TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br />
<br />
NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG MÊ LỌ NƢỚC VÀ THỬ NGHIỆM CƢỠNG<br />
BỨC TRÊN MÔ HÌNH XUẤT HUYẾT NÃO THỰC NGHIỆM<br />
Hồ Anh Sơn*; Nguyễn Viết Trung**; Nguyễn Trọng Tài***<br />
TÓM TẮT<br />
Mê lộ nƣớc Morris (MWM) đƣợc sử dụng để đánh giá trí nhớ không gian, chỉ huy vận động<br />
và bản đồ nhận thức. So sánh với các bài tập không gian khác nhƣ mê lộ chữ T, động vật chỉ<br />
cần quyết định chọn rẽ phải hoặc trái. Trong bài tập MWM, động vật cần phải liên tục có quyết<br />
định về hƣớng chuyển động của mình. Thử nghiệm cƣỡng bức vận động trên trục quay cũng<br />
đƣợc nghiên cứu áp dụng cho mô hình động vật đột quỵ nhằm đánh giá thực chất khả năng<br />
vận động của chúng. Để có thể áp dụng các bài tập trên trong nghiên cứu tại Học viện Quân y,<br />
chúng tôi tiến hành áp dụng bài tập MWM và cƣỡng bức vận động trên trục quay ở đối tƣợng<br />
chuột nhắt bị đột quỵ cho chảy máu não. Kết quả cho thấy có thể sử dụng các bài tập này để<br />
phân tích bài học không gian và khả năng vận động trên mô hình chuột nhắt bị xuất huyết não.<br />
* Từ khóa: Morris water maze; Mô hình đột quỵ; Chuột nhắt.<br />
<br />
Applying Morris water maze and forced task on<br />
brain haemorrhage mice model<br />
Summary<br />
The Morris water maze task (MWM) is supposed to measure spatial memory, movement control,<br />
and cognitive mapping. Comparing to other spatial tasks such as the t-maze, only requires the<br />
mouse to choose left or right. In the Morris water navigation task, the animal needs to decide<br />
continually where to go. In order to perform the task, animal do not need to be motivated by<br />
food deprivation or electrical shock. Also, forced task was applied for stroke animal model run<br />
on rota-rod to evaluate basically mobility. To apply in current study in our university, we tested<br />
MWM on the brain haemorrhage mice model. The results showed the MWM could be used to<br />
analyze the spatial learning, re-learning and spatial memory on brain haemorrhage mice.<br />
* Key words: Morris water maze; Stroke animal model; Mice.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Sử dụng mê lộ để đánh giá khả năng<br />
học và ghi nhớ không gian của động vật<br />
gặm nhấm là nội dung thí nghiệm thƣờng<br />
dùng trong nghiên cứu sinh lý thần kinh.<br />
<br />
Trong số các mê lộ cạn và mê lộ nƣớc<br />
hiện đang đƣợc sử dụng trên thế giới,<br />
mê lộ nƣớc Morris (Morris water maze,<br />
MWM) đƣợc lựa chọn với nhiều ƣu điểm<br />
[1, 2]. Sử dụng trục quay rota-rod cũng là<br />
<br />
* Học viện Quân y<br />
** Bệnh viện Qu©n y 103<br />
*** Đại học Y Vinh<br />
Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhson@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 20/02/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 05/05/2014<br />
