sưu tầm được bài thuốc làm cao ho gà chữa trẻ em

mắc bệnh ho gà mà thành thần cao có chứa hoa đu đủ đực sấy khô. Bài thuốc

như sau: Tang bạch bì 100g, lá chanh tươi 100g, lá táo tươi 100g, cỏ sữa nhỏ

lá tươi 100g, hoa đu đủ đực khô 50g, gừng tươi 50g, củ sả tươi 50g, đường

kính 800g. Các vị thái nhỏ sao vàng hạ thổ. Cho nước đường, nấu lấy 1000ml

cao lỏng. Trẻ em dưới 5 tuổi mỗi lần uống 5ml cao. Ngày uống 2 lần, khi

uống hòa với ít nước chín.

Hoa đu đủ đực trị ho mất tiếng hiệu quả khi kết hợp với hạt chanh và lá

hẹ. Với việc phối kết hợp giữa hoa đu đủ đực trị ho, lá hẹ, hạt chanh và đường

phèn, hỗn hợp này không những hỗ trợ cho trẻ em và người lớn trị được ho,

mà còn hỗ trợ chữa cuống phổi bị viêm, giải quyết và khắc phục tình trạng

mất tiếng, khản giọng rất hiệu quả. Bài thuốc chữa viêm thanh quản gồm: Hoa

đu đủ đực 15g lá hẹ 15g, hạt chanh 10g, nước đun sôi để nguội 20ml. Các

dược liệu được nghiền nát với nước. Thêm ít mật ong hoặc đường kính, uống

làm 3 lần trong ngày. Dùng vài ngày. Bài thuốc chữa viêm họng: Hoa đu đủ

đực 15g, xạ can 10g, củ mạch môn 10g, lá húng chanh 10g. Tất cả cho vào

một bát nhỏ, thêm ít muối, hấp chín rồi nghiền nát [14] . Chữa ho khản tiếng:

Hoa đu đủ đực tươi 12g, đường phèn 50g. Hoa đu đủ đực tươi sao vàng thơm,

đem đun cách thủy với đường phèn. Chia uống dần trong ngày [3].

Hoa đu đủ đực ngoài được sử dụng để chữa các bệnh về đường hô hấp

còn được sử dụng làm thành phần chữa bệnh viêm đau niệu đạo: Hoa đu đủ

đực 40g phối hợp với lá bạc thau 60g, đậu đen 40g, phác tiêu 4g. Sắc lấy nước

đặc uống làm ba lần vào lúc đói [14].

Theo như tài liệu Chữa bệnh bằng cây, củ, quả của nhà xuất bản Y học

năm 2005 đã đưa ra bài thuốc sử dụng hạt đu đủ để chữa bệnh gai cột sống.

Bài thuốc như sau: Hạt đu đủ đem xát cho sạch phần nhớt bao quanh, giã nát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

trong túi vải rồi đắp lên vùng đau. Mỗi lần chỉ đắp tối đa 30 phút và theo dõi

để tránh bị bỏng. Ngày làm một lần, liên tục trong 20-30 ngày [6].

Hạt đu đủ có chứa chất phytochemical nephroprotective và có hữu ích

trong việc ngăn ngừa tổn thương thận gây ra bởi paracetamol (Thử nghiệm

trên chuột) [38]. Hạt đu đủ có tác dụng trong tránh thai (Thử nghiệm trên

chuột) [22].

Cây đu đủ đực không chỉ cho hoa đực và hạt làm thuốc mà rễ của cây đu

đủ đực cũng được sử dụng để chữa bệnh rắn cắn. Bài thuốc như sau: Rễ đu đủ

đực 20g, lá xuyên tiêu 10g, hồng bì 5 hạt. Tất cả giã nhỏ, thêm nước, gạn

uống, bã đắp [14]. Rễ đu đủ sắc uống làm thuốc cầm máu trong bệnh băng

huyết, bệnh sỏi thận [13]. Bên cạnh đó rễ của cây đu đủ còn được dùng để

chữa cá đuối cắn. Bài thuốc như sau: Rễ đu đủ tươi 30g, muối ăn 4g. Hai thứ

giã nhỏ. Vắt lấy nước uống, bã đắp lên chỗ sưng đau. Sau chừng nửa giờ thấy

giảm đau vài ngày sau khỏi hẳn (kinh nghiệm nhân dân miền Nam) [14].

Lá của đu đủ dùng gói những thịt gà cứng để khi nấu chóng mềm, dừ.

Nước sắc lá đu đủ dùng giặt những vết máu trên vải và quần áo, hoặc để rửa

vết thương, vết lở loét. Thái lá đu đủ cho nhỏ rồi trộn với thóc cho ngựa, bò

ăn để chữa bệnh biếng ăn ở bò ngựa [13]. Nước ép lá của đu đủ còn được sử

dụng cho điều trị bệnh sốt xuất huyết. Nghiên cứu của Varisha cho thấy nước

ép lá đu đủ có thể làm trung gian giải phóng tiểu cầu để điều trị và phòng

ngừa sốt xuất huyết [22], [50].

Dịch chiết xuất từ lá đu đủ làm giảm quá trình tan máu hồng cầu do

hydro peroxide gây ra [43]. Dịch chiết xuất từ lá đu đủ còn được chứng minh

có tác dụng chống lại các tổn thương oxy hóa gây ra bởi chì acetate trong tủy

xương và có hiệu quả tốt đối với bệnh tan máu hồng cầu [56]. Hoạt tính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

chống co thắt được quan sát thấy trong chiết xuất thô ethyl acetate từ lá đu đủ

[32]. Ngoài ra dịch chiết xuất từ lá đu đủ còn có tác dụng bảo vệ chức năng

của thận [27], tiềm năng chống lại bệnh sốt xuất huyết [21] .

Nghiên cứu này cho thấy rằng dịch chiết của đu đủ có tác dụng hạ

đường huyết và chống oxy hóa; nó cũng cải thiện hàm lượng lipid ở chuột bị

tiểu đường. Ngoài ra, chiết xuất lá ảnh hưởng tích cực đến tính toàn vẹn và

chức năng của cả gan và tuyến tụy. Chiết xuất nước của Carica đu đủ (0,75g

và 1,5g/100 mL) làm giảm đáng kể lượng đường trong máu (p <0,05) ở chuột

mắc bệnh tiểu đường. Nó cũng làm giảm nồng độ cholesterol, triacylglycerol

và amino-transferase trong máu. Nồng độ insulin huyết tương thấp không

thay đổi sau khi điều trị ở chuột bị tiểu đường, nhưng chúng tăng đáng kể ở

động vật không mắc bệnh tiểu đường. Các tế bào đảo tụy là bình thường ở

động vật được điều trị không mắc bệnh tiểu đường, trong khi ở chuột được

điều trị tiểu đường, C. đu đủ có thể giúp tái sinh đảo nhỏ biểu hiện như bảo

tồn kích thước tế bào. Trong gan của chuột được điều trị tiểu đường, C. đu đủ

đã ngăn chặn sự phá vỡ tế bào gan, cũng như tích lũy glycogen và lipid. Cuối

cùng, tác dụng chống oxy hóa của C. đu đủ chiết xuất cũng được phát hiện ở

chuột mắc bệnh tiểu đường [28].

Chiết xuất từ đu đủ có thể làm thay đổi sự phát triển của một số loại tế

bào ung thư [39], chống các khối u và điều hòa miễn dịch cơ thể [44]. Kết quả

xét nghiệm cho thấy so với thuốc sắc, nước ép lá không chỉ thể hiện tác dụng

gây độc tế bào mạnh hơn đối với tế bào ung thư SCC25, mà còn tạo ra hiệu

quả chọn lọc ung thư đáng kể như các xét nghiệm trên các tế bào keratinocyte

không gây ung thư ở người. Hơn nữa, bằng chứng từ việc thử nghiệm nước ép

lá ủ trên hai dòng tế bào này cho thấy rõ tác dụng chọn lọc của lá đu đủ đối

với tế bào ung thư SCC25 [40]. Chiết xuất từ lá đu đủ có tác dụng chống tăng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

sinh các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới [46], chống ung thư

thông qua cơ chế chống tăng sinh và cảm ứng apoptosis trên tế bào ung thư vú

ở người MCF-7 [41]. Dịch chiết đu đủ và chất phytochemical liên quan đến

đu đủ có đặc tính chống viêm và điều hòa miễn dịch [33], [45], phần pectin

hòa tan chelate từ bột đu đủ tương tác với galectin-3 và ức chế sự tăng sinh tế

bào ung thư đại tràng [49]. Dịch chiết metanlo từ hạt đu đủ có hiệu quả tránh

thai tốt ở chuột [23]. Chế phẩm chiết xuất từ rễ cây đu đủ có tiềm năng điều

trị như là một chất bổ sung có thể được áp dụng trong ngộ độc thạch tín [42].

Nhựa của cây đu đủ dùng để chữa chai chân và mụn cơm: Bài thuốc như

sau: Rửa sạch chai chân hay mụn cơm, dùng kim sạch khêu nhẹ vết chai chân

hay mụn cơm, sau đó lấy nhựa đu đủ bôi lên băng lại. Nhựa đu đủ sẽ ăn mòn

vết chai chân hoặc mụn cơm [3]. Nhựa, mủ đu đủ có hiệu quả trong việc điều

trị sốt xuất huyết, giun kim [24]. Protein cysteine của đu đủ có tác dụng chống

giun sán (Nghiên cứu ở lợn) [29], papain trong mủ đu đủ có tác dụng giúp

kiểm soát các bệnh ký sinh trùng [35]. Các sản phẩm thu được từ đu đủ lên

men có tác dụng chống độc và miễn dịch (Đã thử nghiệm trên người) [37].

1.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng

để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô

trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác

định [1].

1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Tính toàn năng của tế bào (Totipotency): Mỗi tế bào của bất kỳ cơ

thể sinh vật nào đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể đó có khả

năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi; Tính toàn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

năng của tế bào thực vật: Là khả năng của tế bào đã biệt hóa có khả năng thể

hiện toàn bộ thông tin di truyền và có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

trong điều kiện thuận lợi giống như chu trình phát triển của phôi.

Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra giả thiết về tính toàn năng của tế

bào thực vật. Ông cho rằng tất cả tế bào đều có tính toàn năng

(totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di

truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh

khi gặp điều kiện thuận lợi [8]. Nhưng phải đến năm 1922 tính toàn năng

của tế bào mới được chứng minh bằng thực nghiệm nhờ thí nghiệm nuôi

cấy thành công đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo của Kotte

và Robbins. Và sau đó 43 năm (1965) Vasil và Haberlandt đã nuôi từng tế

bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong

ống nghiệm. Kết quả này đã chứng minh toàn diện tính toàn năng của tế

bào [2].

Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào:

Sự phân hóa: là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào

của các mô chuyên hóa đảm nhiệm các chức năng khác nhau nhưng chúng

đều có từ nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa tế

bào để hình thành các mô riêng biệt; Phản phân hóa: Khi các tế bào đã

phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về

trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi.

Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là quá trình hoạt

hóa của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể thì

một số gen được hoạt hóa và một số gen khác bị ức chế. Điều này đươc xảy

ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA. Khi

nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh gế bào giữa các tế bào có sự ức chế lẫn

nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

gen được hoạt hóa dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen

để hình thành các thể mới. Đây chính là cơ sở khoa học là nền tảng cho kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào.

Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân

sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản rất dễ xảy ra quá trình biệt hóa. Vì vậy,

theo Galson và Murashige thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các

tế bào thực vật lại giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [1], [2], [8].

1.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định

cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.

1.2.2.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a) Điều kiện vô trùng:

Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác

với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

- Vô trùng thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ được hấp ướt ở 121oC trong

30 phút; sấy khô ở nhiệt độ 90oC trong 2 giờ; sấy tiệt trùng 180oC trong 1

giờ. Thiết bị sử dụng: Nồi hấp, tủ sấy, box cấy vô trùng.

- Vô trùng mẫu: Sử dụng hóa chất cồn tuyệt đối, thủy ngân HgCl2 0,1%.

b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH

Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình

thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ

ánh sáng. Cường độ ánh sáng được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại

mô là từ 1000-2500 lux. Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng

của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashege, 1977).

Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng

và chất lượng bình nuôi cấy [8].

Nhiệt độ thích hợp: Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển

ở các loài là không như nhau. Tuy nhiên trong thực tế phòng thí nghiệm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

nhiệt độ thường được duy trì trong khoảng từ 25-28oC.

Độ pH của môi trường: Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh

hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường

vào tế bào. Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,5 – 6,0 trước

khi khử trùng. Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị

cứng và nếu thấp hơn 5,0 thì agar khó đông [2], [8].

1.2.2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát

triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi

trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ

theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa

dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường

nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau:

Thành phần khoáng: Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường

dinh dưỡng nuôi cấy mô - tế bào thực vật được chia thành hai nhóm theo

hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng. Nhóm đa lượng:

gồm các nguyên tố như Nitơ, lưu huỳnh, photpho, magiê, canxi. Chúng đặc

biệt cần thiết đối với quá trình sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào.

Nhóm vi lượng gồm các nguyên tố như sắt, mangan, bo, molypden… là

nhóm nguyên tố được sử dụng với nồng độ rất nhỏ nhưng lại không thể

thiếu đối với sự phát triển của mô – tế bào [8].

Nguồn cacbon: Phần lớn mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống

theo phương thức dị dưỡng vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn

cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng hiện nay là

sucrose. Nồng độ thích hợp là 2-3% song cũng còn phụ thuộc vào mục đích

nuôi cấy mà thay đổi. Ngoài ra còn có thể sử dụng một số nguồn cacbon

khác như glucose, maltose, fructose…Các loại rượu như glycerin cũng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

được tế bào sử dụng. Manitol hoặc sorbitol còn có thể được sử dụng trong

nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp

suất thẩm thấu [2], [8].

Vitamin: Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in

vitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường

không đủ về lương, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là

các vitamin thuộc nhóm B như: B1, B3, B5, B6, meso-inosit… rất cần thiết

cho các phản ứng sinh hóa [8].

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Trong môi trường nuôi cấy mô

– tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả

nuôi cấy là các chất điều khiển sinh trưởng, thuộc các nhóm sau:

+ Auxin: Có 4 loại auxin thường được sử dụng là: Indole acetic acid

(IAA), Naphthylacetic acid (NAA), 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D),

Indol butyric acid (IBA). Chúng chủ yếu có tác dụng kích thích sinh trưởng

của tế bào nhưng cũng làm phân bào.

+ Cytokinin: Là nhóm các phytohormone dẫn xuất của adenin.

Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa của các cơ

quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô

sẹo nuôi cấy. Các loại cytokinin thường dùng trong môi trường nuôi cấy là

kinetin, 6-Benzylaminopurin (BAP). Ngoài ra còn có Zeatin nhưng nó ít

được sử dụng trong nuôi cấy vì giá thành quá đắt.

+ Gibberellic acid: Tới nay đã phát hiện được trên 60 loại thuộc

nhóm gibberellic acid. Loại thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3.

Trong cơ thể thực vật, gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều

quá trình sinh lý như: Sinh lí ngủ nghỉ của hạt và chồi, phát triển của hoa,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật.

+ Abscisic acid: Abscisic acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chế

sinh trưởng. ABA có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào

thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào

môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định [2], [8], [12].

Các hỗn hợp chất tự nhiên: Sự bổ sung thêm một số các hỗn hợp

dinh dưỡng tự nhiên như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mì, dịch chiết nấm

men, dịch thủy phân casein…vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sự

sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy [8].

Chất độn- thạch (Agar): Agar là thành phần quyết định trạng thái vật

lí của môi trường. Hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động 0,6 – 1,0

% theo khối lượng. Tuy nhiên còn tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy

mà sử dụng cho phù hợp [2], [8].

Nước: Nước là thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy.

Nước pha môi trường nuôi cấy thường là loại nước cất 2 lần [8].

1.3. Tình hình nghiên cứu cây đu đủ bằng phương pháp nuôi cấy mô trên

thế giới và Việt Nam

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1994 Mondal và các cộng sự đã nghiên cứu cải tiến kỹ thuật nhân

giống in vitro cây đu đủ bằng phương pháp nuôi cấy tái sinh mô sẹo từ cuống

lá, thân và rễ của cây đu đủ con. Môi trường nuôi cấy được bổ sung IBA 2,0

mg/l và BAP 0,5 mg/l. Cây con được sử dụng là những cây sạch bệnh được

nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Số lượng chồi nhiều nhất thu được từ mô

sẹo có nguồn gốc phát sinh từ rễ trong môi trường MS bổ sung IBA 0,5 mg/l

và Kinetin từ 1 mg/l đến 2 mg/l. Sự hình thành rễ được tạo ra trong môi

trường MS 1/2 bổ sung IBA 2 mg/l. Cây con invitro đã được thuần dưỡng và

đưa ra trồng ở môi trường tự nhiên [34].

Năm 2003, McCubbin và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến kỹ thuật nhân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

giống cây đu đủ trong ống nghiệm. Khi bổ sung than hoạt tính với hàm lượng

3g/l ở bước trung gian trước khi ra rễ làm giảm hiệu ứng độc của cytokinin do

việc sử dụng lâu dài [31].

Năm 2012, Roy Và cộng sự đã nghiên cứu về sự di truyền của cây đu đủ

thông qua nuôi cấy in vitro. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy một số lượng lớn

chồi được tái sinh từ nụ bên và lá non của đu đủ trên môi trường MS được bổ

sung zeatin 1,0 mg/l và NAA 0,2 mg/l. Bổ sung casein hydrolylate (CH) 200

mg/l và than hoạt tính 2,0 g/l vào môi trường nuôi cấy sẽ tạo được môi trường

phù hợp cho lá phát triển. Trong khi đó, khi bổ sung ure 100 mg/l và than hoạt

tính 2,0 g/l vào môi trường nuôi cấy sẽ tạo được môi trường phù hợp cho sự

kéo dài chồi. Môi trường tốt nhất cho sự ra rễ là môi trường có bổ sung IBA

4,0 mg/l. Sau bốn tuần theo dõi 90% số chồi ra rễ, đạt được 12 – 14 rễ/ chồi.

Khi đưa ra môi trường ngoài có 84% cây con phát triển tốt [52] .

Năm 2013, Mumo và cộng sự đã nghiên cứu quy trình tái sinh cây đu đủ

Kenya trong ống nghiệm bằng cách sự dụng vật liệu là chồi cây đu đủ. Kết

quả nghiên cứu đã cho thấy: Môi trường nhân chồi tốt nhất là MS có bổ sung

BAP 0,5 mg/l và NAA 0,1 mg/l.; Môi trường có hàm lượng IBA 2,5 mg/l có

tỷ lệ cảm ứng ra rễ tốt nhất với số lượng rễ và chiều dài rễ cao nhất [36].

Năm 2015, Setargie và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình nhân giống

in vitro cây đu đủ. Nghiên cứu này đươc tiến hành để cải tiến cho quy trình

nhân giống in vitro cây đu đủ lưỡng tính (Carica papaya L.) từ chồi non trước

đó. Trong nghiên cứu này, môi trường MS có bổ sung các nồng độ auxin và

cytokinin khác nhau, từ đó đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ auxin và

cytokinin đến việc tạo môi trường phù hợp cho việc tái sinh chồi trong điều

kiện in vitro. Môi trường phù hợp nhất cho mô sẹo tái sinh chồi là môi trường

MS có bổ sung BAP 1mg/l và NAA 0,5 mg/l. Tại môi trường MS có bổ sung

BAP 1,0 mg/l và NAA 0,5 mg/l có số lượng chồi đạt mức trung bình là 16

chồi, chồi cao nhất là 1,7 cm, số chồi có lá là 21 chồi. Lượng BAP và NAA

tối thiểu bổ sung vào môi trường để nẩy chồi là BAP 0,5 mg/l và NAA 0,5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

g/l. Lượng BAP và NAA tối đa bổ sung vào môi trường để nẩy chồi là BAP

2,0 mg/l và NAA 0,5 g/l. Số lượng chồi, số lá và chiều dài lá được ghi nhận

trong khoảng từ BAP 0,5 mg/l đến BAP 2,0 mg/l . Môi trường ra rễ cho chồi

tốt nhất là môi trường MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l. Số lượng rễ thu được là

16,25 rễ; chiều dài gốc đo được là 3,92 cm. Tại môi trường MS có bổ sung IBA

3mg/l cho độ dài gốc tối thiểu. Khả năng cây con sống sót khi làm quen với khí

hậu đạt 40% trên hỗn hợp đất vườn, cát và phân bò theo tỷ lệ 2: 1: 1 [55].

