Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi (stephania spp.)

34

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ----------------------------------

Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ

HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

Ở CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

1

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ----------------------------------

Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ

HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

Ở CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn

2

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen

mã hóa enzyme columbamine O-methyltransferase ở cây Bình vôi (Stephania

spp.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Mọi kết quả thu được là trung

thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác. Tất cả những tham khảo và

kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Tác giả luận văn

i

Tangmany SYSOMEPHONE

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành

cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại

Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn,

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong

quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ

trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học

của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị cho tôi

những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến chuyên

ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.

Tôi xin cảm ơn ThS. Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ

gen và Công nghệ tế bào của Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm – Đại

học Thái Nguyên, đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thí

nghiệm.

Tôi xin cảm ơn những ý kiến nhận xét của các thầy cô trong Hội đồng

đánh giá luận văn ngày 16 tháng 11 năm 2020.

Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh

sống tại Thái Nguyên, Việt Nam.

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Tác giả luận văn

ii

Tangmany SYSOMEPHONE

MỤC LỤC

Trang

i LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................

ii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................

MỤC LỤC................................................................................................... iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT......................................................................... v

DANH MỤC CÁC HÌNH........................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................... vii

1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................

3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................

3 1.1. Cây Bình vôi .......................................................................................

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi 3

1.1.2. Giá trị của cây Bình vôi ………………………………………….... 7

1.1.3. Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi …………. 12

1.2. Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương……………………… 13

1.3. Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện

hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc ……………….....………. 15

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 22

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu............................................ 23

2.2.1. Hóa chất nghiên cứu.......................................................................... 23

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu........................................................................... 24

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu......................................................................... 24

2.3. Phương pháp nghiên cứu ……............................................................. 24

2.3.1. Nhóm phương pháp tạo dòng gen..................................................... 24

iii

2.3.1.1. Thiết kế mồi colony- PCR.............................................................. 24

2.3.1.2. Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp............................................. 25

2.3.1.3. Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp........... 25

2.3.1.4. Tách chiết và tinh sạch plasmid...................................................... 26

2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích ........ 27

2.3.2.1. Xử lý enzyme cắt giới hạn............................................................. 27

2.3.2.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR ............................................ 28

2.3.2.3. Gắn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121................................. 28

2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc

nhiệt............................................................................................................ 29

2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)................. 29

2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E.coli............................................... 30

2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới

hạn............................................................................................................... 31

2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung

điện............................................................................................................. 31

2.3.2.9. Chọn dòng A. tumefaciens tái tổ hợp............................................... 32

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 33

3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT .... 33

3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo

CoOMT ...................................................................................................... 35

3.3. Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium

tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT.................................................. 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 40

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ ......................................... 41

iv

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 42

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

cDNA ADN bổ sung Complementary

Deoxyribonucleic Acid

CoOMT Columbamine O-

Methyltranferase

Cs/cs Cộng sự

EB Extration buffer

EDTA Ethylene diamine

tetraacetic acid

EST expressed sequence tag

Fw Mồi xuôi Primer forward

LB Lysogeny Broth Môi trường nuôi cấy vi

khuẩn

OMT O-Methyltranferase

PCR Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi Polymerase

Rv Mồi ngược Primer reverse

SDS Sodium doecyl sulfate

SMT S-adenosyl-L-

methionine:scoulerine 9-O-

methyltransferase

SOC môi trường giàu dinh dưỡng Soil organic carbon

v

(dùng để tạo dòng vi khuẩn)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vôi………................................................. 6

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)... 11

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine ..... 14

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……………………… 16

Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA…... 18

Hình 1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes…………………………… 19

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pUC19……………………………........... 22

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121…………… …………………….. 23

Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong

con đường tổng hợp palmatine .................................................................... 34

Hình 3.2. Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT....……… 34

Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT.......................................... 35

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR..................................... 36

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector PUC-1113 và vector

pBI121 với enzyme XbaI và SacI ................................................................ 37

Hình 3.6. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. Coli 37

Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong

vi

A.tumefaciens............................................................................................... 38

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania…………………………………………………………... 10

Bảng 2.1. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR........................... 24

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối ghép gen............................................. 25

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony-PCR…………………………….. 26

Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid …………………………... 27

Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn........................... 28

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen............................................. 28

Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn………………... 31

vii

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR…………………………………….. 32

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Bình vôi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae),

là một loài cây thân thảo dạng dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào

núi đá, có củ nặng tới hơn 40kg. Vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá.

Củ còn được gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”… Cây

Bình vôi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại tỉnh Hà Giang, Tuyên

Quang, Hòa Bình, Hà Tây (cũ) … Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất

alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin.

Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có

tác dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau

dạ dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Hiện nay, cây Bình vôi đang bị

khai thác nhiều, số lượng cây Bình vôi tự nhiên ngày càng giảm mạnh. Bình

vôi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp”

(V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số

32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ.

Chi Bình vôi (Stephanta) có khoảng trên 45 loài, còn ở Việt Nam có từ

14 đến 16 loài, trong đó một số loài như Bình vôi hoa đầu (Stephania

cepharantha Hayata), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng

(Stephania japonica Miers) đang được khai thác, và nhìn chung hàm lượng

rotundin của các loài Bình vôi là thấp và rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều

kiện sinh thái. Do vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng rotundin

ở cây Bình vôi được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện

enzyme chìa khóa tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp rutundin là rất

quan trọng. Columbamine O-methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện

là một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc

bộ Mao lương, trong đó có cây Bình vôi [77]. Biểu hiện mạnh gen mã hóa

1

enzyme CoOMT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng

rotundin trong cây Bình vôi được nâng cao. Xuất phát từ những lí do trên chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen

mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi

(stephania spp.)”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme

columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT.

- Tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT.

- Thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium

2

tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây Bình vôi

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây Bình vôi

Về nguồn gốc, phân loại: Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh

pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa

trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn

gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia. Tên gọi dân dã trong

tiếng Việt là Bình vôi [91].

Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc:

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Ranunculales

Họ (familia): Menisperrnaceae

Chi (genus): Stephania Lour [13].

Trên thế giới chi Bình vôi (genus: Stephania) có khoảng 50 loài, phân bố

ở vùng nhiệt đới, chủ yếu như là các nước châu Á như: Trung Quốc 43 loài,

Thái Lan 18 loài, Indonesia 17 loài, Việt Nam 14-16 loài, Malaysia 17 loài, Ấn

Độ 11 loài, Philippine 8 loài, Papua New Guinea 8 loài, Myanma 5 loài, Nhật

Bản 2 loài, Sri Lanka 2 loài, Lào 2 loài, Đông Timor 1 loài, Nepal 1 loài. Ngoài

ra còn có ở châu Úc: Australia 7 loài và châu Phi 12 loài [11].

Ở Việt Nam, các loài trong chi Bình vôi phân bố rất rộng, trên nhiều địa

phương từ Bắc vào Nam. Song các khu vực có số loài phong phú, đa dạng và

tập trung hơn cả ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn,

Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hòa

Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh. Một số ít

loài (S. venosa, S. cambodica, Gagnep, S. pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam

như: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yến, Ninh Thuận, Khám Hòa, Bà

3

Rịa-Vũng Tàu và An Giang [8].

Đặc điểm sinh học

Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm hoặc

hằng năm. Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc

xanh đậm. Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sần sùi,

màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành

rễ củ. Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc. Củ thường có dạng

hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định. Có loài rễ củ thường chỉ

nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặng tới 50-70

kg. Tuy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà hình

thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng, nâu

đậm, xám tro, đen…). Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà,

vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [16].

Lá Bình vôi mọc cách. Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20

cm và hai đầu phồng lên [8], có khi gấp khúc ở gốc [11]. Cuống lá đính vào lá

thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc là ở những khoảng cách nhất

định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá). Phiến

lá mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác

rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc

chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát

từ đỉnh cuống lá. Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn,

phằng hoặc gần hình tim. Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu

xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [24].

Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá. Cụm hoa

có dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [8], có cuống

đơn độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh

cuống cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa

[13]. Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2

4

vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường

4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn. Hoa

cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh

hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [24].

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt. Ở quả

trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy.

Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Hạt hình

móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng

hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một số loài

có 5 hàng [24]. Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon;

nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên

khoa học đối với các loài chi Bình vôi [8]. Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng

rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [14].

Sinh thái, sinh trường và phát triển của các loài Bình vôi

Các loài thuộc cây Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên

sinh hay rừng thứ sinh. Chúng thường mọc trên đỉnh hay các sườn núi đá vôi,

núi đất xen lẫn đá, các dài đất ven đường, ven song, đôi khi gặp ở ven bòe biển.

Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 23oC, lượng mưa 2000- 2500

mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH= 6,5- 7. Một số loài có thể phân bố

ở độ cao tới 2000 – 2800 m so với mực nước biển. Hầu hết các loài Bình vôi

đều ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả.

Các loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm.

Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ)

ngay từ tháng 11- 12. Những chồi này ở trạng thái “chồi ngủ” cho đến mùa

xuân (tháng 1- 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh. Chỉ trong vòng 1- 2

tháng, chồi đã dài tới hơn 1 m. Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của

cây Bình vôi, vì trên loài chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồi

xuân hè (chồi cấp II). Số lá chồi cấp II nhiều hơn cấp bội so với chồi đông xuân

5

(tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi). Lá trưởng thành ngay trong mùa

hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10). Sự rụng lá hàng năm cũng là

tập tính quang trọng của cây Bình vôi. Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình

vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống

đất. Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những

mảnh khác. Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi. Trong

tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng.