Ngày bài báo được đăng: 26/05/2014<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br />
<br />
phƣơng pháp đánh giá vận động cƣỡng<br />
bức thƣờng dùng trên động vật. Cùng với<br />
MWM có thể đánh giá khả năng vận động<br />
của động vật do bị cƣỡng ép bơi (môi<br />
trƣờng nƣớc lạnh), trục quay buộc động<br />
vật phải vận động để có thể đứng trên<br />
trục mà không bị rơi. Do vậy, ứng dụng<br />
của MWM và phƣơng pháp cƣỡng bức<br />
vận động khá phổ biến trong nghiên cứu<br />
thần kinh nói chung, trí nhớ và vận động<br />
nói riêng. Trong nghiên cứu này, chúng<br />
tôi tiến hành xây dựng và thử nghiệm<br />
MWM và vận động cƣỡng bức trên trục<br />
quay với động vật bị gây tổn thƣơng não<br />
thực nghiệm do xuất huyết.<br />
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIấN CỨU<br />
1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br />
Chuột nhắt trắng do Ban Cung cÊp<br />
®ộng vật thÝ nghiÖm, Học viện Quân y cung<br />
cấp, không phân biệt giống, khoẻ mạnh,<br />
đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, cân nặng 20,0 <br />
2,0 g. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện nhiệt<br />
độ 24 ± 20C, ánh sáng tự nhiên, nƣớc và<br />
thức ăn đƣợc nấu chín, bảo đảm theo nhu<br />
cầu. Quá trình nuôi đƣợc bắt đầu trƣớc khi<br />
tiến hành thí nghiệm ít nhất 3 ngày.<br />
2. Ph-¬ng ph¸p nghiên cứu.<br />
- Tổng số chuột 30 con, chia đều thành<br />
các nhóm:<br />
+ Nhóm chứng: chuột đƣợc phẫu thuật,<br />
nhƣng không đƣa hóa chất vào não (xem<br />
phẫu thuật gây xuất huyết não).<br />
+ Nhóm nghiên cứu: chuột đƣợc gây<br />
đột quỵ chảy máu, sử dụng nƣớc cất.<br />
+ Nhóm Não thông lạc: chuột đƣợc gây<br />
đột quỵ chảy máu, điều trị bằng viên nang<br />
Não thông lạc (bài thuốc do Viện Y học<br />
Cổ truyền Quân đội điều chế và sản xuất).<br />
- Phẫu thuật gây xuất huyết não:<br />
<br />
Chuột đƣợc gây mê bằng nembutal<br />
đƣờng phúc mạc với liều 40 mg/kg thể<br />
trọng. Cố định chuột trên hệ thống định vị<br />
M2009S, một lỗ nhỏ 0,5 mm trên xƣơng<br />
sọ bên phải, tại vị trí dự định đƣa hóa<br />
chất vào não, khoan với mũi khoan đƣờng<br />
kính 0,2 mm. Kim tiêm 31G nối với bơm<br />
tiêm siêu nhỏ (1 µl) gắn trên hệ thống<br />
thƣớc không gian ba chiều, đƣa chậm<br />
vào não tới đích là nhân bèo, theo tọa độ<br />
trƣớc-sau 1,0; bên 2,0; sâu 3,5 mm (tính<br />
từ điểm Bregma). Sau đó, bơm chậm 0,5<br />
µl dung dịch chứa 0,075 đơn vị collagen<br />
vào não. Đóng da đầu lại. Nhỏ kháng sinh<br />
gentamicine 80 mg/ml tại bề mặt xƣơng<br />
sọ bộc lộ trong quá trình phẫu thuật. Lô<br />
chứng đƣợc tiến hành các bƣớc nhƣ<br />
trên, nhƣng không đƣa kim tiêm và hóa<br />
chất vào não [2, 5].<br />
Cho chuột uống thuốc Não thông lạc<br />
kéo dài 10 ngày sau phẫu thuật với liều<br />
0,1 ml/10 gr thể trọng (thuốc viên pha nƣớc<br />
cất thành dung dịch 10%). Thuốc uống qua<br />
sonde dạ dày 18G, nhóm chứng và nhóm<br />
nghiên cứu uống nƣớc cất với thể tích<br />