Năm 2016, Gatambia đã sử dụng phương pháp in vitro để tái sinh đu đủ

trên môi trường lỏng và môi trường bán lỏng có bổ sung các chất điều hòa

sinh trưởng với các nồng độ khác nhau. Số lượng chồi cao nhất thu được trên

môi trường có bổ sung IBA 0,5 mg/l và NAA 1,0 mg/l. Môi trường cảm ứng

ra rễ tốt nhất là môi trường có bổ sung IBA 2,5 mg/l [26].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Đỗ Văn Nam và các cộng sự (2013) đã nghiên cứu nhân giống vô tính

in vitro cây đu đủ dòng bố của giống VNĐĐ9 từ đoạn thân mang chồi nách.

Kết quả đã xác định được chế độ khử trùng thích hợp là khử trùng kép bằng

HgCl2 0,1 % lần 1 trong thời gian 10 phút và lần 2 trong thời gian 5 phút. Chế

độ khử trùng này cho 86,9% mẫu sạch. Môi trường thích hợp nhất để tạo

callus từ lát cắt đoạn thân là MS bổ sung α-NAA 1 mg/l và BA 0,5 mg/l, tỷ lệ

hình thành callus đạt 90,74 % sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ callus tái sinh chồi

cao nhất (44,44 %) trên môi trường MS có BA 1 mg/l và α- NAA 0,1 mg/l.

Hệ số nhân chồi đạt cao nhất (3,17 lần) trên môi trường MS bổ sung BA 1

mg/l và α-NAA 0,25 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy. Môi trường thích hợp để cảm

ứng tạo rễ cho chồi in vitro là MS ½ bổ sung 1mg/l than hoạt tính và IBA 1,5

mg/l cho tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất đạt 50% sau 4 tuần nuôi cấy [15].

Phan Đình Kim Thư và cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật sản xuất cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

giống đu đủ in vitro lưỡng tính. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Đối với vật liệu

là lá trên chồi thân từ cây trưởng thành, trong môi trường MS ½ có bổ sung

sucrose 30 g/l với glutamine 400 mg/l và agar 8 g/l, BAP 0,02 mg/l và 2,4-D

1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong tạo mô sẹo. Môi trường để nuôi cấy kích

thích hình thành phôi soma là MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 8 g/l, BAP 0,5

mg/l, NAA 0,1 mg/l cho kết quả tốt nhất trong kích thích mô sẹo hình thành

phôi. Môi trường để nuôi cấy kích thích phôi nảy mầm là MS bổ sung sucrose

30 g/l, không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng.Trạng thái lỏng lắc

cho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi nảy mầm. Môi trường để nuôi cấy

kích thích phôi đã nảy mầm phát triển thành cây hoàn chỉnh là MS bổ sung

sucrose 30 g/l. Không cần bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng. Trạng thái

đặc cho kết quả tốt nhất trong kích thích phôi đã nảy mầm phát triển thành

cây hoàn chỉnh [20].

Nguyễn Thị Nhẫn và cs (2004) đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh in

vitro cây đu đủ. Phương thức khử trùng tốt nhất với cây đu đủ là kết hợp

Ca(OCl)2 0,15% với HgCl2 0,1% sau đó đưa vào nuôi cấy trên môi trường

MS có BA 1ppm hoặc BA 0,5 ppm và kinetin 0,5 ppm. Sử dụng môi trường

MS bổ sung NAA 0,2 ppm và BA 0,5 ppm với nước dừa (5%) đạt được hệ số

nhân chồi từ 4,4 đến 4,6 lần. Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường NAA 0,025

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

ppm là 95% sau 4 tuần nuôi cấy [16].

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu thực vật

Đoạn chồi ngọn cây đu đủ đực có độ tuổi khác nhau được thu thập từ

các vườn dược liệu ở tỉnh Tuyên Quang.

A B C

A) Cây giống từ vườn ươm, B) Cây nhỏ, C) Cây lớn

Hình 2.1. Cây đu đủ đực dùng trong nghiên cứu

2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

a) Hóa chất

Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS gồm

khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).

- Môi trường: MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng và

nước dừa, agar

- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D, NAA, IBA (Sigma, Đức).

- Hợp chất hữu cơ: cao nấm men, peptone (Phytech, USA), nước dừa.

- Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)

- Than hoạt tính.

- Hóa chất khử trùng (cồn 70%, thủy ngân HgCl2 0,1%, hypoclrit canxi

Ca(OCl)2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

b) Thiết bị

- Cân điện tử.

- Nồi hấp khử trùng.

- Tủ sấy.

- Tủ cấy vô trùng cấp

- Máy đo pH.

- Lò vi sóng.

Ngoài ra còn một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của

Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên.

2.2. Địa điểm và thời gian

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật, khoa Công

nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2017 -

tháng 4/2019

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy.

- Vật liệu thí nghiệm: đoạn ngọn chứa chồi nách của cây đu đực với các độ

tuổi khác nhau từ cây non đến cây trưởng thành (chưa ra hoa hoặc đang có hoa).

- Phương pháp tiến hành: mẫu thu về rửa sạch dưới vòi nước chảy, ngâm

trong xà phòng loãng khoảng 15 phút, tiếp theo rửa sạch xà phòng sau đó tráng

bằng nước cất, mang vào box cấy để khử trùng. Ở trong box cấy vô trùng; khử

trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1-2 phút, tráng sạch bằng nước cất khử trùng

3-4 lần sau đó khử trùng bằng thủy ngân clorua HgCl2 với các nồng độ 0,1%,

0,15% và trong các khoảng thời gian khác nhau 13 phút, 15 phút hoặc 10 phút

(lần 1) và 5 phút (lần 2).

- Chỉ tiêu nghiên cứu: xác định tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ

mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo

- Vật liệu nghiên cứu là mảnh lá, cuống lá, lát cắt đoạn thân sạch của

cây đu đủ thu được sau khi khử trùng được cắt với kích thước dài khoảng 0,3

- 0,5cm đối với đoạn thân và cuống lá, 0,3 x 0,3cm với mảnh lá.

- Phương pháp tiến hành: cấy các nguyên liệu đã chuẩn bị vào môi

trường MS có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như NAA, IBA, hoặc tổ

hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và NAA với các nồng độ khác nhau để

nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo. Nồng độ NAA được bổ sung từ 0,5 mg/l -

1mg/l - 2 mg/l, BAP có nồng độ từ: 0,5mg/l -1,0 mg/l - 2,0 mg/l.

- Thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại,

mỗi lần 4 bình, mỗi bình từ 4-7 mẫu.

- Thời gian theo dõi: 30 ngày.

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ tạo mô sẹo, đặc điểm mô sẹo, tốc độ sinh

trưởng phát triển của mô sẹo.

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

2.3.3.1.Phương pháp tái sinh chồi từ mô sẹo

- Vật liệu thí nghiệm: mô sẹo có nguồn gốc từ mảnh lá, đoạn thân và

cuống lá thu được trong thí nghiệm tạo mô sẹo.

- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển mô sẹo đã hình thành vào môi

trường MS có bổ sung có bổ sung NAA dải nồng độ là 0 mg/l, 0,1 mg/l và

0,25 mg/l, BAP có nồng độ là 0 mg/l, 0,5 mg/l và 1,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 6 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu đặc

điểm sinh trưởng của mô sẹo, tỷ lệ tái sinh chồi, chất lượng chồi sau 30 ngày.

2.3.3.2. Phương pháp nhân nhanh chồi

- Vật liệu thí nghiệm: chồi non in vitro

- Phương pháp tiến hành: cấy chuyển chồi đã hình thành vào môi

trường MS có bổ sung nước dừa 5% và bổ sung NAA với nồng độ 0,1 mg/l,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

0,25 mg/l, BA với nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 4 mẫu. Theo dõi các chỉ tiêu hệ số

nhân chồi, chiều cao chồi, số lá/chồi, đặc điểm hình thái chồi sau 30 ngày.

2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

-Vật liệu thí nghiệm: chồi sau khi nhân nhanh đã có từ 2 lá trở lên.

- Phương pháp tiến hành: chồi được cấy vào môi trường tạo rễ MS có

bổ sung than hoạt tính 0,5 g/l, NAA với các nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l, 2,0

mg/l hoặc bổ sung IBA với các nồng độ 1,0 mg/l, 1,5 mg/l, 2,0 mg/l.

- Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 3 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ ra

rễ, tỷ lệ không ra rễ.

2.4. Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các

yếu tố vật lý như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25oC ± 2oC. Độ ẩm: 60 – 70 %.

- Ánh sáng: cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12-16

giờ/ngày.

2.5. Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học

trên máy tính bằng phần mềm Microsoft Excel và trình ứng dụng Statgraphics

centurion XV.I. Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a,

b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép

kiểm định Duncan với p < 0,05.

- Giá trị trung bình ( ):

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

- Độ lệch chuẩn ( ):

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế độ khử trùng mẫu cấy

3.1.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu

Trong quy trình nhân giống thực vật bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

thì khâu khử trùng mẫu từ ngoài tự nhiên để đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro là

khó khăn và mất tương đối nhiều thời gian do các mẫu này thường mang

nhiều nguồn bệnh như nấm, vi khuẩn và khả năng chống chịu với các hóa

chất khử trùng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu 03 chế độ khử

trùng sử dụng HgCl2 với các nồng độ 0,1% và 0,15% với các khoảng thời

gian khác nhau để khử trùng đoạn chồi ngọn của cây đu đủ đực để đưa mẫu

vào nuôi cấy. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.

Kết quả thu được ở bảng 3.1 cho thấy các chế độ khử trùng khác nhau đã

cho hiệu quả khử trùng (tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sống) có sự khác biệt

nhau rõ rệt. Qua theo dõi cho thấy tỷ lệ mẫu sạch và sống thu được ở cả ba

chế độ khử trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% -55,17% ở tuần đầu

tiên. Sau đó tỷ lệ mẫu sạch và sống sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi sau 2

và 4 tuần do tỷ lệ nhiễm và chết tăng lên.

Đối với tỷ lệ mẫu sạch: tỷ lệ mẫu sạch thu được ở cả ba chế độ khử

trùng đạt được tương đối thấp chỉ từ 27,78% đến 74,14% ở tuần đầu tiên. Với

chế độ 1: Tỷ lệ mẫu sạch đạt được ở tuần 1 rất cao đạt 74,14%, nhưng sau đó

giảm xuống tuần 2 đến tuần 4 (chỉ còn 53,45% và 46,55%).Với chế độ khử

trùng 2: tỷ lệ mẫu sạch thu được khá cao ở tuần đầu (52,63%), đến 2 tuần tỷ lệ

mẫu sạch giảm xuống còn 42,11% và ổn định cho đến 4 tuần. Còn chế độ khử

trùng 3: tỷ lệ mẫu sạch thu được rất thấp, chỉ đạt 27,78% ở tuần 1 và tiếp tục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

giảm sau 2 và 4 tuần (lần lượt chỉ đạt 26,38% và 25,0%).