Hạt Bình vôi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1000 hạt thường

chỉ khoảng 10- 29g. Hạt phát tán nhờ nước. Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt

thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh. Chỉ sau 5- 6 tháng tuổi, cây đã vươn

dài tới 50-100) cm, phân cành khỏe. Ở một số loài, cây có thể bắt đầu ra hoa và

cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi. Trong quá trình sinh

trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ở những loài có củ) hoặc phân

nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những loài chỉ có rễ dạng sợi) [8].

Hình 1.1. Hình ảnh về cây Bình vôi

6

(Nguồn: http://www.thuocvuonnha.com/c/dung-cu-binh-voi-chua-mat- ngu/hoi-dap)

1.1.2. Giá trị của cây Bình vôi

Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian. Củ

Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa hen,

ho lao, lỵ, sốt, đau bụng.

Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, Bình vôi được dùng dưới dạng

thuốc sắc, thuốc bột hoặc rượu thuốc để chữa bệnh mất ngủ, sốt nóng, nhức

đầu, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở… Liều dùng: 6 - 12 g/ngày

[2], [3]. Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vôi (1 phần) với rượu 40° (5 phần);

mỗi ngày uống 5 - 15 ml rượu, có thể thêm đường cho dễ uống [6]. Để tránh bị

ngộ độc, nên sử dụng liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 –

0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [6], [21]. Trong y học hiện đại, Bình vôi chủ yếu

được dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy L-tetrahydropalmatin hoặc

cepharanthin tuỳ theo loài. L-tetrahydropalmatin (Rotundin) được dùng là

thuốc trấn kinh, an thần dùng trong các trường hợp: Mất ngủ, trạng thái căng

thẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần [6], [17], [94]. Liều dùng

là 0,05g - 0,10g dưới dạng viên L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc sulfat

[6], [94].

Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin

(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng

phổ biến để điều chế các loại thuốc. Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn

xuất của nhân isoquinolin. Trong đó quan trọng nhất là rotundin.

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của alkaloid và

rotudin trong cây như sau:

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản

ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tính

mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc

thử của alkaloid. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp

7

chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [55].

Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, ở thể rắn ở nhiệt

độ thường. Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, các

alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng. Ở thể rắn, chúng dễ kết tinh và có độ chảy

xác định. Một số alkaloid không đo được độ chảy do bị phá hủy ở nhiệt độ thấp

hơn độ chảy. Các alkaloid ở dạng lỏng thường không có oxy trong phân tử

(nicotin, spartein). Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo

muối với acid thì nó có thể chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng

spartein sulfat ở thể rắn). Tuy nhiên có một vài trường hợp ngoại lệ một số

alkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin

[16], [4].

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất

độc. Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau.

Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được

các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều

thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng

hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây. Do đó, người ta vẫn dùng

phương pháp chiết xuất từ cây, ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin,

eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa bán

tổng hợp, ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine,

vincamin [16], [4], [8].

Trước đây, người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất

đường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh

ra. Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng

xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin. Qua định tính

và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay

đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây, người ta thấy nơi tạo ra

8

alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo

ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những

biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt.

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đỗ Tất Lợi và P. Bonnet đã phát

hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vôi, đặt tên là rotundin - có tác dụng an

thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau

do co thắt cơ trơn [96].

Năm 1998, Nguyễn Tiến Vững và cs đã tiến hành thăm dò tác dụng của

L-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ. Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện

cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não. Kết quả là sau khi cho

thỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền,

thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong

thể lưới thân não có những biến động rõ. Sự tăng thành phần sóng chậm denta

và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin có tác

dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại

não và thể lưới thân não [14].

Năm 1996, Dương Hữu Lợi thử nghiệm tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml

dung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau 0,5%, 1%, 2% nhận

thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì

trong vòng 3-5 giờ [4].

Theo Zhu (1991), D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được

phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua không chỉ

có tác dụng giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ [90].

Năm 1986, Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận nghiên cứu đã cho thấy

gindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alkaloid

chiết từ củ Bình vôi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách

rõ rệt. Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năng kéo

dài thời gian ngủ lên 1,5 lần. Hỗn hợp alkaloid với liều 100 mg/kg thể trọng

9

chuột cũng có tác dụng tương đương [18].

Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania

Hoạt tính Tên chất Tài liệu

Chống sốt rét

[30], [53]

Kháng sinh

[48], [71]

Diệt giun sán [40]

Chống virus [26], [51]

Chống ung thư

[29], [31]

Dehydroroemerine, tetrahydropalmatine, xylopinine, cepharanthine, Nmethylliriodendronine, 2-O, N dimethylliriodendronine, liriodenine, dicentrinone, corydine, aloe-emodine Glabradine, dịch chiết trong cồn từ củ từ loài S. glabra (Roxb.) Mies, dịch chiết trong methanol từ rễ của loài S. japonica, cepharanone D,Nformyl-asimilobine, Nformylannonain Dịch chiết trong cồn từ rễ của loài của cây S. glabra (Roxb.) Miers Dịch chiết từ củ trong methanol của loài S. cepharantha Hayata dl-tetrandrine, fangchinoline, d- tetrandrine, d-isochondrodendrine, dịch chiết trong cồn từ củ của loài S. venosa (Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine. (−)-Stepholidine, Ltetrahydropalmatin An thần [41], [90]

Kích đẻ cho phụ sản Tetrandrine [89]

[31], [42]

Đảo chiều đa kháng Insotrilobine và trilobine [46]

Chống viêm và Tetrandrine, fangchinoline,

Ltetrahydropalmatin, cepharinthin giảm đau

Miễn dịch Tetrandrine [47], [63]

Chặn kênh Ca2+ Tetrandrine [67], [79]

10

Chống oxi hóa Fangchinoline cepharanthine [45], [74]

Nguyễn Tiến Vững đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của L-

tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đã kéo

dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm trực

tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần [14].

Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang. L-tetrahydropalmatin có tác dụng

trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone [56].

Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid,

lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong

quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [50].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)

Rotundin có công thức phân tử: C12H25NO4. Khối lượng phân tử là

M=355,43. Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10-

tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine.

Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng

isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong

các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật.

Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú. Kết

quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L-

tetrahydropalmatin rất ít độc. Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30

mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm thỏ mệt 1-2 ngày, đồng

11

tử bị liệt nhất thời rồi hết [16], [6].

Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến

chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim,

mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần. Rotundin

nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp

thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý. Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không

gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [10].

Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tác

dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [19]. Phạm Thị Kim,

Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện

Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng), tương

đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược

điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được

LD50 đường uống. Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm. Rotundin ít

độc. Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất

thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày. Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và

60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml

(60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày,

hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh... [10],

[95]. Chu Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự. nghiên cứu cơ chế giảm đau

của L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2,

ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc [35].

Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như:

Rotundin của công ty Dược phẩm TW3 [92], Rotundin của Công ty cổ phần

Dược phẩm TW2 [93].

1.1.3. Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi

Loài Bình vôi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú

bị xâm hại do nạn chặt phá rừng. Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đến nguy cơ

12

tuyệt chủng cao. Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh

giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy

cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006

của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [12].

Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật nuôi cấy tạo nguồn

nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc ngày một tăng.

1.2. Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương

Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối

tượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ. Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen

Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein

ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S, 5S,

L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit 1,

NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH

dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và c,

RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein, envelope

membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate

carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase, maturase K,

ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania. Bên cạnh đó, hệ gen lục lạp của loài

Stephania japonica cũng được xác định trình tự, kích thước của trình tự được

xác định dài 157719 bp [76].

Thực vật bậc cao có rất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau, gồm hơn

25000 terpenoid, khoảng 12000 alkaloid và 8000 phenolic [36]. Trong đó nhiều

chất có hoạt tính sinh học cao và được dùng làm thuốc, đặc biệt là các alkaloid.

Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh

tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng [66]. Mỗi methyltransferase trong quá trình

sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-

O-methyltransferase (6OMT) [68], [59], [69], [49], [57]; S-adenosyl-L-

methionine: coclaurine N-methyltransferase (CNMT) [43], [83], [33], [34]; S-

13

adenosyl-L-methionine: 3’ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase

(4’OMT) [57], [43]; S-adenosyl-L-methionine: scoulerine 9-O-methyltransferase

(SMT) [58], [78] và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơ chất chặt chẽ cho dù

các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc.