tƣơng đƣơng 0,1 ml/10 gr thể trọng.<br />
- Thử nghiệm tại MWM: bài tập này<br />
tiến hành liên tục trong 9 ngày, bắt đầu<br />
vào ngày thứ 7 đến ngày thứ 15 sau tổn<br />
thƣơng. Nội dung này thực hiện tại MWM.<br />
Mê lộ là bể hình tròn có đƣờng kính 80<br />
cm, cao 30 cm, sơn đen. Duy trì lƣợng<br />
nƣớc trong mê lộ ở mức 20 cm, nhiệt độ<br />
18 - 200C trong suốt quá trình thí nghiệm.<br />
Một bến đỗ kích thƣớc 8 x 8 cm, làm<br />
bằng nhựa trong suốt, đặt tại một góc<br />
phần tƣ của mê lộ. Toàn bộ chƣơng trình<br />
bao gồm bài tập không gian (giai đoạn<br />
học, invisible task) kéo dài 7 ngày, bài tập<br />
Probe (trí nhớ không gian, Probe task)<br />
vào ngày thứ 8 và bài tập học lại (visible<br />
task) vào ngày thứ 9.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br />
<br />
+ Bài tập không gian (Place task):<br />
trong suốt bài tập, bến đỗ luôn đƣợc đặt<br />
cố định tại chính giữa góc phần tƣ của<br />
mê lộ nƣớc hƣớng đông nam (phần tƣ<br />
đích), 1,5 cm dƣới mặt nƣớc. Mỗi ngày<br />
tập bao gồm 3 lƣợt, mỗi lƣợt tập kéo dài<br />
tối đa 90 giây, bắt đầu từ một trong ba<br />
góc phần tƣ còn lại của mê lộ. Nếu sau<br />
90 giây, chuột không đến đƣợc đích (bến<br />
<br />
đỗ), chúng đƣợc hƣớng dẫn đến bến đỗ.<br />
Khi đến đƣợc đích, cho chuột ở đó 30<br />
giây. Khoảng cách giữa các lƣợt tập 1<br />
phút, trong thời gian này nhanh chóng lau<br />
khô và sƣởi ấm chuột. Toàn bộ quá trình<br />
chuột tập bài đƣợc ghi lại bằng camera,<br />
xử lý dữ liệu bằng phần mềm máy tính<br />
theo các tham số: thời gian tập bài, quãng<br />
đƣờng và vận tốc của chuột (hình 1).<br />
<br />
H×nh 1: Mª lé n-íc - bµi tËp Invislble.<br />
+ Bài tập trí nhớ không gian (Probe task): trong bài tập này, bỏ bến đỗ ra ngoài, cho<br />
chuột bơi trong mê lộ 90 giây một lần duy nhất. Chuột nhớ lại vị trí của bến đỗ và có xu<br />
hƣớng bơi lâu hơn tại góc phần tƣ đích (góc có bến đỗ trong những ngày tập trƣớc).<br />
Camera và máy tính tự động ghi lại và phân tích thời gian chuột bơi tại mỗi góc phần<br />
tƣ của mê lộ theo các mức thời gian 30, 60 và 90 giây (hình 2).<br />
<br />
H×nh 2: Mª lé n-íc - bµi tËp Probe.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br />
<br />
+ Bài tập học lại (Visible task): trong bài<br />
tập này, một bến đỗ dễ nhận thấy (cao hơn<br />
mặt nƣớc 1 cm) đƣợc đặt tại góc phần tƣ<br />
đối diện (góc tây bắc) với góc phần tƣ đích<br />
trong những ngày tập trƣớc (góc đông<br />
nam). Chuột tập bài 3 lần, mỗi lần 90 giây,<br />
khoảng cách giữa các lần tập đều 1 phút.<br />
Các lần tập xuất phát từ các góc phần tƣ<br />
khác nhau. Camera và máy tính tự động<br />
ghi lại và phân tích thời gian, vận tốc và<br />
quãng đƣờng bơi của mỗi chuột.<br />
- Đánh giá khả năng vận động chủ động:<br />
®o tổng chiều dài quãng đƣờng vận động<br />
trong 5 phút (tiến hành vào ngày 1, 3 sau<br />
phẫu thuật gây đột quỵ). Đặt mỗi chuột<br />