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến hiệu quả khử trùng đối với

ngọn đu đủ

Thời gian

Tỷ lệ sạch

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ chết

Tỷ lệ nhiễm

Số mẫu

nuôi cấy

(%)

CĐ 1: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 15 phút

1 tuần

74,14

55,17

18,96

25,86

2 tuần

53,45

29,31

24,14

46,55

4 tuần

46,55

22,41

24,14

53,45

CĐ2: Chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 13 phút

1 tuần

52,63

42,10

10,53

47,37

2 tuần

42,11

31,58

10,53

57,89

4 tuần

42,11

31,58

10,53

57,89

CĐ3: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2)

1 tuần

27,78

72,22

2 tuần

6,9

26,38

19,44

73,61

4 tuần

6,9

25,0

18,05

75,0

Đối với tỷ lệ mẫu sống: trong 3 chế độ khử trùng nghiên cứu thì chế độ

khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất sau 2

đến 4 tuần theo dõi (đạt 31,58%), cao hơn chế độ 1 và chế độ 3 (tương ứng là

22,41% và 18,05%). Chế độ khử trùng 1, tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất ở tuần

đầu (55,17%) nhưng giảm dần ở các tuần tiếp theo do tỷ lệ mẫu chết tăng.

Chế độ khử trùng 3 có tỷ lệ mẫu sống đạt thấp nhất so với cả CĐ1 và CĐ2 do

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất.

Đối với tỷ lệ mẫu nhiễm: qua theo dõi các chế độ khử trùng đến tuần

thứ 4 cho thấy: Chế độ khử trùng 1 và 2 cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp hơn và

chênh lệch không nhiều (53,45% và 57,89% ở tuần thứ 4). Chế độ khử trùng 3

cho tỷ lệ mẫu nhiễm rất cao (75,0% ở tuần thứ 4). Hơn nữa, chế độ khử trùng

1 và chế độ khử trùng 3 khi theo dõi tỷ lệ mẫu nhiễm tăng từ tuần 1 đến đến

tuần thứ 4. Với chế độ khử trùng 1, tỷ lệ nhiễm đạt lần lượt là 25,86%,

46,55%, 53,45 %. Chế độ khử trùng 3, tỷ lệ mẫu nhiễm từ tuần 1 đến tuần 2

và tuần 3 là 72,22%, 73,61% và 75,0%. Chế độ khử trùng 2, tỷ lệ mẫu nhiễm

tuần 1 là 47,37%. Đến tuần 2 tăng lên 57,89%, tuần 3 không phát hiện thêm

mẫu nhiễm.

Như vậy, chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15 % trong 13 phút cho là phù

hợp cho khử trùng mẫu ngọn đu đu đực với tỷ lệ mẫu sạch sống đạt cao nhất

31,58% sau 4 tuần nuôi cấy.

Có nhiều hóa chất khác nhau đã được lựa chọn để khử trùng mẫu đu đủ

như: Ca(OCl)2 NaClO, HgCl2 và đã thu được các kết quả khử trùng khác nhau

đối với các giống đu đủ khác nhau như: theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự

(2004): Phương thức khử trùng có hiệu quả nhất là khử trùng kép (Khử trùng

Ca(OCl)2 trước, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2), tỷ lệ mẫu sạch đạt 60%

đối với mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm

sau 12 ngày nuôi cấy. Công thức HgCl2 2 trong 3 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt

20% với mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất [16] . Theo Đỗ

Văn Nam và cộng sự (2013) khi nhân nhanh in vitro dòng bố của giống

VNĐĐ9 từ vật liệu đoạn thân mang chồi nách đã kết luận chế độ khử trùng

kép bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút (lần 1) và lần 2 trong thời gian 5

phút cho tỷ lệ 86,9 % mẫu sạch [15].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ mẫu sạch thu được thấp hơn các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

nghiên cứu khác nhưng thời gian theo dõi của chúng tôi lâu hơn đến 4 tuần.

Các mẫu sạch sau khi khử trùng khoảng 4 tuần được cấy chuyển sang môi

trường tạo mô sẹo. Trên môi trường tạo mô sẹo, một số mẫu lại thấy vi khuẩn

phát triển mạnh ở quanh mẫu. Điều này chứng tỏ vi khuẩn chứa trong mạch

của mô đu đủ rất khó loại bỏ khi khử trùng. Tỉ lệ mẫu sạch hoàn toàn thu

được sẽ giảm dần theo thời gian theo dõi. Đây là khó khăn lớn cho việc vào

mẫu đu đủ. Trước đây những thí nghiệm sơ khởi cho thấy xử lý mẫu bằng

Natri hypochlorit không hiệu quả với phần bên trong mẫu. Việc sử dụng chất

kháng sinh RIF có tác động đến bên trong mẫu ngăn chặn sự phát triển của vi

khuẩn [20].

Kết luận: chế độ khử trùng 2, HgCl2 0,15% trong 13 phút là phù hợp để

khử trùng đưa mẫu đu đủ đực vào nuôi cấy .

A B

Hình 3.1 Mẫu trước và sau khử trùng A) Mẫu trước khi khử trùng, B) Mẫu sau khi khử trùng cấy vào ống nghiệm

3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng

Chúng tôi thu mẫu đu đủ ở các độ tuổi khác nhau là ngọn non (phân

biệt giới tính chủ yếu dựa vào hình thái rễ) và ngọn đã bắt đầu phân hóa mầm

hoa (mới ra nụ, ra hoa) để khử trùng đưa vào nuôi cấy in vitro. Kết quả cho

thấy độ tuổi mẫu đã có ảnh hưởng khá rõ rệt đến hiệu quả khử trùng. Kết quả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

chỉ ra ở bảng 3.2.

Qua kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hiệu quả khử trùng đạt được cao nhất

khi mẫu đu đủ còn non chưa có hoa và giảm dần khi độ tuổi mẫu tăng lên (từ

bắt đầu phân hóa mầm hoa, mới ra hoa,ngọn vừa, ra hoa, ngọn to).

Đối với ngọn non (ngọn chưa phân hóa mầm hoa): khi khử trùng thu

được hiệu quả khá cao, tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất (Tỷ lệ sạch đạt 60,71%

sau 2 tuần và 50,0% sau 4 tuần; Tỷ lệ sống đạt 57,14% sau 2 tuần và 42,86%

sau 4 tuần).

Đối với mẫu ngọn đu đực mới ra nụ hoa: thu được hiệu quả khử trùng

khá cao, tỷ lệ mẫu sạch đạt 53,45% sau 2 tuần và 46,55% sau 4 tuần; Tỷ lệ

sống đạt 29,31% sau 2 tuần và 22,41% sau 4 tuần. Đối với mẫu đu đủ ra hoa

(ngọn vừa và ngọn to) có tỷ lệ mẫu bị nhiễm chiếm từ 80% đến 86,11% sau 4

tuần nuôi cấy. Tỷ lệ mẫu sạch và sống đạt được rất thấp, chỉ từ 16,67% đến

6,94% sau 4 tuần.

Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ tuổi mẫu đến hiệu quả khử trùng

sau 2-4 tuần nuôi cấy

Tỷ lệ

Thời

Số

Tỷ lệ

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ

Độ tuổi mẫu

nhiễm

gian

mẫu

sạch (%)

(%)

chết (%)

(%) 39,29

2 tuần

60,71

57,14

3,57

Ngọn non

4 tuần

50,00

42,86

7,14

2 tuần

46,55

53,45

29,31

24,14

Mới ra nụ hoa

4 tuần

53,45

46,55

22,41

24,14

2 tuần

70,00

30,00

16,67

3,33

Ra hoa, ngọn

vừa

4 tuần

80,00

20,00

16,67

3,33

Ra hoa, ngọn

2 tuần

77,78

22,22

15,27

6,9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

rất to

4 tuần

86,11

13,89

6,94

6,9

Chế độ khử trùng: HgCl2 0,15% trong 13 phút đối với tất các lô thí nghiệm

Điều này cho thấy nên lấy mẫu khi còn non, ngọn bắt đầu phân hóa

(nhận rõ đu đủ đực) thì sẽ cho hiệu quả khử trùng tốt hơn là lấy mẫu trưởng

thành và đã phân hóa rõ giới tính, nhất là khi ngọn to và thân đã rỗng sẽ cho

hiệu quả khử trùng rất thấp vì có thể do vi khuẩn lan trong mô ruột của đu đủ

dẫn đến tỉ lệ nhiễm rất cao. Theo Ngô Xuân Bình (2010), các mô phân sinh

đỉnh ở các cây bị nhiễm bệnh thường là sạch bệnh hoặc chứa nồng độ virus

rất thấp. Tuy nhiên, nồng độ của virus trong cây tăng lên tương ứng với việc

tăng khoảng cách từ các đỉnh phân sinh. Các lý do khác nhau để cho mô phân

sinh không hoặc ít bị virus xâm nhiễm là các virus di chuyển dễ dàng trong cơ

thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn là cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh

không có; Hoạt tính trao đổi chất cao trong quá trình phân chia của các tế bào

phân sinh ngăn cản sự sao chép của virus; Nồng độ auxin nội sinh cao ở trong

các đỉnh chồi có thể ức chế sinh sản của virus [2].

Như vậy với chế độ khử trùng HgCl2 0,15% trong 13 phút với thời gian

theo dõi 4 tuần có thể kết luận độ tuổi mẫu phù hợp cho hiệu quả khử trùng

tốt nhất là mẫu còn non (chưa ra hoa).

Theo Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (2004) hiệu quả khử trùng các

nguyên liệu khác nhau đạt được khác nhau. Tỷ lệ mẫu sạch đạt 60% đối với

mẫu cây lấy từ vườn sản xuất và 78% khi các mẫu lấy từ vườn ươm sau 12

ngày nuôi cấy (đối với chế độ khử trùng kép). Tỷ lệ mẫu sạch đạt 20% với

mẫu từ vườn ươm và 10% với mẫu từ vườn sản xuất đối với chế độ khử trùng

bằng HgCl2 trong 3 phút [16].