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [77]

Công trình nghiên cứu của Takashi Morishige và cs (2002) là công trình

14

đầu tiên đã xác định được gen mã hóa columbamine O-methyltransferase tham

gia trực tiếp chuyển hóa cơ chất tetrahydrocolumbamine để sinh tổng hợp

rotundin. Các tác giả cũng xác định được trình tự cDNA mã hóa enzyme này

dài 1053bp, mã hóa cho 351 amino acid (với mã số AB073908 trên Ngân hàng

gen Quốc tế). Các kết quả nghiên cứu xác định tất cả các gen O-

methyltransferase có liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline trong tế bào

Copapis Japonica. Tác giả giải trình tự 1014 cDNA được phân lập từ tế bào

nuôi cấy sản xuất alkaloid với hàm lượng cao của C. Japonica. Trong đó, tác

giả phát hiện ra tất cả ba O-methyltransferase và một O-methyltransferase

giống như bản sao cDNA có mã số CJEST64. cDNA này khá giống với cDNA

của gen mã hóa S-adenosyl-l-methionine: coclaurine 6-O-methyltransferase và

S-adenosyl-l-methionine: isoflavone 7-O-methyltransferase. Nhờ S-adenosyl-l-

methionine: columbamine O-methyl-transferase xúc tác chuyển đổi

columbamine thành palmatine, là một trong những thành phần chưa được phân

giải trong quá trình tổng hợp isoquinoline alkaloid ở C. japonica, tác giả đã xác

định được sự khác biệt của protein trong E.coli và đánh giá sự hoạt động của

columbamine O-methyltransferase. Protein tái tổ hợp biểu hiện rõ ràng hoạt

tính O-methyl hóa sử dụng columbamine, cũng như (S) -

tetrahydrocolumbamine, (S) -, (R, S) -scoulerine và (R, S) -2,3,9,10-

tetrahydroxyprotoberine làm chất nền. Kết quả này chứng tỏ rõ ràng rằng EST

rất hữu ích để phân lập gen quan tâm theo con đường sinh tổng hợp tương đối

tốt. Mối quan hệ giữa cấu trúc và sự nhận biết chất nền của O-methyltransferase

liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline alkaloid và palmatine [77].

1.3. Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện

hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc

Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là

bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bào

15

thực vật Hai lá mầm. Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector

liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary

vector) là phổ biến hơn. Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti

plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Hệ vector

được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận tải mang GOI

giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm

chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các

Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát

triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật. Để

tái bản trong A. tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế gồm các phần sau: (i)

Vị trí ghép nối đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả E. coli và A.

tumefaciens; (iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv)

Gen có khả năng vận chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T – DNA ngoại biên.

Ngoài ra, còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển

T – DNA [15], [60], [70].

Vector chuyển gen pBI121 có kích thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các

thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn

XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4).

16

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang được ứng dụng trên cây dược liệu

và ở nhiều cây trồng khác. Gần đây dữ liệu hệ gen học được phát triển dựa trên

những thông tin về trình tự các gen, dữ liệu EST (expressed sequence tag), thư

viện cDNA, microarray. Những nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng

các tiến bộ kỹ thuật chuyển gen, là cơ sở của những hiểu biết về chức năng gen

trên cơ sở tách dòng gen và phương pháp di truyền ngược. Trên cơ sở đó, nghiên

cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu quả ở cây dược liệu

nói chung, cây Bình vôi nói riêng là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến

lược cải thiện hàm lượng các dược chất quan trọng. Hai nhóm phương pháp được

ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và

chuyển gen gián tiếp. Trong đó, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng

bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã được ứng dụng

phổ biến [37].

Agrobacterium là các vi khuẩn đất thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, yếm

khí, gây ra bệnh sần ở thân và rễ khi xâm nhiễm qua vết thương. Agrobacterium

thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính, trong đó A.

tumefaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. A. tumefaciens cũng

giống như các loại vi khuẩn khác là có mang các plasmid. Các thực nghiệm

cho thấy, khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn A. tumefaciens không mang

plasmid sẽ không gây ra khối u ở thực vật. Khối u này chỉ được hình thành khi

vi khuẩn có mang plasmid. Như vậy chứng tỏ rằng plasmid của vi khuẩn đã

chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u ở cây. Do vậy

người ta gọi chúng là các Ti-plasmid (tumor inducing plasmid).

Ti-plasmid là một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb. Trên Ti -

plasmid có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái

(left border). T-DNA là đoạn sẽ tách khỏi plasmid, chuyển vào tế bào thực vật và

gắn vào bộ gen của cây. T-DNA chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin gây nên

17

sự phân chia tế bào liên tục và hình thành khối u. Ngoài ra nó còn chứa các gen

tổng hợp nên các axit amin biến dạng gọi là các opine là nguồn cacbon và nitơ

bổ sung cho vi khuẩn (các chất này không tồn tại ở cây bình thường). Ngoài T-

DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng gây độc, có chứa các gen vir chịu trách

nhiệm trong hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp T-DNA vào hệ gen tế bào thực

vật và tiêu hóa opine [9].

Hình 1.5. Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình

chuyển gen: (1) Vùng T-DNA: là đoạn DN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium

vào tế bào thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen của

cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay

đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu

hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [28]; (2) Vùng gây độc Vir

(Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến

virH, mỗi operon chứa một số gen. Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp

của T-ADN. Trong đó vir A, B, D, G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá

trình biến nạp ở tế bào thực vật; vir C, E, F, H có tác dụng làm tăng cường hiệu

quả quá trình biến nạp gen [39]; (3) Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium:

18

Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T-DNA, tuy nhiên NST

của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt

của tế bào vi khuẩn, giúp tạo ra exopolysaccarid, đồng thời gắn vi khuẩn vào tế

bào thực vật … Ngoài ra những gen khác như vir A đóng vai trò thứ yếu hơn trong

quá trình biến nạp [44].

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc

mất tính biệt hóa ở các mô, tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết

sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Đây là một trong những trở ngại

lớn do tồn dư các chất điều tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh

hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng. Tuy nhiên, việc này

hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ [65].

Hình 1.6. Cấu trúc Ri-plasmid của A. rhizogenes [84]

Vi khuẩn đất A.rhizogenes là vi khuẩn gram âm, gây bệnh rễ tơ ở thực

vật hai lá mầm. A.rhizogenes mang Ri-plasmid và đây là tác nhân gây bệnh rễ

tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Tế bào thực vật bị thương tiết ra các

polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây chuyển một đoạn T-DNA từ Ri-

plasmit vào hệ gen của tế bào vật chủ. Các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở

vi khuẩn A.rhizogenes có vai trò quan trọng quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

[26]. Trong thực tế, gen tạo rễ tơ đã được các nhà nghiên cứu sử dụng để thiết

19

kế vector biểu hiện mang gen chuyển. Cấu trúc vector biểu hiện mang gen

chuyển và gen tạo rễ tơ được chuyển vào thực vật thông qua A. tumefaciens, giúp

cho việc phân tích cây chuyển gen được thuận lợi, nhanh chóng sau 2- 4 tuần

chuyển gen.

Đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển

nhanh, phân nhánh cao và ổn định trên môi trường nuôi cấy mà không cần bổ

sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra

các hợp chất tự nhiên của hệ thống rễ tơ cũng cao hơn rất nhiều so với thực

vật nguyên vẹn, cũng như so với hệ thống dịch treo tế bào ở nhiều loài thực

vật. Với sự chuyển gen của A.rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng tổng

hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân

hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp lại hoặc tổng hợp với

hàm lượng không đáng kể. Rễ tơ được xem như là nguồn nguyên liệu có giá trị

trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia

trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm. Hơn nữa, kỹ thuật này có ý nghĩa lớn

trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp

với hiệu suất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành

sản phẩm. Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào, ta còn

có thể chuyển các gen ngoại lai thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong

đoạn T-DNA của A.rhizogenes. Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các hợp

chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong con

đường sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên mong muốn [52], [65].

Các nghiên cứu về cải tiến việc sản xuất alkaloid C. roseus đã tập trung

vào việc nuôi cấy tế bào và rễ tơ để làm sáng tỏ quy định về sự biểu hiện quá

mức của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp TIA ở cây chuyển gen.

Magnotta và cộng sự (2007) đã phân tích sự biểu hiện protein DAT trong rễ C.

roseus và kết luận rằng nó thay đổi cấu trúc MIA. Kết quả này cho thấy sự biểu

hiện quá mức của các gen trong con đường vindoline có thể dẫn đến những thay

20

đổi đáng kể hàm lượng alkaloid trong cây C. Roseus [54]. Dựa trên nghiên cứu

về sự biểu hiện mạnh của gen ORCA3 và G10H trong cây C. Roseus. Pan Q và

cộng sự (2012) kết luận rằng sự biểu hiện quá mức này làm tăng đáng kể sự

tích lũy của strictosidine, vindoline, catharanthine và ajmalicine [64]. Trong

năm 2010, Wang và cộng sự đã chuyển thành công gen G10H và ORCA3 vào

cây dừa cạn thông qua A. rhizogens MSU440. Do đó, hàm lượng catharanthine

trong cây chuyển gen tích lũy cao gấp 6,5 lần so với cây không chuyển gen

[82]. Ngoài ra, hệ thống tái sinh và chuyển gen ở C. roseus sử dụng

Agrobacterium tumefaciens được phát triển và hoàn thành thành công bởi

Wang và cộng sự (2012) [81].

