Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056 Trang 1
Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Giới thiệu
Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu
chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm
màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Vì vậy Listeria
monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực
phẩm.
Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM
– FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao
gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa
sinh để định danh. Quá trình này thường kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp
âm tính và trên bảy ngày cho các trường hợp dương tính. Đây thật sự là một
trở ngại cho việc đánh giá chất lượng nói chung và phân tích vi khuẩn gây
bệnh trong sản phẩm thực phẩm vì thời gian chờ trả kết quả quá dài.
Trong những năm qua, nhiều phương pháp phát hiện Listeria
monocytogenes dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như
phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA, … đã được triển khai. Trong đó nhiều
phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh. Vì vậy
việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là
vấn đề được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm. RAPID’L.mono là phương
pháp mới khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ
khả năng phát hiện nhanh, dễ thực hiện, đọc kết quả phân tích dễ dàng, cho kết
quả cùng lúc về Listeria monocytogenes và các loài khác thuộc Listeria spp
trên cùng một đĩa môi trường chọn lọc. Vì những lý do đó chúng tôi tiến hành
nghiên cứu “ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để
phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Xác định độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.
mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn
ISO 11290-1:2004 thông qua các chỉ tiêu thí nghiệm:
- Độ đặc hiệu
- Độ nhạy
- Độ lặp lại
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056 Trang 2
1.3. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện đề tài chúng tôi dự kiến các nội dung nghiên cứu sau:
1. Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh
RAPID’L.mono bằng cách thử nghiệm trên mẫu gây nhiễm Listeria
monocytogenes và mẫu gây nhiễm vi sinh vật khác. Trên cơ sở xác định
khuẩn lạc điển hình, thử nghiệm sinh hóa điển hình (nếu có) của
Listeria monocytogenes.
2. Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD) của phương pháp thông
qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để
tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện.
3. Xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách phân tích mẫu thực
phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes hay mẫu thực phẩm gây
nhiễm Listeria monocytogenes nhằm đánh giá sự ổn định của phương
pháp phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm.
4. Phân tích song song mẫu sản phẩm thủy sản nhiễm Listeria
monocytogenes bằng cả hai phương pháp: RAPID’L.mono và ISO
11290-1:2004. Kết hợp kết quả thu được từ Mục 1 – 3 để đánh giá mức
độ tương đồng của phương pháp RAPID’L.mono so với phương pháp
chuẩn ISO 11290-1:2004.
1.4. Thời gian thực hiện đề tài
Tháng 01/2009 đến 05/2009
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056 Trang 3
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes
2.1.1. Phân loại học
Theo khóa phân loại của Bergey’s (tái bản lần thứ 7), giống Listeria
được xếp vào họ Corynebacteriaceae. Tuy nhiên theo nghiên cứu của
Stackebrandt và cộng sự (1983) về rRNA 16S, ông đã chứng minh rằng
Listeria monocytogenes hoàn toàn khác biệt trong nhánh Lactobacillus-
Bacillus thuộc cây phát sinh loại vi khuẩn do Woese xây dựng năm 1981. Năm
2001, Họ listeriaceae đã được tạo ra, bao gồm cả Staphylococcaceae,
Bacillaceae và các họ khác. Trong phạm vi cây phát sinh loại này có sáu loại
thuộc loại Listeria: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii
L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L.
grayimurrayi.
2.1.2. Hình thái học
Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ
tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi
kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng
chúng là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể
trông giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng (không lớn 370C) vi khuẩn này
có khả năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình
tán dù trong môi trường motility agar. Hoạt tính tiêu huyết (heamolysis) trên
môi trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria
monocytogenes trong số các loài khác thuộc giống Listeria, nhưng đây không
phải là tiêu chí để xác định loài này.
Để phân biệt các loại thuộc Listeria cần thêm các đặc tính sinh hóa
được thể hiện ở Bảng 2.1.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056 Trang 4
Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria
Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol,
Rham: Rhamnose, Xyl: Xylose.