Rohman và cộng sự (2007), khi nhân giống vô tính từ chồi nách của

các cây đu đủ trưởng thành đã tiến hành lắc mẫu trong L-rifampicin 300 mg/l

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

trong 2 giờ trước khi đưa vào khử trùng bề mặt. Kết quả nghiên cứu cho thấy

tỷ lệ sống cao nhất trong môi trường MS bổ sung BAP 1 mg/l, NAA 0,2 mg/l

đạt 53,33% [51]. Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013) đã ngâm mẫu trong

cefotaxim trong 3 giờ trước khi khử trùng bằng HgCl2 0,1 %, Ca(OCl)2 5% và

NaOCl 5,5% [15].

Điều này cho thấy hiệu quả khử trùng ngoài phụ thuộc vào hóa chất

khử trùng, nồng độ và thời gian xủa lí hóa chất, còn phụ thuộc rất lớn vào

mẫu, độ tuổi cũng như kiểu gen.

A B

Hình 3.2.Khử trùng mẫu với các độ tuổi khác nhau A ) Ngọn non, B) Ngọn mới ra nụ 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (IAA,

NAA, BAP và NAA) đến khả năng hình thành mô sẹo

3.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy đến khả năng tạo mô sẹo

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến khả năng tạo mô sẹo sau 40 ngày

Nguyên liệu Số mẫu Đặc điểm mô sẹo Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) Điểm hình thành mô sẹo Tốc độ sinh trưởng mô sẹo

Trắng đến xanh Bề mặt trên Đoạn thân 40 100a± 0,0 ++ nhạt, rắn mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Cuống lá 38 86,65b ± 4,74 Xanh nhạt, rắn Gốc cuống +

Trắng bông, Đầu cuống Mảnh lá 40 19,50c ± 0,71 ++

Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05.

mềm lá

Đoạn thân, mảnh lá và cuống lá của chồi đu đủ được nuôi cấy trên môi

trường tạo mô sẹo N2B bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 0,5 mg/l đều đã cho

sự cảm ứng mô sẹo khá tốt sau khoảng 15-20 ngày. Tuy nhiên, đối với mỗi

nguồn nguyên liệu sự hình thành và sinh trưởng phát triển của mô sẹo có

những đặc trưng khác nhau (Bảng 3.3).

Qua bảng 3.3 cho thấy cả 3 loại vật liệu nuôi cấy là đoạn thân, cuống

lá, mảnh lá sau khi khử trùng và đưa lên môi trường nuôi cấyđều có khả năng

tạo mô sẹo.Tỷ lệ tạo mô sẹo đạt cao nhất ở đoạn thân (đạt 100%), đạt thấp

hơn ở cuống lá (đạt 86,65%) và thấp nhất là mảnh lá (chỉ đạt 19,50%).Đoạn

thân có khả năng tạo mô sẹo tốt, mô sẹo sinh trưởng nhanh và tạo khối mô to,

mô sẹo có màu trắng nhạt đến xanh đậm. Đây là nguồn nguyên liệu chính để

khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy. Cuống lá non khi nuôi cấy tạo mô sẹo ở đầu

cơ bản nhưng mô sẹo sinh trưởng chậm, kích thước nhỏ. Mảnh lá cũng có khả

năng tạo mô sẹo mặc dù tỷ lệ rất thấp (19,50% ), mô sẹo hình thành có màu

trắng tuyết, một số mô sẹo sinh trưởng khá nhanh tạo khối mô to. Như vậy,

vật liệu phù hợp nhất để tạo mô sẹo là đoạn thân non của cây đu đủ đực.

3.2.2. Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo

Trong quá trình nhân giống in vitro sự phối hợp giữa auxin và cytokinin

ở một nồng độ và tỷ lệ thích hợp có tác động quan trọng tới sự phát sinh hình

thái của tế bào, mô nuôi cấy. Phát sinh hình thái thông qua cảm ứng mô sẹo

đã thành công trên nhiều đối tượng cây trồng với ưu điểm cho hệ số nhân cao.

Do đó, chúng tôi đã sử dụng các đại diện của auxin và cytokinin đó là NAA,

IBA và BAP để kích thích hình thành mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

được từ đoạn chồi ngọn đu đủ đực.

Trên các môi trường nuôi cấy các mô sẹo sau khi hình thành có dạng hạt

trắng li ti, rắn trên bề mặt cắt của mẫu. Trên các môi trường nuôi cấy mô sẹo

bổ sung NAA hoặc IBA hoặc kết hợp NAA với BAP ở các tổ hợp khác nhau

thì đã có sự ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành và sinh trưởng phát triển của

mô sẹo.Sự kết hợp giữa BAP và NAA cho hiệu quả cảm ứng mô sẹo tốt hơn

việc sử dụng đơn chất IBA hoặc NAA (Bảng 3.4).

Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy các môi trường tạo mô sẹo nghiên cứu từ

MS1 đến MS8 bổ sung các chất kích thích sinh trưởng có ảnh hưởng rõ rệt

đến khả năng hình thành mô sẹo và sinh trưởng phát triển của mô sẹo so với

đối chứng (không bổ sung kích thích sinh trưởng). Mô sẹo hình thành từ mẫu

thân và cuống lá thì có màu vàng nhạt, mô sẹo lá màu xanh. Tuy nhiên, mô

sẹo sinh trưởng và phát triển tương đối chậm, đa số chỉ mô sẹo hóa phần bề

mặt mẫu ở phía trên, không mô sẹo hóa toàn bộ mẫu cấy.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của của các chất kích thích sinh trưởng đến sự hình

thành mô sẹo (sau 4 tuần nuôi cấy)

Kí hiệu

α-NAA

BAP

IBA

Số

Tỷ lệ mẫu tạo

Tốc độ sinh

Đặc điểm mô sẹo

MT

(mg/l)

mẫu

callus (%)

trưởng

ĐC - - 20 25,0d ± 0,5 Xanh nhạt, rắn + -

MS1 1,0 - 16 68,8 b ± 6,3 Xanh nhạt, rắn + -

Trắng, rắn

MS2 2,0 - 18 38,9 cd ± 5,6 + -

Xanh nhạt, rắn

± 5,0

MS3 1,0 0,5 24 95,0a ++ -

MS4 2,0 0,5 28 90,0a ± 10 Vàng nhạt, rắn + + -

Xanh, rắn

MS5 0,5 1,0 8 43,8 c ± 6,3 + -

Trắng, rắn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

MS6 1,0 1,0 24 81,7 ab ± 4,0 + -

Trắng, rắn

MS7 1,0 2,0 - 28 39,3cd ± 2,1 +

MS8 - - 2,0 16 35,4cd ± 3,6 Vàng nhạt, rắn +

MS9 - - 3,0 16 25,0d ± 0,0 Vàng nhạt, rắn +

(-): không bổ sung , +: sinh trưởng chậm, ++: sinh trưởng khá.Các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05.

Nhóm môi trường chỉ bổ sung NAA: môi trường tạo mô sẹo chỉ bổ

sung NAA riêng rẽ với hai nồng độ 1,0 mg/l (MS1) và NAA 2,0 mg/l cho tỷ

lệ mẫu tạo mô sẹo có sự khác biệt đáng kể. Tỷ lệ tạo mô sẹo ở môi trường

MS1 đạt khá cao (68,8%), mô sẹo trắng hoặc xanh nhạt, trong khi môi trường

MS2 tỷ lệ này giảm chỉ còn 38,9%, mô sẹo màu trắng bông.

Nhóm môi trường chỉ bổ sung IBA 2,0 và 3,0mg/l (MS8 và MS9) cho tỷ

lệ tạo mô sẹo đạt thấp nhất, lần lượt là 35,4% và 25,0%,mô sẹo nhỏ, vàng nhạt

Điều này có thể do IBA không phù hợp cho tạo mô sẹo hoặc do nồng độ IBA quá

cao đã ức chế sự hình thành mô sẹo.

và tỷ lệ tạo mô sẹo ở các môi trường này không khác biệt so với đối chứng.

Nhóm môi trường bỏ sung hàm lượng auxin cao hơn hàm lượng BAP

(MS3 và MS4) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất. Trên môi trường MS3 (MS có

bổ sung NAA 1 mg/l và BAP 0,5 mg/l) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất

(95,0a%), mô sẹo xanh nhạt, rắn, tốc độ sinh trưởng khá tốt. Môi trường MS4

(MS có bổ sung NAA 2 mg/l và BAP 0,5 mg/l) cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao

(90,0a%). Tuy nhiên, sự khác biệt về tỷ lệ tạo mô sẹo giữa MS3 và MS4

không có ý nghĩa thống kê. Vì vậy có thể bổ sung NAA từ 1-2 mg/l kết hợp

với BAP 0,5 mg/l vào môi trường tạo mô sẹo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Môi trường có hàm lượng auxin thấp hơn với hàm lượng cytokin (MS5,

MS7) cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo đạt thấp, chỉ từ 39,3% đến 43,8%. Khi hàm

lượng auxin và cytokinin cân bằng (MS6) thì tỷ lệ tạo mô sẹo đạt khá cao 81,7%.

Như vậy môi trường phù hợp nhất cho tạo mô sẹo là môi trường MS có

bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 0,5 mg/l.

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Văn Nam và

cộng sự (2013). Theo nhóm nghiên cứu này thì môi trường thích hợp nhất để

cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt đoạn thân là MS bổ sung 1 mg/l α-NAA và 0,5

mg/l BA, cho tỷ lệ hình thành callus đạt 90,74 % sau 4 tuần nuôi cấy [15].

A B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

C D

E F

Mô sẹo cuống lá, mảnh lá, đoạn thân sau 2 tuần nuôi cấy (A, C, E) và 4 tuần nuôi

cấy (B, D, F)

Hình 3.3 Nuôi mô sẹo đu đủ

Theo Phan Đình Kim Thư và cộng sự (2012) khi nghiên cứu nhân

giốngcây đu đủ lưỡng tính đã cho thấy ảnh hưởng tổ hợp auxin và BAP đến

khả năng tạo mô sẹo khá rõ rệt. Mô sẹo hình thành tốt nhất ở môi trường MS

có bổ sung BAP 0,02 mg/l và 2,4-D 1 mg/l. Đường kính mô sẹo ở môi

trường này là lớn nhất và khi chuyển sang môi trường MS thì mô sẹo này

cũng cho thấy khả năng phát sinh phôi soma tốt nhất. Trên môi trường này,

mô sẹo màu nâu nhạt, hơi bở, tăng sinh nhanh. Trên môi trường có sự kết hợp

giữa BAP 0,02 mg/l và 2,4-D 0,5 mg/l, mô sẹo hình thành có màu trắng

xanh, mềm, tăng sinh chậm. Trên môi trường có sự kết hợp giữa BAP 0,02

mg/l và NAA 2 mg/l, mô sẹo màu nâu đậm, mềm, tăng sinh chậm [20].