Một số nghiên cứu khác như chuyển gen gus ở cây cà chua của Đỗ Xuân

Đồng và cs (2007), ở cây dưa hấu của Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012), ở

cây dầu mè của Võ Thị Thúy Huệ và cs (2011), ở cây thông nhựa của Vương

Đình Tuấn và cs (2012), ở cây xoan ta của Bùi Văn Thắng và cs (2013). Ngoài

ra, nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ điệp

(Phalaenopsis amabilis) của Trần Lê Lưu Li và cs (2008) với thí nghiệm lây

nhiễm bởi A.tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector 35S -GUS-INT chứa

gen uidA và nptII và thu được kết quả biểu hiện gus tối ưu ở nồng độ AS 50μM

21

sau 4 ngày đồng nuôi cấy [7], [20], [23], [25], [1], [22].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Trình tự cDNA mang thông tin di truyền mã hóa cho enzyme

columbamine O-methyltransferase (có mã số AB073908 trên Ngân hàng gen

NCBI) được sử dụng để tổng hợp gen nhân tạo. Trình tự gen nhân tạo có kích

thước 1113 bp được tổng hợp trên nền frit, tổng hợp gen theo công nghệ của

Công ty Phù Sa gồm trình tự cDNA CoOMT, Kdel, Cmyc và trình tự nhận biết

của enzyme giới hạn XbaI, SacI.

Vector tách dòng pUC19 do Công ty Phù Sa cung cấp (hình 2.1).

22

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector tách dòng pUC19

Vector biểu hiện pBI121-GUS được phòng Công nghệ tế bào thực vật,

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

cung cấp (hình 2.2).

Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện pBI121

2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Hóa chất nghiên cứu

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Enzyme phusion DNA

polymerase và T4-DNA ligase (Thermo Scientific), Kit tách chiết plasmid

(QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen), kit tinh sạch DNA GeneJET PCR

purification Kit (Thermo Scientific), thang DNA 1 Kb (Thermo Scientific).

Các hóa chất thông dụng khác: SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức);

isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức); phenol, EtBr (Ethidium bromide),

23

glycerol, agarose (Gribco, Mỹ); ethanol, agar (Fluka, Đức); carbenicillin

(Merk, Đức); cao nấm men, bactor peptone, d-NTPs (Promega, Mỹ); MgCl2,

CaCl2, NaOH, NaCl, kali acetate, axit acetic, glucose (Sigma).

2.2.2. Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR (MJ Research,

Mỹ), Máy đọc trình tự, máy ly tâm Eppendorf, máy điện di DNA, máy xác định

DNA trên gel agarose (Bio-Rad, Mỹ), máy làm khô DNA (Speed Vac), pipet

man, tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy đo pH, máy tính

chuyên dụng.

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm và luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Công

nghệ gen, Công nghệ tế bào thực vật, Di truyền học thuộc Khoa Sinh học,

Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên. Một phần thí nghiệm được

thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Nhóm phương pháp tạo dòng gen

2.3.1.1. Thiết kế mồi colony- PCR

Dựa trên trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI mã số

AB073908. Chúng tôi sử dụng phẩn mềm DNAstar thiết kế cặp mồi đặc trưng

cho phản ứng colony- PCR để tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang vector

pUC19_1113bp. Thông tin về cặp mồi được trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR

Nhiệt Kích

TT Tên mồi Trình tự (5' - 3') độ bắt thước gen

cặp dự kiến

24

1 Fw TCTAGAATGGATACTCCGAACAC 58oC 1113bp 2 Rv GAGCTCTCAGAGTTCGTCTT

2.3.1.2. Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp

Vecor pUC19 được cắt mở vòng bằng enzyme SmaI. Sản phẩm cắt được

điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng kit Jena Bioscience.

Phản ứng ghép nối gen mục tiêu CoOMT vào vector pUC19 có thành phần

được trình bày ở bảng 2.2. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, sau đó ly tâm

nhanh để bảo đảm tất cả thành phần nằm dưới đáy của tube PCR. Phản ứng

được ủ ở 37oC trong 15 phút, sau đó đặt lên nước đá để chuẩn bị biến nạp.

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối ghép gen

Thành phần Thể tích (µl)

Mạch thẳng vector (100ng) 1

DNA (300 ng/µl) 5

Dung dịch đệm eClone 1,5

Enzyme eClone 1

Nước khử ion 6,5

Tổng thể tích 15

2.3.1.3. Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp

Hỗn hợp phản ứng ligation được bổ sung vào 100µl tế bào khả biến trong

tube 1.5 ml và ủ trên nước đá khoảng 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được sốc nhiệt ở

42oC trong 60-90 giây. Tube phản ứng tiếp tục được đặt trong đá 5 phút, sau đó

được thêm 1 ml môi trường giàu dinh dưỡng (SOC) và nuôi lắc ở 37oC trong 60

phút. Tiến hành ly tâm thu tế bào vi khuẩn, đổ bỏ dung dịch nổi và trải 100 µl lên

đĩa môi trường thạch có chứa kháng sinh chọn lọc ampicillin (100µg/ml).

Sau 16 - 18 giờ nuôi khuẩn trên đĩa môi trường thạch, các khuẩn được

chọn lọc dựa trên kiểu hình được sử dụng cho phản ứng colony- PCR. Thành

phần của phản ứng được trình bày ở bảng 2.3.

Các dòng tế bào dương tính với phản ứng colony- PCR được nuôi trong

môi trường LB lỏng thu sinh khối để tách chiết và tinh sạch plasmid (trong 16

25

giờ, ở 37oC).

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony-PCR

STT Thành phần Thể tích (l)

1 Nước deion, khử trùng 6,5

2 PCR Master mix 2X 7,5

3 Primer forward (10 pmol): Fw 0,5

4 Primer reverse (10 pmol): Rv 0,5

5 Tế bào vi khuẩn

Tổng thể tích của phản ứng 15

2.3.1.4. Tách chiết và tinh sạch plasmid

Sau khi kiểm tra sản phẩm tách dòng tiến hành tách plasmid bằng dung

dịch sol I, sol II, sol II (Bảng 2.4). Các bước được tiến hành như sau:

Bước 1: Chuyển 2ml dịch nuôi sang ống eppendorf. Ly tâm 6000 v/p ở 4oC

trong 5 phút. Loại bỏ dịch môi trường để thu nhận cặn tế bào.

Bước 2: Làm tan cặn tế bào trong 100l dung dịch Sol I (giữ trong đá),

Bước 3: Bổ sung 200l dung dịch Sol II vào mỗi eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo

ngược eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút

Bước 4: Bổ sung 150l dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược eppendorf

vài lần và giữ trong đá trong 3-5 phút.

Bước 5: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút chuyển dịch phía trên

sang ống mới. Bổ sung hỗn hợp chloroform: isoamin (24:1) theo tỉ lệ

1:1, đảo đều mẫu sau đó để ở nhiệt độ phòng 15 phút.

Bước 6: Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hút dịch phía trên chuyển

sang ống mới.

Bước 7: Tủa plasmid bằng cách bổ sung 1 lần thể tích isopropanol lạnh và giữ

ở -20oC trong 30 phút.

Bước 8: Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Rửa sạch

26

mẫu bằng cách bổ sung 0,5ml ethanol 70độ. Ly tâm thu tủa 12000v/p

trong 10 phút ở 4oC (lặp lại 2 lần).

Bước 10: Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 2 phút hoặc để mở nắp trong

15 phút ở nhiệt độ phòng trong box bật quạt.

Bước 11: Hoà tan tủa plasmid trong 50l H2O khử vô trùng chứa 20g/ml

RNase. Mẫu được lưu giữ ở -20 oC.

Bước 12: Kiểm tra DNA plasmid bằng điện di trên gel agarose 1,0 %.

Bảng 2.4. Thành phần dung dịch tách plasmid

Dung dịch Hóa chất Nồng độ Thể tích

Tris- HCl, 1M, pH 8,0 25 mM 2,5 ml Dung dịch I (Sol I) EDTA, 0,5M, pH 8,0 10 mM 2 ml (khử trùng, giữ 4oC) Glucose 50 mM 0,9 g

Dung dịch II (Sol II) NaOH, 2N 0,2 N 10 ml

(Pha mới trước khi sử SDS, 10% 1% 10 ml dụng)

CH3COOK, pH 5,5 5,0 M 60 ml Dung dịch III (Sol III) CH3COOH 11,5% 11,5 ml (giữ 4oC) 28,5 ml H2O

(Tổng thể tích mỗi loại Sol, V= 100 ml)

Sử dụng kit tinh sạch plasmid của Jena Biociense để tinh sạch các dòng tế

bào dương tính với clony- PCR trước khi tiến hành giải trình tự.

2.3.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích

2.3.2.1. Xử lý enzyme cắt giới hạn

Vector pUC-1113 và vector pBI121 được xử lý bằng enzyme XbaI và

SacI. Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản

xuất bộ kit sử dụng enzyme.

Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt sau đó được điện di

27

kiểm tra trên gel agarose 1% dưới điều kiện 120V, 40 phút.

Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn

Thành phần Thể tích (µl)

Nước deion, khử trùng 14

Buffer Tango 10X 4

DNA (50 ng/µl) 20

XbaI (5U/ µl) 1

SacI (10 U/ µl) 1

40 Tổng thể tích của phản ứng

2.3.2.2. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Mảnh gel chứa đoạn gen có kích thước 1113 bp và vector pBI121 được

thu nhận vào ống 2 ml. Bổ sung dung dịch đệm gắn (binding buffer) vào gel

theo tỷ lệ: Vmẫu : Vđệm = 1 : 1, trộn đều và chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột, ly

tâm 13000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500l dung

dịch đệm rửa (washing buffer), ly tâm 13000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua

cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch đệm rửa. Hoà tan DNA

trong 30 – 50l nước cất hoặc dung dịch EB, đã được làm ấm đến 50oC, để ở

nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13000 v/p trong 1 phút.