trong hộp nhựa, kích thƣớc 20 x 30 cm và<br />
ghi quá trình vận động trong 5 phút bằng<br />
camera nối với máy tính. Phần mềm máy<br />
tính sẽ tự động phân tích tổng quãng đƣờng<br />
di chuyển và vận tốc trung bình của chuột.<br />
- Đánh giá khả năng vận động thụ<br />
động: đặt chuột lên trục quay vào ngày<br />
thứ 5 để làm quen với vận tốc khoảng 4<br />
<br />
vòng/phút. Ngày tiếp theo (ngày thứ 6),<br />
đặt chuột lên trục quay với vận tốc tăng<br />
dần từ 0 - 40 vòng/phút. Thời gian chuột<br />
ở trên trục quay đến khi bị rơi xuống<br />
đƣợc tự động ghi lại. Mỗi chuột thử<br />
nghiệm 3 lần. Ghi lại thời gian ở trên trục<br />
quay lâu nhất để lấy số liệu đánh giá.<br />
- Đánh giá tổn thƣơng não bằng giải<br />
phẫu bệnh: sau khi thực hiện toàn bộ các<br />
bài tập và uống thuốc, gây mê sâu chuột<br />
bằng nembutal, tiêm phúc mạc 80 mg/kg<br />
thể trọng sau 4 tuần sau khi phẫu thuật.<br />
Sau đó, phẫu tích lấy não chuột rồi ngâm<br />
vào dung dịch formalin 10% trong 24 giờ.<br />
Tiến hành đúc parafin và cắt lát, nhuộm<br />
tiêu bản bằng cresyl violet, chụp hình tiêu<br />
bản dƣới kính hiển vi. §o diện tích tổn<br />
thƣơng bằng phần mềm máy tính.<br />
* Phương pháp xử lý số liệu:<br />
Các số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng<br />
thuật toán one-way ANOVA, phần mềm<br />
SPSS (12.0).<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br />
1. Bài tập không gian (Invisible task).<br />
25<br />
<br />
600<br />
<br />
500<br />
<br />
Chứng<br />
<br />
15<br />
<br />
NTL<br />
NC<br />
10<br />
<br />
L<br />
<br />
5<br />
<br />
quãng đường (cm)<br />
<br />
vận tốc (cm/s)<br />
<br />
20<br />
<br />
400<br />
Chứng<br />
300<br />
<br />
NTL<br />
NC<br />
<br />
200<br />
100<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
1<br />
<br />
2<br />
<br />
3<br />
<br />
4<br />
<br />
5<br />
<br />
6<br />
<br />
7<br />
<br />
ngày<br />
<br />
ngày<br />
<br />
Hình 3: Vận tốc và quãng đƣờng bơi của chuột trong bài tập không gian.<br />
Về tốc độ bơi và quãng đƣờng bơi, khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng<br />
với hai nhóm bị gây đột quỵ. Không có sự khác biệt đáng kể về các tiêu chí này giữa<br />
nhóm chuột bị xuất huyết Não thông lạc và nhóm nghiªn cứu trong từng ngày bơi kế<br />
tiếp nhau.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2014<br />
<br />
2. Bài tập trí nhớ không gian (Probe task).<br />
<br />
Hình 4: Thời gian phân bố tại phần tƣ của MWM trong bài tập Probe.<br />
Trong bài tập trí nhớ không gian, chuột ở các lô đều sử dụng thời gian lâu hơn tại<br />
phần tƣ đích và không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các lô. Thời gian sử dụng tại<br />
phần tƣ đích giảm dần sau 30, 60, 90 giây bơi trong mê lộ nƣớc. Không có sự khác<br />
biệt đáng kể về thời gian bơi giữa các nhóm tại phần tƣ đích trong khoảng thời điểm<br />
0 - 30; 30 - 60; 60 - 90 giây.<br />
<br />