2.1.3. Đặc điểm sinh lý
2.1.3.1. Thông số phát triển
Bảng 2.2: Một số thông số cơ bản của Listeria
Thế nước
(aw) cực đại
pH tối
thiểu
pH cực
đại
NaCl(%)
cực đại
T0C tối
thiểu
T0C cực
đại
Nhu cầu oxy
0,92-0,95 4,6 9,6 8-12 0-2 45 Kỵ khí tùy nghi
2.1.3.2. Trong thực phẩm
Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm
đông lạnh, trong các sản phẩm chưa được gia nhiệt tốt, bề mặt sản phẩm đã bị
tách nước. Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt
độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật.
2.1.4. Khả năng chịu đựng
Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng
phát triển ở nhiệt độ 2 - 80C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng
có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân
không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic.
Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong
nguồn nước công cộng ở nhiệt độ 28- 300C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5
đến 100C. Ở nước ao chúng có khả năng sống đến 8 tuần với nhiệt độ không
Các phản ứng phân biệt Listeria spp.
CAMP test
TÊN LOÀI Cata Gram Di
động
Henry
Man
(a)
Rham Xyl Tan
huyết S.aureus R.equi
L. monocytogens + + + Xanh - + - + + -
L. innocua + + + Xanh - V - - - -
L. ivanovii + + + Xanh - - + + - +
L. seeligeri + + + Xanh - - + (+) (+) -
L. welshimeri + + + Xanh - V + - - -
L. grayi loài phụ
grayi
+ + + Xanh + - - - - -
L. grayi loài phụ
murrayi
+ + + Xanh + V - - - -
V : phản ứng có thể xảy ra
(+): phản ứng yếu
+ : >90% phản ứng dương tính
-: phản ứng không xảy ra
(a) tham khảo theo USFDA/CFSAN BAM- chương 10.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản
SVTH: Hồ Linh Phương GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng
MSSV: 2052056 Trang 5
khí từ -260C đến 90C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3
tuần hoặc lâu hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ
và chủng vi khuẩn này.
Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 150C, hỗn
hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp. Có thể tồn tại hơn
75 ngày trên bề mặt thép không gỉ. Thời gian để giết chết 90% các tế bào này
là 18,5 ngày.
Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông
khói đóng gói chân không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 100C, trong nhiều
trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua,
surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 70C trong vòng 14 ngày, Listeria
monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn:
Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)).
Khả năng chịu nhiệt của Listeria monocytogenes cũng là một yếu tố khá
quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của vi sinh vật này đối với an toàn
thực phẩm. Theo cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
(USFDA), khả năng kháng nhiệt của loài vi khuẩn này trên các sản phẩm thủy
sản khác nhau thì không giống nhau.
Listeria monocytogenes là điển hình cho vi khuẩn không sinh bào tử có
khả năng kháng khá tốt các tác động có hại như đông lạnh, làm khô và gia
nhiệt.
2.1.5. Phân bố, nguồn lây nhiễm
Mãi đến năm 1960, người ta vẫn còn nghĩ rằng Listeria monocytogenes
hầu như không liên quan đến các bệnh truyền nhiễm ở động vật và ít khi xuất
hiện ở người. Tuy nhiên, trong những năm sau đó, người ta bắt đầu phân lập
được nhiều loài thuộc giống Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như
Listeria monocytogenes và L. ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau. Đến nay vi
khuẩn này được công nhận là phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Ít nhất có 42
loài động vật có vú hoang dã và thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần
dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của Listeria. Có khoảng từ 5 – 10% trong số
chúng ta có Listeria monocytogenes hiện diện trong đường ruột nhưng không
biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về bệnh do listeria. Listeria cũng được phân
lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và ruồi. Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn
này từ đất, thức ăn động vật và các nguồn khác từ môi trường.
2.1.6. Đặc điểm gây bệnh