2.3.2.3. Gắn đoạn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121

Sản phẩm thôi gel sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng

pBI121. Thành phần phản ứng nối ghép như sau:

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối ghép gen

STT Thành phần Thể tích (l)

1 2 3 4 5 1 1 6 1 1 Dung dịch đệm (10x) T4 ligase DNA (20 ng/ µl) pBI121 plasmid (20 ng/ µl) H2O

28

Tổng thể tích 10

Hỗn hợp được ủ ở 22oC trong 60 phút và sau đó được biến nạp vào tế

bào khả biến E.coliDH5α.

2.3.2.4. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

+ Chuẩn bị tế bào khả biến:

Tế bào E.coli DH5α được cấy ria trên môi trường LB đặc và nuôi qua đêm

ở 37oC. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC,

qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 37oC,

trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly

tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 4oC). Ly tâm 4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút.

Thu cặn và hoà tan trong 30ml CaCl2 0,1 M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm

4000 v/p, ở 4oC, trong 5 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút,

lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban

đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia 50 l dịch tế bào khả biến vào mỗi ống

eppendorf 1,5 ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -84oC.

+ Biến nạp:

Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -84oC và được làm tan trên đá. Bổ sung

5l vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp được

đặt trong đá 10-15 phút, rồi được chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC

trong 1 phút 30 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong 5

phút. Bổ sung 500 l môi trường LB lỏng, hỗn hợp được nuôi ở 37oC, lắc 200

v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 100- 200 l dịch khuẩn lên đĩa môi

trường LB đặc có chứa 50mg/l carbenicillin, 100 µM IPTG, 40 mg/l X-gal. Ủ đĩa

ở 37oC qua đêm.

2.3.2.5. Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)

Các mẫu khuẩn tái tổ hợp sau biến nạp mọc trên môi trường LB đặc được

chọn lọc để thực hiện phản ứng colony- PCR. Thành phần của phản ứng colony-

29

PCR được trình bày trong bảng 2.3.

Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C: 30s;

58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.

Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn

ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn.

2.3.2.6. Tách chiết plasmid từ tế bào E. coli

Sử dụng Kit QIAprep Spin Miniprep (của hãng QIAGEN) và chỉ dẫn

của nhà sản xuất để tách chiết plasmid. Đây là phương pháp tách plasmid lượng

bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản copy plasmid cao.

Quy trình: Hút 1,5 ml dịch khuẩn E.coli đã nuôi qua đêm trong môi trường

LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Ly tâm 7000 v/p trong 5 phút để thu tế

bào. Hòa tan tế bào trong 250 l buffer P1 (lưu ý RNase đã được bổ sung vào

buffer P1). Bổ sung 250 l buffer P2, đảo ống nhẹ nhàng 4 – 6 lần để trộn đều.

Không votex, vì sẽ làm lẫn với DNA genome. Cần thiết có thể đảo ống cho đến

khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Bổ sung

350 l buffer N3, đảo ống ngay lập tức nhưng nhẹ nhàng 4- 6 lần. Tránh kết

tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhưng liên tục ngay sau khi bổ sung

buffer N3. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Ly tâm ở 13000 v/p trong 10

phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm ở 13000 v/p

trong 30- 60 giây, loại bỏ dịch chảy qua cột. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep

bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây.

Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của

nuclease khi sử dụng chủng endA+ như JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của

nó cũng như các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng

độ carbonhydrate cao. Chủng tế bào chủ như XL-1 và DH5 không cần thiết

phải sử dụng bước rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprrep bằng cách bổ

sung 0,75 ml buffer PE và ly tâm ở 13000 v/p trong 30- 60 giây. Loại bỏ dịch

30

chảy qua cột, và ly tâm bổ sung ở 13000 v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer

rửa. Đặt cột trong một ống eppendorf 1,5 ml. Hòa tan DNA, bổ sung 50 l EB

hoặc nước cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprrep, để ở nhiệt độ phòng

1 phút và ly tâm ở 13000 v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm

tich sạch plasmid trên gel agarose 1%.

2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chứa vector pBI121, các plasmid này

được kiểm tra bằng cách xử lý bằng enzyme XbaI và SacI. Thành phần phản

ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bộ kit sử dụng

enzyme (bảng 2.7).

Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn

Thành phần Thể tích (µl)

Nước deion, khử trùng 8

Buffer Tango 10X 2

DNA (50 ng/µl) 10

XbaI (5U/ µl) 0.5

SacI (10 U/ µl) 0.5

Tổng thể tích 20

Phản ứng được ủ trong 2 giờ ở 37oC. Sản phẩm cắt sau đó được điện di

kiểm tra trên gel agarose 1% dưới điều kiện 120V, 40 phút.

2.3.2.8. Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện

Sau khi chọn được dòng plasmid tái tổ hợp, plasmid được biến nạp vào

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens K599 (khuẩn để kiểm tra cấu trúc chuyển

gen bằng cách tạo rễ tơ trong thời gian ngắn 2 tuần) và AGL1 (dòng khuẩn để

biến nạp vào cây chuyển gen mong muốn) bằng phương pháp xung điện

(Sambrook và cộng sự, 1989). Sau khi xung điện xong, các dịch khuẩn được

trải trên môi trường có kháng sinh chọn lọc streptomycin 100 mg/l và

kanamycine 50 mg/l (với chủng K599) và môi trường có kháng sinh chọn lọc

31

kanamycine 50mg/l, rifamycine 50 mg/l và carbenicilin 50mg/l (với chủng

AGL1). Đĩa được ủ ở 28oC, ở điều kiện tối trong 2 ngày. Các chủng vi khuẩn

tái tổ hợp được lưu giữ ở điều kiện -84oC để phục vụ cho các thí nghiệm chuyển

gen sau này.

2.3.2.9. Chọn dòng A.tumefacines tái tổ hợp

Để chọn A.tumefacines tái tổ hợp, chúng tôi chọn 3 khuẩn lạc riêng rẽ

từ mỗi chủng, sau đó nuôi lỏng thu sinh khối và tách plasmid. Các plasmid này

được sử dụng làm khuôn cho phương pháp PCR. Thành phần của phản ứng

được trình bày ở bảng sau.

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR

STT Thành phần Thể tích (l)

1 Nước deion, khử trùng 10.5

2 PCR Master mix 2X 12,5

3 Primer forward (10 pmol) 0,5

4 Primer reverse (10 pmol) 0,5

5 Plasmid (20 ng/ul) 1

Tổng thể tích 25

Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony- PCR như sau: 94°C: 3min; (94°C:

30s; 58°C: 30s; 72°C: 60s) lặp lại 25 chu kỳ; 72°C: 5min; 4°C: ∞.

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để chọn ra các

32

dòng A.tumefacines mang gen có kích thước như mong muốn.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT

Hiện nay, sự hiện diện và chức năng của các protein tham gia con đường

sinh tổng hợp rotundin nói riêng, palmatine nói chung vẫn đang được các nhà

khoa học quan tâm, khám phá. Takashi và cs (2002) lần đầu tiên đã xác định

được trình tự cDNA của gen CoOMT ở loài Coptis japonica và chứng minh được

vai trò chuyển hóa cơ chất columbamine thành palmatine. Đồng thời, các tác giả

đề xuất chức năng chuyển hóa cơ chất tetrahydro columbamine thành

tetrahydropalmatine (rotundin) dựa trên những kết quả thí nghiệm thu được [77].

Do vậy, định hướng nghiên cứu của chúng tôi là xác định vai trò, chức năng của

gen CoOMT trong con đường tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi.

Từ trình tự cDNA thu được, Takashi và cs xác định được gen CoOMT có

sự tương đồng với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật, mức độ

tương đồng cao hơn gen SMT (hình 1.3) [77].

Khi so sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con

đường tổng hợp palmatine, cấu trúc phân tử enzyme có 3 motif (A, B, C) bảo

thủ (hình 3.1), có sự tương đồng với protein flavonoid 7OMT và caffeiic acid

OMT (lúa mạch), 6a-hydroxymaackia 3’OMT (đậu xanh), isoflavone 7OMT

(cỏ linh lăng, alfalfa), 4OMT và 6 OMT (Coptis), SMT (Coptis), caffeiic acid

OMT (alfalfa), caffeiic acid OMT (Arabidopsis), O-diphenol OMT và caffeoyl

CoA 3OMT (Tobacco), myo-inositol OMT (ice plant). Sự đa dạng về trình tự

này ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N của Coptis OMTs [75]. Từ

trình tự amino acid suy diễn của các enzyme CoOMT, chúng tôi sử dụng phần

mềm Tin sinh học Phyre2 để mô hình hóa cấu trúc không gian 3D của phân tử

33

(hình 3.2, 3.3).