3.3. Nghiên cứu tái sinh chồi từ mô sẹo

Sau khi thu được các khối mô sẹo, cấy chuyển các mô sẹo này sang

môi trường tái sinh. Môi trường tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường bổ sung

hàm lượng cytokinin/auxin phù hợp cho sự biệt hoá chồi. Trong nghiên cứu này

chúng tôi tạo mô sẹo trên môi trường có tỷ lệ NAA/BAP cao, sau đó chuyển

sang môi trường bổ sung NAA thấp từ 0,1 đến 0,25 mg/l kết hợp với nồng độ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

BAP ở nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l hoặc kết hợp với kinetin 0,5 và 1,0 mg/l để

nghiên cứu sự tái sinh chồi từ mô sẹo. Các kết qủa thu được trình bày ở bảng 3.5.

Kết quả thu được cho thấy, các môi trường nghiên cứu từ TC1 đến TC5

đã có sự ảnh hướng khác biệt rõ rết lên sự tái sinh của mô sẹo. Trên môi

trường TC1 và TC2, mô sẹo tiếp tục sinh trưởng và phát triển tốt, mô sẹo lá

màu trắng, mềm, nhũn. Khối mô sẹo khá to. Trên môi trườngtrường TC1 (BAP

0,5 mg/l và NAA 0,1 mg/l), tỷ lệ tái sinh chồi đạt 36,4%. Môi trườngTC2 (MS

bổ sung BAP 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l) cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất

(40,3%),với chất lượng chồi tốt, có màu xanh nhạt. Môi trường TC3(BAP 0,5

mg/l và NAA 0,25 mg/l) cho tỷ tạo chồi thấp nhất, chỉ đạt 27,8 %.

Môi trường TC4 và TC5 bổ sung kinetin 0,5 và 1,0 mg/l kết hợp với

NAA 0,1 mg/l đã không có hiệu quả kích thích tạo chồi từ mô sẹo đu đủ. Mô

sẹo ban đầu sinh trưởng chậm sau đó vàng dần đi, chưa quan sát thấy hình

thành chồi. Như vậy, bổ sung BAP và NAA với tỷ lệ phù hợp dã kích thích

mô sẹo tái sinh chồi. Khi hàm lượng auxin cao quá ức chế quá trình tạo mô

sẹo, do đó hàm lượng NAA lựa chọn trong nghiên cứu là ≤ 0,25 mg/l.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi của

callus đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy)

Kinetin

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

Đặc điểm sinh trưởng mô sẹo

Chất lượng chồi

(mg/l)

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 30 ngày

0,0 b 0 0 ĐC 0 Thâm đen

36,4a Vàng nhạt 0,5 0,1 TC1 -

40,3 a Xanh nhạt 1,0 0,1 TC2 -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

27,8ba Xanh nhạt 0,5 0,25 TC3 Không sinh trưởng. Sinh trưởng tốt. Khối mô to, mềm, màu trắng. Sinh trưởng tốt. Khối mô to, mềm, màu vàng nhạt đến trắng. Sinh trưởng khá, khối mô to, màu

0,0 b Vàng nhạt TC4 0,5 - 0,1

0,0 b Vàng nhạt TC5 1,0 - 0,1

vàng nhạt Sinh trưởng TB Khối mô rắn, màu xanh nhạt. Sinh trưởng TB Khối mô rắn, màu vàng nhạt.

Kết quả nghiên cứu này phù với với nghiên cứu của Đỗ Văn Nam và

cộng sự (2013), môi trường cho tỷ lệ callus tái sinh chồi cao nhất (44,44 %)

đạt được trên môi trường MS bổ sung BA1 mg/l, NAA 0,1 mg/l [15].

Vậy môi trường phù hợp nhất cho tái sinh chồi đu đủ đực là môi trường

MS bổ sung BAP 1mg/l và NAA 0,1 mg/l

A B

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

C D

A và B) Chồi tái sinh từ khối mô sẹo mềm, rời rạc sau 30 ngày và 40 ngày

C và D) Chồi tái sinh từ các mô sẹo rắn sau 30 ngày và 40 ngày

Hình 3.4.Chồi tái sinh từ mô sẹo

3.4. Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi đu đủ đực

Trong quá trình nhân giống in vitro sự phối hợp giữa auxin và cytokinin ở

một nồng độ và tỷ lệ thích hợp có tác động tốt tới sự hình thành chồi và chất

lượng chồi tạo thành. Trong nghiên cứu này, việc bổ sung BAP và NAA đã làm

tăng hệ số nhân chồi so với đối chứng không bổ sung (Bảng 3.6).

Môi trường bổ sung các tổ hợp BAP và NAA với hàm lượng khác nhau

cho hệ số nhân chồi khác nhau. Hệ số nhân chồi tăng từ 1,0 đến 2,67 lần khi

kết hợp BAP (0,5- 1 mg/l) với NAA (0,1 - 0,5 mg/l). Các tổ hợp môi trường

cho hệ số nhân chồi từ cao nhất đến thấp và có sự khác biệt so với đối chứng

là môi trường NC7, NC6, NC5 và NC2 (lần lượt đạt tương ứng là 2,67a;

2,00ab;1,67bc; 1,33bc), còn hai môi trường NC1 và NC8 không có sự khác biệt

so với đối chứng, hệ số nhân chồi bằng 1. Tổ hợp BAP 1 mg/l và NAA 0,25

mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất (2,67a lần) với đặc điểm chồi có màu xanh

nhạt, số lá/chồi là 2-3 lá.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

đu đủ (Sau 4 tuần nuôi cấy)

Kí hiệu Đặcđiểm BAP (mg/l) NAA (mg/l) Hệ số nhân (lần) Số lá/chồi (lá)

ĐC 0 0 1,0c ± 0,0 Vàng 3-4

NC1 0,5 0 1,0c ± 0,0 3-4 Xanh nhạt

1,33bc ± 0,47 Xanh nhạt NC2 0,5 0,1 1-2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

1,67bc ± 0,41 1-2 Xanh nhạt NC5 1,0 0,1

2,00ab ± 0,82 2-3 Xanh nhạt NC6 0,5 0,25

2,67a ± 0,47 2-3 Xanh nhạt NC7 1,0 0,25

NC8 1,0 0,5 1,0c ± 0,0 3-4 Vàng nhạt

Hệ số nhân chồi trong nghiên cứu này của chúng tôi thấp hơn hệ số

nhân chồi trong các nghiên cứu của Đỗ Văn Nam (2013), Rohman (2007),

Panjaitan (2007). Có sự khác biệt trên có thể do giống đu đủ, loại giới tính đu

đủ trong các nghiên cứu là khác nhau.

Theo nghiên cứu của Đỗ Văn Nam và cộng sự (2013), khi nghiên cứu

nhân giống đu đủ cái dòng lai VNĐĐ9 thu được hệ số nhân chồi đạt cao

nhất trên môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l và α-NAA 0,25 mg/l (sau 4

tuần)[15]. Kết quả nghiên cứu của Rohman và cộng sự (2007) cho thấy: tỷ lệ

nhân chồi cao nhất trong môi trường MS bổ sung BAP 0,5 mg/l và NAA 0,2

mg/l (3,24 lần trong 4 tuần) [51]. Nghiên cứu của Wu và cộng sự (2012) thì tỷ lệ

nhân chồi trung bình đạt 6,7 lần trên môi trường MS có BA 0,25 mg/l và sucrose

1mg/l [57]. Theo Pạnjaitan, tỷ lệ chồi trung bình cao nhất (73,3%) trên mỗi cây

ở môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l và α-NAA 0,05 mg/l [47].

Như vậy môi trường tốt nhất cho hệ số nhân chồi của đu đủ đực là MS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

có bổ sung NAA 0,25 mg/l và BAP 1 mg/l.

A) Chồi trên môi trường đối chứng, B) Chồi trên môi trường NC7

B Hình 3.5. Nhân chồi

3.5. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi đu đủ đực

Các chồi sau giai đoạn nhân nhanh với chiều cao chồi 1- 1,2 cm, lá

xanh, chồi sinh trưởng phát triển bình thường sẽ được chuyển sang môi

trường ra rễ để hoàn thiện quá trình nhân giống in vitro. Chất cảm ứng ra rễ

được sử dụng là IBA với nồng độ 1mg/l, 1,5mg/l, 2,0mg/l và NAA bổ sung

với các nồng độ 0,5mg/l, 1,0 mg/l và 2,0 mg/l trên nền môi trường MS bổ

sung 0,5g/l than hoạt tính (Bảng 3.7)

Các môi trường nghiên cứu bổ sung NAA gồm môi trường R4, R5 và

R6 chồi đều không tạo rễ, chồi sinh trưởng chậm, lá vàng nhạt tương tự như

môi trường đối chứng. Nhóm môi trường MS có bổ sung than hoạt tính và

IBA, chồi sinh trưởng mạnh hơn với cuống lá dài, màu xanh. Trong ba môi

trường nghiên cứu R1, R2 và R3 thì hai môi trường R1 và R3 với nồng độ

IBA bổ sung là 1mg/l và 2mg/l đều chưa thấy ra rễ sau 4 tuần theo dõi. Môi

trường R2 bổ sung ung IBA 1,5mg/l và than hoạt tính 0,5mg/l sau khoảng 10

ngày đã hình thành rễ, rẽ trắng, ngắn và mập và chỉ có duy nhất 1 rễ. Sau

khoảng 4 tuần rễ sinh trưởng dài khoảng 2,0 cm, từ 1 rễ chính phát sinh ra các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

rễ nhỏ (rễ phụ).