Hình 3.1. So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong con

đường tổng hợp palmatine (CJEST64: trình tự amino acid suy diễn của CoOMT)

Hình 3.2. Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT

34

( : đoạn xoắn alpha; : Phiến gấp beta)

Hình 3.3. Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT

3.2. Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT

Phân tử cDNA tổng hợp nhân tạo của gen CoOMT được gắn vào vector

tách dòng. Trên môi trường nuôi dưỡng, chúng tôi chọn ra 15 dòng tế bào để

thực hiện phản ứng clony- PCR với cặp primer trên pUC19. Sản phẩm PCR được

điện di kiểm tra kích thước trên gel agarose 2% (90V/40 phút), sử dụng PSA

35

Loading buffer 6X. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 M

2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR nhân gen CoOMT

(M: PSA DNA Ladder. Giếng 1->15: sản phẩm PCR của 15 khuẩn lạc)

Chúng tôi tiếp tục chọn 4 dòng 1, 2, 3 và 15 để nuôi tăng sinh khối phục vụ

cho việc tách chiết, tinh sạch và giải trình tự plasmid tái tổ hợp thu được. Bộ kit

tinh sạch plasmid của Jena Biociense được sử dụng để tinh sạch 4 dòng nuôi lắc

ủ qua đêm (sau 16 giờ, 37oC).

Hai mồi trên vector được sử dụng để xác định trình tự như sau:

pUC19 Fwd.A: CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC

pUC19 Rv.A3: ATTTCACACAGGAAACAGCTATGA

Phân tích kết quả giải trình tự cDNA CoOMT cho thấy dòng 2 cho kết quả

đúng 100%, còn 3 dòng còn lại đều mang các đột biến điểm.

3.3. Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium

tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT

Sau khi xử lý vector PUC-1113 và pBI121 với enzyme giới hạn XbaI và

SacI, chúng tôi thu được cấu trúc 35S-CoOMT-Cmyc-Kdel có kích thước khoảng

1113 bp và vector pBI121 đã được loại bỏ gen gus (hình 3.5).

Các sản phẩm này được gắn với nhau bằng enzyme T4 ligase, sau đó được

biến nạp vào trong E.coli để chọn dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp dựa trên

kiểu hình. Kết quả chọn các dòng plasmid pBI121-1113 bằng phản ứng colony-

36

PCR và cắt enzyme giới hạn XbaI và SacI được thể hiện ở hình 3.6.

14 758 bp

1113 bp

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector pUC-1113 (A) và

vector pBI121 (B) với enzyme XbaI và SacI

14 758 bp

1113 bp

1113 bp

Hình 3.6. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E. coli

A. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR. M: marker 1kb (Thermo), NC:

đối chứng âm (H2O), 1-5: dòng khuẩn lạc từ 1-5

B. Kết quả cắt enzyme giới hạn plasmid tái tổ hợp. 1: Đối chứng pBI121; 3:

plasmid pBI121-1113 dòng số 3.

Cấu trúc vector đã thiết kế đầy đủ các thành phần cần thiết như 35S-CoOMT-

Cmyc-Kdel được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng kĩ thuật điện xung. Vi

khuẩn A.tumefaciens sau khi biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB đặc bổ

sung kháng sinh chọn lọc kanamycin. Chúng tôi lựa chọn những khuẩn lạc tốt, phát

triển đồng đều chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin để

37

nuôi cấy thu sinh khối, tách plasmid. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CoOMT

trên plasmid ở 2 dòng vi khuẩn được chọn bằng phản ứng colony- PCR cho thấy

đều dương tính, nghĩa là mang gen đích CoOMT. Các dòng vi khuẩn A. tumefaciens

có plasmid tái tổ hợp chứa gen CoOMT được lưu giữ chủng để sử dụng cho việc

biến nạp vào cây Bình vôi và cây thuốc lá.

Chúng tôi đã chọn được dòng khuẩn số 2 mang plasmid tái tổ hợp với

đúng kích thước tính toán lý thuyết. Plasmid tái tổ hợp này được tinh sạch và

biến nạp vào 2 chủng A.tumefacines khác nhau: K599 (phục vụ cho đánh giá

nhanh sự hoạt động của cấu trúc vector chuyển gen nhờ vào sự hình thành rễ tơ

sau quá trình chuyển gen trong khoảng 2 tuần) và chủng AGL1 (biến nạp tạo cây

1113 bp

1113 bp

chuyển gen).

Hình 3.7. Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong

A.tumefaciens

A. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp trong chủng

A.tumefaciens K599. M: marker 1kb (Thermo), NC: đối chứng âm

(H2O), 1-2: plasmid số 1,2

B. Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp chủng

38

A.tumefaciens AGL1. 1,2: plasmid dòng số 1,2

Kết quả chọn các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp được thể hiện ở hình 3.7

cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp số 1 và 2 trong A.tumefaciens K599 và

AGL1 đều cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Như vậy, chúng tôi đã

thiết kế và tạo thành công hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hợp là K599

và AGL1 mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT (hình 3.7) phục

vụ cho biểu hiện gen và đánh giá chức năng của gen này ở cây mô hình và cây

39

Bình vôi chuyển gen.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

- Từ trình tự cDNA của gen nhân tạo CoOMT dài 1113 bp có sự tương đồng

với gen 6OMT, 4’OMT và các gen OMT khác ở thực vật. Protein suy diễn

có 3 motif (A, B, C) bảo thủ giống với các protein họ OMT. Sự đa dạng

về trình tự protein ở vị trí liên kết cơ chất, dự kiến nằm ở đầu N-terminal

của Coptis OMTs.

- Tạo được thành công 01 dòng tế bào chủ mang gen CoOMT nhân tạo có

trình tự nucleotid cho kết quả đúng 100%, 03 dòng còn lại đều mang các

đột biến điểm.

- Thiết kế và tạo thành công chủng vi khuẩn A.tumefacines K599 và AGL1

mang vector pBI121-1113 chứa gen chuyển CoOMT, phục vụ cho biểu

hiện gen ở cây mô hình và cây Bình vôi.

2. Kiến nghị

Biểu hiện gen CoOMT ở cây mô hình và cây Bình vôi để đánh giá vai trò

40

của gen chuyển trong quá trình sinh tổng hợp rotundin.

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ

1. Tangmany SYSOMEPHONE, Ngô Diễm Quỳnh, PHANTHAHAK

Santhana, Nongkhan MANISOK, Phạm Thị Thanh Nhàn (2020), Nghiên

cứu công thức khử trùng mẫu và môi trường nuôi cấy in vitro cây bình vôi

vàng (stephania spp.), TNU Journal of Science and Technology 225(08):

239 – 244.

2. Pham Thi Thanh Nhan, Thongkham LAPHASY, Tangmany

SYSOMEPHONE (2020), Sterilization of sterilizing plant materials and

effect of cytokinin on shoot formation of Orthosiphon aristatus plantlets,

41

CASEAN – 6.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

[1]. Bùi Văn Thắng, Đỗ Xuân Đồng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013),

“Quy trình chuyển gen vào cây xoan ta (Melia azedazach L.) đạt hiệu suất

cao”, Tạp chí Sinh học, 35(2), tr. 227 - 233.

[2]. Dược điển Việt Nam V tập 2 (2007), NXB Y học. Hà nội – 2017. Tr. 1084.

[3]. Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà nội – 2009. Tr. 697.

[4]. Dương Hữu Lợi (1996), “Nghiên cứu hoạt chất từ củ Bình vôi’, Tạp chí

y học Việt Nam, số 1, trang 14 – 23.

[5]. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy

trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cà chua của Việt Nam”, Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 5(2), tr. 217- 223.

[6]. Đỗ Tất lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y Học, Hà nội.

[7]. Đỗ Xuân Đồng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2007), “Nghiên cứu quy

trình tái sinh và hệ thống chuyển gen cà chua của Việt Nam”, Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 5(2), tr. 217- 223.

[8]. Lã Đình Mỡi, Trần Minh Hợi, Dương Đức Huyến, Trần Huy Thái, Ninh

Khắc Bản (2005), Tài nguyên thực vật Việt Nam những cây chứa các hợp

chất có hoạt tinh sinh học, Tập I, NXB nông nghiệp, Hà Nội, tr. 58-82.

[9]. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005) Nghiên cứu và phát triển vaccine

ăn được trong thực vật. Tạp chí công nghệ sinh học 3: 133-142.

[10]. Ngô Quang Đại (1999), Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vôi, Tạp chí

công nghiệp hóa chất, số 2-1999.

[11]. Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học,

một số tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt

Nam, Luận án tiến sĩ dược học, Trường đại học Dược Hà nội.

[12]. Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam- phần thực vật, NXB khoa

42

học tự nhiên và công nghệ, tr285.

[13]. Nguyễn Tiến Vân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật

hạt kín ở Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Hà Nội

[14]. Nguễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, Bùi Kim Liên, Chu Đình Kính, Trịnh

Văn Bảo (1998), Tác dụng của L-tetrahydropalmatin chiết suất từ củ loài

bình vôi Stephania glaba (Roxb) Miers lên điện tim và điện não thỏ, Tạp

chí dược học, 269, tr. 21-23.

[15]. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị

Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb

Nông Nghiệp - Hà Nội.

[16]. Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách Rotundin từ củ một số

loài Bình vôi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế Rotundin Sulfat để bào

chế thuốc tiêm, Luận án Tiến sĩ dược học, Hà nội

[17]. Phan Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1997), Bài giảng

dược liệu, tập 2, Trường Đại học Dược Hà Nội

[18]. Phạm Duy Mai, Phan Đức Thuận (1986), Tác dụng Dược lý của Bình vôi,

Công trình NCKH Viện Dược liệu 1972 -1986, NXB Y học, Hà nội, 55-57

[19]. Nguyễn Minh Chính (2001), Nghiên cứu chiết tách rotundin từ củ một số

loài Bình vôi (thuộc chi Stephania Lour.), điều chế rotundin sulfat để bào

chế thuốc tiêm, NXB Đại học Cần Thơ, trang 3 - 4.

[20]. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường

Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), “Nghiên cứu quy trình chuyển

gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb)”, Tạp chí Sinh học, 34(3),

tr. 389 - 396.

[21]. The Asia Foundation (2012), Cây thuốc người Dao Ba Vì, tr.32.

[22]. Trần Lê Lưu Li, Nguyễn Hữu Hoàng, Bùi Lan Anh (2008), “Thử nghiệm

chuyển gen trên lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) bằng phương pháp

bắn gen và Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí phát triển KH&CN- ĐH

43

Quốc gia TP.HCM, 11(10), tr. 109 - 113.

[23]. Võ Thị Thúy Huệ, Mã Yến Thanh (2011), “Thiết lập quy trình tái sinh in

vitro và đánh giá bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha

curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí KHKT Nông

Lâm Nghiệp, số 1, tr. 6 - 10.

[24]. Vũ Đức Thắng (2014), Điều tra, thu nhập mẫu củ bình vôi ở một số tỉnh

Việt Nam và xây dựng phương pháp định lượng Rotundin bằng sắc ký lớp

mỏng kết hợp đo mật độ quang (TLC-Scanning), luận văn thạc sĩ sinh học,

Hà Nội.

[25]. Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan (2012),

“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến chuyển gen gus vào phôi trưởng

thành 6 gia đình Thông nhựa bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”,

Kết quả nghiên cứu Khoa học công nghệ lâm nghiệp giai đoạn 2006-2010,

NXB Nông nghiệp, tr. 60 - 66.

Tiếng Anh

[26]. Angerhofer, C.K., Guinaudeau, H., Wongpanich, V., Pezzuto, J.M.,

Cordell, G.A., 1999. Antiplasmodial and cytotoxic activity of natural

bisbenzylisoquinoline alkaloids. Journal of Natural Products 62, 59–66.

[27]. Aogi K., Nishiyama M. (1997), Overcoming CPT-11 resistance by using

abiscoclaurine alkaloid, cepharanthine, to modulate plasma trans-

membrane potential, Int-J-Cancer, vol. 72, pp. 295-300.

[28]. Bako L, Umeda M, Tiburcio AF, Schell J, Koncz C (2003) The VirD2

pilot protein of Agrobacterium-transferred DNA interacts with the TATA

box - binding protein and a nuclear protein kinase in plants. Proceedings

of the National Academy of Sciences of the United States of America

100: 10108-10113.

[29]. Bun Sok-Siya, Michele Laget, Aun Chea, Hot Bun, Evelyne Ollivier and

44

Riad Elias (2009), Cytotoxic activity of alkaloids isolated from Stephania

rotunda in vitro cytotoxic activity of cepharanthine, Phytother. Res., 23, pp.587-590.

[30]. Camacho, M.R., Kirby, G.C., Warhurst, D.C., Croft, S.L., Phillipson, J.D.,

2000. Oxoaporphine alkaloids and quinines from Stephania dinklagei and evalution of their antiprotozoal activity. Planta Medica 66, 478–480.

[31]. Chen Y. J., Tu M.L. (1997), Protective effect of tetrandrine on normal

human mononuclear cells against ionizing irradiation, Biol-PharmBull, 20, pp. 1160-1164.

[32]. Cardarelli M., Mariotti D., Pomponi M., Spano L., Capone I., Costantino

P. (1987), “Agrobacterium rhizogenes T-DNA genes capable of inducing

hairy root phenotype”, Mol Gen Genet, 209: 475- 480.

[33]. Choi K.B., Morishige T. and Sato F. (2001), “Purification and

characterization of coclaurine N-methyltransferase from cultured Coptis

japonica cells”, Phytochemistry, 56: 649–655.

[34]. Choi K.B., Morishige T., Shitan N., Yazaki K. and Sato F. (2002),

“Molecular cloning and characterization of coclaurine N-methyltransferase

from cultured cells of Coptis japonica”, J. Biol. Chem., 277: 830–835.

[35]. Chu, H., Jin, G., Friedman, E. et al (2008), Recent Development in

Studies of Tetrahydroprotoberberines: Mechanism in Antinociception

and Drug Addiction. Cell Mol Neurobiol 28, 491–499.

[36]. Croteau R., Kutchan T.M. and Lewis N. (2000), Biochemistry and Molecular

Biology of Plants, Buchanan, B., Gruissem, W. & Jones, R., eds, American

Society of Plant Physiologists, Rockville, Maryland, pp. 1250–1318.

[37]. Cunha, N.B., A.M.Murad, T.M. Cipriano, A.C.G. Araújo, F.J.L. Aragão,

A.Leite, G.R.Vianna, T.R.McPhee, G.H.M.F.Souza, M.J. Waters (2011),

“Expression of functional recombinant human growth hormone in

45

transgenic soybean seeds”, Transgenic res, 20: 811-826.

[38]. Diof M. F., Hehn A., Ptak A., Chrétien F., Doerper S., Gontier E.,

Bourgaud F., Henry M., Chapleur Y., Laurain-Mattar D. (2006), “Hairy

root and tissue cultures of Leucojum aestivum L. - Relationships to

galanthamine content”, Phytochem.Rev., 6 (2006): 137-141.

[39]. Ding ZS, Zhao M, Jing YX, Li LB and Kuang TY (2006) Efficient

agrobacterium mediated transformation of rice by phosphomannose

isomerase mannose selection. Plant Molecular Biology Reporter 24: 295-303.

[40]. Das, B., Pal, P., Tandon, V., Lyndem, L.M., Kar, P.K., Rao, H.S.P., 2004.

Anthelmintic efficacy of extract of Stephania glabra and aerial root

extract of Trichosanthes multiloba in vitro: two indigenous plants in Shillong, India. Journal of Parasitic Diseases 28, 37–44.

[41]. Ellenbroek, B.A., Zhang, X.X., Jin, G.Z., 2006. Effects of (−)stepholidine

in animal models for schizophrenia. Acta Pharmacologica Sinica 27, 1111–1118.

[42]. Furusawa Shinobu, Wu Jianghong (2007), The effects of biscoclaurine

alkaloid cepharanthine on mammalian cells: Implications for cancer,

shock, and inflammatory diseases, Life Sciences, Volume 80, pp. 1073– 1079.

[43]. Frenzel T. and Zenk M.H. (1990), “Purification and characterization of three

isoforms of S-adenosyl-L-methionine: (R,S)-tetrahydrobenzylisoquinoline-

N-methyltransferase from Berberis koetineana cell cultures”,

Phytochemistry, 29: 3491–3497.

[44]. Gelvin SB (2003) Agrobacterium and plant transformation: the biology

behind the “gene - jockeying” tool. Microbiology and Molecular

Biology 67: 16-37.

[45]. Gulcin, I., Elias, R., Gepdiremen, A., Chea, A., Topal, F., 2010.

46

Antioxidant activity of bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania

rotunda: cepharanthine and fangchinoline. Journal of Enzyme Inhibition

and Medicinal Chemistry 25, 44–53.

[46]. Hall, A.M., Chang, C.J., 1997. Multidrug resistance modulators from

tephania japonica. Journal of Natural Products 60, 1193–1195.

[47]. Ho, L.J., Chang, D.M., Lee, T.C., Chang, M.L., Lai, J.H., 1999. Plant

alkaloid tetrandrine down reg ulates protein kinase C-dependent

signaling pathway in T cells. European Journal of Pharmacology 367,

389–398.

[48]. Hullatti, K.K., Sharada, M.S., 2007. Antimicrobial activity of Cissampelos

pareira. Cyclea peltata and Stephania japonica methanolic root extracts.

Advances in Pharmacology and Toxicology 8, 105–108.

[49]. Hara M., Yazaki K., Tanaka S. and Tabata M. (1995), “S-adenosyl-L-

methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase from Thalictrum minus

cell cultures”, Phytochemistry, 38: 1131–1135.

[50]. Hotta T., Tanimura H. (1997), “Modulation of multidrug resistance by

cepharanthin in fresh human gastrointestinal tumor cells”, Oncology, 54,

pp. 153-157.

[51]. Liu, X.J., Wang, Y.F., Zhang, M.Y., 2004. Study on the inhibitory effect

of cepharanthine on herpes simplex type 1 virus (HSV-1) in vitro. Journal of Chinese Medicinal Materials (Chin) 27, 107–110.

[52]. Lodhi A., Charlwood B. (1996), “Agrobacterium rhizogenes-mediated

transformation of Rubia peregrina L: invitro accumulation of

anthraquinones”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 46:103- 108.

[53]. Muregi, F.W., Chhabra, S.C., Njagi, E.N.M., Lang at-Thoruwa, C.C.,

Njue, W.M., Orago, A.S.S., 2004. Anti-plasmodial activity of some

47

Kenyan medicinal plant extracts singly and in combination with chloroquine. Phytotherapy Research 18, 379–384.

[54]. Magnotta M., Murata J., Chen J., De Luca V. (2007), “Expression of

deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy

roots”, Phytochemistry 68: 1922- 1931.