Môi trường tạo rễ cho kết quả hình thành rễ sau 4 tuần theo dõi với

tỷ lệ 50,0% với sỗ rễ/cây là 2,0. Cây đu đủ in vitro có thân gầy, cuống dài,

lá xanh nhạt, rễ có 1 rễ chính dài và 1 rễ phụ. Đặc điểm cây đúng với đặc

điểm hình thái học của cây đu đủ đực. Như vậy bước đầu đã tạo được cây đu

đủ đực hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA, α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi đu đủ đực (sau 4 tuần theo dõi)

Đặc điểm chồi Số rễ/ cây Kí hiệu môi trường Nồng độ IBA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Tỷ lệ hình thành rễ (%)

ĐC 0 0 0 0

Chồi cuống ngắn, lá vàng nhạt

R1 1 0 - 0

Thân gầy, cuống ngắn,lá xanh nhạt

1,5 50,0 R2 0

2,0 Thân gầy, cuống dài, lá xanh nhạt

R3 2 0 - 0

Cuống dài, lá vàng nhạt

R4 0,5 0 0

R5 1,0 0 0 Cuống ngắn, lá vàng nhạt Cuống ngắn, lá vàng nhạt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

R6 2,0 0 0 Cuống ngắn, lá vàng nhạt

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Văn

Nam và cộng sự (2013), môi trường ra rễ tốt nhất là MS có bổ sung than hoạt

tính và bổ sung IBA 1,5 mg/l, tỷ lệ ra rễ đạt 50% với số rễ trung bình trên

một cây là 6,5 rễ [15]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Setargie

và cộng sự (2015): Môi trường cho ra rễ tốt nhất là MS có bổ sung IBA 1,5

mg/l với số rễ cao nhất là 16,25 rễ trên một cây và chiều dài rễ trung bình là

3,92 cm [55].

Đối với các nghiên cứu khác trên các đối tượng giống đu đủ khác nhau

thì môi trường ra rễ phù hợp là môi trường có bổ sung IBA với các nồng độ

khác nhau có thể là 1, 2, 2,5 mg/l thậm chí là 3 – 4,0 mg/l. Có sự khác biệt

này cũng có thể có nguyên nhân từ đối tượng mẫu ở đề tài là đu đủ đực còn

các nghiên cứu khác có đối tượng là đu đủ cái và lưỡng tính hoặc cũng do

giống đu đủ lựa chọn khác nhau.

Theo các nghiên cứu của Rohman và cộng sự (2007) thì môi trường ra

rễ tốt nhất MS có bổ sung IBA 1 mg/l (2,18 cm trong 4 tuần) [51].Với nghiên

cứu của Panjaitan và cộng sự (2007): tỷ lệ ra rễ cao nhất thu được trên môi

trường MS có bổ sung IBA 1 mg/l với chiều dài rễ trung bình là 2 cm [47].

Còn nghiên cứu của Roy và cộng sự (2012) thì môi trường ra rễ phù hợp nhất

MS ½ bổ sung IBA 4,0 mg/l (sau 4 tuần) số rễ trung bình là 12 đến 14 rễ trên

một cây [52]. Theo Mumo (2013), môi trường có bổ sung hàm lượng IBA từ

0,1 mg/l đã có cảm ứng tạo rễ. Tỷ lệ ra rễ cao nhất trong môi trường MS bổ

sung IBA 2,5 mg/l [36].

Kết luận: môi trường ra rễ phù hợp nhất là MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

và than hoạt tính.

C

D

Rễ

A) Chồi ban đầu trên môi trường ra rễ; B, C, D) Chôi trên môi trường R1, R2,

R3 sau 4 tuần; Mũi tên chỉ rễ hình thành trên môi trường R2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6. Tạo cây hoàn chỉnh

Hình 3.7. Rễ cây đu đủ đực in vitro trên môi trường R2

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra quy trình nhân giống

in vitro cây đu đủ đực như sau:

Bước 1: Chọn vật liệu nuôi cấy: đoạn thân hoặc ngọn cây đu đủ đực.

Bước 2: Chế độ khử trùng mẫu cấy: HgCl2 0.15% trong 13 phút

Bước 3: Tạo mô sẹo: môi trường MS + α NAA 1,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l

Bước 4: Tái sinh chồi từ mô sẹo: MS + α NAA 0,1 mg/l + BAP 1 mg/l

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Bước 5: Nhân nhanh chồi: MS + α NAA 0,25 mg/l + BAP 1 mg/l

Bước 6: Tạo cây hoàn chỉnh: môi trường MS + IBA 1,5 mg/l + than hoạt tính.

Hình 3.8. Quy trình nhân giống cây đu đủ đực

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1) Đối với chế độ khử trùng mẫu cấy: chế độ khử trùng HgCl2 0,15%

trong 13 phút là phù hợp để khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy (tỷ lệ mẫu sạch

sống đạt 31,58 %). Vật liệu phù hợp nhất để cho hiệu quả khử trùng cao là

mẫu còn non, ngọn mới phân hóa.

2) Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng đến khả năng hình

thành mô sẹo: môi trường MS có bổ sung NAA 1,0 mg/l và BAP 0,5 mg/l cho

tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất (95,4%) với mô sẹo có đặc điểm xanh nhạt, rắn, tốc

độ sinh trưởng khá tốt.

3) Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo: môi trường phù hợp cho tái sinh

chồi từ mô sẹo là môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l, NAA 0,1 mg/l, tỷ lệ

tái sinh chồi đạt 40,3%, với chất lượng chồi tốt, có màu xanh nhạt. Môi

trường phù hợp cho nhân chồi từ mô sẹo là môi trường MS bổ sung BAP 1,0

mg/l, NAA 0,25mg/l, hệ số nhân chồi đạt 2,67 vớisố lá/ chồi 2-3 lá/chồi, chồi

có màu xanh nhạt.

4) Tạo cây hoàn chỉnh: môi trường MS có bổ sung IBA 1,5 mg/l và

than hoạt tính có tỷ lệ hình thành rễ tốt nhất, với số rễ/ chồi là 2. Đặc điểm rễ

có 1 rễ chính dài và 1 rễ phụ.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để tăng hệ số nhân chồi, tạo

rễ hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây đu đủ đực với các dòng đu đủ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

đực khác nhau để tạo nguồn dược liệu phong phú đa dạng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997),“Công nghệ tế bào thực

vật trong cải tiến giống cây trồng”, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

2. Ngô Xuân Bình (2010), “Nuôi cấy mô tế bào thực vật”, NXB Khoa học

và kỹ thuật.

3. Nguyễn Đức Đoàn (2005), “ Cây quả cây thuốc”, NXB Y học, tr. 30-32.

4. Hồ Thị Hà và cộng sự, (2014), “Carpainone: Alkaloid mới từ lá câu đu

đủ”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 52 (5), tr. 593-598.

5. Thái Hà, Đặng Mai (2011), “Bạn của nhà nông kỹ thuật trồng và chăm

sóc cây đu đủ”, NXB Hồng Đức.

6. Trung Hiếu (2005), “Chữa bệnh bằng cây, củ, quả”, NXB Y học.

7. Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Tuấn Anh, Phạm Thị Ngọc (2010). “Khảo

sát đặc điểm cấu tạo hoa, cụm hoa và biểu hiện kiểu hình giới tính của

các mẫu giống đu đủ (Carica Papaya L.) mới thu thập”, Tạp chí Khoa

học và Phát triển, 8(6), tr. 883 – 889.

8. Lê Văn Hoàng (2008), “Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật”,

Giáo trình, Trường đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng.

9. Trần Bá Hoành và cộng sự (2011), “Từ điển giáo khoa Sinh học”, NXB

Giáo dục Việt Nam.

10. Nguyễn Thành Hối(2000), “Kỹ thuật trồng đu đủ” , NXB Nông nghiệp, tr. 4.

11. Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình (1999), “Góp phần nghiên

cứu hoạt tính sinh học của Flavonoid lá đu đủ (Carica papaya )”, Tạp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

chí Dược học, 6 (278), tr. 15 - 17.

12. Nguyễn Như Khanh (2011), “Giáo trình các chất điều hoà sinh trưởng

thực vật”,NXB Giáo dục.

13. Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học.

14. Đoàn Lư (2015), “Rau ngon thuốc quý”, NXB Dân Trí.

15. Đỗ Văn Nam, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Bích Hồng, Phạm Thị

Ngọc, Nguyễn Văn Hoan, Nguyễn Thị Phương Thảo (2013), “Nhân

giống vô tính in vitro cây đu đủ Carica papaya L.”, Tạp chí Khoa học và

phát triển,11(6), tr. 833-839.

16. Nguyễn Thị Nhẫn (2004), “Nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro

cây đu đủ”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp,2(3), tr.174-180

17. Dương Phong (2016), “Kỹ thuật chọn giống, chăm sóc và phòng bệnh

cho cây đu đủ”, NXB Hồng Đức.

18. Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Thu Sang (2006), “Khảo sát tinh sạch Enzyme

Chymopapain trong mủ trái đu đủ Việt Nam”, Tạp chí Phát triển Khoa

học và công nghệ, 9(5), tr. 59-63.

19. Ngọc Phương, Hồng Hà (2009), “Đông Y trị bách bệnh”, NXB Văn hóa

- thông tin.

20. Phan Đình Kim Thư, An đệ (2012), “Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất cây

giống đu đủ in vitro lưỡng tính nhằm phát triển đu đủ hàng hóa chất

lượng cao ở miền đông nam bộ”, Viện cây ăn quả Miền nam, Viện Khoa

học nông nghiệp Việt Nam.

Tiếng anh

21. Ahmad N, Fazal H, Ayaz M, Abbasi B H, Mohammad I,Fazal L (2011),

“Dengue fever treatment with Carica papaya leaves extracts”,Asian

Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 1(4), pp. 330-333.

22. Anjum V, Arora P, Ansari S H, Najmi A K, Ahmad S (2017),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

“Antithrombocytopenic and immunomodulatory potential of

metabolically characterized aqueous extract of Carica papaya leaves”

Pharmaceutical Biology, 55(1), pp. 2043–2056.

23. Boomi M, Ruchi M, Shipra G, Abdul S. A, Nirmal K. L (2009), “Sperm

characteristics and ultrastructure of testes of rats after long-term

treatment with the methanol subfraction of Carica papaya seeds”, Asian

Journal of Andrology11, pp. 583–599.

24. Chandrasekaran R , Seetharaman P , Krishnan M , Gnanasekar S,

Sivaperumal S (2018), “Carica papaya (Papaya) latex: a new paradigm to

combat against dengue and flariasis vectors Aedes aegypti and Culex

quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)”, 3 Biotech 8, pp. 83.

25. Chong-Pérez B, Carrasco B, Silva H, Herrera F, Quiroz K, Garcia-

Gonzales R. (2018), “Regeneration of highland papaya

(Vasconcelleapubescens) from anther culture”, Appl Plant Sci.,

6(9):e01182 doi: 10.1002/aps3.1182.

26. Gatambia E K, Agnes W K, Fredah K R and Monica M W (2016), “In

vitro Meristem Culture for Rapid Regeneration of Papaya Plantlets in

Liquid Media”, Annual Research & Review in Biology, 9(1), pp. 1-7.