[55]. Manske R.H.F. (1973), The alkaloid- chemistry and Physiology, volume

XIV, Academic Press- New York- London.

[56]. Mantsch JR, Li SJ, Risinger R, Awad S, Katz E, Baker DA, Yang Z

(2007), “Levo-tetrahydropalmatine attenuates cocaine selfadministration

and cocaine-induced reinstatement in rats”, Psychopharmacology (Berl),

192, pp. 581-591.

[57]. Morishige T., Tsujita T., Yamada Y. and Sato F. (2000), “Molecular

characterization of the S-adenosyl-L-methionine: 3’-hydroxyroxy-N-

methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase involved in isoquinoline alkaloid

biosynthesis in Coptis japonica”, J. Biol. Chem., 275: 23398–23405.

[58]. Muemmler S., Rueffer M. and Zenk M.H. (1985), “S-adenosylL-

methionine: (S)-scoulerine 9-O-methyltransferase, a highly stereo- and

regio-specific enzyme in tetrahydroprotoberberine biosynthesis”, Plant

Cell Reports, 4: 36–39.

[59]. Muller M.J. and Zenk M.H. (1992), “The norcoclaurine pathway is

operative inberberine biosynthesis in Coptis japonica”, Planta Med., 58:

524–527.

[60]. Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J.,

Gubler F., Jacobsen J.V. (2001), “Marker gene elimination from transgenic

barley, using co-transformation with adjacent ‘twin T-DNAs’ on stDNAard

Agrobacterium transformation vector”, Mol Breed, 7: pp. 195 - 202.

[61]. Nawawi, A., Nakamura, N., Meselhy, M.R., Hattori, M., Kurokawa, M.,

Shiraki, K., Kashiwaba, N., Ono, M., 2001. In vivo antiviral activity of

48

Stephania cepharantha against herpes simplex virus type-1. Phytotherapy Research 15, 497–500.

[62]. Okamoto M., Ono M. (2001), Suppression of cytokine production and neural

cell death by the anti-inflammatory alkaloid cepharanthine: a potential

agent against HIV-1 encephalopathy, Biochem Pharmacol, 747-753.

[63]. Pang, L., Hoult, J.R., 1997. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine,

an antisili cosis alkaloid, accompanied by an overproduction of

prostaglandins. Biochemical Pharmacology 53, 773–782.

[64]. Pan Q., Wang Q., Yuan F., Xing S., Zhao J., Choi Y.H., Verpoorte R.,

Tian Y., Wang G. and Tang K. (2012), “Overexpression of ORCA3 and

G10H in Catharanthus roseus plants regulated alkaloid biosynthesis and

metabolism revealed by NMR-Metabolomics”, PLoS One 7: e43038.

[65]. Pham N.B. 2009, Production and secretion of recombinant sweet- tasting

thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum,

phD Thesis, University of Heidelberg.2.

[66]. Poulton J.E. (1981), The Biochemistry of Plants, Conn, E.E., ed., Vol. 7,

Academic Press, New York, pp. 667–723.

[67]. Qian, J.Q., 2002. Cardiovascular pharmacological effects of

bisbenzylisoquinoline alkaloid derivatives. Acta Pharmacologica Sinica

23, 1086–1092.

[68]. Rueffer M., Nagakura N. and Zenk M.H. (1983), “Partial purification

and properties of S-adenosylmethionine:(R), (S)-norlaudanosolin-6-

O-methyltransferase from Argemone platyceras cell cultures”, Planta

Med., 49: 131–137.

[69]. Sato F., Tsujita T., Katagiri Y., Yoshida S. And Yamada Y. (1994),

“Purification and characterization of S-adenosyl-L-methionine:

norcoclaurine 6-O-methyltransferase from cultured Coptis japonica

cells”, Eur. J. Biochem., 225: 125–131.

[70]. Simoens C., Alliotte T., Mendel R., Muller A., Schiemannm J. Van

49

Lijsebettens M., Schell J., van Montagu M., DNA inze D. (1986), “A binary

vector for transferring genomic libraries to plants”, Nucl. Acids Res, 14, pp.

8073 - 8090.

[71]. Semwal, D.K., Rawat, U., 2009a. Antimicrobial hasubanalactam alkaloid

from Stephania glabra. Planta Medica 75, 378–380.

[72]. Semwal, D.K., Rawat, U., 2009. Gindarudine, a novel morphine alkaloid

from Stephania glabra. Chinese Chemical Letters 20, 823– 826.

[73]. Semwal, D.K., Rawat, U., Bamola, A., Semwal, R., 2009. Antimicrobial

activity of Phoebe lanceolata and Stephania glabra; preliminary

screening studies. Journal of Scientific Research 1, 662– 666.

[74]. Sharma, U, Sahu, R.K., Roy, A., Golwala, D.K., 2010. In vivo antidiabetic

and antioxidant potential of Stephania hernandifolia in streptozotocin-

induced-diabetic rats. Journal of Young Pharmacists 2, 255–260.

[75]. Shaghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W.

(1984), “Ribosomal DNA sepacerlength polymorphism in barley:

mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics”,

Proc Natl Acad Sci, 81 (1984): 8014-8019.

[76]. SunY., Moore M.J., Zhang S., Soltis P.S., Soltis D.E., Zhao T., Meng A.,

Li X., Li J. and Wang H. (2016), “Stephania japonica chloroplast, complete

genome”, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_029432.1.

[77]. Takashi Morishige, Emilyn Dubouzet, Kum‐Boo Choi, Kazufumi Yazaki,

Fumihiko Sato (2002), “Molecular cloning of columbamine O‐

methyltransferase from cultured Coptis japonica cells”, Eur J Biochem.,

269(22):5659-67.

[78]. Takeshita N., Fujiwara H., Mimura H., Fitchen J.H., Yamada Y. and Sato

F. (1995), “Molecular cloning and characterization of S-adenosyl-L-

methionine: scoulerine-9-O-methyltransferase from cultured cells of

50

Coptis japonica”, Plant Cell Physiol., 36: 29–36.

[79]. Takemura, H., Imoto, K., Ohshika, H., Kwan, C.Y., 1996. Tetrandrine as

a calcium antagonist. Clinical and Experimental Pharmacology and

Physiology 23, 751–753.

[80]. Vanhala L., Hiltunen R., Oksman-Caldentey K. M. (1995), “Virulence of

different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus

muticus”, Plan Cell Rep., 14 (1995): 236-240.

[81]. Wang Q., Xing S., Pan Q., Yuan F., Zhao J., Tian Y., Chen Y., Wang G.,

Tang K. (2012), “Development of efficient Catharanthus roseus

regeneration and transformation system using Agrobacterium tumefaciens

and hypocotyls as explants”, BMC Biotechnol 12:34.

[82]. Wang C.T., Liu H., Gao X.S., Zhang H.X. (2010), “Overexpression of

G10H and ORCA3 in the hairy roots of Catharanthus roseus improves

catharanthine production”, Plant Cell Rep 29: 887-894.

[83]. Wat C.K., Steffens P. and Zenk M.H. (1986), “Partial purification and

characterization of S-adenosyl-L-methionine: norreticuline N-

methyltransferases from Berberis cell suspension cultures”, Z.

Naturforsch., 41c: 126–134.

[84]. Weising K., Kahl G. (1996), “Natural genetic engineering of plant cells:

the molecular biology of crown gall and hairy root disease”, World J.

Microbiol. Biotechnol., 12: 327- 351.

[85]. Xue, Y., Wang, Y., Feng, D.C., Xiao, B.G., Xu, L.Y., 2008. Tetrandrine

suppresses lipopolysaccharide induced microglial activation by inhibiting

NF-kappaB pathway. Acta Pharmacologica Sinica 29, 245–251

[86]. Yang, D.L., Mei, W.L., Dai, H.F., 2010a. Cytotoxic alkaloids from the

tuber of Stephania succifera. Chinese Journal of Medicinal Chemistry 20,

51

206–210.

[87]. Yang, D.L., Mei, W.L., Wang, H., Dai, H.F., 2010b. Antimicrobial

alkaloids from the tubers of Stephania succifera. Zeitschrift für

Naturforschung B 65, 757–761.

[88]. Zhang, H., Yue, J.M., 2005. Hasubanan type alkaloids from Stephania

longa. Journal of Natural Products 68, 1201–1207

[89]. Zhao, Y.Z., Kim, J.Y., Park, E.J., Lee, S.H.,Woo,S.W., Ko, G., Sohn,

D.H., 2004. Tetrandrine induces apoptosis in hepatic stellate cells.

Phytotherapy Research 18, 306–309.

[90]. Zhu X. Z, (1991), Development of Natural products as drugs acting on

central nervous system, Mem. Inst. Oswaldo. Cruz, 86, pp. 173-175.

Tài liệu website

[91]. http://123doc.org/document/254782-nghien-cuu-cay-binh-voi-va-cac-

hop-chat-alkaloid-trong-cay.htm

[92]. http://duocphamtw3.com/pr70-rotundin.html

[93]. https://baomuctim.com/rotunda-30mg

[94]. http://duoclieu.net/Binh%20voi.html

[95]. www.vinachem.com.vn/xuat-ban-pham/239-so-vnc/c3239.html

[96]. https://suckhoedoisong.vn/nhung-chien-cong-cua-mot-duoc-si-binh-di-

52

n32313.html