27. Gheith I, El-Mahmoudy A (2018), "Novel and classical renal biomarkers

as evidence for the nephroprotective effect of Carica papaya leaf

extract”, Bio Rep, 38(5), pp. 1-10.

28. Juárez-Rojop IE, Díaz-Zagoya JC, Ble-Castillo JL, MirandaOsorio PH,

Castell-Rodríguez AE, Tovilla-Zárate CA, Rodríguez-Hernández A,

Aguilar-Mariscal H,Ramón-Frías T, Bermúdez-Ocaña DY (2012),

“Hypoglycemic effect of Carica papaya leaves in streptozotocin-induced

diabetic rats”, BMC Complement Altern Med.12, pp.236.

29. Levecke B, Buttle D J, Behnke JM, Duce IR, Vercruysse1 J (2014),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

“Cysteine proteinases from papaya(Carica papaya) in the treatment of

experimental Trichuris suis infection in pigs: two randomized controlled

trials”, Levecke et al. Parasites & Vectors 7, pp.255.

30. Mangala BM, Murthy MB, Murthy BK, Bhave S (2012), “Comparison

of safety and efficacy of papaya dressing with hydrogen peroxide

solution on wound bed preparation in patients with wound gape”, Indian

J Pharmacol., 44(6), pp. 784–787.

31. McCubbin MJ, Staden J V, Debergh P (2003), “A modified technique for

in vitro propagation of papaya (Carica papaya L.)”, South Africa Journal

of Botany, 69(3), pp. 287–291.

32. Melariri P, Campbell W, Etusim P, Smith P (2011), “Antiplasmodial

Properties and Bioassay-Guided Fractionation of Ethyl Acetate Extracts

from Carica papaya Leaves”, Journal of Parasitology Research, Article

ID 104954.

33. Mikhal'chik EV, Ivanova AV, Anurov MV, Titkova SM, Pen'kov

LY, Kharaeva ZF, Korkina LG (2004), “Wound-healing effect of

papaya-based preparation in experimental thermal trauma”, Bull ExpBiol

Med.,137(6), pp. 560-562.

34. Mondal M, Gupta S, Mukherjee BB (1994), “Callus culture and plantlet

production in carica papaya L”, Plant Cell Rep.,13(7), pp. 390- 393.

35. Moraes D, Marcelo Arantes Levenhagen MA, Costa-Cruz JM,

Costa NettoAP, Rodrigues RM (2017), "In vitro efficacy of latex and

purified papain from Carica papaya against Strongyloides venezuelensis

eggs and larvae", Rev Inst Med Trop Sao Paulo, PMC 5441158, PMID:

28380118.

36. Mumo N N, Rimberia F K, Mamati G E, Kihurani A W (2013), “In vitro

regeneration of selected Kenyan papaya (Carica papaya L.) lines through

shoot tip culture”, African Journal of Biotechnology,12(49), pp. 6826-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

6832.

37. Murakami S , Eikawa S , Kaya S , IMAO M , Aji T (2016), "

AntiTumor and Immunoregulatory Effects of Fermented Papaya

Preparation (FPP: SAIDOPS501)", Asian Pac J Cancer Prev, 17(7): pp.

3077-84.

38. Naggayi M, Mukiibi N, Iliya E (2015), “The protective effects of

aqueous extract of Carica papaya seeds in paracetamol induced

nephrotoxicity in male wistar rats”, African Health Sciences, 15(2), pp.

598–605.

39. Nguyen TT, Shaw PN, Parat MO, Hewavitharana AK (2013),

"Anticancer activity of Carica papaya: a review", Mol Nutr Food Res,

57(1): pp. 153-64

40. Nguyen TT, Parat M-O, Shaw PN, Hewavitharana AK, Hodson MP

(2016), “Traditional Aboriginal Preparation Alters the Chemical Profile

of Carica papaya Leaves and Impacts on Cytotoxicity towards Human

Squamous Cell Carcinoma”, PLoS One, 11(2): e0147956.

41. Nisa F Z, Astuti M, Murdiati A, Haryana S M (2017), "Anti-proliferation

and Apoptosis Induction of Aqueous Leaf Extract of Carica papaya L. on

Human Breast Cancer Cells MCF-7" , Pak J Biol Sci, 20(1): pp. 36-41.

42. Ojo OA , Ojo AB , Awoyinka O , Ajiboye BO , Oyinloye BE ,

Osukoya OA , Olayide II , Ibitayo A (2017) "Aqueous extract of Carica

papaya Linn. roots potentially attenuates arsenic induced biochemical

and genotoxic effects in Wistar rats.", J Tradit Complement Med, 8(2):

pp. 324-334.

43. Okoko T, Ere D (2012), “Reduction of hydrogen peroxide- induced

erythrocyte damage by Carica papaya leaf extract”, Asian Pac J Trop

Biomed, 2(6), pp. 449-453.

44. Otsuki N, Dang NH, Kumagai E, Kondo A, Iwata S, Morimoto C

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

(2010), " Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor

activity and immunomodulatory effects", J Ethnopharmacol, 127(3): pp.

760-7

45. Pandey S , Cabot PJ , Shaw PN , Hewavitharana AK (2016), " Anti-

inflammatory and immunomodulatory properties of Carica papaya.", J

Immunotoxicol,13(4):pp. 590-602.

46. Pandey S, Walpole C,Shaw P N,Cabot P J, Hewavitharana A K,1, Batra

J (2018), "Bio-Guided Fractionation of Papaya Leaf Juice for

Delineating the Components Responsible for the Selective Anti-

proliferative Effects on Prostate Cancer Cells", Frontiers in

Pharmacology, 9: doi: 10.3389/ fphar.2018.01319.

47. Panijaitan S B, Aziz M A, Rashid A A, Saleh N M (2007), “In vitro

plantlet regeneration from shoot tip of field grown Hermaphrodite

Papaya (Carica papaya L. cv. Eksotika)”, Internationnal Journal of

Agriculture & Biology, 09(6), pp. 827–832.

48. Pathak N , Khan S , Bhargava A , Raghuram GV , Jain D , Panwar H ,

Samarth RM , Jain SK , Maudar KK , Mishra DK , Mishra PK 92014),

"Cancer chemopreventive effects of the flavonoid-rich fraction isolated

from papaya seeds", Nutr Cancer;66(5): pp. 857-71.

49. Prado SBRD, Santos GRC, Mourão PAS, Fabi JP (2019), "Chelate-

soluble pectin fraction from papaya pulp interacts with galectin-3 and

inhibits colon cancer cell proliferation", Int J Biol Macromol;1(126): pp.

170-178.

50. Ranasinghe P, Ranasinghe P, Abeysekera W P K M, Premakumara G A

S, Perera Y S, Gurugama P, Gunatilake S B (2012), “In vitro erythrocyte

membrane stabilization properties of Carica papaya L. leaf extracts”,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

Pharmacognosy Res.; 4(4), pp. 196–202.

51. Rohman M M, Islam M N, Alam M S, Munshi Rashid Ahmad M S, Paul

T K (2007), “Lateral Bud of Papaya (Carica papaya) for Clonal

Propagation”, Biotechnology, 6(3): pp. 339-343.

52. Roy P K, Roy S K, Hakim M L (2012), "Propagation of Papaya ( Carica

Papaya L.) cv. Shahi through in vitro culture", Bangladesh J. Bot, 41(2),

pp. 191-195

53. Saksena P (2013), “Cell and tissue studies in papaya (Carica papaya

L.)”, Nanobiotechnica Universale, 4(1&2), pp. 1-11.

54. Sekeli R, Hamid M H, Roslinda R A, Wee C, Ong-Abdullah J (2018),

“Malaysian Carica papaya L. var. Eksotika: Current Research Strategies

Fronting Challenges”, Frontiers in Plant Science 9, Article 1380.

55. Setargie A, Mekbib F, Abraha E (2015),“In vitro Propagation of Papaya

(Carica papaya L.)”, World Journal of Agricultural Sciences, 11 (2),

pp.84-88.

56. Tham C S (2013), “Morphological study of bone marrow to assess the

effects of lead acetate on haemopoiesis and aplasia and the ameliorating

role of Carica papaya extract” Experimental and Therapeutic Medicine

5,pp. 648-652.

57. Wu KL, Zeng SJ, Chen ZL, Duan J (2012) In vitro mass propagation of

hermaphroditic Carica papaya cv. ‘Meizhonghong’. Pak J Bot, 44(5),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

pp.1669–1676.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần môi trường MS (1962)

Hàm Hàm

STT Thành phần lượng STT Thành phần lượng

(mg/l) (mg/l)

1 332,02 10 8,60 CaCl2 ZnSO4

440 CaCl2.6H2O

170 0,025 2 11 CoCl2.6H2O KH2PO4

1900,00 0,025 3 12 CuSO4.5H2O KNO3

180,54 0,25 4 MgSO4 13 NaMoO4.2H2O

1650,00 16,90 5 NH4NO3 14 MnSO4.H2O

15 Glycin 27,8 2,00 6 FeSO4.7H2O

37,3 EDTA

36,70 16 Thiamin HCl 0,10 Hoặc

FeNaEDTA

6,2 17 Pyridoxine HCl 0,50 7 H2BO3

0,83 18 Axit Nicotinic 0,50 KI 8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – Đại học Thái Nguyên http://lrc.tnu.edu.vn

16,90 100,00 Myo - inositol 9 MnSO4.H2O

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây đu đủ đực (Carica Papaya L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ----------

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ HƯƠNG GIANG

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

(CARICA PAPAYA L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thời gian

Tỷ lệ sạch

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ chết

Tỷ lệ nhiễm

Số mẫu

nuôi cấy

(%)

(%)

(%)

(%)

CĐ 1: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 15 phút

CĐ2: Chế độ khử trùng 2: HgCl2 0,15% trong 13 phút

CĐ3: Chế độ khử trùng 1: HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1) và 5 phút (lần 2)

Tỷ lệ

Thời

Số

Tỷ lệ

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ

Độ tuổi mẫu

nhiễm

gian

mẫu

sạch (%)

(%)

chết (%)

(%) 39,29

Kí hiệu

α-NAA

BAP

IBA

Số

Tỷ lệ mẫu tạo

Tốc độ sinh

Đặc điểm mô sẹo

MT

(mg/l)

(mg/l)

(mg/l)

mẫu

callus (%)

trưởng

Kinetin

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

Đặc điểm sinh trưởng mô sẹo

Chất lượng chồi

(mg/l)

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 30 ngày

C

D

Rễ

Tiếng việt

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam