Luận án Tiến sĩ Kỹ thuật: Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu gama-aminobutyric acid bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGUYỄN VIỆT TẤN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN

GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

HÀ NỘI - 10/2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

NGUYỄN VIỆT TẤN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHÈ ĐEN GIÀU GAMA AMINOBUTYRIC ACID BẰNG KỸ THUẬT LÊN MEN TỪ MỘT SỐ GIỐNG CHÈ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 9540104

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS. NGUYỄN DUY THỊNH

2. PGS.TS. NGUYỄN DUY LÂM

HÀ NỘI - 10/2022

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh và PGS.TS Nguyễn Duy Lâm.

Các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được

công bố trước đó ở bất kỳ nơi nào.

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

1. PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh Nguyễn Việt Tấn

2. PGS.TS Nguyễn Duy Lâm

i

LỜI CAM ĐOAN

Để có thể hoàn thành nghiên cứu và viết luận án này, trước hết tôi xin chân thành

cảm ơn PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh và PGS.TS Nguyễn Duy Lâm, những người thầy

tâm huyết đã có những định hướng và hướng dẫn rất có giá trị khoa học cho nghiên

cứu sinh.

Tôi cũng chân thành cảm ơn Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu

hoạch, Phòng Nghiên cứu Công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm, Phòng Khoa học

và Hợp tác quốc tế trực thuộc Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch,

và Trường Cao đẳng công nghiệp

thực phẩm, Bộ Công Thương

đã tạo điều kiện cho tôi tiến hành nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả người thân, đồng nghiệp và những người bạn

đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 10 năm 2022

LỜI CẢM ƠN

ii

Nguyễn Việt Tấn

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ................................................................................................. i

Lời cảm ơn ................................................................................................... ii

Mục lục ........................................................................................................ iii

Danh mục chữ viết tắt ............................................................................... viii

Danh mục các bảng .................................................................................... xii

Danh mục các hình ..................................................................................... xv

MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 7

1.1. Tổng quan về cây chè, thành phần, hoạt tính sinh học và sản phẩm .... 7

1.1.1. Giới thiệu chung về cây chè ........................................................... 7

1.1.2. Thành phần hóa học của chè tươi .................................................. 8

1.1.3. Hoạt tính sinh học và tác dụng của chè đối với sức khỏe ............ 11

1.1.4. Các sản phẩm chè và sự khác biệt về công nghệ và tính chất ..... 13

1.2. Tổng quan về gama-aminobutyric axit (GABA) ................................ 15

1.2.1. Giới thiệu chung về GABA .......................................................... 15

1.2.2. Hóa học, phân bố trong tự nhiên và sự chuyển hóa của GABA .. 16

1.2.3. Vai trò và ứng dụng của GABA ................................................... 18

1.2.4. Sản xuất và sản phẩm GABA thương mại ................................... 21

1.2.5. Tình trạng pháp lý của GABA và liều lượng sử dụng ................. 22

1.3. Chế biến chè giàu GABA bằng lên men vi sinh vật ........................... 24

1.3.1. Thực phẩm giàu GABA bằng lên men vi sinh vật ....................... 24

1.3.2. Chè lên men bằng vi sinh vật ....................................................... 27

1.3.3. Chè giàu GABA bằng lên men vi sinh vật ................................... 30

1.4. Chế biến chè giàu GABA bằng lên men yếm khí ............................... 32

1.4.1. Sự chuyển hóa GABA trong thực vật và trong lá chè ................. 32

iii

1.4.2. Công nghệ lên men yếm khí và đặc điểm chè giàu GABA ......... 33

1.4.3. Lợi ích của chè giàu GABA ......................................................... 37

1.5. Một số nghiên cứu thực phẩm và chè giàu GABA ở Việt Nam ......... 38

1.5.1. Thực phẩm giàu GABA bằng lên men vi sinh vật ....................... 38

1.5.2. Thực phẩm giàu GABA từ hạt nảy mầm ..................................... 39

1.5.3. Chế biến chè lên men và chè giàu GABA ở Việt Nam ............... 40

1.6. Kết luận từ tổng quan và giả thuyết nghiên cứu ................................. 41

1.6.1. Những kết luận rút ra từ tổng quan .............................................. 41

1.6.2. Những định hướng và giả thuyết nghiên cứu của luận án ........... 43

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 45

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................... 45

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 45

2.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh vật ............................... 45

2.1.3. Thiết bị phân tích và thiết bị công nghệ ....................................... 47

2.2. Kỹ thuật công nghệ để nghiên cứu chế biến chè ................................ 47

2.2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ để nghiên cứu lên men chè ............... 47

2.2.2. Kỹ thuật làm héo, vò và sấy chè .................................................. 47

2.2.3. Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí ................................................. 48

2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................ 49

2.3.1. Các thí nghiệm lựa chọn chủng giống vi sinh vật và chè thích

hợp .......................................................................................................... 49

2.3.2. Các thí nghiệm xác định tác dụng của lên men yếm khí ............. 51

2.3.3. Các thí nghiệm xác định tác dụng của lên men yếm khí kết hợp lên

men bằng lactic ...................................................................................... 53

2.3.4. Các thử nghiệm hoàn thiện công nghệ và sản xuất quy mô pilot 53

2.3.5. Thí nghiệm bảo quản chè đen giàu GABA .................................. 53

2.4. Phương pháp phân tích ........................................................................ 53

2.4.1. Phương pháp phân tích hàm lượng GABA .................................. 53

iv

2.4.2. Phương pháp xác định enzym glutamate decarboxylase ............. 55

2.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng chè ..................... 55

2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 55

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 57

3.1. Nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn lactic và nguyên liệu chè thích hợp cho

sản xuất chè giàu GABA bằng phương pháp lên men ............................... 57

3.1.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym

glutamate decarboxylase cao ................................................................. 57

3.1.2. Thẩm định đặc điểm hình thái và phân loại 4 chủng vi khuẩn

lactic ........................................................................................................ 58

3.1.3. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè ................. 63

3.1.4. Xác định chế độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic để

lên men chè giàu GABA ........................................................................ 64

3.1.5. Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic ............................. 72

3.1.6. Phân tích các chỉ số chất lượng một số giống chè ở Việt Nam ... 77

3.1.8. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.1 ............................. 83

3.2. Tác dụng của lên men yếm khí tới hiệu quả tích lũy GABA và chất

lượng chè đen giàu GABA ......................................................................... 83

3.2.1. Thăm dò khả năng tích lũy GABA do quá trình lên men yếm

khí ........................................................................................................... 83

3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng quá trình lên men yếm

khí ........................................................................................................... 84

3.2.3. Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí ......................................... 86

3.2.4. So sánh chất lượng của chè đen lên men yếm khí với chè đen được

sản xuất theo quy trình truyền thống ...................................................... 89

3.2.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.2 ............................. 90

3.3. Tác dụng của lên men yếm khí kết hợp lên men bằng vi khuẩn lactic tới

v

hiệu quả tích lũy GABA và chất lượng chè đen giàu GABA .................... 91

3.3.1. Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa công nghệ của các yếu tố ảnh

hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic ....... 91

3.3.2. Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí kết hợp lên men lactic .... 95

3.3.3. So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm từ 2 phương án lên

men yếm khí không và có sử dụng chế phẩm vi khuẩn ......................... 97

3.3.4. Tối ưu hóa lên men yếm khí chè đen bằng phương pháp thang điểm

có sử dụng hệ số quan trọng cho các chỉ tiêu chất lượng ...................... 99

3.3.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.3 ........................... 106

3.4. Thực nghiệm sản xuất chè giàu GABA quy mô Pilot ...................... 106

3.4.1. Sản xuất chè ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ ................... 106

3.4.2. Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA quy

mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ ............................................................ 111

3.4.3. Áp dụng quy trình đã hoàn thiện để sản xuất chè đen giàu GABA

quy mô pilot với một số giống chè Việt Nam ...................................... 119

3.4.4. Sự biến đổi chất lượng cảm quan của chè đen giàu GABA giống

Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên trong quá trình bảo quản ..................... 121

3.4.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.4 ........................... 124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................. 125

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CỦA LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ ........... 127

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 128

PHỤ LỤC ................................................................................................. 145

PHỤ LỤC 1. ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN

LACTIC .................................................................................................... 146

PHỤ LỤC 2. THU HỒI, LÀM KHÔ VÀ BẢO QUẢN SINH KHỐI

CHỦNG GIỐNG ...................................................................................... 150

PHỤ LỤC 3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG VI

KHUẨN ................................................................................................... 154

vi

PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM VÀ SẢN PHẨM ... 158

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AABA alpha-aminobutyric acid alpha-aminobutyric axit

ABALDH 4-aminobutyraldehyde enzy 4-

dehydrogenase aminobutyraldehyde

dehydrogenaza

BABA beta-aminobutyric acid beta-aminobutyric axit

CACA cis-aminocrotonic acid cis-aminocrotonic axit

CFSAN center for food safety and trung tâm an toàn thực

applied nutrition phẩm và dinh dưỡng ứng

dụng

chemical abstract services dịch vụ tóm tắt hóa chất CAS

central nervous system hệ thần kinh trung ương CNS

colony forming unit đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU

crushing tearing and curling - chè đen công nghệ CTC CTC

black tea

orthodox -black tea chè đen công nghệ OTD OTD

diamineoxidase enzym diamineoxidase DAO

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2- DPPH

picrylhydrazyl

DS dietary supplements chất bổ sung dinh dưỡng

DSHEA dietary supplement health and đạo luật giáo dục và sức

education act khỏe bổ sung chế độ dinh

dưỡng

electron transport chain chuỗi vận chuyển điện tử ETC

deoxynucleic acid deoxynucleic axit DNA

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2- DPPH

picrylhydrazyl

epicatechin epicatechin EC

viii

epicatechin gallate epicatechin gallat ECG

EGC epigallocatechin epigallocatechin

EGCG epigallocatechin gallate epigallocatechin gallat

EFSA european food safety authority cục an toàn thực phẩm

châu âu

EMA european medicines agency cục quản lý thuốc châu âu

EPA U.S. environmental protection cục bảo vệ môi trường Mỹ

agency

FDA U.S. food and drug cục quản lý thực phẩm và

administration dược phẩm Mỹ

FMG fermented milk containing sữa lên men chứa GABA

GABA

GC gallocatechin gallocatechin

GH immunofunctional growth hocmon tăng trưởng có

hormone chức năng miễn dịch

irGH immunoreactive growth hocmon tăng trưởng có

hormone hoạt tính miễn dịch

GABA gamma-aminobutyric acid gamma-aminobutyric axit

enzym GABA GABA-T GABA transaminase

transaminaza

GAD glutamate decarboxylase enzym glutamat

decacboxylaza

GBR germinated brown rice gạo lứt nảy mầm

GHB gamma-hydroxybutyrate gamma-hydroxybutyrat

enzym GHB GHBDH GHB dehydrogenase

dehydrogenaza

GLRs glutamate receptor-like proteins protein giống như chất

nhận glutamat

GC gas chromatography sắc kí khí

ix

GTE green tea extract dịch chiết chè xanh

SSF solid state fermentation lên men môi trường rắn

HDL high-density lipoprotein lipoprotein tỷ trọng cao

HGH human growth hormone hocmon tăng trưởng ở người

HPLC high performance liquid sắc kí lỏng hiệu năng cao

chromatography

JECFA joint FAO/WHO expert ủy ban chuyên gia

committee on food additives FAO/WHO hỗn hợp về

phụ gia thực phẩm

LAB lactic acid bacteria vi khuẩn lên men axit

lactic

LDH lactate dehydrogenase enzym lactat

dehydrogenaza

NIH national institutes of health viện sức khỏe quốc gia Mỹ

NHPD natural and non-prescription tổng cục quản lý các sản

health products directorate phẩm sức khỏe tự nhiên

Canada

PCR polymerase Chaine Reaction phản ứng chuỗi

polymeraza

PSP pyridoxal phosphate pyridoxal phosphat

ppm part per million đơn vị một phần triệu

SCN suprachiasmatic nuclei tế bào não có nhiệm vụ

phản ứng với các tín hiệu

sáng - tối

SSA succinic semialdehyde succinic semialdehid

SSADH succinic semialdehyde enzym succinic

dehydrogenase semialdehyd

dehydrogenaza

TCA tricarboxylic acid cycle chu trình axit tricacboxylic

x

hay chu trình Krebs

TCVN tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam -

TGA therapeutic goods administration cục quản lý hàng hóa trị liệu

TLC thin layer chromatography sắc kí bản mỏng

TSTBNM-M tổng số tế bào nấm mốc - men

TSVKHK tổng số vi khuẩn hiếu khí

TSVKYK tổng số vi khuẩn yếm khí

VTCC-B-439 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarium VTCC-B-439

VTCC-B-411 Chủng vi khuẩn Lactobacillus casei VTCC-B-411

66 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 66

xi

67 Chủng vi khuẩn Lactobacillus brevis 67

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT Tên bảng Trang

Bảng 1.1. Hàm lượng GABA (mg/l00g) của các loại chè khác nhau ........ 34

Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym

glutamatedecarboxylase được sàng lọc sơ bộ .......................... 57

Bảng 3.2. Khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn .. 64

Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng và hàm lượng GABA trong 8 môi trường

nuôi cấy chủng vi khuẩn VTCC-B-439 ................................... 65

Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và hàm lượng GABA trong 8 môi trường

nuôi cấy chủng vi khuẩn VTCC-B-411 khác nhau.................. 66

Bảng 3.5. Mức độ sinh trưởng và pH môi trường sau nuôi cấy của hai chủng

nghiên cứu ở pH khác nhau ..................................................... 67

Bảng 3.6. Kết quả thực nghiệm theo ma trận ............................................. 73

Bảng 3.7. Lược đồ tối ưu hóa thực nghiệm ............................................... 76

Bảng 3.8. Hàm lượng GABA và các chỉ số cảm quan của các mẫu sản phẩm

chè lên men (*)......................................................................... 77

Bảng 3.9. Độ ẩm nguyên liệu các giống chè theo thời gian trong năm

(%) ............................................................................................ 78

Bảng 3.10. Hàm lượng chất hòa tan trong nguyên liệu của các giống chè

theo thời gian trong năm (% chất khô) .................................... 79

Bảng 3.11. Hàm lượng tanin trong nguyên liệu của các giống chè theo thời

gian trong năm (% chất khô).................................................... 79

Bảng 3.12. Hàm lượng tổng axit amin trong nguyên liệu của các giống chè

theo thời gian trong năm (%) ................................................... 80

Bảng 3.13. Hàm lượng các axit amin thành phần trong nguyên liệu thu hoạch

vào tháng 6 của các giống chè (% chất khô) ........................... 80

Bảng 3.14. So sánh hàm lượng thành phần trong nguyên liệu của các giống

xii

chè (% chất khô) ...................................................................... 82

Bảng 3.15. Tiêu chuẩn chè nguyên liệu dùng cho sản xuất chè giàu

GABA ...................................................................................... 82

Bảng 3.16. Hàm lượng GABA và các chỉ số chất lượng của bán thành phẩm

chè đen lên men theo 2 phương án .......................................... 84

Bảng 3.17. Ảnh hưởng nhiệt độ lên men yếm khí đến hàm lượng GABA 85

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến hàm lượng GABA

trong chè ................................................................................... 85

Bảng 3.19. Hàm lượng GABA và các chỉ số chất lượng cảm quan của các

mẫu thí nghiệm theo ma trận ................................................... 87

Bảng 3.21. Hàm lượng GABA của 9 mẫu thí nghiệm kiểm định .............. 88

Bảng 3.22. Các chỉ tiêu chất lượng của 2 mẫu chè lên men và kiểm

chứng ........................................................................................ 90

Bảng 3.23. Hàm lượng GABA trong chè đen giống Phúc Vân Tiên lên men

ở những thời gian và nhiệt độ khác nhau ................................. 95

Bảng 3.24. Hàm lượng GABA (mg/100g chè) theo ma trận khuyết 1/2 ... 96

Bảng 3.25. Kết quả thực nghiệm theo ma trận tối ưu hóa ......................... 97

Bảng 3.26. Các chỉ số cảm quan của 2 mẫu chè có chế độ lên men yếm khí

có và không sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic ....................... 98

Bảng 3.27. Kết quả phân tích hàm lượng GABA (mg/100g) của 27 mẫu thí

nghiệm .................................................................................... 102

Bảng 3.28. Kết quả phân tích các chỉ số cuối 12 mẫu ............................. 102

Bảng 3.29. Điểm tổng hợp của 3 chỉ tiêu chất lượng chè ........................ 105

Bảng 3.30. Các chỉ số chất lượng của chè đen sản xuất theo QT1, QT2 và

QT3 ........................................................................................ 110

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của thời gian héo đến sự biến đổi tính chất của lá

chè .......................................................................................... 113

Bảng 3.32. Ảnh hưởng của thời gian héo nhẹ đến chất lượng của chè GABA

xiii

bán thành phẩm ...................................................................... 114

Bảng 3.34. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến các chỉ tiêu hóa

lý của chè đen giàu GABA .................................................... 116

Bảng 3.35. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến các chỉ tiêu cảm

quan của chè đen GABA ....................................................... 118

Bảng 3.36. Các chỉ số cảm quan và hàm lượng GABA (mg/100g) của các

mẫu chè .................................................................................. 120

Bảng 3.37. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được bảo quản

trong bao bì túi chất dẻo PE (B1) .......................................... 121

Bảng 3.38. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được bảo

quản trong bao bì màng giấy (B2) ......................................... 121

Bảng 3.39. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được bảo

quản trong bao bì túi phức hợp hút chân không (B3) ............ 122

Bảng 3.40. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu chè

được bảo quản trong bao bì túi chất dẻo PE (B1) .................. 123

Bảng 3.41. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu chè

được bảo quản trong bao bì màng giấy (B2) ......................... 123

Bảng 3.42. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu chè

xiv

được bảo quản trong bao bì túi phức hợp (B3) ...................... 124

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT Tên hình Trang

Hình 1.1. Gamma‐aminobutyric axit (GABA, 4‐aminobutyric axit) ........ 16

Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa GABA (tổng hợp và phân giải) .............. 17

Hình 1.3. Vai trò của GABA trong động vật, vi sinh vật và thực vật ........ 18

Hình 1.4. Các quy trình cơ bản để sản xuất chè GABA bằng lên men yếm

khí............................................................................................. 35

Hình 1.5. Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất chè đen GABA dự

kiến ........................................................................................... 44

Hình 2.1. Hai phương án lên men yếm khí sản xuất chè đen giàu GABA 48

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (bên trái) và hình thái tế bào (bên phải) của

chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-439 (bar 5µm) ....................... 59

Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc (bên trái) và hình ảnh tế bào (bên phải) chủng

vi khuẩn lactic VTCC-B-411 (bar 5 µm) ................................. 59

Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh tế bào (bên phải) của chủng vi

khuẩn lactic 66 (bar 5µm) ........................................................ 60

Hình 3.4. Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và hình ảnh tế bào (phải) của chủng vi

khuẩn lactic 67 (bar 5µm) ........................................................ 60

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng nghiên cứu và một số loài

có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự

rRNA 16S ................................................................................. 62

Hình 3.6. Mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic VTCC-B-439 và VTCC-

B-411 ở các nhiệt độ khác nhau ............................................... 67

Hình 3.7. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 ở các điều kiện cung cấp khí khác nhau ........... 68

Hình 3.8. Mức độ sinh trưởng của 2 chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

xv

VTCC-B-411 ở các tỷ lệ giống khác nhau .............................. 69

Hình 3.9. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 trên các nguồn nitơ khác nhau .......................... 70

Hình 3.10. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 trên các nguồn cacbon khác nhau ..................... 71

Hình 3.11. Mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên môi trường

có tỷ lệ glutamate khác nhau.................................................... 71

Hình 3.12. Hàm lượng GABA ở chè lên men bởi vi khuẩn lactic với các tỷ

lệ giống khác nhau ................................................................... 93

Hình 3.13. Hàm lượng GABA ở chè lên men bởi vi khuẩn lactic với độ ẩm

lên men khác nhau ................................................................... 94

Hình 3.14. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất 3 loại chè đen ............... 107

xvi

Hình 3.15. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA ..... 117

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu và sản xuất thực phẩm bảo vệ

sức khỏe đã trở thành một lĩnh vực rất triển vọng và nhận được sự quan tâm

đặc biệt từ nhiều doanh nghiệp và tổ chức nghiên cứu. Nhiều hoạt chất sinh học

từ nguồn thực vật, động vật và vi sinh vật đã được tìm hiểu, khai thác để tạo ra

các sản phẩm không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tác dụng hỗ trợ phòng

chống bệnh tật.

Gama-Aminobutyric Axit (GABA) là một trong những hoạt chất sinh học

nói trên. Các nhà khoa học đã phát hiện được vai trò và chức năng sinh lý của

chất này trong điều tiết các chức năng tim mạch và tuần hoàn mạch máu não,

ức chế dẫn truyền thần kinh, tăng cường trí nhớ, làm giảm các rối loạn tâm

trạng và chống mất ngủ [14,22,23,30,39,107].

GABA tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên kể cả thực vật, động vật và vi

sinh vật, nhưng phong phú và đáng kể nhất là trong các thực phẩm lên men và

trong một số loại cây trồng, bao gồm cả lá chè xanh [19,21,23,24,28,32]. Cơ

chế hình thành GABA trong thực vật và vi sinh vật lên men đã được phát hiện

và điều kiện môi trường là nguyên nhân làm cho sinh vật tăng cường sinh tổng

hợp GABA [79,83,105]. Đây chính là ý tưởng để nghiên cứu sản xuất ra các

loại sản phẩm giàu GABA từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn thiếu ô xy

trong quá trình ngâm hạt nảy mầm, lên men chìm vi sinh vật trong môi trường

yếm khí.

Mặc dù GABA đã được tổng hợp bằng con đường hóa học, nhưng có nhiều

hạn chế đáng kể, cho nên những sản phẩm GABA thương mại trên Thế giới

hiện nay chỉ là những sản phẩm của công nghệ lên men vi sinh vật sau khi được

tinh chế để có độ tinh khiết cao [143]. Các sản phẩm GABA thương mại phổ

1

biến nhất chính là các thực phẩm và đồ uống giàu GABA được con người tạo

ra do tác dụng của enzym có mặt trong vi sinh vật lên men hay hệ enzym có

sẵn trong nông sản thực phẩm [144].

Các sản phẩm chè như chè xanh, chè đen, chè ô long, v.v đều được chế

biến từ lá và búp của cây chè Camellia sinensis. Cây chè được trồng ở nhiều

nước trong đó có Việt Nam và người Việt rất ưa chuộng thưởng thức chè. Hiện

nay Việt Nam chế biến và xuất khẩu chủ yếu là chè đen, trong khi ở trong nước

người dân thích dùng chè xanh hơn. Chè chứa nhiều hợp chất hóa học chẳng

hạn catechin, alkaloid, polysaccharid, axit amin, vitamin, khoáng, tinh dầu.

Trong số đó, axit amin có vai trò đặc biệt quan trọng vì không những tạo ra

hương vị của nước chè mà còn có rất nhiều lợi ích cho sức khỏe

[1,5,9,17,22,23,34,35]. GABA chính là một axit amin tự do 4 carbon được tìm

thấy đáng kể trong lá chè tươi và tất cả các sản phẩm chè [107].

GABA được tạo ra bởi quá trình decarboxy hóa axit L-glutamic được xúc

tác bởi enzym glutamate decarboxylase (GAD). Tất cả các loại chè đều có chứa

GABA với hàm lượng khác nhau và thường ở mức cao hơn một số nông sản

thực phẩm khác, nhưng GABA cao hơn nhiều ở sản phẩm gọi là chè GABA

hay chè Gabaron [107,121,127]. Sản phẩm này do Nhật Bản sản xuất bằng một

kỹ thuật đặc biệt là lên men lá chè tươi trong khí nitơ. Sản phẩm chè này rất dễ

uống như tất cả những sản phẩm chè truyền thống khác, rất có lợi cho sức khỏe

và hoàn toàn không có tác dụng phụ [121].

Rất gần đây, các nhà khoa học chủ yếu ở Trung Quốc đã phát triển kỹ thuật

tạo chè GABA bằng phương pháp lên men vi sinh vật. Nếu như các chủng nấm

mốc Aspergillus là chủ đạo trong lên men sản xuất chè lên men Phổ Nhĩ thì các

nhà khoa học Trung Quốc cho biết các chủng vi khuẩn Lactobacillus lên men

lactic có khả năng sinh trưởng, sinh tổng hợp GABA trên chè

[92,93,94,100,106,141]. Nhiều nghiên cứu sản xuất chè và nước chè giàu

2

GABA theo hướng này với cơ chất bổ sung natri glutamat (SMG) đã được tiến

hành, tạo ra một xu hướng rất mới để làm tăng hàm lượng GABA trong chè

[78,79,80,100].

Tại Việt Nam, trong thời gian qua đã có một số nghiên cứu và sản xuất

thực phẩm giàu GABA như hạt nảy mầm, thực phẩm lên men giàu GABA

[4,10,13,102]. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm GABA tinh khiết cao bằng

phương pháp lên men cũng đã được tiến hành thăm dò [3]. Tuy nhiên, các

nghiên cứu và sản xuất chè lên men và chè giàu GABA còn rất hạn chế, nhất là

nghiên cứu về chè giàu GABA [5,6]. Nghiên cứu duy nhất do chính tác giả luận

án chủ trì cũng mang tính chất thăm dò và chủ yếu có kết quả về chủng giống

vi khuẩn và nguyên liệu chè [12].

Nhiệm vụ nghiên cứu sản xuất chè giàu GABA ở Việt Nam là vấn đề rất

mới, còn nhiều lý luận và thực tiễn cần tìm tòi và thực hiện, nhưng sẽ có giá trị

rất đáng kể vì khai thác được tiềm năng nguyên liệu, sở thích tiêu dùng, trong

khi tạo ra được sản phẩm mới đáp ứng nhu cầu ẩm thực và bảo vệ sức khỏe

cộng đồng.

Trên cơ sở những dẫn liệu đã nêu ở trên, nghiên cứu sinh đã xác định

nhiệm vụ của luận án là “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè đen giàu gama-

aminobutyric axit (GABA) bằng kỹ thuật lên men từ một số giống chè Việt Nam”.

2. Mục tiêu luận án

Xác định và thiết lập được một số thông số của quá trình cải tiến hệ thống

chế biến chè đen Việt Nam thành chè đen giàu GABA, bao gồm các chủng

giống vi khuẩn Lactobacillus thúc đẩy sinh tổng hợp GABA, các giống chè

thích hợp, xác định và tối ưu hóa các thông số về qui trình lên men yếm khí có

và không có bổ sung vi khuẩn, sản xuất thử thành công ở quy mô thực nghiệm

tạo chè đen giàu GABA có chất lượng cảm quan tốt và thương mại hóa được.

3. Nội dung luận án

Để thực hiện được mục tiêu, đề tài luận án đã thực hiện những nội dung

3

nghiên cứu sau:

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho quá trình lên men yếm

khí để sản xuất chè đen giàu GABA;

- Kiểm định hình thái, một số tính chất sinh lý, sinh hóa, và định danh

chính xác, tối ưu hóa quá trình nuôi cấy chủng vi khuẩn lựa chọn được;

- Nghiên cứu lựa chọn giống chè Việt Nam phù hợp làm nguyên liệu cho

sản xuất chè đen giàu GABA;

- Khảo sát khả năng tích lũy GABA trong chè đen khi bổ sung công đoạn

lên men yếm khí (không bổ sung vi sinh vật);

- Khảo sát khả năng tích lũy GABA trong chè đen khi bổ sung công đoạn

lên men yếm khí có bổ sung vi sinh vật lên men;

- Phân tích, so sánh, đánh giá chất lượng toàn diện sản phẩm chè đen giàu

GABA;

- Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất thực

nghiệm chè đen giàu GABA và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở chè đen giàu GABA.

4. Những đóng góp mới của luận án

a) Đề xuất đưa thêm công đoạn lên men yếm khí trong quy trình sản xuất

chè đen truyền thống tạo ra các sản phẩm chè đen có hàm lượng GABA cao.

b) Lựa chọn và xác định được các thông số quan trọng để xây dựng quy

trình sản xuất chè đen có GABA cao và chất lượng cảm quan tốt. Cụ thể: (1)

Chọn được 2 chủng vi khuẩn Lactobcillus là L. casei VTCC-B-411 và L.

plantarum VTCC-B-439 có khả năng sinh tổng hợp GABA cao đưa vào quy

trình sản xuất chè đen; (2) Lựa chọn và đề xuất hai giống chè Phúc Vân Tiên

và Kim Tuyên làm nguyên liệu để sản xuất chè đen vừa cho GABA cao vừa có

giá trị cảm quan tốt; (3) Từ khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa đa yếu tố, đã xác

định được các thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm khí

+ vi khuẩn lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt

4

độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này, hàm lượng

GABA của sản phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở mức hài

hòa nhất.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học

Những kết quả nghiên cứu trong luận án có thể tạo ra những đóng góp về

mặt khoa học như sau:

a) Đã cung cấp những dẫn liệu khoa học về vai trò của lên men yếm khí

và vi sinh vật chi Lactobacillus trong sự tăng cường hàm lượng GABA trong

quá trình chế biến chè đen của Việt Nam. Những dẫn liệu này là cơ sở khoa học

cho việc đề xuất bổ sung hai công đoạn lên mên yếm khí và lên men yếm khí

có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus trong quá trình chế biến chè, tạo chè đen

giàu GABA thành công.

b) Đã cung cấp những thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men

kép (yếm khí + vi khuẩn lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè

vò 68%, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này,

hàm lượng GABA của sản phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở

mức hài hòa nhất có thể. Những thông số này là những tài liệu khoa học quí

phục vụ giảng dạy và nghiên cứu quy trình sản xuất chè đen giàu GABA có

chất lượng cảm quan tốt.

Ý nghĩa thực tiễn:

a) Đã xây dựng được quy trình công nghệ có tính khả thi cao, được hoàn

thiện và kiểm định quy mô pilot để sản xuất chè giàu GABA bằng công nghệ

lên men nhằm nâng cao giá trị gia tăng và đa dạng hóa sản phẩm từ một số

giống chè Việt Nam;

b) Đã đưa ra được một số sản phẩm chè đen giàu GABA thích hợp như là

một dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe có thể thương mại hoá;

c) Đã tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA quy mô

pilot và bước đầu ứng dụng thực tiễn có kết quả quy trình công nghệ này tại

5

Công ty CP Chè Sông Lô và Công ty CP Chè Tân Trào tại tỉnh Tuyên Quang.

6. Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 126 trang (không kể danh mục các công trình nghiên cứu,

tài liệu tham khảo và phụ lục), 42 bảng số liệu, 15 hình. Kết cấu của luận án

gồm 8 phần chính: Mở đầu (6 trang), tổng quan tài liệu (38 trang), vật liệu và

phương pháp nghiên cứu (12 trang), kết quả và thảo luận (68 trang), kết luận

và kiến nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố của luận án (1

trang), danh mục tài liệu tham khảo (152 tài liệu) và phần phụ lục (4 phụ lục).

6

********

Chương 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây chè, thành phần, hoạt tính sinh học và sản phẩm

1.1.1. Giới thiệu chung về cây chè

Cây chè xanh nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau: Phân giới

thực vật - Tracheobionta; Liên ngành hạt - Spermatophyta; Ngành -

Magnoliophyta; Lớp song tử diệp - Dicotyledonae - Magnoliopsida; Bộ chè

Theales - Dilleniide; Họ chè - Theaceae; Chi chè - Camellia L (Thea); Loài -

Camellia sinensis (L.) Kuntze (Tea, Wikipedia). Ngày nay, cây chè được trồng

ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trải dài từ 30 vĩ

độ nam đến 45 vĩ độ bắc, tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á chiếm 80 - 90%

tổng diện tích chè thế giới. Trong đó nổi tiếng là Ấn Độ, Trung Quốc, Kenya,

Sri Lanka, Thổ Nhĩ Kỳ và Việt Nam (Theo: Tea, Wikipedia).

Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh mà

cây chè Camellia Sinensis (L.) Kuntze được chia thành thành 4 loại (Liu, 2005):

- Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var.Macrophylla):

- Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var.Bohea)

- Chè Shan (Camellia sinensis var.Shan)

- Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica)

Tại Việt Nam, chè được trồng nhiều ở vùng Tây Bắc, vùng Việt Bắc -

Hoàng Liên Sơn, vùng Trung du - Bắc bộ, vùng Bắc Trung bộ và Tây Nguyên.

Năm 2019, Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng chè đứng thứ 5 và xuất

khẩu chè lớn thứ 3 trên thế giới với 123.400 ha diện tích trồng và hơn 500 cơ

sở sản xuất chế biến, công suất đạt trên 500.000 tấn chè khô mỗi năm, sản lượng

7

1025,2 ngàn tấn (Tổng cục Thống kê, 2019).

1.1.2. Thành phần hóa học của chè tươi

1.1.2.1. Nước

Thành phần chủ yếu trong búp chè tươi là nước, cụ thể trong búp chè (1

tôm + 3 lá) hàm lượng nước thường có từ 75-82%. Hàm lượng nước trong búp

chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác, thời gian

hái và tiêu chuẩn hái, v.v. Nước trong nguyên liệu chè là môi trường xảy ra

tương tác giữa các chất có trong nguyên liệu chè khi chế biến. Nước tham gia

trực tiếp vào nhiều phản ứng thủy phân, ô xy hóa khử. Hàm lượng nước có

quan hệ mật thiết đối với quá trình chế biến chè. Trong quá trình chế biến chè

cần khống chế sự bay hơi nước, đặc biệt trong sản xuất chè đen [7,9,78].

1.1.2.2. Hợp chất phenol và polyphenol

Hợp chất phenol giữ vai trò chủ yếu trong quá trình tạo màu sắc, hương vị

của chè đặc biệt là chè đen. Tiêu biểu là tanin có đặc tính dễ bị ô xy hóa dưới

tác dụng của enzym và khi được cung cấp ô xy đầy đủ. Vì vậy, chè nguyên

liệu chứa càng nhiều tanin, đặc biệt là tanin hòa tan thì sản phẩm chè đen có

chất lượng càng cao. Flavanoid là thành phần quan trọng của tanin, trong đó

catechin và flavonol chiếm tỉ lệ lớn [7,9,78].

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất

trong lá chè. Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất

polyphenol trong các loại cây khác, đó là các cấu tử chính chiếm đa số là các

catechin (C, EC, EGCG, EGC, ECG,...). Trong sản xuất chè đen, catechin có

vị trí quan trọng trong việc tạo màu sắc, mùi, vị cho chè thành phẩm. Có 6 loại

catechin chiếm khoảng 20 - 30 % tổng lượng chất khô trong lá chè tươi. Về cấu

trúc, catechin là là hợp chất flavanol, được đặc trưng bởi cấu trúc C6-C3-C6,

tương ứng với sự thay thế 2- phenyl bằng benzopyran và pyron [7,9,78].

1.1.2.3. Hợp chất alcaloid và caffein

Alcaloid là nhóm hợp chất vòng hữu cơ có chứa nitơ trong phân tử. Phần

8

lớn các alcaloid là những chất không màu, có vị đắng và ít hòa tan trong nước.

Trong lá chè tươi người ta tìm thấy các alcaloid chủ yếu là caffein, theobromin

và theophylin. Trong đó, caffein chiếm khoảng 2 - 5% lượng chất khô,

theobromin và theophyllin với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều, chỉ khoảng

0,33% khối lượng chất khô. Tuy vậy, vai trò dược lý của theobromin và

theophyllin của cây chè quan trọng hơn so với caffein [7,27]. Caffein có khả

năng liên kết với tanin và các sản phẩm ô xy hóa của tanin để tạo nên các

muối tanat caffein. Các muối này tan trong nước nóng, không tan trong nước

lạnh và tạo nên hương thơm và sắc nước chè xanh, giảm vị đắng và nâng cao

chất lượng thành phẩm [7,27].

1.1.2.4. Protein và axit amin

Protein trong búp chè phân bố không đồng đều, chiếm khoảng 15% tổng

lượng chất khô của lá chè tươi. Protein có thể kết hợp với trực tiếp với tanin,

polyphenol tạo ra những hợp chất không tan làm đục nước chè đen. Nhưng

trong chế biến chè xanh, protein kết hợp với một phần tanin làm cho vị đắng và

chát giảm đi. Người ta đã tìm thấy 17 axit amin có trong chè, trong đó 10 loại

amin cơ bản là theanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, tyrosine,

glutamine, serine, glutamic, aspartic. Theanin chiếm hàm lượng cao nhất,

khoảng 50-60% tổng hàm lượng axit amin tự do và là axit amin đặc trưng của

cây chè [118]. Các axit amin có thể kết hợp với đường, tanin tạo ra các hợp

chất aldehyd, alcol có mùi thơm cho chè đen và chúng cũng góp phần điều vị

cho chè xanh. Axit amin trong chè không chỉ ở trong thành phần protein, mà

còn ở dạng tự do, có ý nghĩa lớn đối với chất lượng chè. Hàm lượng axit amin

trong lá chè phụ thuộc nhiều vào giống và điều kiện canh tác cây chè [78].

1.1.2.5. Gluxit và pectin

Trong lá chè chứa ít gluxit hòa tan, các gluxit không hòa tan chiếm tỉ lệ

lớn. Pectin làm cho chè có mùi táo chín trong quá trình làm héo, làm chè dễ

xoăn khi chế biến nhưng dễ hút ẩm nên có ảnh hưởng xấu tới quá trình bảo

9

quản chè [78].

1.1.2.6. Các chất màu, vitamin và khoáng

Các chất màu trong lá chè gồm có anthocyanidin (cyanidin, delphenidin),

carotenoid, chlorophyll. Các hợp chất màu có vai trò quan trọng trong tạo màu

cho thành phẩm. Búp chè chứa hầu hết các loại vitamin như vitamin A, B1, B2,

PP, đặc biệt vitaminn C có rất nhiều trong chè, cao gấp 3-4 lần so với quả cam,

chanh. Trong quá trình chế biến chè đen hàm lượng vitamin C giảm nhiều, còn

trong chế biến chè xanh thì giảm không đáng kể. Trong chè, thành phần khoáng

chủ yếu là kali chiếm gần 50 % tổng lượng khoáng [78].

1.1.2.7. Enzym

Enzym là nhân tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng và chế biến chè,

đặc biệt trong chế biến chè đen. Enzym có vai trò quyết định chiều hướng biến

đổi các phản ứng sinh hóa trong giai đoạn làm héo, vò, lên men. Trong búp chè

có 2 loại enzym chủ yếu là nhóm enzym thủy phân (amilase, protease,

glucosidase) và nhóm enzym ô xy hóa - khử (peroxidase, polyphenoloxidase).

Peroxidase và polyphenoloxidase đóng vai trò quan trọng nhất và có tác dụng

khác nhau trong quá trình lên men chè đen. Các enzym này đều hoạt động mạnh

ở 45°C, nhưng đến 70°C thì hoạt động yếu hẳn đi và ở nhiệt độ cao hơn sẽ bị

bất hoạt hoàn toàn. Trong chế biến chè xanh, không cần tạo nên những biến đổi

sinh hóa cho tanin, nên enzym không có ích cho quá trình chế biến. Vì vậy,

ngay từ giai đoạn đầu của quá trình chế biến chè xanh người ta phải dùng nhiệt

độ cao để vô hoạt enzym bằng cách chần hoặc sao [9,78].

1.1.2.8. Các hợp chất khác

Các hợp chất lipid, phospholipid và các axit béo chiếm khoảng 5-6% trong

lá chè, hàm lượng này thay đổi khá nhiều tùy theo từng giống chè khác nhau.

Các axit béo tự do tìm thấy trong lá chè có linolenic, oleic và palmitic.... Các

hợp chất carotenoid gồm có caroten, lutein, violaxanthin và neoxanthin. Các

axit như citric, tartaric, malic, oxalic, fumaric, caffeic, quinic, gallic,

10

succinic, chlorogenic, neo-chlorohenic, p-coumarylquinic, ellagic axit, v.v

đã được phát hiện trong lá chè tươi. Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối

lượng khô của chè, chiếm nhiều nhất là nhôm, mangan, magie. Các chất dễ bay

hơi (tinh dầu chè) được hình thành trong quá trình sinh trưởng, phát dục của

cây chè và trong quá trình chế biến [1,9,78].

1.1.3. Hoạt tính sinh học và tác dụng của chè đối với sức khỏe

1.1.3.1. Tác dụng chống ô xy hóa của flavonoid

Một trong những cơ sở sinh hóa quan trọng nhất để flavonoit thể hiện được

hoạt tính sinh học là khả năng kìm hãm các quá trình ô xy hóa dây chuyền sinh

ra bởi các gốc tự do hoạt động. Hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc

vào đặc điểm cấu tạo hoá học của từng flavonoid cụ thể [113]. Trong cơ thể

con người có sẵn một vài enzym dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều loại gốc

tự do làm nguy hại tế bào như superoxyt dismutase (SOD), catalase trong nhiều

tế bào hoặc glutathion periodase. Các gốc tự do tạo nên bởi flavonoid phản ứng

với các gốc tự do hoạt động và trung hoà chúng nên không tham gia vào dây

chuyền phản ứng ô xy hoá tiếp theo [113].

1.1.3.2. Tác dụng đối với enzym

Các flavonoid có khả năng tác động đến hoạt động của nhiều hệ enzym

động vật trong các điều kiện in vitro và in vivo. Khả năng tương tác với protein

là một trong những tính chất quan trọng nhất của các hợp chất phenol, quyết

định hoạt tính sinh học của chúng. Phản ứng xảy ra giữa nhóm oxyphenolic và

oxycacbonyl của các nhóm peptit để tạo thành liên kết hydro. Các chất phenol

nói chung khi ở dạng ô xy hoá (quinon) có khả năng liên kết với nhóm

sulfihydril (1) và nhóm (-NH) của lysine hoặc asparaginic (2) trong phân tử

protein enzym. Flavonoid có tác dụng trên nhiều enzym động vật như protein-

tyrozin kinase, protein kinase, lipoxygenase và cyclooxyhenase, phospholypase

và topoizo-merase, glutation S transferase [113].

Bản thân các chất flavonoid khi ở trong cơ thể động vật có thể tồn tại ở

11

dạng ô xy hoá hoặc khử và chịu nhiều biến đổi phức tạp khác nhau cho nên

trong các điều kiện khác nhau nó sẽ thể hiện hoạt tính sinh học khác nhau. Nhờ

tác dụng sinh học đối với enzym mà các flavonoid có khả năng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư, mau chóng làm lành vết thương, giảm các nguy cơ về

bệnh tim mạch [113].

1.1.3.3. Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm

Tác dụng chống viêm nhiễm và kháng khuẩn của catechin đã được nhiều

công trình nghiên cứu trên thế giới chứng minh. Một số tác giả nghiên cứu ứng

dụng anthocyanin, leuco anthocyanin và axit phenolic lên Samonella, thấy có

tác dụng kìm hãm rõ rệt. Hầu hết các chất này đều có khả năng kìm hãm sự hô

hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose. Tác dụng kháng virus của

catechin còn được nghiên cứu thông qua khả năng ức chế virus HIV ở các tế

bào H9 của catechin chiết xuất từ thực vật. Trong các dòng tế bào người,

Herpesvirus hominis bị kìm hãm bởi quercetin ở nồng độ 300 ppm, nhưng

không bị kìm hãm bởi rutin hay dihydro quercitin. Khi thêm quercitin vào virus

gây bệnh ở người, virus sẽ bị kìm hãm nếu có vỏ bọc và chết nếu không có vỏ

bọc bảo vệ [34].

1.1.3.4. Tác dụng đối với ung thư

Các kết quả thực nghiệm cho thấy một số flavonoid có tác dụng chống

ung thư thông qua khả năng hoạt hóa các enzym gan có nhiệm vụ chuyển hóa

các chất gây ung thư. Những sản phẩm chuyển hóa thường có tính gây ung thư

thấp. Ngoài ra, các flavonoid còn tham gia trong việc phòng chống ung thư

bằng khả năng chống ô xy hóa, loại trừ các gốc tự do có thể gây tổn hại tế bào,

làm cho tế bào có những biến đổi ác tính [35].

1.1.3.5. Các tác dụng khác của chè

Có nhiều dẫn liệu chứng mình chè xanh còn có các tác dụng sau: Chống

lại các bệnh suy thoái tim mạch; Làm giảm nguy cơ mắc bệnh tiền liệt tuyến;

Giúp con người có được một trí nhớ tốt và dài lâu, chống lại bệnh Alzheimer;

12

Chữa các bệnh về đường tiêu hoá như tả, lị, thương hàn, xuất huyết dạ dày;

Làm giảm lượng đường trong máu; Chữa bệnh sỏi thận, sỏi bàng quang; Làm

giảm sự nhiễm độc do kim loại, do nhiễm phóng xạ [34].

1.1.4. Các sản phẩm chè và sự khác biệt về công nghệ và tính chất

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ thì các sản phẩm chè cũng

ngày càng đa dạng về chủng loại và được nâng cao về chất lượng bao gồm các

sản phẩm chè xanh, chè đen truyền thống, chè đen CTC, chè đỏ, chè vàng, v.v.

Từ các sản phầm chè này lại sản xuất ra hàng loạt các sản phẩm khác nhau như

chè hương, chè hoa, chè hòa tan, v.v.

Có nhiều loại sản phẩm chè khác nhau có sẵn trên thị trường và có thể có

thể được nhóm thành sáu loại: chè xanh, chè vàng, chè trắng, chè ô long, chè

đen và chè đen đậm dựa theo các phương pháp xử lý [57]. Chè xanh, chè vàng

và chè trắng được chế biến tối thiểu, chè ô long và chè đen trải qua quá trình ô

xy hóa, còn chè đen đậm được lên men. Mùa vụ, tuổi của lá, khí hậu, loài cây

và tập quán canh tác là những yếu tố chính ảnh hưởng đến thành phần của chè.

Chè xanh được chế biến bằng cách cuốn và hấp lá để giảm thiểu quá trình

ô xy hóa và khử hoạt tính polyphenol oxydase trước khi sấy khô [90]. Chè

xanh rất giàu polyphenol, bao gồm flavanol, flavadiols, flavonoid và axit

phenolic, chiếm tới 30% trọng lượng khô. Các flavonoid chính của chè xanh là

các catechin khác nhau, chẳng hạn epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC),

epicatechin3-gallate (ECG), và epigallocatechin-3-gallate (EGCG) có nhiều

trong chè xanh hơn so với chè ô long hay chè đen [111,125].

Chè trắng được chế biến bằng cách tuốt các búp hoặc lá rất non, sau đó

sấy khô với quy trình chế biến tối thiểu sao cho các sợi lông trắng mỏng manh

của lá vẫn còn nguyên vẹn, tạo nên vẻ ngoài của ‘chè trắng’. Hơn nữa, các chồi

được che chắn có khả năng tiếp xúc tối thiểu với ánh sáng mặt trời và do đó

làm giảm hàm lượng chất diệp lục, làm cho chè có màu trắng [17].

Việc chuẩn bị chè đen bao gồm một số công đoạn, chẳng hạn như thu hoạch,

13

làm héo, vò, lên men và sấy khô [1]. Trong quá trình lên men, quá trình ô xy hóa

polyphenol bằng enzym dẫn đến sự hình thành theaflavins và thearubigin, mang

lại màu sắc và hương vị độc đáo cho chè đen [75]. Theaflavin cho thấy các lợi

ích sức khỏe khác nhau, chẳng hạn như chống béo phì, chống ung thư, chống xơ

vữa động mạch, kháng vi rút chống viêm, kháng khuẩn, chống loãng xương và

đặc tính chống sâu răng [119]. Tương tự, thearubigin có một số vai trò đối với

sức khỏe, bao gồm các đặc tính chống ô xy hóa và chống ung thư, cùng với khả

năng giảm viêm và cải thiện nhu động đường tiêu hóa [66].

Phổ biến nhất là hai sản phẩm chè xanh và chè đen, trong đó tanin và men

trong chè liên quan đến phương pháp lựa chọn chế độ công nghệ chế biến sản

phẩm. Diệt men để bảo toàn tanin trong chế biến chè xanh, trong khi lên men

để biến đổi tanin trong chế biến chè đen, còn kết hợp nhịp nhàng giữa men và

chế biến nhiệt được thực hiện khi chế biến chè vàng và chè đỏ.

Phương pháp công nghệ chế biến chè xanh theo sơ đồ: Nguyên liệu (lá chè

xanh)  làm héo  diệt men trong lá chè  vò chè  làm khô  phân loại,

đóng gói [1]. Thành phần của sản phẩm chè xanh rất gần với chè tươi, do trong

quá trình chế biến ngay từ công đoạn đầu tiên dưới tác dụng của nhiệt độ mà

hoạt động của men (enzym) bị đình chỉ dẫn tới các chất trong chè ít bị ô xy

hóa. Khi đánh giá cảm quan chất lượng chè xanh theo TCVN thường dựa vào

các tiêu chí: Ngoại hình xoăn chắc, màu xanh xám; Nước pha có màu xanh

vàng trong sáng; Hương thơm tự nhiên, và vị đậm dịu có hậu ngọt.

Sơ đồ công nghệ chế biến chè đen gồm có các bước: Nguyên liệu (lá

chè xanh)  làm héo  vò chè  lên men  làm khô  phân loại đóng

gói [1]. Điểm khác với quy trình chế biến chè xanh không cần phải qua công

đoạn lên men mà tiến hành diệt men, vò và làm khô luôn thì chè đen là sản

phẩm phải trải qua biến đổi sinh hóa mãnh liệt làm biến đổi hầu hết thành

phần hóa học có trong chè tươi nguyên liệu cả về lượng và chất để tạo nên

hương vị và màu sắc đặc trưng. Về ngoại hình, chè đen có khối lượng và

14

kích cỡ đồng đều, xoăn tốt. Về nội chất, chè đen có hương thơm tươi mát dễ

chịu; vị chát dịu sảng khoái, có dư vị; nước chè có màu đỏ nâu trong sáng.

Về hàm lượng các chất theo TCVN, thủy phần không quá 7,5%, chất hòa tan

không thấp hơn 32%, hàm lượng tanin không thấp hơn 9%, cafein không

thấp hơn 1,8%, chất xơ không lớn hơn 16,5%.

1.2. Tổng quan về gama-aminobutyric axit (GABA)

1.2.1. Giới thiệu chung về GABA

Axit gamma-amino-butyric (GABA) là một axit amin phi protein 4

cacbon, được phân bố rộng rãi ở khắp các sinh vật sinh học, bao gồm cả thực

vật, động vật và vi sinh vật. Hợp chất GABA lần đầu tiên được tổng hợp vào

năm 1883 và vào thời điểm đó người ta cho rằng nó chỉ là một chất chuyển

hóa trong thực vật và vi sinh vật. Nghiên cứu sau đó cho thấy GABA là chất

dẫn truyền thần kinh ức chế chính trong hệ thần kinh trung ương của động

vật có vú và trong nhiều loại phyla động vật không xương sống [40].

GABA tự nhiên lần đầu tiên được phân lập từ củ khoai tây. Ở thực vật

và vi sinh vật, GABA là một phần không thể thiếu của chu trình Krebs và đã

được quan sát thấy tăng nhanh trong các stres môi trường [109]. Ở động vật,

GABA có chức năng là chất dẫn truyền thần kinh ức chế chính trong hệ thần

kinh trung ương. Ba mươi phần trăm tế bào thần kinh não của con người có

chứa GABA, chất này ảnh hưởng đến hầu hết các hoạt động của tế bào thần

kinh [47,126].

GABA đã được nghiên cứu về tác dụng làm giảm stres căng thẳng và tăng

cường giấc ngủ trong các nghiên cứu trên người và các hoạt động sinh học khác

bao gồm chống tăng huyết áp, chống tiểu đường, chống ung thư, chống ô xy

hóa, chống viêm, chống vi khuẩn, và tác dụng chống dị ứng [56,95]. Tại Mỹ,

GABA được bán trên thị trường như một thành phần của một số chất bổ sung

dinh dưỡng (DS). Một số công ty dự báo ước tính rằng quy mô thị trường toàn

cầu đối với thực phẩm chức năng GABA sẽ tăng đáng kể từ 38 triệu USD năm

15

2019 lên 50 triệu USD vào cuối năm 2026 [86].

1.2.2. Hóa học, phân bố trong tự nhiên và sự chuyển hóa của GABA

1.2.2.1. Bản chất hóa học và tính chất

GABA là một axit amin phi protein bốn cacbon, một axit butanoic với

nhóm thế amin nằm ở vị trí C-4. Công thức phân tử của GABA là C4H9NO2.

Tên IUPAC là axit 4-aminobutanoic (Hình 1.1), số CAS là 56-12-2, và số mã

UNII là 2ACZ6IPC6I (FDA, 2021). Khối lượng phân tử là 103,12 g/mol và

nhiệt độ nóng chảy là 202°C. GABA còn được gọi là axit 4-aminobutanoic, axit

piperidic và axit piperidinic. Các số nhận dạng khác cho GABA có thể được

tìm thấy trong PubChem [123]. GABA là một chất kết tinh, có màu từ trắng

đến vàng nhạt, hòa tan tự do trong nước nhưng không hòa tan hoặc hòa tan kém

trong các dung môi khác.

Hình 1.1. Gamma‐aminobutyric axit (GABA, 4‐aminobutyric axit)

1.2.2.2. GABA trong tự nhiên

GABA có mặt khắp nơi ở thực vật, tại đó GABA được tổng hợp chủ yếu

từ axit glutamic thông qua enzym glutamate carboxylase [44]. GABA đã

được chứng minh có hàm lượng tăng đáng kể ở thực vật sau các stres môi

trường và các căng thẳng khác, chẳng hạn như hạn hán, tăng độ mặn, tổn

thương, thiếu ô xy , nhiễm trùng và nảy mầm. Một số loại cây ăn được và

làm thuốc có chứa GABA ở các mức độ khác nhau, ví dụ, trong quả cà chua

có tích lũy ở giai đoạn chín [16]. Một nghiên cứu về hàm lượng GABA của

một số thực phẩm chưa nấu chín cho thấy một số loại chứa một lượng GABA

khiêm tốn. Trong khi mầm gạo lứt (718 nmol/g), ngũ cốc nảy mầm (300-400

nmol/g), và rau bina (414 nmol/g) có hàm lượng GABA cao nhất [97,98].

Các nghiên cứu khác đã phát hiện tương tự ở giá đậu và đậu nảy mầm, bao

16

gồm đậu adzuki, lupin, và đậu tương khi so sánh với đậu không nảy mầm

[74,88,132]. Tương tự, các loại ngũ cốc, chẳng hạn như yến mạch, lúa mì,

và lúa mạch, đã được chứng minh là có chứa GABA [26]. Trong một số thực

phẩm lên men, GABA xuất hiện ở mức cao hơn nhiều. Kim chi, thực phẩm

truyền thống của Hàn Quốc, được báo cáo là chứa 2667 đến 7225 nmol

GABA/g [114], trong khi lá chè xanh Nhật Bản được báo cáo là chứa 9697-

19,395 nmol GABA/g [121]. Các loại thực phẩm lên men axit lactic khác,

chẳng hạn như thịt và pho mát đã qua xử lý, cũng chứa một lượng GABA

cao [39]. Con người đã tiếp xúc với GABA trong thực phẩm lên men kể từ

khi con người bắt đầu tiêu thụ những thực phẩm như vậy.

1.2.2.3. Sự chuyển hóa của GABA

Trong hệ thống sinh học, GABA được tổng hợp từ glutamate thông qua

chu trình chuyển hóa GABA như nêu trên Hình 1.2 [87]. Quá trình tổng hợp

được xúc tác bởi enzym L-glutamic axit decarboxylase (GAD), với sự trợ giúp

của pyridoxal phosphate là dạng hoạt hóa của vitamin B6. GABA được chuyển

hóa bởi gama-aminobutyrate transaminase thành chất chuyển hóa trung gian là

succinate semialdehyde, chất này sau đó được khử thành gama-

hydroxybutyrate hoặc bị ô xy hóa thành succinate và cuối cùng chuyển thành

CO2 và nước qua chu trình axit citric (chu trình Kreb).

Hình 1.2. Chu trình chuyển hóa GABA (tổng hợp và phân giải)

17

(Theo Martin & Rimvall, 1993 [87])

1.2.3. Vai trò và ứng dụng của GABA

1.2.3.1. Vai trò của GABA đối với thực vật, động vật và vi sinh vật

Nhiều báo cáo đã nêu đầy đủ, rõ ràng GABA được tìm thấy trong tất cả các

sinh vật và tham gia vào một số chức năng quan trọng của hệ thống của chúng.

GABA đóng một vai trò rộng lớn hơn nhiều trong các sinh vật hơn những gì

người ta nghĩ trước đây, có thể là một phân tử tín hiệu (signaling) thông thường

hoặc như một chất hòa tan tương thích khi bị stres hoặc như một phân tử bảo vệ

trong cơ thể vật chủ. Vai trò của GABA được tóm tắt trong Hình 1.3.

Hình 1.3. Vai trò của GABA trong động vật, vi sinh vật và thực vật

(Theo Rashmi và cộng sự, 2018 [107])

a) Vai trò đối với thực vật

Trong thực vật, GABA được giả thiết thực hiện nhiều chức năng trong

điều kiện stres và không stres. Nó là chất chuyển hóa quan trọng cho các chu

trình chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp, là chất trung gian quan trọng của quá trình

18

chuyển hóa nitơ và sinh tổng hợp axit amin [105]. Ngoài ra, quá trình chuyển

hóa GABA thông qua chu trình cung cấp nguồn năng lượng cho bộ xương

carbon và năng lượng cho các con đường sinh tổng hợp xuôi dòng. GABA cũng

tham gia vào các cơ chế tín hiệu hoặc điều chỉnh. Nó gián tiếp ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong toàn bộ chu kỳ cây trồng và nó

tích lũy nhanh chóng để đáp ứng với các stres phi sinh học. Nó đã được chứng

minh là có đóng góp vào phản ứng với stres sinh học thông qua nhiều cơ chế.

Hoạt động quá mức của chu trình GABA có thể giúp hạn chế sự lây lan của các

loại nấm hoại tử như Botrytis [65]. Hoạt động của GABA chống lại côn trùng

có thể dựa trên tác dụng ức chế trực tiếp hoặc dựa trên sự cảm ứng của các phản

ứng phòng thủ xuôi dòng hoặc dựa vào sự kết hợp của cả hai cơ chế. Chức năng

kép của GABA như một chất chuyển hóa và như một thành phần của các con

đường truyền tín hiệu là sự kết hợp cho phép thực vật đối phó với các điều kiện

khác nhau [109]. GABA được ứng dụng ngoại sinh gây ra các hiệu ứng tương

tự như phân tử bên trong và do đó, có thể mang lại tiềm năng cải thiện sức sống

tổng thể của thực vật [105,62].

b) Vai trò đối với vi sinh vật

Mặc dù GABA được sản xuất với số lượng dồi dào bởi vi sinh vật nhưng

vai trò của GABA đối với vi sinh vật vẫn còn cần phải được tìm hiểu đầy đủ

hơn nữa. Cho đến nay, vai trò của GABA đối với vi sinh vật được nghiên cứu

rộng rãi trong điều kiện stres do axit. Tuy nhiên, GABA cũng đóng vai trò quan

trọng do một số stres khác [41]. Chu trình chuyển hóa GABA cũng được cho

là có tham gia vào quá trình chuyển hóa glutamate, hiệu ứng anaplerosis và

phản ứng với stres ô xy hóa [37].

Trong điều kiện stres axit, GABA được tạo ra bởi hệ thống GAD của vi sinh

vật, do đó đã điều chỉnh độ pH của dịch bào. Hiện tượng kháng axit này thường

thấy ở vi khuẩn [85]. Khi cảm ứng, GAD xúc tác quá trình khử cacboxyl của

glutamat, do đó loại bỏ H+. Tính kháng axit này cho phép vi khuẩn gây hư hỏng

19

và vi khuẩn gây bệnh phát triển trên thực phẩm có tính axit bị hư hỏng. Hệ thống

GAD cũng được sử dụng bởi vi khuẩn gây bệnh để chúng tồn tại ở độ pH axit

thấp của ruột (pH 3,5) [42,36]. Francis và cộng sự [43] cho rằng hệ thống GAD

của chu trình GABA có thể đóng một vai trò nào đó trong sự tồn tại và tăng

trưởng trong điều kiện hạn chế ô xy ở L. monocytogenes. Vi khuẩn trợ sống

(probiotic) sống trong ruột cũng có thể bổ sung vào sức khỏe của sinh vật [45].

1.2.3.2. Vai trò và ứng dụng của GABA đối với sức khỏe con người

GABA là một hoạt chất sinh học được tìm thấy trong não và hoạt động

như một chất dẫn truyền thần kinh ức chế. Các nghiên cứu cho thấy GABA

thực hiện nhiều chức năng sinh lý (Hình 1-3). GABA có tác dụng hạ huyết áp

đối với chuột tăng huyết áp tự phát [138]. Sự giảm huyết áp đáng kể được phát

hiện sau 4-8 h sau khi dùng 0,05-5,00 mg/kg GABA [54]. Suwanmanon và

Hsieh [117] cũng báo cáo rằng GABA và nattokinase làm giảm huyết áp ở

chuột tăng huyết áp tự phát. Ở nam giới bị tăng huyết áp nhẹ, việc tiêu thụ hàng

ngày pho mát giàu GABA, chứa 16 mg GABA, làm giảm huyết áp trung bình

và huyết áp tâm thu [103]. Ở những người có huyết áp cao và bình thường, tiêu

thụ thực phẩm bổ sung chlorella giàu GABA làm giảm đáng kể huyết áp tâm

thu và huyết áp tâm trương [115]. GABA thể hiện các hoạt động chống đái tháo

đường ở chuột và người. Chè giàu GABA, chứa 3,01 hoặc 30,1 μg GABA, làm

giảm mức đường huyết ở chuột mắc bệnh tiểu đường [64]. Liều uống GABA

làm tăng tiết insulin [82].

Việc tiêu thụ GABA làm tăng đáng kể sự tiết insulin ở chuột bình thường;

tuy nhiên, việc tiết insulin không có ý nghĩa ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Vai

trò của GABA trong việc tăng tiết insulin vẫn chưa được biết rõ. Trong suy

thận mãn tính, GABA cải thiện tình trạng rối loạn chức năng thận, ức chế sự

tiến triển của bệnh, điều hòa huyết áp và cải thiện hồ sơ lipid. Việc sử dụng

GABA cũng làm giảm stres ô xy hóa do suy thận gây ra bằng cách tăng hoạt

động của các enzym chống ô xy hóa [112]. Ở bệnh nhân ung thư đường mật

20

hoặc ung thư ống mật, GABA ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [63]. Việc

uống GABA làm tăng đáng kể sóng alpha và giảm sóng beta trong não người,

do đó gây ra cảm giác thư giãn và giảm lo lắng. GABA tăng cường khả năng

miễn dịch, được đánh giá bằng cách đo nồng độ IgA, trong điều kiện stres căng

thẳng [14]. Việc tiêu thụ GABA từ các sản phẩm lên men hoặc chất bổ sung có

thể có tác dụng hữu ích ở một số liều lượng nhất định đối với chuột và người.

Tuy nhiên, các thử nghiệm lâm sàng về ảnh hưởng của việc tiêu thụ thực phẩm

và đồ uống lên men chứa GABA đối với sức khỏe con người vẫn còn cần thiết.

1.2.4. Sản xuất và sản phẩm GABA thương mại

Thực phẩm lên men và hạt nảy mầm được coi là nguồn cung cấp GABA.

Hàm lượng GABA tăng lên trong thực vật do các quá trình khác nhau bao gồm

xử lý bằng enzym, xử lý khí (ví dụ nitơ, cacbondioxit) và lên men [105]. Do

nhu cầu thương mại ngày càng tăng đối với GABA, các loại thực phẩm đa dạng

có chứa GABA được tạo ra về mặt sinh học và hóa học đã được báo cáo. Chẳng

hạn, chè xanh giàu GABA được sản xuất bằng cách xử lý yếm khí, mầm gạo

bằng cách ngâm trong nước, gạo lứt bằng cách xử lý áp suất cao và nảy mầm,

đậu tương lên men, và các sản phẩm từ sữa.

GABA có thể được sản xuất thông qua ba phương pháp chính: (i) lên men

vi sinh vật, (ii) xúc tác sinh học bằng enzym, và (iii) tổng hợp hóa học. Lên

men vi sinh là phương pháp sản xuất được ưa chuộng để sử dụng cho mục đích

thương mại. Theo đó, mặc dù vi khuẩn và nấm là những nguồn tốt để sản xuất

GABA, các chi vi khuẩn axit lactic (LAB) đã được sử dụng rộng rãi nhất để

sản xuất GABA. Trong một phương pháp sản xuất, quá trình sản xuất bắt đầu

với môi trường lỏng dùng lên men có chứa monosodium glutamate, axit

glutamic, chiết xuất nấm men, glucose và este axit béo glycerin trong nước.

Hỗn hợp được khử trùng và sau đó được cấy vi khuẩn Lactobacillus hilgardii

chủng K-3 và để lên men trong một số ngày. Sau đó, dịch lên men dùng được

khử trùng, trải qua một số bước lọc, và sau đó được phun sấy khô để tạo thành

21

bột [126]. Một số bằng sáng chế mô tả sản xuất GABA thông qua quá trình lên

men đã được công bố [94], Chung-Ang Industry University [32], Hanshan

Normal University [52]. Lên men ở trạng thái rắn (SSF) là một chiến lược khác

đã cho thấy nhiều hứa hẹn trong việc sản xuất GABA. Ví dụ, quá trình lên men

Vicia faba bởi Lactobacillus plantarum VTT E-133328 dẫn đến sản xuất 626

mg/kg GABA [33]. Tuy nhiên, do sự phức tạp và chi phí tinh chế cao đi kèm

với GAD cũng như các hạn chế về tính ổn định và khả năng tái sử dụng của nó,

phương pháp sản xuất này không khả thi để áp dụng thương mại [38,132].

Tổng hợp hóa học GABA có thể đạt được bằng một số con đường. Trong

một phương pháp như vậy, sản xuất GABA liên quan đến phản ứng cacboamin

hóa của anken, được xúc tác bằng chuyển phức đồng [142]. Các phương pháp

khác phức tạp hơn, bao gồm tối đa năm bước phản ứng thường đắt tiền, tạo ra

các sản phẩm phụ không mong muốn và yêu cầu sử dụng hóa chất nguy hiểm,

làm cho quá trình tổng hợp hóa học không thuận lợi để sử dụng cho mục đích

thương mại [133].

1.2.5. Tình trạng pháp lý của GABA và liều lượng sử dụng

Tại Mỹ, GABA như một axit amin đáp ứng định nghĩa về thành phần chế

độ ăn uống theo quy định số 201 (ff) (1) (D) và có sẵn trong nhiều sản phẩm

được tiếp thị dưới dạng thực phẩm chức năng. GABA được liệt kê trong danh

sách của UNPA (Liên minh các sản phẩm tự nhiên thống nhất) về các thành

phần chế độ ăn uống có mặt trên thị trường trước khi DSHEA thông qua vào

năm 1994. Mặc dù danh sách UNPA không được chính thức công nhận, sự hiện

diện của GABA trong danh sách này là một dấu hiệu cho thấy GABA có thể đã

được sử dụng như một chất bổ sung chế độ ăn uống trước khi ban hành của

DSHEA vào năm 1994. Tính đến ngày 14 tháng 4 năm 2021, Cơ sở dữ liệu về

nhãn bổ sung chế độ ăn uống (DSLD) có 644 sản phẩm có GABA được liệt kê.

Hai thông báo GRAS (GRN00257 và GRN00595) đã được đệ trình vào năm

2008 và 2015 để FDA xem xét [122]. Theo cơ sở dữ liệu FDA, GABA (dưới

22

dạng axit 4-aminobutyric) được sử dụng cho hiệu quả kỹ thuật như một chất

tạo hương vị hoặc chất bổ trợ. Theo 40 CFR Phần 180- đối với dư lượng hóa

chất thuốc trừ sâu trong thực phẩm (40 CFR § 180.1188), GABA được miễn

trừ yêu cầu về cấp phép đối với tất cả các mặt hàng thực phẩm khi được sử

dụng theo thực hành nông nghiệp tốt. Cơ quan Bảo vệ môi trường (EPA, Mỹ)

đã đánh giá GABA và quyết định rằng nó đáp ứng yêu cầu luật định về tính

chắc chắn hợp lý là không gây hại.

Ở các quốc gia khác, GABA được quy định như một dược phẩm hoặc

thuốc. Ở Canada, GABA được công nhận là một thành phần thuốc. Tổng cộng

có 119 giấy phép hoạt động cho sức khỏe tự nhiên cho các sản phẩm có chứa

GABA như một thành phần thuốc đã được liệt kê vào tháng 4 năm 2021 trong

Cơ sở dữ liệu về các sản phẩm sức khỏe tự nhiên được cấp phép của Bộ Y tế

Canada (LNHPD). Ở Châu Âu, GABA là một thành phần trong thực phẩm bổ

sung. Năm 2009, Ủy ban An toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) về các sản phẩm

ăn kiêng, dinh dưỡng và dị ứng đã đưa ra ý kiến khoa học về các tuyên bố về

sức khỏe liên quan đến GABA và chức năng nhận thức và kết luận rằng mối

quan hệ nguyên nhân và ảnh hưởng không được thiết lập giữa lượng GABA và

các chức năng nhận thức đã được khẳng định [122].

Các nhà sản xuất khuyến nghị lượng trên nhãn cung cấp GABA trong

khoảng 1,5 µg - 3000 mg/ngày, mặc dù đối với phần lớn các sản phẩm, lượng

khuyến cáo là 100 mg chia làm nhiều lần mỗi ngày. Hầu hết các sản phẩm được

liệt kê trong DSLD đều có ghi nhãn chỉ ra rằng sản phẩm dành cho người lớn

từ 18 tuổi trở lên. Một số sản phẩm bao gồm một cảnh báo trên nhãn cho biết

rằng: Một số cá nhân có thể bị ngứa ran nhẹ trên da và/hoặc khó thở nhẹ ngay

sau khi dùng GABA. Đây là đặc điểm của axit amin này và nhanh chóng giảm

xuống. GABA đã được đánh giá bởi Ủy ban hỗn hợp chuyên gia FAO/WHO

về phụ gia thực phẩm (JECFA, Rome, Ý) để xác định độ an toàn như một chất

phụ gia thực phẩm hay chất gây ô nhiễm. Ủy ban JECFA kết luận rằng mức

23

GABA trong các mô cơ thể phát sinh từ việc tiêu thụ thực phẩm có chứa GABA

như một chất tạo hương sẽ không đáng kể về mặt sinh học (ở dân số Mỹ, ước

tính là 0,1 µg/ngày) và do đó sẽ không gây lo ngại về an toàn.

1.3. Chế biến chè giàu GABA bằng lên men vi sinh vật

1.3.1. Thực phẩm giàu GABA bằng lên men vi sinh vật

1.3.1.1. Thực phẩm lên men chứa GABA

GABA đã được phân lập từ nhiều nguồn, chẳng hạn như lá chè, lá dâu

tằm, cà chua, động vật, vi khuẩn axit lactic (LAB), nấm men và nấm mốc

[131,39,141,107,77,5118]. GABA cũng được tìm thấy trong thực phẩm và đồ

uống lên men như tempe (đậu tương lên men), dadih (sữa trâu lên men), sầu

riêng asam (sầu riêng lên men), băng singkong (sắn lên men), ikan budu (cá lên

men), rượu sake, sữa chua-sake, bột chua, dâu tằm bia, kim chi và pho mát

zlatar [21,68,140,53,19,99].

Sản xuất γ-aminobutyric axit bằng thực vật và động vật không dễ dàng.

Nồng độ GABA ở thực vật thấp và cơ chế sản xuất không rõ ràng [110]. Ngược

lại, sản xuất GABA sử dụng vi sinh vật đã được nghiên cứu rộng rãi, các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất được kiểm soát dễ dàng. Do đó các nhà

nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sản xuất GABA bằng cách sử dụng vi sinh

vật [39]. Hơn nữa, sản xuất GABA sử dụng vi sinh vật an toàn và thân thiện

với môi trường so với phương pháp hóa học [39,72].

Vi sinh vật được tìm thấy ở khắp mọi nơi, tuy nhiên, chúng chủ yếu được

phân lập từ thực phẩm và đồ uống lên men. Quá trình lên men liên quan đến vi

khuẩn, nấm men và nấm mốc, tạo ra GABA. Sản xuất GABA dựa trên vi sinh

vật trong thực phẩm lên men có triển vọng to lớn [72]. Sự sẵn có của các chất

dinh dưỡng trong thực phẩm, cùng với vi sinh vật, cho phép tổng hợp GABA

một cách tự nhiên. Tất cả những gì chúng ta cần làm là tối ưu hóa quá trình lên

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật

được kiểm soát dễ dàng, do đó các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào sản xuất

24

men trong thực phẩm lên men để tối đa hóa hàm lượng GABA.

GABA bằng cách sử dụng vi sinh vật. Hàng loạt nghiên cứu tối ưu hóa đã được tiến

hành như (1) phân lập và tinh sạch vi sinh vật từ thực phẩm và đồ uống lên men; (2)

xác định hoạt động của enzym GAD trong môi trường đã chọn; (3) định danh vi sinh

vật tạo ra lượng GABA cao nhất; (4) tối ưu hóa sự phát triển của vi sinh vật đã chọn;

(5) và sản xuất thực phẩm và đồ uống lên men bằng cách sử dụng vi sinh vật được

lựa chọn trong các điều kiện phát triển tối ưu [21,53,68,99,141]. Các nghiên cứu cũng

đã xác định được các vi sinh vật đặc biệt nhóm Lactobacillus thúc đẩy sự tạo GABA

được phân lập từ thực phẩm và đồ uống lên men là Lactobacillus plantarum, L.

pentosus SS6, L. brevis, L. brevis, Leuconostoc mesenteroides, L. lactis và

Streptococcuse thermophillus sp. [21,53,68,99,141].

1.3.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong sản xuất GABA

Sự tổng hợp γ-aminobutyric axit của L-glutamate trong quá trình trao đổi

chất được xúc tác bởi enzym GAD. GAD có thể được tạo ra bởi nhiều vi sinh

vật như LAB, nấm men và nấm [104,67,76,51]. LAB, chẳng hạn như

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus brevis, L. paracasei, L. fitaii, L.

plantarum và Bifidobacterium teencentis có hoạt tính enzym GAD và được sử

dụng rộng rãi để sản xuất GABA. Những vi khuẩn này thường được phân lập từ

thực phẩm và đồ uống lên men như koumiss, kim chi, pho mát zlatar và kung-

som. Tuy nhiên, một số vi khuẩn đã được phân lập từ cá biển tươi, ruột cá [131].

Axit glutamic decarboxylase cũng đã được xác định trong các loại nấm

men như Saccharomyces cerevisiae và Kluyveromyces marxianus được phân

lập từ sản phẩm lên men [140,101]. S. cerevisiae có hoạt tính thấp hơn L.

plantarum, điều này có thể do S. cerevisiae sử dụng GABA làm nguồn nitơ

[140,18] Tuy nhiên L. plantarum và S. cerevisiae nuôi cấy có hoạt tính tạo ra

GABA cao nhất so với nuôi cấy đơn L. plantarum và S. cerevisiae trong bia

dâu tằm [140].

Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc dùng để ủ lên men gạo-koji để ủ

25

rượu sake. A. oryzae tạo ra GABA [18]. Rhizopus oligosporus và R. oryzae là

các loại nấm mốc được sử dụng để chuẩn bị tempe (đậu tương lên men) tạo ra

1,770 mg/100 g GABA đối với R. microsporus var. oligosporus IFO 32002 và

770 mg/100 g GABA đối với R. oryzae IFO 4705 và R. oryzae IFO 5438 [18].

LAB là những “nhà sản xuất” GABA được nghiên cứu nhiều nhất, bởi vì chúng

có hiệu quả kinh tế làm men khởi động và tạo ra GABA cao hơn các nhà sản

xuất khác [39].

1.3.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất GABA và quá trình lên men

Một số yếu tố, cụ thể là nhiệt độ, pH, cơ chất và thời gian nuôi cấy ảnh

hưởng đến lượng GABA được tạo ra trong quá trình lên men vi sinh vật. Theo

Wu và cộng sự [130], nhiệt độ lên men tối ưu để tổng hợp GABA là 30oC, trong

khi theo Ohmori và cộng sự [99] là 37oC. Điều kiện tối ưu để tổng hợp GABA

bởi L. brevis là pH 3,5 - 5, trong canh thang GM chứa 1% glucose, 2,5% cao

nấm men, 2 ppm Tween 80, 2 ppm CaCO3, MnSO4, 10 μM PLP và 650 mM

MSG [131]. Tuy nhiên, theo Lim và cộng sự [77], các điều kiện tối ưu để tổng

hợp GABA bởi Enterococcus faecium là pH 7,74, với cơ chất chứa 2,14% (w/v)

maltose, 4,01% (w/v) tryptone và 2,38% (w/v) MSG. Sự phát triển của E.

faecium tăng tỷ lệ thuận với pH ban đầu, trong đó pH thí nghiệm nằm trong

khoảng 4-8. Tương tự như vậy, sự hình thành GABA tăng lên khi số lượng E.

faecium tăng lên, nhưng ở độ pH hơn 7,5 sự hình thành GABA giảm.

Độ pH là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp GABA, GAD

trong LAB chỉ hoạt động trong điều kiện axit và mất hoạt tính ở pH > 5 [107].

Hoạt động của GAD là tối ưu ở pH 4,5 [99]. Sinh tổng hợp GABA làm tăng

pH và axit được bổ sung trong quá trình lên men để duy trì pH [107]. Ngoài

ra, các hoạt động của các enzym phân hủy GABA, chẳng hạn như GABA

transaminase và SSADH phải được xem xét [58,18]. Độ pH tối ưu cho quá

trình lên men khác nhau: đối với L. plantarum pH 5 và L. brevis pH 3,5-5, với

mức tối ưu là 4,74 [77,53,131]. Trong quá trình lên men, Saccharomyces

26

cerevisiae có thể tiêu thụ GABA bằng cách sử dụng SSADH ở pH 8,40, do đó

làm giảm lượng GABA được tạo ra [18]. Ở Pseudomonas, GABA được sử

dụng làm cơ chất ở pH 8,5 bởi GABA transaminase, chất này bị ức chế bằng

cách thêm chất đệm [107].

Thành phần môi trường cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp GABA. Sản

xuất GABA của L. paracasei và L. brevis tăng khi thêm glutamate [107]. Bổ

sung glutamate vào sữa chua-sake lên men bởi Streptococcus thermophilus Hp

làm tăng nồng độ GABA. Việc bổ sung glutamate tạo ra sữa đông giàu GABA

[53]. Nhiệt độ lên men rất quan trọng đối với sản xuất GABA [140]. Nhiệt độ

lên men ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Đối với L. brevis, nhiệt độ

tối ưu là 30 oC, S. thermophilus Hp 37 oC và L. plantarum 30 - 36 oC [130,33].

Thời gian lên men ảnh hưởng đến việc sản xuất GABA, tức là thời gian

lên men càng lâu thì nồng độ GABA càng cao. L. plantarum DSM19463 và

L. paracasei NFRI 7415 cần 72 và 144 h để tạo ra lần lượt là 4,83 mM và 60

mM GABA [107]. L. plantarum cần 84 h để sản xuất 211,169 mM GABA

trong dadih [53] và L. lactis cần 24 h để sản xuất 1,031 mg/kg trong bia dâu

tằm [140].

Thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến việc sản xuất

GABA bằng quá trình lên men vi sinh vật [128]. Ngoài ra, các chất phụ gia môi

trường bao gồm glutamate và PLP như các coenzym của GAD là những yếu tố

chính ảnh hưởng đến việc sản xuất GABA trong quá trình lên men

[31,69,73,83]. Thành phần môi trường, đặc biệt là các nguồn cacbon và nitơ và

các thành phần khác có thể ảnh hưởng đến lượng sản xuất GABA [128]. Hơn

nữa, nồng độ của cơ chất rất quan trọng để đạt được năng suất GABA cao [135].

1.3.2. Chè lên men bằng vi sinh vật

1.3.2.1. Giới thiệu về chè lên men

Chè lên men (còn gọi là chè sau lên men hay chè đậm) là loại chè đã trải

qua quá trình lên men vi sinh, từ vài tháng đến nhiều năm. Sự tiếp xúc của lá

27

chè với độ ẩm và ô xy trong quá trình này cũng gây ra sự ô xy hóa nội sinh

(bắt nguồn từ chính các enzym của lá chè) và ô xy hóa ngoại sinh (được xúc

tác bởi vi sinh vật). Lá chè và rượu làm từ chúng trở nên sẫm màu hơn do quá

trình ô xy hóa. Vì vậy, các loại chè lên men khác nhau được sản xuất trên khắp

Trung Quốc cũng được gọi là chè đậm, không nên nhầm lẫn với chè đen. Loại

chè lên men nổi tiếng nhất là Phổ Nhĩ (Pu-erh) được sản xuất ở tỉnh Vân Nam

của Trung Quốc [92,84].

Quá trình lên men của lá chè làm thay đổi thành phần hóa học của chúng,

ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của chè. Quá trình lên men ảnh hưởng đến

mùi của chè và thường làm giảm hương vị của chè, làm giảm độ chát và đắng

đồng thời cải thiện cảm giác miệng và dư vị. Các vi sinh vật cũng có thể tạo ra

các chất chuyển hóa có lợi cho sức khỏe [120]. Ngoài ra, các chất như ethyl

carbamate (urethane) có thể được tạo thành.

Quá trình lên men chè được thực hiện chủ yếu bằng nấm mốc. Aspergillus

niger được coi là vi sinh vật chính trong quá trình Pu-erh (Phổ nhĩ) [48,15],

nhưng việc xác định loài đó đã bị thách thức bởi phân tích PCR-DGGE toàn

diện, chỉ ra Aspergillus luchuensis là tác nhân chính của quá trình lên men

[93,124,49,58].

Hầu hết các loại chè lên men được sản xuất ở Trung Quốc, nhưng một số

loại được sản xuất ở Nhật Bản [127]. Ở Myanma, lahpet là một dạng chè lên

men được ăn như một loại rau, và các loại chè ngâm tương tự cũng được ăn

hoặc nhai ở miền bắc Thái Lan và miền nam Vân Nam [134].

1.3.2.2. Sản xuất chè lên men

Nhiều loại chè lên men không sẵn sàng để tiêu thụ trên thị trường. Thay

vào đó, chúng có thể bắt đầu là chè xanh hoặc chè giống ô long được ô xy hóa

một phần, sau đó được cho phép ô xy hóa từ từ và trải qua quá trình lên men

vi sinh trong nhiều năm. Ngoài ra, chè lên men có thể được tạo ra nhanh chóng

thông qua quá trình ủ chín kéo dài vài tháng, như với Shu Pu-erh. Quá trình

chín này được thực hiện thông qua một quy trình được kiểm soát tương tự như

28

quá trình ủ phân, nơi độ ẩm và nhiệt độ của chè được giám sát cẩn thận.

Chè lên men thường được bán dưới dạng chè nén với nhiều hình dạng khác

nhau như viên gạch, đĩa, bát hoặc nấm. Chè Pu-erh chín được nấu chín, sau đó

được nén lại. Chè lên men có thể được ủ trong nhiều năm để cải thiện hương

vị, một lần nữa có thể sánh ngang với rượu vang. Trong một số trường hợp, chè

Pu-erh thô có thể được ủ đến 50 năm mà không giảm chất lượng, và chè Pu-erh

chín có thể lên đến 10 hoặc 15 năm. Các chuyên gia và những người đam mê

không đồng ý về độ tuổi tối ưu. Nhiều người Tây Tạng và Trung Á sử dụng Pu-

erh hoặc các loại chè lên men khác như một loại thực phẩm giàu calo và vi chất

dinh dưỡng, đun sôi với bơ yak, đường và muối để làm chè bơ yak [92]. Chè

sau khi lên men thường có giá trị hơn theo độ tuổi. Chè đậm thường được ủ

trong giỏ tre, phên nứa, hoặc trong bao bì bản địa. Nhiều loại chè đậm được cố

ý ủ trong môi trường ẩm ướt để thúc đẩy sự phát triển của một số loại nấm,

thường được gọi là "hoa vàng" vì màu vàng tươi [84].

1.3.2.3. Vai trò của vi sinh vật trong quá trình lên chè

Mùi vị chè lên men là do hợp chất flavonoids và sản phẩm ô xy hóa của

nó, trong đó polyphenol và các sản phẩm ô xy hóa của nó là hợp phần chủ yếu

trong sự hình thành hương vị tổng thể, có vị chát của catechin, vị đắng của

caffein và cả vị ngọt của axit amin. Chất lượng chè lên men được thể hiện qua

các tính chất như: mùi thơm, vị thuần khiết và sự có mặt của các chủng nấm

mốc đặc trưng trong quá trình lên men. Trong quá trình lên men, vi sinh vật

sinh tổng hợp enzym, trong đó có các enzym ngoại bào (polyphenol oxydase,

ascorbic oxydase) với vai trò là những chất xúc tác thúc đẩy quá trình ô xy hóa,

ngưng tụ các hợp chất polyphenol chè, phân giải protein; xúc tác hàng loạt các

phản ứng phân giải gluxit và phản ứng trùng hợp các sản phẩm trung gian.

Trong quá trình lên men, gluxit bị phân giải để tạo thành các sản phẩm khác

nhau, trong đó có đường là vật chất quan trọng tạo độ sánh và hương trong chè

đen, đồng thời cũng được thể hiện qua đánh giá cảm quan. Các kết quả nghiên

29

cứu cho thấy, thành phần chủ yếu tạo mùi thơm của chè lên men là do các

terpenoids, alcohol thơm, aldehydes và ketones, phenol, heterocyclic, este,

polysaccharid. Trong quá trình lên men, vi sinh vật thông qua quá trình trao đổi

chất đã giải phóng các enzym ngoại bào, các enzym ngoại bào này có vai trò

xúc tác quá trình thuỷ phân các terpene, xúc tiến quá trình alcohol hóa hình

thành hợp chất thơm. Các nghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật như

Aspergillus niger, Penicillium, Rhizopus, Aspergillus tồn tại ở tất cả các công

đoạn trong quá trình chế biến chè [84,98].

Lá cây nói chung và lá chè nói riêng chứa rất nhiều thành phần hóa học,

chủ yếu là gluxit, protein, polyphenol, vitamin, chất khoáng và tinh dầu thơm.

Đối với chè xanh, polyphenol và tinh dầu thơm là những cấu tử quan trọng tạo

ra hương thơm của chè, còn protein và gluxit là những cấu tử quan trọng định

ra khung của vị. Khi thực hiện quá trình lên men bằng vi sinh vật, chúng sẽ sinh

tổng hợp tạo ra nhiều loại enzym khác nhau tác động lên cấu trúc phân tử của

polyphenol, protein, gluxit, v.v... để tạo ra hàng loạt hợp chất khác. Những hợp

chất này lại tham gia phản ứng với nhau, chịu tác động của quá trình ô xy hóa

khử mà dẫn đến hàng loạt chất mới được hình thành.

Polyphenol bị biến đổi một cách sâu sắc, làm cho vị của chè thay đổi theo

chiều hướng tốt hơn. Các hợp chất dạng terpenoid bị chuyển đổi hình thành nên

các hợp chất dễ bay hơi làm cho hương thơm của chè thay đổi một cách sâu

sắc. Các loại đường đơn tham gia vào phản ứng với các axit amin để tạo ra

melanoid. Những hợp chất này sẽ làm tăng cường độ màu của nước chè, và cải

thiện hương và vị của sản phẩm. Một quá trình rất quan trọng ở giai đoạn lên

men chè là sự hình thành hợp chất GABA. Sự tạo ra hợp chất này trong chè sẽ

làm tăng giá trị sử dụng của chúng. Chính quá trình này là một mục tiêu cơ bản

mà đề tài của luận án hướng tới.

1.3.3. Chè giàu GABA bằng lên men vi sinh vật

Nghiên cứu sản xuất chè giàu GABA chủ yếu được tiến hành tại Trung

30

Quốc. Sáng chế CN107197966B của nhóm tác giả Trường đại học Nam Hoa

được cho là tiêu biểu vì đăng kí gần đây và có nhiều cải tiến. Sáng chế đưa ra

phương pháp điều chế chè GABA bằng phương pháp lên men vi sinh vật, bao

gồm các bước sau: tiến hành khử hoạt tính lá chè tươi bằng vi sóng trên lá chè

tươi, đảo trộn, khử trùng ở nhiệt độ cao, ngâm lá chè trong nước vô trùng theo

tỷ lệ khối lượng 20-60%, bổ sung dịch giống lên men lactobacillus với lượng

cấy là 1-6%; nhiệt độ lên men là 32-42℃, thời gian lên men là 24-48 h, lá chè

được lấy ra và sấy khô sau khi kết thúc quá trình lên men. Phương pháp của

sáng chế làm giảm hư hỏng cơ học, ngăn chè chuyển sang màu đen và bị gãy

vụn, đồng thời đảm bảo chất lượng chè thành phẩm đồng nhất. Phương pháp

này thực hiện đơn giản, và có khả năng kiểm soát tốt. Chè GABA được chế

biến theo sáng chế có vị chua, sảng khoái và thơm, vị dịu và tươi, màu nước

canh vàng nhạt, hình dáng dây đều và nhỏ gọn, nhiều dầu, màu xanh lục, chất

lượng lá mềm, và hàm lượng GABA đạt tiêu chuẩn chè GABA.

Sáng chế lấy chất lỏng lên men lactobacillus làm giống. Sản phẩm

lactobacillus có lợi cho sức khỏe và axit lactic được tạo ra từ quá trình lên men

có thể ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại khác, do đó có lợi cho việc

bảo quản trà lâu dài. Mặt khác, bản thân vi khuẩn lactic có hoạt tính glutamate

decarboxylase nên có thể chuyển hóa glutamate với hiệu suất cao. Lá tươi được

ngâm trong nước vô trùng và ở trong môi trường stres ngập nước, glutamate

decarboxylase được kích hoạt, và glutamate decarboxylase và vi sinh vật hiệp

đồng thúc đẩy quá trình tổng hợp GABA. Sáng chế tương tự như xử lý ngâm

nên hoạt động đơn giản và dễ dàng. So với phương thức xử lý thay thế yếm khí

và hiếu khí được áp dụng nhiều nhất, phương pháp này giảm được hư hỏng cơ

học, tránh cho chè chuyển sang màu đỏ và gãy, đảm bảo chất lượng chè thành

phẩm đồng đều. Hàm lượng GABA có thể đạt tiêu chuẩn của chè GABA.

So với phương pháp ngâm trong nước, phương pháp nói trên có hai ưu

điểm: thứ nhất, chè GABA theo sáng chế có hàm lượng cao hơn so với chè

31

được chế biến bằng phương pháp ngâm nước. Thứ hai, phương pháp ngâm

nước là ngâm nước xen kẽ nhiều lần và làm khô không khí từ 2 đến 3 lần,

phương pháp này không cần làm khô bằng không khí, do đó tiết kiệm nhân

công và thời gian. Chè GABA được chế biến theo sáng chế không chỉ có hàm

lượng GABA cao, mà còn là sản phẩm của vi khuẩn axit lactic, do đó chè này

có tác dụng kép là chứa GABA và các sản phẩm probiotic.

1.4. Chế biến chè giàu GABA bằng lên men yếm khí

1.4.1. Sự chuyển hóa GABA trong thực vật và trong lá chè

Trong thực vật, GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng không

thuận nghịch của glutamat decarboxylase (GAD) theo cách khác thông qua sự

phân hủy polyamine [136] hoặc bằng phản ứng không enzym từ proline trong

điều kiện stres ô xy hóa (Hình 1-4). Ở Arabidopsis, năm gen mã hóa GAD được

biểu hiện khác nhau ở các cơ quan thực vật khác nhau và biểu hiện của chúng

có thể thay đổi theo các quá trình thực vật và điều kiện sinh trưởng [24]. GAD

là một calmodulin phụ thuộc Ca2+ liên kết protein được kích thích bởi sự thay

đổi của nồng độ Ca2+ trong tế bào và pH trung tính ở trạng thái thực vật nguyên

vẹn [116]. GABA permease (GABA-P) nằm trong màng ty thể kết nối chu trình

GABA và chu trình TCA để cho phép hấp thu GABA trong tế bào vào ty thể,

nơi cuối cùng năng lượng và bộ xương carbon được cung cấp bởi chu trình

TCA [91]. GABA được chuyển hóa thông qua chu trình GABA bỏ qua hai bước

trong chu trình TCA từ α-ketoglutarate qua succinic-CoA thành succinate [25].

Trong mạng lưới ty thể, GABA được chuyển hóa thành succinic semialdehyde

(SSA) bởi GABA transaminase (GABA-T) [108]. Hai loại GABA-T sử dụng

α-ketoglutarate (GABA-TK) hoặc pyruvate (GABA-TP) làm chất nhận amin,

với các sản phẩm là glutamate hoặc alanin. Sau đó, SSA được chuyển đổi bởi

SSA dehydrogenase (SSADH) thành succinate, một thành phần của chu trình

TCA và NADH. Cả hai hợp chất đều là những chất cho electron cho chuỗi vận

chuyển điện tử của ty thể với sản phẩm cuối cùng là ATP. Sự điều khiển phản

32

hồi âm của SSADH bởi NADH và ATP có thể là một giải thích khả thi về cách

GABA được liên kết với các con đường khác ngoài TCAC, ví dụ: đường dẫn

tín hiệu.

Mối quan hệ giữa GABA và GHB vẫn chưa rõ ràng. Việc bỏ qua chu trình

TCA bởi chu trình GABA được chứng minh bằng cách ức chế các enzym liên

quan của chu trình TCA và sự bù đắp sau đó thông qua sự gia tăng thông lượng

qua chu trình GABA [20]. Ngược lại, các thể đột biến của Arabidopsis thiếu

chất vận chuyển GABA của ty thể cho thấy sự hấp thu GABA vào ty thể bị

giảm và tăng hoạt động chu trình TCA [91]. Ở thực vật, các protein vận chuyển

malate được kích hoạt bằng nhôm (ALMT) được cho là hoạt động như các thụ

thể GABA bị ức chế bởi GABA và được kích hoạt bởi các anion và thường có

sẵn trong mô thực vật. Người ta giả thuyết rằng sự điều khiển ALMT qua trung

gian GABA đại diện cho một con đường tín hiệu có thể thông qua việc thay đổi

điện thế màng, từ đó có thể kích hoạt các thay đổi sinh lý trong toàn cây [46].

Sự phân bố và đặc điểm của ALMT trong tế bào thực vật và trên mô thực vật

vẫn chưa được làm rõ.

1.4.2. Công nghệ lên men yếm khí và đặc điểm chè giàu GABA

Chè GABA (gamma-aminobutyric axit) hay chè Gabaron với tên gọi ở

Nhật Bản, là một loại chè đặc biệt được làm giàu với GABA. Lượng GABA có

thể được tăng lên bằng cách áp dụng lặp lại các điều kiện hiếu khí và yếm khí

thay thế [100,89]. Lượng GABA trong chè Gabaron nhiều hơn tới 70 lần so với

các loại chè thông thường [106]. Tất cả các loại chè thực sự đều chứa GABA

(Bảng 1-1) và mỗi loại có thể được chế biến thành chè GABA (Hình 1-4).

Huang và cộng sự [64] báo cáo rằng quy trình chè Gabaron tốt nhất là: lá tươi

 hút chân không và nạp nitơ (h)  hút nitơ và nạp đầy ôxy (2 h)  hút chân

33

không và làm đầy nitơ (3 h)  quy trình làm khô chè xanh.

(Theo Bostanci & Koca, 2017 [23])

Bảng 1.1. Hàm lượng GABA (mg/l00g) của các loại chè khác nhau

Chè xanh Chè Ô long Chè đen Chè trắng Chè Phổ Nhĩ Chè GABA

12,00

-

-

-

-

272,00

16,94

-

-

-

-

180,97

263,5-105,4 19,17- 101,16 34,5-55,45

44,56-46,07

197,51

-

13,8-20,4

14,8-20,7

31,1-41,5

50,5

0,9 - 1,7

-

12,21

-

-

-

185,02 (A)

178,15 (B)

-

-

50-870

90-970

70-550

240-2070

-

0,49-1,51*

1,69-2,42*

*nmol/g, (A): chế biến chân không, (B): chế biến ngâm chìm trong nước

Hàm lượng GABA tăng lên trong lá chè xanh đã được bảo quản trong điều

kiện yếm khí. Tsushida và cộng sự [121] bảo quản lá chè đã hái trong các loại

khí khác nhau ở nhiệt độ phòng từ 5 đến 10 h và theo dõi sự thay đổi của hàm

lượng axit amin trong lá chè. Họ báo cáo rằng khí nitơ và cacbondioxit đều cho

thấy sự giảm đáng kể hàm lượng axit aspartic và axit glutamic, cũng như làm

gia tăng đáng kể hàm lượng alanine và GABA.

Trong khi đó trong môi trường không khí và giàu ô xy, kết quả thu được

hoàn toàn trái ngược với những thay đổi của môi trường thiếu ô xy. Sau 10 h

xử lý trong những loại khí đó, hàm lượng GABA trong khí nitơ và cacbondioxit

lần lượt nhiều hơn khoảng 8 và 10 lần so với trong công thức không khí. Thực

tế này chỉ ra rằng có thể thu được nhiều GABA hơn trong quá trình xử lý yếm

khí. Các tác giả phát hiện ra rằng một lượng lớn GABA tích tụ trong chè xanh

trong điều kiện yếm khí. Họ đã nghiên cứu sâu hơn về hàm lượng GABA của

chè xanh, ô long và chè đen được sản xuất trong điều kiện yếm khí và phát hiện

ra rằng GABA tích tụ trong tất cả các loại chè. Ứng dụng yếm khí để sản xuất

chè GABA là bước quan trọng. Các quy trình cơ bản để sản xuất chè GABA

34

với các cấp lên men khác nhau được thể hiện bằng sơ đồ trong Hình 1-4.

(Theo Bostanci & Koca, 2017 [23])

Hình 1.4. Các quy trình cơ bản để sản xuất chè GABA bằng lên men yếm khí

Để ngăn ngừa sự mất mát GABA được tạo ra bởi quá trình lên men yếm

khí, các quy trình chần, vò và sấy khô phải được thực hiện ngay sau khi lên

men yếm khí theo thứ tự để cố định hàm lượng GABA trong chè thành phẩm.

Đối với loại chè GABA lên men như chè ô long và chè đen, quá trình lên men

yếm khí phải diễn ra sau khi làm héo nắng và làm héo trong nhà. Nếu không,

GABA sẽ dễ dàng bị mất [100].

Sự khác biệt chính giữa chè GABA và các sản phẩm chè khác là quá trình

lên men yếm khí phức tạp trong quá trình làm héo. Chất lượng của chè GABA

thương mại được xác định bởi hàm lượng GABA [71]. Tác giả này báo cáo

rằng hàm lượng GABA tăng lên khi thời gian lên men yếm khí tăng lên, và hàm

35

lượng GABA và axit glutamic trong chè GABA của mùa xuân và mùa đông

cao hơn so với mùa hè và mùa thu. Lin và cộng sự [79] đã nghiên cứu ảnh

hưởng của loại chất khí, thời gian và nhiệt độ tới hàm lượng GABA và các

thành phần chất lượng của lá chè trong quá trình xử lý yếm khí. Họ báo cáo

rằng lượng GABA trong lá chè trong điều kiện yếm khí chủ yếu bị ảnh hưởng

bởi thời gian, tiếp theo là loại khí, nhưng không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.

Xem xét hàm lượng GABA và các thành phần chất lượng của lá chè, điều kiện

tối ưu của quá trình xử lý yếm khí trên lá chè tươi là chân không, 25oC và 8 h.

Lin và cộng sự [78] đã giữ cây chè xanh trong bể nitơ trong 8 h và sau đó

trong không khí mát trong 3 h, lặp lại các thao tác này hai lần. Sau đó, họ cho

lên men yếm khí trong 8 h và chịu sốc làm phai màu ở 250 - 270°C. Họ sản

xuất chè GABA là kết quả của quá trình vò xoăn và sấy khô. Họ thực hiện phân

tích catechin, hoạt tính chống ô xy hóa, teanin và GABA trong chè và các chất

chiết xuất mà họ sản xuất. Hàm lượng GABA cao nhất được xác định trong các

loại chè được chiết xuất bằng rượu etylic 25% ở 95°C.

Wang và cộng sự [127] đã nghiên cứu các thành phần hoạt tính sinh học

của chè GABA so với chè xanh được sản xuất ở Đài Loan. Họ phát hiện ra rằng

GABA, alanin, amoniac, lysine, leucine và isoleucine được tìm thấy cao hơn

đáng kể trong chè GABA, trong khi axit glutamic, axit aspartic và phenylalanin

cao hơn trong chè xanh. Ngoài ra, catechin, epicatechin và epigallocatechin

gallate được tìm thấy trong chè GABA thấp hơn so với chè xanh.

Sự khác biệt chính giữa GABA và chè xanh là hàm lượng GABA, axit

glutamic, alanin, axit aspartic, tổng catechin, EGCG và EC, đặc biệt là hai chất

đầu tiên. Hầu hết các hợp chất khác được kiểm tra không có sự khác biệt đáng

kể giữa hai loại chè. Nhìn chung, chè GABA gần giống chè xanh về hoạt tính

sinh học [127].

Zeng và cộng sự [139] đã nghiên cứu các thành phần dễ bay hơi của chè

GABA được sản xuất bằng hai quy trình công nghệ khác nhau (hút chân

36

không và ngâm nước). Họ phát hiện ra rằng màu sắc nước chè GABA tương

tự như màu của chè ô long, và mùi tương tự như mùi thơm của chè là đỏ đã

nấu chín có pha chút chua. Họ xác định rằng trong chè GABA, hàm lượng

2,6-bis (l,1-dimethylethyl)-4-metylphenol, metyl myristat, metyl laurat và

metyl palmitat cao hơn so với chè xanh bình thường. Các thành phần hương

thơm đặc trưng của chè GABA được tạo ra bằng xử lý chân không kết luận

là metyl myristat, hexadecan, metyl laurat và metyl palmitat, trong khi đối

với chè GABA được làm bằng cách ngâm nước là 2,6-bis (1,1-dimethyletyl)

-4 -metylphenol và 1-octanol.

1.4.3. Lợi ích của chè giàu GABA

Chè GABA gần đây đã trở thành một thức uống phổ biến cho những người

quan tâm đến sức khỏe ở các nước châu Á. Các bước sản xuất chè GABA tương

tự như chè xanh, chỉ khác là ủ yếm khí. Quá trình yếm khí này dẫn đến hàm

lượng GABA và alanin cao nhưng hàm lượng axit glutamic và aspartic thấp

trong GABA. Chè GABA, giống như các loại chè khác, có nhiều tác dụng đối

với sức khỏe, chẳng hạn như chống apoptosis, chống ô xy hóa, chống tăng huyết

áp và các hoạt động hạ đường huyết [61]. Chè GABA có đặc tính chống bệnh

tiểu đường [30]. GABA là một chất dẫn truyền thần kinh ức chế nhập khẩu

trong hệ thần kinh trung ương của động vật có vú và được biết là có tác dụng

chống tăng huyết áp. Các loại chè giàu GABA có thể làm giảm huyết áp ở chuột

[22]. Chè GABA cũng đã được chứng minh là giúp ngủ ngon [29].

Huang và cộng sự [61] đã nghiên cứu tác động của chè GABA đối với quá

trình apoptosis và autophagy trong vỏ não của chuột mắc bệnh tiểu đường do

streptozotocin (STZ) gây ra. Cherng và cộng sự [30] đã nghiên cứu tác động

của chè GABA đối với tim trên mô hình chuột mắc bệnh tiểu đường. Họ tiêm

vào những con chuột đực Wistar 55 mg/kg STZ để gây bệnh tiểu đường trong

2 tuần và sau đó uống với liều lượng 4,55 và 45,5 mg/kg/ngày chiết xuất chè

GABA trong 6 tuần. Họ xác định rằng mức đường huyết lúc đói trở lại mức

37

bình thường ở chuột tiểu đường được điều trị bằng GABA, chè GABA ức chế

xơ hóa tim do STZ gây ra và mức protein STZ do yếu tố hoại tử khối u-alpha

(TNF-alpha), Fas, hoạt hóa caspase-8 và caspase-3. Các nhà nghiên cứu gợi ý

rằng tác dụng ức chế của chè GABA đối với chứng xơ hóa cơ tim do STZ gây

ra ở chuột mắc bệnh tiểu đường có thể qua trung gian làm giảm lượng đường

trong máu và làm giảm thêm biểu hiện TNF-alpha và quá trình chết theo

phương pháp phối tử Fas.

GABA có thể hoạt động như một chất thư giãn tự nhiên, giảm lo âu và

tăng cường miễn dịch trong điều kiện stres căng thẳng. Ngoài ra, GABA còn

có vai trò sinh lý trong nhiều hệ thống bên ngoài hệ thống trung ương, chẳng

hạn như điều hòa các chức năng tim mạch, ức chế sự di căn của tế bào ung thư,

điều hòa chức năng thận. Sự khác biệt đáng kể giữa chè GABA và chè xanh là

GABA, axit glutamic, alanin, axit aspartic, tổng catechin, EGCG và

epicatechin, đặc biệt là GABA và axit glutamic [78].

1.5. Một số nghiên cứu thực phẩm và chè giàu GABA ở Việt Nam

1.5.1. Thực phẩm giàu GABA bằng lên men vi sinh vật

Tác giả Trịnh Tất Cường và cộng sự [3] thuộc Phòng thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ enzym và protein, Trường đại học Khoa học tự nhiên, Đại học

Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài cấp bộ “Nghiên cứu qui trình sản xuất axit

Gamma Amino Butyric từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus để ứng

dụng làm thực phẩm chức năng”. Nhóm tác giả đã chọn được chủng

Lactobacillus từ dưa muối có khả năng sinh tổng hợp GABA và tìm điều kiện

phù hợp cho quá trình lên men (các thông số pH, nhiệt độ, tỉ lệ O2), tối ưu hóa

các thành phần trong dịch lên men cám gạo, và sản xuất GABA ở dạng bột

bằng phương pháp kết tinh. Kết quả, đa phân lập được chủng Lactobactillus

plantarum KLEPT từ dịch dưa muối. Đồng thời đã xây dựng được quy trình

sản xuất GABA từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus plantarum

38

KLEPT. Hàm lượng GABA thu được tương đối cao 660 mM, tương đương với

700 gam GABA trong 10 lít dịch lên men. Quá trình thực hiện cho thấy, việc

sản xuất GABA tương đối đơn giản và có giá thành khá thấp.

1.5.2. Thực phẩm giàu GABA từ hạt nảy mầm

Hạt ngũ cốc và một số loại đậu có hàm lượng protein cao và rất cao. Trong

thành phần protein của chúng có hợp chất glutation. Hợp chất này khu trú ở lớp

cám và phôi của hạt. Khi hạt hút nước đến một độ ẩm nhất định, thường là

khoảng 30-40% thì hệ enzym thủy phân trong hạt được chuyển sang dạng hòa

tan và bắt đầu kích hoạt. Dưới sự tác động của nhóm enzym thủy phân, phức

chất glutaion bị phân ra thành một phân tử glycocol, một phân tử cystein và

một phân tử glutamic. Axit glutamic tạo thành là nguồn nguyên liệu cho việc

tổng hợp GABA xảy ra trong phôi của hạt ở giai đoạn nảy mầm.

Gạo lứt là loại gạo sau khi bóc hết vỏ trấu, nhưng vẫn giữ nguyên vẹn phần

phôi của hạt. Ở trạng thái đó, nếu gạo lứt được hút nước đến một tỷ lệ phù hợp thì

các nhóm enzym ô xy hóa khử và nhóm enzym thủy phân sẽ được chuyển từ trạng

thái liên kết (bị hấp phụ) sang trạng thái hòa tan (trạng thái tự do). Nếu nhiệt độ

môi trường phù hợp thì các enzym này sẽ kích hoạt và các quá trình sinh lý (hô

hấp) sinh hóa (thủy phân) sẽ xảy ra. Trong những quá trình đó có quá trình sinh

tổng hợp GABA. Hàm lượng GABA trong gạo lứt nảy mầm phụ thuộc trước

hết vào chất lượng gạo, nhiệt độ, thời gian nảy mầm, tỷ lệ hạt hút nước và nhiều

yếu tố khác [8].

Khi nghiên cứu sự tích lũy GABA trong gạo lứt huyết rồng nảy mầm,

Cung Tố Quỳnh [10] đã tiến hành nảy mầm ở nhiệt độ 35oC trong 42 h thu được

lượng GABA 159,81 mg/100g. Cũng ở điều kiện tương tự nhưng với loại gạo

Jasmin, tác giả này thu được 148,43mg/100g. Một nghiên cứu khác của Phạm

Quang Trung và Nguyễn Công Hà [102] khi nảy mầm gạo Jasmin 85 ở điều

kiện 37oC, thời gian nảy mầm 24 h chỉ thu được lượng GABA 37,56 mg/100g.

Nhóm tác giả Nguyễn Văn Toản [13] đã nghiên cứu hàm lượng GABA trong

39

giống gạo lứt giống Vĩnh Hòa. Điều kiện nảy mầm: Ngâm gạo lứt ở nhiệt độ

34oC, thời gian ngâm hạt 20 h, thời gian ủ mầm 32 h, nhiệt độ ủ 36oC. Hàm

lượng GABA cực đại thu được là 87,76 mg/100g tăng gấp 5 lần so với gạo

không nảy mầm.

Đậu xanh là một trong những loại đậu phổ biến nhất ở Việt Nam, có hàm

lượng protein trong khoảng 20 - 24% chất khô. Trong đậu xanh còn chứa nhiều

loại axit amin quý giá, như leucin, isoleucine, valine, glutamic...v.v. Lượng axit

glutamic trong đậu xanh là nguồn nguyên liệu cung cấp cho quá trình tổng hợp

GABA. Theo kết quả của Đống Thị Anh Đào [4] đã nghiên cứu một cách toàn

diện các điều kiện thích hợp cho hạt đậu xanh nảy mầm nhằm thu được hàm

lượng GABA cao nhất. Các điều kiện tối ưu, tác giả này thu được là: pH 5,83,

nhiệt độ nảy mầm 36,6oC, thời gian nảy mầm 14,5 h. Lượng GABA cao nhất

thu được là 1638,67 ppm.

1.5.3. Chế biến chè lên men và chè giàu GABA ở Việt Nam

Việc nghiên cứu sản xuất chè lên men (chè Phổ Nhĩ Việt Nam) đã được

triển khai từ năm 2012 với đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất chè đặc

sản Shan tuyết bằng công nghệ lên men” và kết thúc vào năm 2019 với dự án

sản xuất thử nghiệm “Sản xuất chè lên men từ chè shan tuyết Hà Giang phục

vụ tiêu dùng trong nước và xuất khẩu” [5,6]. Các nhà khoa học đã phân lập,

tuyển chọn được các chủng vi sinh vật và quy trình sản xuất sinh khối vi sinh

vật phù hợp cho quá trình sản xuất chè lên men từ nguồn nguyên liệu có sẵn và

trong các điều kiện sản xuất của Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cũng đã khẳng

định từ nguồn chè shan trong nước hoàn toàn có thể sản xuất được một số sản

phẩm chè lên men không những phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng trên thị

trường nội địa mà còn có thể tham gia vào thị trường Trung Quốc và các nước

châu Á khác, tạo ra giá trị cao từ nguồn nguyên liệu chè sẵn có.

Song song với việc nghiên cứu sản xuất chè lên men (chè Phổ Nhĩ) các

nhà khoa học thuộc Trường Cao đẳng Công nghiệp thực phẩm còn nghiên cứu

40

sản xuất chè giàu γ-aminobutyric axit (GABA). Nhóm nghiên cứu đã thu được

một số kết quả bước đầu về sản xuất chè giàu GABA trên cơ sở công nghệ sản

xuất chè đen đang sử dụng rộng rãi ở Việt Nam [12].

Với mục đích nghiên cứu sản xuất chè giàu GABA bằng lên men yếm khí,

nhóm tác giả Nguyễn Quốc Sinh và cs từ Trường đại học Nông Lâm Huế [96]

đã khảo sát mức độ thay đổi một số hợp chất hoạt tính sinh học trong lá chè

được tạo ra bằng cách lên men lá chè tươi trong khí nitơ. Quá trình lên men

được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng 28oC, 35 và 40ºC và

thời gian lên men 6, 9, 12 và 15 h. Kết quả cho thấy hàm lượng GABA tăng

đáng kể theo nhiệt độ lên men. Nhiệt độ và thời gian thích hợp nhất cho quá

trình lên men yếm khí tạo ra GABA và các hợp chất hoạt tính sinh học khác lần

lượt là 40ºC và 9 h. Trong điều kiện này, hàm lượng GABA đạt giá trị lớn nhất

là 202,77 mg/100 g chè khô, tổng số polyphenol là 22,30% chất khô (DM),

cafein là 2,39%, và chất rắn hòa tan là 36,25% DM.

1.6. Kết luận từ tổng quan và giả thuyết nghiên cứu

1.6.1. Những kết luận rút ra từ tổng quan

- Cây chè được trồng nhiều ở Châu Á bao gồm cả Việt Nam, sản phẩm

chè chế biến rất phổ biến và được ưa chuộng khắp thế giới từ lâu đời. Chè

có thành phần hóa học đa dạng, chứa nhiều hoạt chất sinh học có lợi cho sức

khỏe, trong đó có gamma-aminobutyric axit (GABA). Việt Nam có tiềm

năng trồng, chế biến và xuất khẩu nhiều sản phẩm chè. Hiện nay chế biến

chủ yếu là chè xanh và chè đen, trong đó chè xanh chủ yếu tiêu dùng trong

nước, còn chè đen cho xuất khẩu. Các nghiên cứu, sản xuất chè các sản phẩm

chè lên men rất ít.

- Hợp chất gamma-aminobutyric axit (GABA) là một chất có giá trị tốt

nhiều mặt đến sức khỏe con người. GABA có thể được tổng hợp hóa học nhưng

vì nhiều hạn chế, kể cả tính an toàn, do đó việc sản xuất chủ yếu dựa vào một

41

số quá trình sinh tổng hợp ở vi sinh vật và thực vật. Sản xuất GABA thương

mại quy mô công nghiệp dựa vào lên men vi sinh vật. Vi khuẩn lactic là vi sinh

vật được ứng dụng rộng rãi nhất trong định hướng tạo GABA cho các sản phẩm

thực phẩm.

- Có một số phương pháp để thu nhận chè giàu GABA nhưng phổ biến,

hiệu quả, an toàn, kinh tế nhất là phương pháp lên men nhờ vi sinh vật và lên

men yếm khí. Phương pháp thứ nhất phổ biến ở Trung quốc vì là nơi gần như

duy nhất có lịch sử lâu đời về lên men chè. Phương pháp thứ hai là lên men

yếm khí bắt đầu từ Nhật Bản với sản phẩm chè Gabaron nổi tiếng.

- Trong phương pháp lên men vi sinh vật để sản xuất GABA, việc chọn vi

sinh vật có ý nghĩa quan trọng và vi khuẩn lên men lactic cũng được sử dụng

nhiều hơn cả. Hơn nữa việc sản xuất giống men và đảm bảo điều kiện lên men

là rất quan trọng cho cả quá trình ủ để có GABA cao và ổn định.

- Để lên men yếm khí, việc chọn chân không có những ưu thế nhất định so

với sử dụng các khí ni tơ hay CO2. Xử lý yếm khí nhiều chu kỳ có tác dụng làm

tăng GABA rõ rệt.

- Mặc dù có khá đáng kể kết quả nghiên cứu và sản phẩm chè giàu GABA

từ công nghệ lên men vi sinh vật hoặc lên men yếm khí, nhưng những nghiên

cứu phối hợp cả hai phương pháp công nghệ là rất ít. Đây là gợi mở ý tưởng

đầu tiên cho nghiên cứu của luận án này.

- Tại Việt Nam đã có những quan tâm đáng kể về sản xuất thực phẩm giàu

GABA bằng phương pháp nảy mầm hạt, chẳng hạn gạo lứt nảy mầm (bản chất

là ngâm yếm khí hạt trong nước), hay bằng phương pháp lên men vi sinh vật.

Các nghiên cứu sản xuất chè lên men có rất ít, nghiên cứu sản xuất chè giàu

GABA gần như không có. Kết quả duy nhất được công bố trong nước của

Trường đại học Nông Lâm Huế là sau khi đề tài luận án này bắt đầu [13]. Kết

42

quả của họ chỉ giới hạn ở quy mô rất nhỏ và chưa có sản phẩm.

1.6.2. Những định hướng và giả thuyết nghiên cứu của luận án

1.6.2.1. Định hướng nghiên cứu

(a) Định hướng chọn nguyên lý làm tăng GABA là bổ sung thêm một công

đoạn lên men yếm khí sau công đoạn vò chè và trước khi lên men (hiếu khí)

trong quy trình chế biến chè đen. Theo đó, sơ đồ công nghệ đề xuất nêu trên

Hình 1.5.

(b) Định hướng tạo sản phẩm chè giàu GABA của luận án là chè đen vì

loại chè này đang được chế biến và xuất khẩu nhiều nhất ở Việt Nam.

(c) Công đoạn lên men yếm khí có sự kết hợp yếm khí với lên men bằng

vi sinh vật, tức là lên men lactic trong môi trường nghèo ô xy nhằm có được sự

đóng góp của cả 2 quá trình tới sự hình thành GABA.

(đ) Nghiên cứu có tính tổng thể, nhằm giải quyết trọn vẹn một vấn đề, do

vậy sẽ chọn tạo chủng giống thích hợp và hiệu lực cao từ một số vi khuẩn lactic

để có được chủng và phương pháp nhân và giữ giống. Giống cây chè thích hợp

cũng được khảo sát để có được đề xuất nguồn nguyên liệu chè phù hợp cho

công nghệ sản xuất chè giàu GABA.

(e) Các thông số quan trọng của quy trình công nghệ cần được tối ưu hóa

để có được sản phẩm chè không những có hàm lượng GABA cao mà cần có

được chất lượng cảm quan nhất định.

(g) Quy trình công nghệ tạo chè giàu GABA cần được tiến hành ở quy mô pilot

và sản xuất thử nghiệm nhằm kiểm định, hoàn thiện công nghệ.

1.6.2.1. Giả thuyết nghiên cứu của luận án

Giả thuyết 1: Bổ sung thêm công đoạn lên men vi khuẩn lactic trong môi

trường yếm khí làm tăng hàm lượng GABA so với trường hợp chỉ lên men vi

khuẩn lactic hay chỉ lên men yếm khí có cùng điều kiện.

Giả thuyết 2: Thời điểm bổ sung công đoạn lên men yếm khí sau khi vò

chè và trước khi lên men hiếu khí là chuẩn xác nhất về thực nghiệm và giải

43

thích được về cơ chế chuyển hóa.

Giả thuyết 3: Quá trình lên men yếm khí và lactic có thể làm thay đổi tính

chất cảm quan của sản phẩm mặc dù hàm lượng GABA tăng đáng kể.

Giả thuyết 4: Một số chủng vi khuẩn lactic chọn tạo được có khả năng sinh

tổng hợp GABA trong môi trường nuôi cấy thích hợp cũng có khả năng sinh

trưởng tốt và tạo hàm lượng GABA cao khi nuôi cấy trên nguyên liệu chè.

Giả thuyết 5: Quy trình công nghệ sản xuất chè giàu GABA khi nâng cấp

quy mô, hoàn thiện có thể sản xuất cho sản phẩm có chất lượng không chênh

lệch đáng kể so với kết quả từ thí nghiệm quy mô nhỏ.

Hình 1.5. Sơ đồ khối quy trình công nghệ sản xuất chè đen GABA dự kiến

44

*******

Chương 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Giống chè: Nguyên liệu búp chè tươi được thu hái từ 4 giống chè Keo Am

Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, Trung Du được trồng tại viện Khoa học

Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc. Trong đó 3 giống chè Keo Am Tích, Phúc

Vân Tiên, Kim Tuyên có tiềm năng để sản xuất chè xanh chất lượng cao. Chè

Trung Du là giống bản địa, được chọn làm đối chứng khi nghiên cứu so sánh

chất lượng của các giống chè.

Chủng vi sinh vật: Sử dụng bộ chủng giống gồm 263 vi khuẩn lactic được

lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Việt Nam (VTCC) thuộc Viện Vi sinh vật và

Công nghệ Sinh học (IMBT), Đại học Quốc Gia Hà Nội. Trong số này có 4

chủng là Lactobacillus plantarum VTCC-B-439, Lactobacillus casei VTCC-

B-411, Lactobacillus brevis 66 và Lactobacillus brevis 67 được nghiên cứu kỹ

nhất về hình thái, tính chất, định danh vì có khả năng sinh enzym glutamate

decarboxylase tạo GABA trên lá chè.

2.1.2. Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.1.2.1. Hóa chất

- Các hóa chất, kit, sử dụng trong quá trình nghiên cứu, phân tích, định

lượng được sản xuất từ các hãng nước ngoài nổi tiếng tin cậy và đảm bảo độ

chính tinh khiết như Merck, Sigma, Wako…

- Các hóa chất làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Glucose, sucrose,

peptone, cao nấm men, cao thịt, NaCl, MgSO4, MnSO4, Tween 80, Na2HPO4,

K2HPO4, CH3COONa, C6H11NO7, agar của Merck, Trung Quốc.

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA, điện di DNA, HPLC, v.v của hãng

45

Sigma, Merck như Tris base, ethylene diamine tetra acetic axit (EDTA),

CH3COOK, β-mercaptoethanol, sodium dodecyl sulphate (SDS), ethanol,

chloroform, isoamyalcohol, agarose, ethydium bromide (EtBr).

- Hóa chất khác: Chất mang là dextrin, sữa gầy và lactose của Sigma, chất

chuẩn γ-aminobutyric axit của Sigma, hóa chất để phân tích GABA như

methanol, ethanol, axit boric, acetone của Merck.

2.1.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường MT1: MRS (Man, Rogosa, Sharpe Broth) (g/l): Peptone - 10;

yeast extract - 5, meat extract - 10, glucose - 20, K2HPO4 - 2, CH3COONa - 5,

MgSO4 - 0,2, MnSO4 - 0,05, Tween 80 - 1,08; ammomium citrate - 2, pH

6,5±0,2;

Môi trường MT2 (g/l): Glucose - 20; K2HPO4 - 2, CH3COONa - 5,

diamonium hydrogen citrate - , MgSO4 - 0,2, MnSO4 - 0,04, Tween 80 - 1, yeast

extract - 50,1;

Môi trường MT3 (g/l): Glucose - 25, yeast extract - 6,25, peptone - 6,25,

MgSO4.7H2O - 0,2, MnSO4.4H2O - 0,05, Tween 80 - 2;

Môi trường MT4 (g/l): Glucose - 40, peptone - 10; yeast extract - 5,

KH2PO4 - 5; MgSO4.7H2O - 2;

Môi trường MT5 (g/l): Glucose - 20; peptone - 20; yeast extract - 10;

Môi trường MT6 (g/l): Glucose - 20; cao thịt - 10, peptone - 10,

CH3COONa - 5, cao nấm men-5, ammonium citrate - 2, K2HPO4 - 2,

MgSO4.7H2O - 0,1, MnSO4.5H2O - 0,05;

Môi trường MT7 (g/l): Glucose -10; yeast extract - 10; peptone - 5;

CH3COONa - 2, MgSO4.7H2O - 0,02, MnSO4.4H2O - 0,01, FeSO4.7H2O-0,01,

NaCl - 0.01;

Môi trường MT8 (g/l): Peptone - 15, cao thịt - 12,5, sucrose - 12,5; K2HPO4

- 1,03, CH3COONa - 5, ammonium citrate - 2, CaCl2 - 2; Tween 80 - 1;

46

Môi trường giữ giống lạnh sâu: -80oC bằng dung dịch glycerol 20%.

2.1.3. Thiết bị phân tích và thiết bị công nghệ

Các thiết bị máy móc và dụng cụ được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu

bao gồm: Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ), cân điện tử AL-300 (Osi, Mỹ),

nồi hấp khử trùng Hiclave HV-85 (Hirayama, Nhật), tủ sấy (Carbolite, Anh),

tủ cấy (Nuaire, Mỹ), máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức), kính hiển vi quang

học Axio (Zeiss, Đức), tủ nuôi vi sinh vật Sanyo (Nhật Bản), nồi điều nhiệt

Labtech (Hàn Quốc), máy đo pH Thermo - Scientific (Mỹ), máy Votex (Đức),

máy sấy phun Eyela (Nhật Bản), máy vò 6 CR-55 (Trung Quốc), quạt héo

KM750 (Nhật Bản), máy sấy thùng quay 6 CCP-100 (Trung Quốc), máy đóng

gói chân không LD-600 (Trung Quốc).

2.2. Kỹ thuật công nghệ để nghiên cứu chế biến chè

2.2.1. Sơ đồ quy trình công nghệ để nghiên cứu lên men chè

Quy trình sản xuất chè đen truyền thống đã biết: Nguyên liệu chè tươi 

Làm héo  Vò chè  Lên men hiếu khí  Sấy khô  Chè đen. Trình tự sản

xuất chè GABA sẽ áp dụng theo quy trình sản xuất chè đen thông thường, điểm

khác biệt là theo quá trình lên men, đề tài luận án thực hiện 2 phương án sản

xuất chè đen GABA có và không bổ sung vi sinh vật (Hình 3.1).

- Phương án 1: Lên men chè yếm khí ngay sau khi làm héo theo sơ đồ:

Làm héo  Xử lý yếm khí (12 h)  Vò  Lên men hiếu khí (90 ph)  Sấy

khô  Chè đen GABA.

- Phương án 2: Lên men chè yếm khí sau khi vò theo sơ đồ: Làm héo 

Vò  Lên men yếm khí + lên men hiếu khí  Sấy khô  Chè đen GABA.

Điểm khác nhau cơ bản giữa 2 phương án là ở công đoạn lên men.

2.2.2. Kỹ thuật làm héo, vò và sấy chè

Các kỹ thuật làm héo, vò và sấy chè được tham khảo theo tài liệu của Đỗ

Văn Chương (2009) với một số cải tiến nhất định. Khoảng 10 kg được sử dụng

mỗi mẻ làm héo. Nguyên liệu chè được rải đều trên các khay, trong thời gian

47

héo, cứ sau 1 h chè trong từng khay được đảo trộn một lần, nhiệt độ trong phòng

biến động trong khoảng 2730oC, độ ẩm không khí biến động trong khoảng

7585%. Tiến hành đánh giá chất lượng của búp chè trong quá trình làm héo.

Chè sau khi héo được chế biến tiếp (vò, lên men và sấy khô) để thu được chè

đen. Chè đen thành phẩm được đánh giá chất lượng bằng phương pháp cảm

quan theo tiêu chuẩn ngành TCVN 3218 - 2012.

Dùng máy vò đơn (Trung Quốc) để vò chè, dung tích của máy vò 50 kg

chè /mẻ, vò mỗi lần với thời gian vò 30 ph/mẻ, độ dập tế bào 70 - 80%.

Hình 2.1. Hai phương án lên men yếm khí sản xuất chè đen giàu GABA

2.2.3. Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí

Kỹ thuật tạo môi trường yếm khí được tiến hành tham khảo một số tài liệu

[100,121,129] có cải tiến cho phù hợp điều kiện thực tế. Để tạo ra môi trường

lên men yếm khí, cần có dụng cụ hay bao bì kín, tức là phải tạo ra môi trường

chân không bằng cách hút khí ra ngoài, hoặc môi trường chứa khí trơ (N2). Chè

48

được đựng trong túi chất dẻo, đưa vào máy hút chân không, được hàn kín bằng

nhiệt hoặc có thể làm kín miệng túi bằng kẹp có cấu tạo thích hợp cho dễ mở

để lấy chè ra sau khi lên men, túi chất dẻo có thể được dùng nhiều lần.

Đối với thí nghiệm nhỏ (khoảng 1 kg chè/1 túi) thì chè được cho vào các

túi nhỏ, hút chân không và hàn kín miệng túi bằng nhiệt. Đối với thí nghiệm ở

quy mô sản xuất lớn hơn (mô hình nghiên cứu với khối lượng 10 kg chè/1 túi),

chè được cho vào túi to hơn (có kích thước lớn 60 cm x 100 cm) và dầy (khoảng

1 mm) dùng kẹp để làm kín miệng túi và hút chân không hoặc hút chân không

sau đó bơm thêm khí ni tơ vào đầy túi đảm bảo không còn ô xy trong túi tức là

mức yếm khí rất cao. Các túi chè được đặt trong phòng lên men đã đươc điều

tiết đến nhiệt độ nhất định. Mỗi thí nghiệm được tiến hành trong 7 túi. Đến thời

điểm đã định thì lấy 1 túi, đó chính là mẫu cần lấy tại thời điểm đó để phân tích

hàm lượng GABA.

2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.1. Các thí nghiệm lựa chọn chủng giống vi sinh vật và chè thích hợp

2.3.1.1. Lựa chọn chủng giống vi khuẩn lactic

Thí nghiệm để lựa chọn chủng giống vi khuẩn lên men lactic thích hợp,

dựa vào tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym

glutamate decarboxylase cao từ 263 chủng vi khuẩn lactic lưu giữ tại Bảo tàng

giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC). Hàm lượng enzym glutamate

decarboxylase là chỉ tiêu để lựa chọn. Các phương pháp quan sát hiển vi được

sử dụng để đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn.

Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rDNA, theo đó DNA tổng

số của các chủng vi khuẩn được tách chiết và làm khuôn cho phản ứng PCR

bằng cặp mồi đã thiết kế. Sản phẩm PCR được tinh sạch và làm mẫu cho phản

ứng khuếch đại tiếp với các mồi và chất huỳnh quang của Kit Cycle sequencing.

Trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa rRNA 16S được xác định và được so

sánh với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế. Phương pháp

49

định danh được nêu chi tiết tại phần Phụ lục.

2.3.1.2. Thí nghiệm xác định khả năng lên men tạo GABA trên chè

Chủng Lactobacillus có hoạt tính sinh enzym glutamate decarboxylase

được cấy vào các bình tam giác chứa môi trường MT1 bổ sung 1% glutamate

ở 37oC, 24 h. Lá chè được làm héo sau đó vò dập rồi được cho đựng vào các

túi zip. Bổ sung 10% thể tích giống nuôi cấy vào trong các túi chè, trộn đều và

hút hết khí bên trong túi ủ ở 37oC sau 1 đến 7 ngày lên men. Mỗi ngày lấy ra 3

gam chè trong mỗi túi đem đi sấy khô sau đó cân 1 g mỗi mẫu chè đã được sấy

khô để chiết tạo dịch phân tích.

2.3.1.3. Xác định các thông số độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn

Để lựa chọn thời gian lên men thích hợp, tiến hành bố trí thí nghiệm tương

tự thí nghiệm 1-2, bao gồm cả cách lấy mẫu và chuẩn bị dịch phân tích GABA.

Chỉ thay đổi thời gian ủ lên men là: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày. Để lựa chọn tỷ lệ

giống cấy thích hợp, cấy giống với tỷ lệ 2%, 5%, 10%, 15% và 20% thể tích

giống nuôi cấy vào trong các túi chè, trộn đều và hút hết khí bên trong túi ủ ở

37oC trong 2 ngày lên men. Để lựa chọn độ ẩm lên men thích hợp, thực hiện

như các thí nghiệm 1-2, chỉ thay đổi độ ẩm là chè. Theo đó, lá chè được sao và

vò dập rồi được đựng vào các túi zip và bổ sung thêm nước cất để tạo thành 5

gradien độ ẩm khác nhau là 59, 62, 63, 70, 75%. Lựa chọn chế độ thay đổi khí

thích hợp: Các chủng Lactobacillus lựa chọn được ủ lên men chè với điều kiện

lên men yếm khí (hút hết khí trong túi zip rồi buộc kín miệng lại) và điều kiện

lên men hiếu khí (mở miệng túi zip) ủ ở 37oC trong 2 ngày lên men. Lựa chọn

tỷ lệ glutamate bổ sung thích hợp bằng cách ủ lên men chè với tỷ lệ glutamate

bổ sung là 0; 0,1; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5% với thời gian ủ 2 ngày.

2.3.1.4. Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic

Tối ưu hóa được thực hiện theo chỉ dẫn tại tài liệu của Phạm Việt Cường,

Hoàng Đình Hòa [2] và tài liệu của Bùi Thế Tâm, Đặng Vũ Thiệu [51]. Sử dụng

môi trường nuôi cấy MT2, điều kiện nuôi cấy tĩnh, hàm lượng glutamat bổ sung

50

1,0%, nguồn cacbon nuôi cấy là lactose, nguồn nitơ nuôi cấy là từ cao nấm

men, tỷ lệ giống khởi động 5,0% để làm môi trường lên men. Quá trình tối ưu

hóa được khảo sát với 3 yếu tố nêu dưới đây với chỉ tiêu cần tối ưu là sinh khối

vi khuẩn tạo thành, thể hiện qua mật độ quang OD đo ở bước sóng 600 nm:

x1- Thời gian nuôi cấy vi khuẩn từ 40 đến 56 h

x2- Nhiệt nuôi cấy vi khuẩn trong khoảng 30 - 40oC

x3- pH môi trường lên men trong khoảng 5 - 8

2.3.1.5. Thí nghiệm lựa chọn giống chè phù hợp

Bốn giống chè đã được sử dụng là: Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên và Kim

Tuyên và Trung Du. Tiến hành thu hoạch chè để phân tích thành phần hóa học

cơ bản tại 3 thời điểm trong năm: Tháng 3, Tháng 6, Tháng 9, tương ứng với

vụ chè đầu năm, giữa năm và cuối năm. Các thành phần được phân tích gồm:

Độ ẩm của nguyên liệu, hàm lượng chất hòa tan, hàm lượng tannin, hàm lượng

axit amin tổng số, và hàm lượng axit amin thành phần.

2.3.2. Các thí nghiệm xác định tác dụng của lên men yếm khí

2.3.2.1. Thí nghiệm thăm dò khả năng tích lũy GABA khi lên men yếm khí

Thí nghiệm được tiến hành với 2 mẫu (công thức), mẫu 1 là chế biến chè

đen theo công nghệ truyền thống: Nguyên liệu  làm héo  vò  lên men

hiếu khí  sấy khô  chè đen thành phẩm, mẫu 2 có bổ sung công đoạn lên

men yếm khí: Nguyên liệu  làm héo  vò  lên men yếm khí  lên men

hiếu khí  sấy khô  chè đen thành phẩm. Sử dụng cả 4 giống chè Keo Am

Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, Trung Du. Các chỉ số phân tích gồm có hàm

lượng GABA, đánh giá cảm quan về hương, vị, màu sắc nước chè.

Điều kiện lên men của mẫu 1 (công thức đối chứng): Lên men hiếu khí ở

35oC, thời gian 90 ph; Mẫu 2 (công thức thí nghiệm): Lên men yếm khi ở 35oC,

thời gian 90 ph.

2.3.2.2. Thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng lên men yếm khí

Chè sau khi được làm héo thời gian 7 - 8 h, được vò 2 lần với thời gian vò

51

30 ph, bổ sung hoặc không bổ sung vi sinh vật, tiến hành lên men yếm khí trong

thời gian từ 0 - 12 h, nhiệt độ từ 15 - 35oC. Cứ sau mỗi 2 h mẫu chè được tiếp

tục lên men hiếu khí trong thời gian 90 ph, sấy khô tại nhiệt độ từ 100 - 105oC.

Tiến hành đánh giá cảm quan và phân tích hàm lượng GABA của sản phẩm chè

lên men.

Lấy mẫu: Mỗi túi chè là 1 mẫu phân tích, có các túi kí hiệu T1, T2, T3,

T4, T5, T6, T7 là ứng với thời gian lên men yếm khí 0, 2, 4, 6, 8, 10 và 12 h,

còn T8 là mẫu chè ứng với thời gian lên men hiếu khí 90 ph.

2.3.2.3. Thí nghiệm tối ưu hóa lên men yếm khí

Tối ưu hóa được thực hiện theo tài liệu của Phạm Việt Cường, Hoàng Đình

Hòa (2017) và tài liệu của Bùi Thế Tâm, Đặng Vũ Thiệu (1999). Các mục tiêu

cần tối ưu gồm: 𝑦1: Hàm lượng GABA trong chè đen bán thành phẩm mẫu thí

nghiệm (mg/100g CK) tiến tới đạt cao nhất; 𝑦2: Điểm cảm quan về mùi của chè

đen bán thành phẩm mẫu đối chứng tiến tới lớn nhất (chỉ số này của mẫu đối

chứng mặc định công nhận 5,0 điểm); 𝑦3: Điểm cảm quan về vị chè đen bán

thành phẩm mẫu thí nghiệm tiến tới cao nhất. Các yếu tố ảnh hưởng gồm 𝑥1 : Nhiệt độ lên men từ 27oC đến 31oC, 𝑥2 : Thời gian lên men từ 9 h đến 13 h. 2.3.2.4. Thí nghiệm nhằm so sánh chất lượng của 2 sản phẩm chè

Mục đích của thí nghiệm này là để so sánh chất lượng của 2 sản phẩm chè

đen. Sản phẩm theo công nghệ sản xuất chè đen truyền thống ở nước ta (chỉ lên

men hiếu khí) và sản phẩm chè đen có bổ sung quá trình lên men yếm khí, sau

đó mới tiến hành lên men hiếu khí. Điều kiện lên men hiếu khí theo chế độ thời

gian 90 ph, nhiệt độ 25oC. Điều kiện lên men yếm khí với mẫu thí nghiệm theo

chế độ đã tối ưu hóa có nhiệt độ 29oC, thời gian 8 h. Các mẫu chè được đánh

giá qua 3 chỉ tiêu chất lượng là hàm lượng GABA, điểm cảm quan về hương

và vị. Các chỉ số phụ để đánh giá khi cần thiết như màu nước, ngoại hình.

Cường độ màu của nước chè được chuẩn bằng dung dịch I2 0,1N. Đơn vị đo là

52

số ml I2 0,1N/100 ml nước lã.

2.3.3. Các thí nghiệm xác định tác dụng của lên men yếm khí kết hợp lên

men bằng lactic

Để xác định tác dụng của quá trình lên men yếm khí kết hợp lên men lactic,

các thí nghiệm sau đây đã được bố trí:

- Thí nghiệm xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa công nghệ của các yếu

tố ảnh hưởng

- Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men kết hợp

- Thí nghiệm so sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm

- Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí chè đen bằng phương

pháp thang điểm có sử dụng hệ số quan trọng của các chỉ tiêu chất lượng.

2.3.4. Các thử nghiệm hoàn thiện công nghệ và sản xuất quy mô pilot

Nhằm hoàn thiện các thông số công nghệ để áp dụng ở quy mô pilot, một

số thí nghiệm đã được tiến hành. Để thuận tiện theo dõi, chi tiết cách bố trí những

thí nghiệm này nêu ở phần “Kết quả và thảo luận” tại những mục tương ứng.

2.3.5. Thí nghiệm bảo quản chè đen giàu GABA

Thí nghiệm bảo quản được tiến hành trong 12 tháng (từ tháng 8 năm 2019

đến tháng 8 năm 2020) tại phòng thí nghiệm của Trường Cao đẳng Công nghiệp

thực phẩm (Thành phố Việt Trì). Các thời điểm lấy mẫu phân tích: Lần 1:

10/8/2019 - thời tiết mùa thu; Lần 2: 10/01/2020 - thời tiết mùa đông; Lần 3:

10/04/2020 - thời tiết mùa xuân; Lần 4: 10/07/2020 - thời tiết mùa hạ; Lần 5:

10/8/2020 - thời tiết mùa thu. Ba loại bao bì đã được sử dụng.

2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.4.1. Phương pháp phân tích hàm lượng GABA

2.4.1.1. Phương pháp định tính GABA bằng sắc kí bản mỏng TLC

Mức độ GABA được xác định định tính bởi TLC theo phương pháp của

Choi và cộng sự [145] với một tấm TLC bằng nhôm (Sigma-Aldrich Co.,

Germany). Dịch nổi mẫu thu được bằng cách ly tâm ở 2.400 v/ph trong 10 ph.

53

Lấy 2 microlit dịch nổi sau đó cho chạy phát hiện trên các tấm TLC so với 1%

(w/v) của dung dịch GABA MSG (bột ngọt) chuẩn. TLC được tiến hành bằng

cách sử dụng hỗn hợp dung môi axit axetic: n-butanol: nước cất (4: 1: 1) làm

pha động. Sau đó, các tấm được phun dung dịch ninhydrin 1,0% (w/v) và sau

đó gia nhiệt ở 70°C trong 5-10 ph cho đến khi xuất hiện các vết đốm.

2.4.1.2. Phương pháp định lượng GABA bằng quang phổ

Hàm lượng GABA được xác định theo Watchararparpaiboon và cộng sự

[129]. Theo đó, hỗn hợp của dung dịch (đệm borat 0,2 M, 0,2 ml: thuốc thử

phenol 6%, 1 ml) đã được thêm vào dịch nổi ly tâm (0,1 mL). Sau đó, 0,4 ml

7,5% natri hypoclorit được thêm vào và đun sôi trong 10 ph. Mẫu được làm

lạnh ngay lập tức trong 5 ph và quang mật độ đo ở bước sóng 630 nm. Đường

chuẩn của GABA chuẩn được chuẩn bị với nồng độ khoảng 0,5-4 g/l cho hệ

số xác định (R2) 0,99 và được sử dụng để xác định nồng độ của GABA trong

các mẫu.

2.4.1.3. Phương pháp định lượng GABA bằng HPLC

Phân tích GABA trong chè và các sản phẩm lên men chè bằng HPLC được

tiến hành theo phương pháp của Hayat và cộng sự [55] với một vài cải tiến nhỏ.

Dịch chiết xuất chè được chuẩn bị (50 μL) được trộn với NaHCO3 100 mM (50

μL) và dung dịch axetonitril DABSYL-Cl 4 mM (50 μL). GABA sau đó được

biến đổi bởi gia nhiệt hỗn hợp ở 70°C trong 10 ph. Sau khi tạo dẫn xuất, mẫu

được trộn với ethanol tuyệt đối (250 μL) và đệm phosphat 25 mM (250 μL, pH

6,8). Các mẫu sau đó được lọc qua bộ lọc 0,2 μm và được phân tích bằng HPLC.

Việc xác định GABA đã được thực hiện trên máy Agilent HPLC 1100 (Agilent

Technologies, Hoa Kỳ). HPLC được trang bị cột Supelcosil LC-DABS (4,6 ×

150 mm, 3 μm) (Supelco, Bellefonte, PA) và detector diode array (ở bước sóng

465 nm). Pha động được tạo thành từ đệm axetat 25 mM : axetonitril theo tỷ lệ

65:35. Hệ thống đã được vận hành ở 55°C với tốc độ dòng 0,5 ml/ph. Nồng độ

của GABA đã được tính toán từ khu vực dưới đỉnh của chính nó so sánh với

54

đường chuẩn của GABA chuẩn (độ tinh khiết ≥ 99%).

2.4.2. Phương pháp xác định enzym glutamate decarboxylase

Theo phương pháp của Yu và cộng sự [137]. Phân tích dựa trên sự thay

đổi màu sắc của xanh bromocresol do sự gia tăng độ pH khi proton bị tiêu thụ

trong phản ứng có sự xúc tác của enzym. Màu xanh bromocresol được chọn

làm chất chỉ thị vì nó có pKa tương tự với dung dịch đệm axetat được sử dụng.

Sự thay đổi độ hấp thụ tương ứng ở bước sóng 620 nm được ghi lại bằng đầu

đọc microplate khi phản ứng xảy ra.

2.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng chè

- Xác định độ ẩm của chè bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng

không đổi

- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo ISO 4833-1:2013

- Xác định tổng số E. coli theo TCVN 7924-2:2008

- Xác định tổng số bào tử nấm men nấm mốc theo TCVN 8275-2:2010

- Xác định hàm lượng polyphenol theo TCVN 9745-1:2013

- Xác định hàm lượng chất xơ thô theo TCVN 5103 - 1990

- Hàm lượng chất hòa tan: TCVN 5610:2007

- Hàm lượng tro tổng số: TCVN 5611:2007

- Phân tích thành phần và hàm lượng axit amin bằng phương pháp sắc kí

lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Đánh giá chất lượng cảm quan của chè theo TCVN 3218 : 2012

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, các số liệu phân tích là trung bình

cộng của 3 lần lặp lại (n = 3) được xử lý bằng phần mềm Excel 2010. Sự khác

nhau giữa các giá trị trung bình được phân tích theo phân tích phương sai một

yếu tố ANOVA ở mức ý nghĩa α = 5% bằng phần mềm Minitab 16.

Phương pháp tối ưu hóa tham khảo tài liệu của Phạm Văn Cường và Hoàng

Đình Hòa [2], Bùi Thế Tâm và Đặng Vũ Thiệu [11]. Trong đó, phương pháp

55

tối ưu hoá quá trình 1 mục tiêu, đa yếu tố được thực hiện theo phương pháp

Box-Willson; Tối ưu hoá quá trình đa mục tiêu, đa yếu tố được sử dụng theo

phương pháp hàm mong đợi; Bài toán đa mục tiêu đa yếu tố thực hiện theo

56

phương pháp thang điểm hoặc xây dựng Hàm-Phạt.

Chương 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn lactic và nguyên liệu chè thích hợp cho

sản xuất chè giàu gaba bằng phương pháp lên men

3.1.1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym

glutamate decarboxylase cao

Các nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật chỉ sử dụng các chủng vi khuẩn

lactic, và cũng chỉ khai thác nguồn chủng giống có sẵn mà không tiến hành

phân lập. Theo đó, công việc tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

sinh enzym glutamate decarboxylase cao để sử dụng trong quá trình lên men

chè được tiến hành từ 263 chủng vi khuẩn lactic lưu giữ tại Bảo tàng giống

chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC). Các chủng giống được cung cấp có nhiều

thông tin nhưng không có thông tin về khả năng sinh tổng hợp GABA. Chỉ tiêu

để tuyển chọn (sàng lọc) đầu tiên dựa là vào khả năng sinh enzym glutamate

decarboxylase (GAD) của các chủng vi khuẩn lactic. Kết quả sàng lọc được thể

hiện trong Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzym

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Lần 4

Kí hiệu

T

Kết

Kết

Kết

Kết

chủng

T

OD600

OD600

OD600

OD600

quả

quả

quả

quả

+

2,883

+

2,591

+

2,591

+

1 VTCC-B-439 2,688

+

2,603

+

2,668

+

2,668

+

2 VTCC-B-411 2,420

+

2,768

+

2,661

+

2,661

+

66

2,564

3

+

2,571

+

2,648

+

2,448

+

67

2,442

4

glutamatedecarboxylase được sàng lọc sơ bộ

Từ bảng cho thấy, sau khi thử nghiệm khả năng sinh enzym glutamate

decarboxylase của các chủng vi khuẩn lactic, có 4 chủng vi khuẩn lactic

57

là VTCC-B-439, VTCC-B-411, 66 và 67 cho kết quả sinh enzym

glutamate decarboxylase và có khả năng sinh trưởng tốt (OD600 > 2,4) sau

cả 4 lần thử nghiệm. Bốn chủng vi khuẩn này được lựa chọn cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Enzym glutamate decarboxylase (GAD) ở các vi khuẩn axit lactic được

coi là enzym mấu chốt trong quá trình sinh tổng hợp GABA [151]. GAD là một

enzym phụ thuộc pyridoxal-5'-phosphate xúc tác quá trình α-decarboxyl hóa

không thuận nghịch của axit L-glutamic thành axit γ-aminobutyric (GABA) và

CO2. Enzym này được phân bố rộng rãi ở sinh vật nhân thực cũng như sinh vật

nhân sơ, ở đó cùng với sản phẩm phản ứng GABA, thực hiện các chức năng

sinh lý rất khác nhau. Sự xuất hiện của các gen gad mã hóa GAD đã được chứng

minh ở nhiều vi sinh vật, và vi khuẩn axit lactic sản xuất GABA (LAB) là trọng

tâm nghiên cứu trong những năm gần đây [151]. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng

GAD để sàng lọc các vi khuẩn có khả năng sinh GABA [152].

3.1.2. Thẩm định đặc điểm hình thái và phân loại 4 chủng vi khuẩn lactic

3.1.2.1. Đặc điểm hình thái

(a) Chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-439:

Mục đích của các nghiên cứu ở mục 3.1.2 nhằm thẩm định lại các đặc điểm

và định danh chính xác 4 chủng vi khuẩn đã lựa chọn. Kết quả về hình thái

khuẩn lạc và tế bào chủng VTCC-B-439 nêu trên Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc

quan sát sau 48 h nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS của chủng VTCC-B-

439 có dạng tròn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng sữa, kích thước 0,49 - 0,97 mm.

Hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi vật kính 100X cho biết thuộc Gram

(+), tế bào dạng que ngắn hoặc que dài, đôi khi hơi cong, xếp thành cặp hoặc

58

chuỗi, kích thước (0,61-0,72) x (0,87-1,49) µm.

Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc (bên trái) và hình thái tế bào (bên phải) của

chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-439 (bar 5µm)

(b) Chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-411:

Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng VTCC-B-411 nêu trên Hình 3.2. Quan

sát sau 48 h nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc có dạng tròn, lồi,

bóng, mép hơi sần trong, màu trắng sữa, kích thước 0,49-0,97 mm. Hình thái

tế bào thể hiện là Gram (+), có dạng que thường kết đôi hoặc chuỗi, kích thước

(0,39- 0.63) x (1,92-3,99) µm.

Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc (bên trái) và hình ảnh tế bào (bên phải)

chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-411 (bar 5 µm)

(c) Chủng vi khuẩn lactic 66:

Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng 66 nêu trên Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng

66 có dạng tròn, lồi, bóng, mép hơi lan, màu trắng đục, kích 0,76-1,39 mm.

59

Hình thái tế bào chủng 66 sau khi nuôi trên môi trường thạch MRS trong 48 h,

quan sát dưới kính hiển vi thể hiện là tế bào Gram (+), có dạng que thường kết đôi

hoặc chuỗi, kích thước (0,55-0,83) x (1,44-2,31) µm.

Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh tế bào (bên phải) của

chủng vi khuẩn lactic 66 (bar 5µm)

(d) Chủng vi khuẩn lactic 67:

Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng vi khuẩn lactic 67 nêu trên Hình 3.4.

Hình thái khuẩn lạc sau 48 h nuôi cấy ở trên môi trường thạch MRS có dạng

tròn, lồi, bóng, mép răng cưa hơi lan, màu trắng đục, kích thước 0,68-1,07 mm.

Hình thái tế bào Gram (+), tế bào có dạng que thường kết đôi hoặc chuỗi, kích

thước (0,52-0.,3) x (1,62-2,41) µm.

Hình 3.4. Hình ảnh khuẩn lạc (trái) và hình ảnh tế bào (phải) của

chủng vi khuẩn lactic 67 (bar 5µm)

3.1.2.2. Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rRNA

DNA tổng số của các chủng vi khuẩn được tách chiết và làm khuôn cho

60

phản ứng PCR bằng cặp mồi đã thiết kế. Sản phẩm PCR được tinh sạch và làm

mẫu cho phản ứng khuếch đại tiếp với các mồi và chất huỳnh quang của Kit Cycle

sequencing. Trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa rRNA 16S được xác định

(xem thêm ở Phụ lục 1) và được so sánh với các trình tự đã được công bố trên

ngân hàng gen Quốc tế.

Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng lựa chọn và 29 loài thuộc chi

Lactobacillus được xây dựng dựa vào trình tự rRNA 16S; Weissella viridescens

được sử dụng làm nhóm ngoài (Hình 3.5). Quan sát cây phát sinh cho thấy 4

chủng nghiên cứu chia làm ba nhóm: 2 chủng 66 và 67 nằm trên vị trí phân loại

với nhóm Lactobacillus brevis. Chủng VTCC-B-439 nằm cùng vị trí với các

loài L.plantarum; chủng VTCC-B-411 nằm cùng với các loài thuộc nhóm

L.casei. Kết quả so sánh trình tự cho thấy chủng 66 và 67 có quan hệ gần gũi

nhất với loài L.brevis M58810 với độ tương đồng đoạn rDNA 16S là 99,9%.

Chủng VTCC-B-439 có quan hệ gần gũi nhất với loài L.plantarum D79210 với

độ tương đồng là 99,4%. Chủng VTCC-B-411có độ tương đồng đoạn ADNr

16S là 100% vớiLactobacillus casei M177140.

Như vậy, dựa vào hình thái và trình tự rRNA 16S, các chủng 66 và 67 được

định tên là Lactobacillus brevis; chủng VTCC-B-439 là Lactobacillus plantarum;

chủng VTCC-B-411 được phân loại vào loài Lactobacillus casei. Đây là các

chủng vi khuẩn lactic an toàn và thường được sử dụng trong thực phẩm.

Hầu hết các chủng vi khuẩn lên men lactic (LAB) trong bộ sưu tập 263

chủng mà đề tài luận án sử dụng đều có nguồn gốc từ thực phẩm lên men hoặc

các nguồn chứa axit glutamic khác. Trong nghiên cứu của luận án, năng suất

cao nhất của LAB tạo ra GABA là chủng L. casei VTCC-B-411 và L.plantarum

VTCC-B-439, cao hơn 2 chủng L. brevis 66 và L. brevis 67. Kết quả này là phù

61

hợp với rất nhiều báo cáo trước đây.

Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng nghiên cứu và một số loài có

quan hệ họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự rRNA 16S

Nhiều chủng LAB tạo GABA từ các nguồn khác nhau như L. plantarum

L10-11 được phân lập từ plaa-som (cá lên men của Thái Lan) [147], L. pentosus

SS6 được phân lập từ quả dâu tằm lên men [141], Compani-lactobacillus futsaii

62

CS3 được phân lập từ tôm lên men của Thái Lan hoặc Kung-Som [148],

Latilactobacillus sakei A156 được phân lập từ hải sản lên men của Hàn Quốc

hoặc Jeot-gal [149], ba chủng L. brevis và một trong số Lactococcus lactis được

phân lập từ pho mát Tây Ban Nha [150], năm chủng bao gồm L. plantarum, L.

brevis, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc lactis và Weissella

viridescens được phân lập từ kim chi [68].

Trong nghiên cứu của luận án có một sự khác biệt so với kết quả của

Kanklai và cộng sự [146], nhóm tác giả đó cho biết khả năng sinh GABA của

L. brevis F064A được phân lập từ xúc xích lên men (Sai Krok Isan) cao hơn

của các chủng L. plantarum. Điều này chứng tỏ ngay cả cùng một giống, chủng

nhưng khả năng tổng hợp GABA vẫn có thể khác nhau, tùy thuộc vào enzym

glutamate decarboxylase và nhiều yếu tố khác.

3.1.3. Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè

Mục đích của nghiên cứu là chứng minh các chủng giống nêu ở trên

không những có khả năng tổng hợp GABA trong môi trường nuôi cấy nhân

tạo mà còn có thể sinh trưởng và sinh GABA trên lá chè. Các chủng này nếu

có khả năng như thế mới có thể sử dụng cho ứng dụng vào sản xuất chè giàu

GABA. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp trình bày tại mục

2.3.1.2. Theo đó, các chủng Lactobacillus được nuôi cấy trong môi trường

MRS ở 37oC trong 24 h. Bổ sung 10% thể tích giống nuôi cấy vào trong các

túi chè. Mỗi ngày lấy ra 3 g chè để xác định hàm lượng GABA trong dịch

chiết chè bằng phương pháp quang phổ. Kết quả xác định hàm lượng GABA

nêu trong Bảng 3.2.

Từ kết quả trong bảng cho thấy cả 4 chủng nghiên cứu đều có khả năng

tạo GABA với hàm lượng khác nhau trong cả 3 ngày thử nghiệm lên men.

Chủng VTCC-B-439 và VTCC-B-411 có khả năng tạo GABA trên chè cao nhất

sau 2 ngày, đạt trên 0,8 mg/ml. Chủng 66 và chủng 67 có khả năng tạo GABA

trên chè thấp hơn, chỉ khoảng 0,3 mg/ml. Cả 4 chủng đều tạo GABA trên chè

63

cao sau 2 ngày lên men và sau đó hàm lượng GABA không tăng nữa. Như vậy,

sau kết quả thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi

khuẩn lactic, 2 chủng VTCC-B-439 và chủng VTCC-B-411 có khả năng tạo

GABA cao nhất được lựa chọn.

Bảng 3.2. Khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn

Hàm lượng GABA (mg/ml)

Chủng vi khuẩn

1 ngày

2 ngày

3 ngày

L. plantarum (VTCC-B-439)

0,421

0,888

0,897

L. casei (VTCC-B-411)

0,359

0,813

0,815

L. brevis (66)

0,233

0,301

0,289

L. (67)

0,267

0,323

0,331

3.1.4. Xác định chế độ công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic để lên

men chè giàu GABA

3.1.4.1. Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp

Các khảo sát ở mục 3.1.4 nhằm xác định các thông số kỹ thuật như loại

môi trường, nhiệt độ, thời gian, pH, điều kiện cung cấp ô xy cho môi trường

nuôi cấy, tỷ lệ giống lên men, và lựa chọn nguồn ni tơ, cacbon để sản xuất giống

phục vụ cho lên men tạo sản phẩm chè đen giàu GABA. Các thí nghiệm được

bố trí theo phương pháp đã trình bày tại mục 2.3.1.3. Hai chủng vi khuẩn

VTCC-B-439 và VTCC-B-411 được nuôi trong các môi trường dịch thể được

kí hiệu MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7 và MT8 bổ sung 1%

glutamate ở nhiệt độ 37oC. Sau 24, 48, 72 và 102 h nuôi cấy, tiến hành xác định

mật độ tế bào bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600) và định

lượng GABA trong dịch nuôi cấy. Kết quả xác định mức độ sinh trưởng (qua

mật độ quang) và hàm lượng GABA của chủng vi khuẩn VTCC-B-439 và

64

chủng vi khuẩn VTCC-B-411 được nêu trong Bảng 3.3 và Bảng 3.4.

Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng và hàm lượng GABA trong 8 môi trường

nuôi cấy chủng vi khuẩn VTCC-B-439

Chủng VTCC-B-439

Môi

24 h

48 h

72 h

102h

trường

GABA

GABA

GABA

GABA

OD600

OD600

OD600

OD600

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

MT1

2,376

0,428

2,987

0,5583

3,246

0,523

3,321

0,499

MT2

2,729

0,633

3,286

0,8149

3,286

0,703

3,280

0,623

MT3

1,416

0,312

2,094

0,323

2,297

0,349

0,886

0,312

MT4

1,407

0,232

1,477

0,303

1,564

0,289

1,012

0,200

MT5

1,458

0,334

1,881

0,412

1,982

0,387

1,189

0,235

MT6

1,585

0,314

1,879

0,328

1,812

0,322

2,043

0,212

MT7

1,262

0,413

0,824

0,545

0,801

0,468

0,365

0,321

MT8

1,519

0,424

0,689

0,591

0,768

0,521

1,110

0,323

Dựa vào kết quả Bảng 3.3 và Bảng 3.4 thấy hai chủng được nuôi trên 8

loại môi trường khác nhau có mật độ tế bào và hàm lượng GABA ở các mức

độ khác nhau tùy thuộc vào môi trường và thời gian nuôi cấy. Khi nuôi cấy

chủng trong môi trường MT1 và MT2 khả năng sinh trưởng và hàm lượng

GABA của 2 chủng đều cao (OD600 > 2,7, hàm lượng GABA đạt trên 0,5

mg/ml. So sánh giữa 2 môi trường này thấy MT1 cho khả năng sinh trưởng tốt

hơn môi trường MT2. Trong khí MT2 cho khả năng tạo hàm lượng GABA cao

hơn MT1. Đánh giá rằng sự khác biệt về hàm lượng GABA của MT2 là rất

đáng kể, do vậy môi trường MT2 được coi là thích hợp để lựa chọn làm môi

trường trong các nghiên cứu tiếp theo cho cả hai chủng. Cũng từ 2 bảng nêu

trên thấy 48 h là thời gian lên men thích hợp của cả 2 chủng vi khuẩn lactic

65

VTCC-B-439 và VTCC-B-411 trong cả 2 môi trường MT1 và MT2.

Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và hàm lượng GABA trong 8 môi trường

nuôi cấy chủng vi khuẩn VTCC-B-411 khác nhau

Chủng VTCC-B-411

Môi

24 h

48 h

24 h

102 h

trường

GABA

GABA

GABA

GABA

OD600

OD600

OD600

OD600

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

M1

3,285

0,523

3,405

0,6191

3,345

0,592

3,319

0,411

MT2

2,831

0,602

3,136

0,8013

3,332

0,699

3,279

0,599

MT3

1,373

0,311

1,776

0,311

2,129

0,315

1,889

0,301

MT4

1,298

0,241

1,292

0,297

1,256

0,267

1,058

0,225

MT5

1,462

0,329

1,946

0,378

2,002

0,336

0,963

0,216

MT6

1,686

0,327

1,809

0,397

1,987

0,364

2,011

0,217

MT7

1,142

0,439

1,724

0,599

1,977

0,432

1,217

0,304

MT8

1,553

0,436

1,535

1,545

0,562

0,537

0,664

0,334

3.1.4.2. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

Hai chủng vi khuẩn lactic VTCC-B-439 và VTCC-B-411 được nuôi trong

môi trường thích hợp đã chọn MT2 ở các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 30, 35, 40,

45, 50 và 55oC sau 24 h thì đo mật độ quang học OD. Kết quả được nêu trên

Hình 3.6. Dựa vào số liệu trên hình cho thấy mật độ tế bào của 2 chủng khi

được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ khác nhau là khác nhau. Giá trị OD của các

chủng vi khuẩn đạt giá trị cao nhất ở khoảng 30oC-40oC (OD > 2). Khi nuôi ở

nhiệt độ dưới 30oC và trên 45oC, OD của các chủng giảm mạnh (OD < 1). Hai

chủng vi khuẩn VTCC-B-439 và VTCC-B-411 sinh trưởng tốt trong khoảng

nhiệt độ từ 30oC đến 40oC và cao nhất ở nhiệt độ 35oC (giá trị OD tương ứng

của 2 chủng là 2,768 và OD 2,677). Dựa vào kết quả này, chọn nhiệt độ 35oC

66

là nhiệt độ thích hợp cho thí nghiệm tiếp theo.

3

VTCCB439

2.5

VTCCB411

2

1.5

0 0 6 D O

1

0.5

0

20

25

30

45

50

55

35 40 Nhiệt độ (oC)

Hình 3.6. Mức độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 ở các nhiệt độ khác nhau

3.1.4.3. Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp

Hai chủng vi khuẩn được nuôi trong các môi trường dịch thể MT2 ở 35oC

với dải pH khác nhau có giá trị từ 4 - 8. Sau 24 h nuôi cấy, kiểm tra khả năng

sinh trưởng của các chủng bằng phương pháp đo OD600. Kết quả được thể hiện

ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Mức độ sinh trưởng và pH môi trường sau nuôi cấy của hai

chủng nghiên cứu ở pH khác nhau

pH môi trường nuôi cấy

Chủng

4

5

6

7

8

OD600

pH OD600 pH OD600 pH OD600 pH OD600

pH

VTCCB439 1,434 4,18 1,989 4,76 2,767 4,95 2,539 4,31 1,989

5,75

VTCCB411 1,589 4,01 2,231 4,25 2,789 3,970 2,601 4,02 2,014

5,10

Theo bảng thấy hai chủng nghiên cứu có khả năng sinh trưởng tốt nhất ở

khoảng pH từ 6-7, giảm nhẹ pH 5 và pH 8, giảm mạnh ở pH 4. Môi trường có

pH trước và sau nuôi khác nhau rõ rệt. Sau quá trình nuôi cấy, các môi trường

67

pH cao có xu hướng giảm pH về giá trị pH axit. Trong khi đó, mật độ tế bào

cũng đạt các giá trị khác nhau và đạt giá trị cao nhất tại pH 6 (OD > 2,7) cho

cả 2 chủng. Dựa vào kết quả này, pH 6 để đề xuất là thích hợp và sử dụng trong

các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.4.4. Lựa chọn điều kiện cung cấp khí

Hai chủng vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường nuôi cấy thích hợp, pH 6,

nhiệt độ 35oC ở các điều kiện cung cấp khí khác nhau như: nuôi lắc, nuôi tĩnh,

nuôi vi hiếu khí. Nhìn vào hình 3.7 thấy ở điều kiện nuôi tĩnh mật độ tế bào của

các chủng nghiên cứu đạt giá trị cao nhất (2,656 với chủng VTCC-B-439 và

2,699 với chủng VTCC-B-411). Tuy nhiên, ở điều kiện nuôi lắc và nuôi vi hiếu

khí, mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu cũng tương đối cao có giá trị OD

> 2,4 nhưng vẫn thấp hơn điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vì vậy điều kiện nuôi tĩnh là

2.7

VTCCB439

2.65

VTCCB411

2.6

2.55

2.5

thích hợp cho 2 chủng vi khuẩn lactic.

0 0 6 D O

2.45

2.4

2.35

2.3

2.25

Nuôi lắc

Nuôi tĩnh

Nuôi vi hiếu khí

Hình 3.7. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 ở các điều kiện cung cấp khí khác nhau

3.1.4.5. Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp

Các chủng vi khuẩn lactic được nuôi tĩnh trên môi trường MT2, pH 6, ở

68

nhiệt độ 35oC với các tỷ lệ giống cấy khác nhau là 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10%.

Sau 24 h nuôi cấy, kiểm tra mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn. Kết quả được

thể hiện ở Hình 3.8. Dựa vào số liệu trên hình thấy rằng khi tăng tỷ lệ giống

cấy từ 0,5-5,0% khả năng sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu đều tăng. Với

tỷ lệ giống cấy 5,0%, các chủng có giá trị OD đạt mức cao nhất. Tuy nhiên, khi

tỷ lệ giống tăng vượt quá 5,0%, mật độ tế bào của cả 2 chủng có xu hướng

3

VTCCB439

2.5

VTCCB411

2

1.5

giảm. Do vậy, tỷ lệ giống cấy là 5,0% được chọn cho thí nghiệm tiếp theo.

0 0 6 D O

1

0.5

0

0.5

1.0

3.0

5.0

7.0

10.0

Tỷ lệ giống cấy (%)

Hình 3.8. Mức độ sinh trưởng của 2 chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 ở các tỷ lệ giống khác nhau

3.1.4.6. Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy dịch thể của môi trường MT2 với nguồn

-. Các chủng vi khuẩn được nuôi tĩnh

nitơ cao nấm men được thay thế bởi các nguồn nitơ khác nhau như: cao thịt,

-, NO3

pepton, tryptone, urea, NH4+; NO2

ở nhiệt độ 35oC trong vòng 24 h. Đánh giá mật độ tế bào của chúng khi nuôi ở

các nguồn nitơ khác nhau. Kết quả được thể hiện trên Hình 3.9. Từ kết quả ở

hình cho thấy các chủng vi khuẩn được nuôi trong nguồn nitơ hữu cơ thì có mật

độ tế bào cao hơn nguồn nitơ vô cơ. Khi không bổ sung nguồn nitơ, khả năng

69

sinh trưởng của các chủng rất kém. Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn yếu

-. Khả năng sinh trưởng thể hiện mạnh ở môi trường

-, NO3

trong nguồn nitơ NO2

chứa nguồn nitơ cao men, cao thịt và pepton. Nhưng khả năng sinh trưởng tốt

nhất ở nguồn nitơ cao men (Đc (+)) (OD của cả 2 chủng > 2,7). Vì vậy, nguồn

3

2.5

VTCCB439

VTCCB411

2

1.5

nitơ là cao nấm men được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.

0 0 6 D O

1

0.5

0

Hình 3.9. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

VTCC-B-411 trên các nguồn nitơ khác nhau

3.1.4.7. Lựa chọn nguồn carbon thích hợp

Chuẩn bị môi trường MT2 với nguồn glucose được thay thế bằng các

nguồn carbon ở các dạng khác nhau: galactose, saccharose, maltose, mannitol

và lactose. Kết quả nêu trên Hình 3.10 cho thấy khả năng sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn khi nuôi trên các nguồn carbon khác nhau rất khác nhau. Trong

đó, hai chủng nghiên cứu có xu hướng sinh trưởng tốt ở các nguồn carbon như

saccharose, lactose, glucose (Đc+). Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng tốt nhất

khi vi khuẩn được nuôi trên nguồn carbon là lactose. Vì vậy, lactose được chọn

70

là nguồn carbon thích hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.

3

VTCCB439

2.5

VTCCB411

2

1.5

0 0 6 D O

1

0.5

0

Đc(+)

Đc(-)

galactose

lactose maltose mannitol saccharose

Hình 3.10. Mức độ sinh trưởng của hai chủng nghiên cứu VTCC-B-439 và

4

VTCCB439

3.5

VTCCB411

3

2.5

2

VTCC-B-411 trên các nguồn cacbon khác nhau

0 0 6 D O

1.5

1

0.5

0

0

0.1

0.5

1

2

3

5

Tỷ lệ glutamate (%)

Hình 3.11. Mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên môi

trường có tỷ lệ glutamate khác nhau

3.1.4.8. Lựa chọn tỷ lệ glutamate thích hợp

Các chủng vi khuẩn được nuôi ở môi trường MT2 có lượng glutamate khác

nhau thay đổi trong khoảng 0-5,0% ở 35oC trong vòng 24 h. Sau đó đo OD của

các chủng vi khuẩn lactic. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.11. Dựa vào số liệu

71

trên hình cho thấy, ở các tỷ lệ glutamate từ 0-1%, mật độ tế bào của hai chủng

xấp xỉ ngang bằng nhau. Mật độ tế bào đạt giá trị cao nhất tại tỷ lệ glutamate là

1%. Tuy nhiên, khi nuôi cấy ở môi trường có tỷ lệ glutamate >1%, khả năng

sinh trưởng của các chủng giảm dần. Vì vậy, đề xuất chọn tỷ lệ glutamate 1%

bổ sung vào môi trường nuôi cấy trong các thì nghiệm tiếp theo.

3.1.5. Tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic

Các ảnh hưởng đơn yếu tố tới quá trình sinh trưởng của vi khuẩn đã được

khảo sát trong mục 3.1.4. Một số đơn yếu tố như nhiệt độ, pH môi trường và

thời gian nuôi cấy có khả năng cao có tác động tương hỗ với nhau. Vì vậy mục

đích của nghiên cứu ở mục 3.1.5 là tối ưu hóa qúa trình thông qua 3 yếu tố vừa

nêu. Các thông số khác thu được từ những thí nghiệm đã trình bày ở mục 3.1.4

được duy trì cố định: Môi trường nuôi cấy MT2, điều kiện nuôi cấy tĩnh, hàm

lượng glutamat bổ sung: 1,0%; nguồn cacbon nuôi cấy: lactose; nguồn nitơ nuôi

cấy: cao nấm men; tỷ lệ giống khởi động: 5,0% để làm môi trường lên men.

Như vậy, quá trình tối ưu hóa được khảo sát tới 3 yếu tố:

x1- thời gian nuôi cấy vi khuẩn, khoảng dao động của yếu tố này là từ 40

đến 56 h.

x2- nhiệt nuôi cấy vi khuẩn, dao động trong khoảng 30 - 40oC.

x3- pH môi trường lên men, dao động trong khoảng 5 - 8.

Chỉ tiêu cần tối ưu là sinh khối vi khuẩn tạo thành, thể hiện qua mật độ

quang OD đo ở bước sóng 600 nm (OD600).

(a) Nội dung và phương pháp nghiên cứu tối ưu hóa:

- Lập ma trận thực nghiệm trực giao cấp 1.

- Thực hiện thực nghiệm theo ma trận và xây dựng hàm hồi quy:

y = b0 + b1𝑥̃1 + b2𝑥̃2 + b3𝑥̃3

Trong đó, y: OD600 của môi trường lỏng nuôi cấy; b0: hệ số tự do; b1, b2,

b3: các hệ số.

- Kiểm định số liệu thực nghiệm, kiểm định sự có ý nghĩa của hệ số,

72

kiểm nghiệm sự thích ứng của mô hình.

- Lập ma trận để tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp Box-Willson.

- Tiến hành thực nghiệm để kiểm định kết quả tối ưu hóa.

(b) Kết quả thực nghiệm xây dựng mô hình:

Ma trận thực nghiệm là ma trận trực giao với số thí nghiệm cần thực hiện

N=23, trong đó số 2 là số mức mà mỗi yếu tố thực hiện thí nghiệm, số 3 là số

yếu tố ảnh hưởng.

Phương trình hồi quy có dạng : y = OD600 = b0 + b1𝑥̃1 + b2𝑥̃2 + b3𝑥̃3 (1).

Trong đó: OD600: là mật độ quang của môi trường, b0: hệ số tự do

𝑥̃i: (i=1÷3): biến số mã (biến số Kod) của các yếu tố ảnh hưởng.

bi (i=1÷3): là hệ số hồi quy của các biến.

+ = 56 h

+ = 40oC

Các biến ảnh hưởng có các mức như sau:

0 = 48 h, 𝑥1 0 = 35oC, 𝑥2 + = 8

0 = 6,5, 𝑥3

𝑥̅1 = 40 h, 𝑥1 𝑥̅2 = 30oC, 𝑥2

𝑥̅3 = 5, 𝑥3 Với ma trận trực giao cấp 1, mỗi yếu tố ảnh hưởng chỉ thực hiện ở mức

âm (-) và mức dương (+). Ma trận thực nghiệm bao gồm 8 thí nghiệm. Kết quả

thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả thực nghiệm theo ma trận

(mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, y là OD600)

TT

x1

x2

x3

y1

y2

y3

𝒚̅

𝟐 𝑺𝒋

+(56)

+(40)

+(8)

2,42

2,44

2,45

1

2,43

0,0002

-(40)

+(40)

+(8)

2,62

2,61

2,65

2

2,63

0,0004

+(56)

-(30)

+(8)

3,24

3,24

3,27

3

3,25

0,0003

-(40)

-(30)

+(8)

2,92

2,92

2,96

4

2,94

0,0004

+(56)

+(40)

-(5)

2,06

2,06

2,09

5

2,07

0,0003

-(40)

+(40)

-(5)

1,62

1,62

1,66

6

1,64

0,0004

+(56)

-(30)

-(5)

2,20

2,20

2,26

7

2,23

0,0005

-(40)

-(30)

-(5)

1,83

1,83

1,86

8

1,84

0,0003

2 = 0,0029

∑𝑆𝑗

73

Bước 1: Kiểm tra sự hội tụ của sai số

Mục đích của bước này là để kiểm định xem số liệu thu được ở Bảng 3.6 có

được đo cùng một độ chính xác hay không. Nếu được đo cùng một độ chính xác

như nhau, thì ta nói sai số là hội tụ, lúc đó số liệu ở Bảng 3.6 chấp nhận được.

Tiêu chuẩn để đánh giá sự hội tụ sai số của số liệu là chuẩn Cocren: GTT ≤

𝑁

GB, ở đây: GTT là chuẩn Cocren theo tính toán, GB là chuẩn Cocren tra bảng.

2 𝑆𝑗 𝑁

𝑗=1

= 0,0003 = 𝐺𝑇𝑇 = ∑ 0,0029 8

GB = 0,56. Ta thấy GB > GTT

Kết luận: Số liệu ở Bảng 3.6 được đo cùng một độ chính xác như nhau và

chấp nhận được.

Bước 2: Tính các hệ số của phương trình hồi quy

𝑁

Các hệ số được tính theo công thức:

𝑗=1

𝑁

𝑏1 =

∑ 𝑦𝑗̅ . 𝑥1𝑗̃ =

(2,43 − 2,63 + 3,25 − 2,94 + 2,07 − 1,64 + 2,23 − 1,84) 8

1 8

𝑗=1

= 0,12

= = 2,38 𝑏0 = ∑ 𝑦𝑗̅ 𝑁 19,03 8

𝑁 ∑ 𝑦𝑗̅ . 𝑥2𝑗̃ = −0,31 𝑗=1

𝑏2 = 1 8

𝑁 ∑ 𝑦𝑗̅ . 𝑥3𝑗̃ = 0,43 𝑗=1

𝑏3 = 1 8

74

Mô hình hồi quy có dạng: y = 2,38 + 0,12𝑥̃1 - 0,31𝑥̃2 + 0,43𝑥̃3 (2).

Bước 3: Kiểm tra sự có ý nghĩa của các hệ số trong mô hình và kiểm tra sự

tương thích của mô hình

Mục đích của 2 bước kiểm tra này là để đánh giá: 1- Tác động của các biến

ứng với các hệ số của nó có ý nghĩa đối với giá trị của y hay không. Nếu không

có ý nghĩa thì sự có mặt của hệ số đó trong mô hình là vô nghĩa ; 2- Mô hình tính

toán được có phản ánh đúng quy luật thay đổi của số liệu trong bảng 3.5 hay

không. Ứng với một giá trị của các yếu tố ảnh hưởng ta nhận được hai giá trị của

y : một giá trị từ số liệu thực nghiệm và một giá trị tính toán theo mô hình. Nếu

sai lệch giữa hai giá trị của y đủ bé thì mô hình xây dựng được là thích ứng.

Để đánh giá sự có ý nghĩa của các hệ số trong mô hình ta dùng chuẩn

Student, còn để đánh giá sự tương thích của mô hình, ta dùng chuẩn Fisher.

Theo phương pháp của Phạm Việt Cường & Hoàng Đình Hòa (2009), tra bảng

xác định được.

Chuẩn Student, t = 2,12

Chuẩn Fisher, FB = 3,01.

Thực hiện tính toán và so sánh ta thấy: Cả 4 hệ số của mô hình (1) đều có

nghĩa. Mô hình (2) là thích ứng.

Bước 4: Thực hiện quá trình tối ưu hóa

Mục đích của quá trình tối ưu hóa là đã tìm các giá trị thật của x1, x2, x3

sao cho giá trị của y ở hàm (2) đạt cực đại. Để giải bài toán đặt ra trong nội

dung này, phương pháp Box-Willson đã được sử dụng.

Trình tự giải bài toán bằng thực nghiệm theo Box-Willson, gồm bước là

xác định hướng chuyển dịch của các biến từ mô hình (2); chọn bước nhảy cho

các biến giữa 2 lần thí nghiệm kề nhau; và tiến hành thực nghiệm theo ma trận.

Từ bước 1 thấy rằng:

- Hệ số của 𝑥̃1 mang dấu +, điều này có nghĩa là nếu x1 tiến về cận trên thì

75

y sẽ tăng.

- Hệ số của 𝑥̃2 mang dấu -, điều này có nghĩa là nếu x2 chuyển dịch về cận

dưới thì y sẽ tăng.

- Hệ số của 𝑥̃3 mang dấu +, điều này có nghĩa nếu x3 tiến về cận trên thì y

tăng.

- Mục tiêu của bài toán là y → cực đại, vậy ta kết luận:

- Để cho y đạt cực đại thì x1 phải dịch dần lên cận trên, x2 phải chuyển dịch

về phía cận dưới, x3 chuyển dịch về phía cận trên.

Từ bước 2 chọn bước nhảy cho các biến giữa 2 lần thí nghiệm kề nhau:

x1: Chọn bước nhảy về thời gian là 1 h

x2: Chọn bước nhảy về nhiệt độ là 1oC

x3: Chọn bước nhảy về pH 0,3

Tiến hành thực nghiệm theo ma trận:

- Thí nghiệm thứ nhất, các biến đặt ở mức trung bình (mức không), cụ thể:

x1 = 48 h, x2 = 35oC, x3 = 6,5

- Các thí nghiệm tiếp theo: Các biến dịch chuyển theo hướng đã nêu trên,

với bước nhảy cũng đã được xác định. Kết quả thực nghiệm đạt được nêu ở

Bảng 3.7. Nhìn vào số liệu ở bảng nhận thấy ở điều kiện x1 = 51 h, nhiệt độ

nuôi cấy 32oC và pH 7,4 thì giá trị y đạt cao nhất là 3,29.

Bảng 3.7. Lược đồ tối ưu hóa thực nghiệm

TT 1 2 3 4 5 6 7

x1 48 49 50 51 52 53 54

y (OD600) 2,48 2,66 2,89 3,29* 2,98 2,78 2,56

x2 35 34 33 32 31 30 29

x3 6,5 6,8 7,1 7,4 7,7 8,0 8,3 Đối với chủng VTCC-B-439 cùng tiến hành nuôi cấy với điều kiện tương

tự như chủng VTCC-B-411. Kết quả xác định được điều kiện tối ưu như chủng

76

VTCC-B-411 nhưng ymax cao hơn 3,29.

Bước 5. Kiểm định lời giải tối ưu hóa bằng thực nghiệm

Tiến hành nuôi cấy lặp lại chủng VTCC-B-411 theo chế độ tối ưu ở Bảng

3.7. Dùng 4 giống chè Keo Am Tích, Phúc Tân Viên, Kim Tuyên và Trung Du

làm đối tượng nghiên cứu. Các bước sơ chế lá chè thực hiện như công nghệ truyền

thống sản xuất chè đen (Mẫu đối chứng). Bổ sung chủng giống lên men là vi khuẩn

có OD600 = 3,29 vào chè chiếm ở tỷ lệ 4% so với lượng chè thí nghiệm. Chỉ tiêu

phân tích các chỉ số: Hàm lượng GABA các mẫu chè, đánh giá cảm quan hương

vị của các sản phẩm. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Hàm lượng GABA và các chỉ số cảm quan của các mẫu

sản phẩm chè lên men (*)

Đối chứng

Mẫu thí nghiệm

T

Tổng

Tổng

Giống chè

GBA

GABA

Hương Vị

điểm

Hương Vị

điểm

T

mg/100g

mg/100g

hương,vị

hương, vị

1 Keo Am Tích

140

195

5,00 5,00 10,00

4,05 4,00 8,05

2 Phúc Vân Tiên

175

260

5,00 5,00 10,00

4,50 4,75 9,25

3 Kim Tuyên

148

255

5,00 5,00 10,00

4,25 4,50 8,75

4 Trung Du

163

4,25 4,5

205

5,00 5,00 10,00

8,75

(*) Các chỉ số cảm quan của mẫu đối chứng mặc định nhận giá đơn vị cao nhất

Từ bảng số liệu có nhận xét: 1- Khi sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để

tiến hành lên men thì tất cả 4 giống chè thực nghiệm đều có hàm lượng GABA

cao hơn mẫu đối chứng; 2- Chất lượng cảm quan các mẫu thí nghiệm thấp hơn

mẫu đối chứng; 3- Hai giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên có các chỉ số

chất lượng có thể tiệm cận được so với mẫu đối chứng.

3.1.6. Phân tích các chỉ số chất lượng một số giống chè ở Việt Nam

Mục đích của phần khảo sát này nhằm đánh giá toàn diện chất lượng 4

giống chè để từ đó đưa ra đề xuất giống chè thích hợp và hiệu quả làm nguyên

77

liệu cho sản xuất chè đen giàu GABA. Theo đó đã tiến hành phân tích thành

phần hóa học cơ bản của 4 giống chè Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên và Kim

Tuyên và Trung Du thu hoạch tại một số thời điểm trong năm (tháng 3, tháng

6, tháng 9 tương ứng với vụ chè đầu năm, giữa năm và cuối năm). Các thành

phần được phân tích gồm: độ ẩm của nguyên liệu, hàm lượng chất hòa tan, hàm

lượng tannin, hàm lượng axit amin tổng số và hàm lượng axit amin thành phần.

3.1.6.1. Độ ẩm nguyên liệu của 4 giống chè

Hàm lượng nước trong lá chè có ảnh hưởng lớn đến việc thiết lập chế độ

công nghệ trong các giai đoạn chế biến chè. Tiến hành phân tích độ ẩm nguyên

liệu của 4 giống chè theo các tháng 3, 6, 9 và độ ẩm trung bình của các tháng.

Kết quả phân tích được thể hiện qua Bảng 3.9. Kết quả cho thấy độ ẩm của

nguyên liệu của các giống chè gần như tương tự nhau, dao động trong khoảng từ

76% đến 78%, tương ứng với độ ẩm trung bình trong nguyên liệu chè Việt Nam.

3.1.6.2. Hàm lượng chất hòa tan trong nguyên liệu của 4 giống chè

Một trong những yêu cầu về nguyên liệu trong sản xuất chè lên men là có

hàm lượng chất hòa tan cao. Vì vậy, đề tài luận án đã phân tích hàm lượng chất

hòa tan trong nguyên liệu của 4 giống chè theo các tháng 3, 6, 9 và hàm lượng

chất hòa tan trung bình của các tháng. Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng

3.10 cho thấy hàm lượng chất hòa tan trong nguyên liệu của các giống có sự

khác biệt. Giống Trung du có hàm lượng cao nhất (43,15%), kế đến là Keo Am

Tích (41,98%), thấp nhất là hai giống Phúc Vân Tiên (40,61%) và Kim Tuyên

(40,70%) tương tự như nhau.

Bảng 3.9. Độ ẩm nguyên liệu các giống chè theo thời gian trong năm (%)

TT

Giống chè

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 9

Trung bình

1 Keo Am Tích

76,9

78,6

77,9

77,8

2

Phúc Vân Tiên

76,6

78,0

77,0

77,0

3 Kim Tuyên

76,0

77,8

77,0

77,0

4

Trung Du

77,0

79,0

78,0

78,0

78

Bảng 3.10. Hàm lượng chất hòa tan trong nguyên liệu của các giống chè

theo thời gian trong năm (% chất khô)

TT

Giống chè

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 9

Trung bình

1 Keo Am Tích

40,39

43,40

42,15

41,98

2

Phúc Vân Tiên

39,71

41,65

40,47

40,61

3 Kim Tuyên

39,16

41,38

41,56

40,70

4

Trung Du

42,08

43,97

43,40

43,15

3.1.6.3. Hàm lượng tanin trong nguyên liệu của 4 giống chè

Hàm lượng tanin cao cũng là một trong những yêu cầu về nguyên liệu sản

xuất chè lên men. Tiến hành phân tích hàm lượng tanin trong nguyên liệu của

4 giống chè theo các tháng 3, 6, 9 và hàm lượng tanin trung bình của các tháng.

Kết quả trình bày trong Bảng 3.11 cho thấy, hàm lượng tanin trong nguyên liệu

của các giống chè cũng rất khác nhau. Cao nhất là Trung du (31,48%), kế đến

là Keo Am Tích (28,23%), thấp nhất là 2 giống Phúc Vân Tiên (27,95%) và

Kim Tuyên (26,97%).

3.1.6.4. Hàm lượng tổng axit amin trong nguyên liệu của 4 giống chè

Hàm lượng axitamin đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành chất

lượng chè lên men sau này. Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.12. Kết

quả ở bảng cho thấy, hàm lượng axitamin tổng số trong nguyên liệu của các

giống chè là khác nhau. Cao nhất là giống Phúc Vân Tiên (2,69%), kế đến là

Kim Tuyên (2,58%), Keo Am Tích chỉ ở mức tương đối thấp (2,47%) và thấp

nhất là Trung du (2,01%).

Bảng 3.11. Hàm lượng tanin trong nguyên liệu của các giống chè

theo thời gian trong năm (% chất khô)

TT

Giống chè

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 9

Trung bình

1 Keo Am Tích

27,47

28,97

28,25

28,23

2

Phúc Vân Tiên

26,91

28,86

28,07

27,95

3 Kim Tuyên

26,30

27,12

27,48

26,97

4

Trung Du

31,02

31,84

31,57

31,48

79

3.1.6.5. Hàm lượng axit amin thành phần trong nguyên liệu 4 giống chè

Hàm lượng các axit amin thành phần trong nguyên liệu là một điều rất đáng

quan tâm, đặc biệt là hàm lượng axit glutamic. Tiến hành phân tích hàm lượng

axitamin thành phần trong nguyên liệu của 4 giống chè. Kết quả phân tích được

thể hiện ở Bảng 3.13. Kết quả cho thấy, trong nguyên liệu của tất cả 4 giống đều

có mặt tất cả 16 axit amin, tuy nhiên hàm lượng của chúng có sự khác nhau giữa

các giống. Một điều đáng chú ý là hàm lượng axit glutamic chiếm tỷ lệ khá cao

trong toàn bộ các axit amin có trong chè. Giống Kim Tuyên (0,356%), Phúc Vân

Tiên (0,324%), Keo Am Tích (0,282%) và Trung du (0,193%).

Bảng 3.12. Hàm lượng tổng axit amin trong nguyên liệu của các giống

chè theo thời gian trong năm (%)

TT

Giống chè

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 9

Trung bình

1 Keo Am Tích

2,30

2,65

2,47

2,48

2

Phúc Vân Tiên

2,45

2,72

2,69

2,90

3 Kim Tuyên

2,42

2,54

2,58

2,78

4

Trung Du

2,19

1,78

2,01

2,06

Bảng 3.13. Hàm lượng các axit amin thành phần trong nguyên liệu

thu hoạch vào tháng 6 của các giống chè (% chất khô)

TT Axit amin

Keo Am Tích Phúc Vân Tiên Kim Tuyên Trung Du

1 Alanin

0,151

0,127

0,102

0,157

2 Arginin

0,147

0,140

0,098

0,161

3 Aspatic

0,157

0,201

0,115

0,212

4 Glutamic

0,282

0,524

0,203

0,556

5 Glycin

0,143

0,134

0,134

0,157

6 Histidin

0,108

0,120

0,098

0,111

7

Izolơxin

0,148

0,146

0,137

0,155

8 Lơxin

0,177

0,186

0,168

0,193

9 Lysin

0,149

0,152

0,129

0,167

10 Methionin

0,115

0,111

0,104

0,122

11 Phenylalanin

0,147

0,171

0,126

0,160

80

TT Axit amin

Keo Am Tích Phúc Vân Tiên Kim Tuyên Trung Du

12 Prolin

0,196

0,179

0,189

0,163

13 Serin

0,123

0,122

0,143

0,108

14 Threonin

0,143

0,147

0,135

0,121

15 Tyrosin

0,133

0,140

0,152

0,114

16 Valin

0,158

0,160

0,151

0,137

2,477

2,899

2,782

2,057

Tổng

Từ các kết quả nêu trên, để so sánh hàm lượng thành phần trong nguyên

liệu của 4 giống chè được trình bày riêng trong Bảng 3.14. Từ bảng 3.14 này

dễ dàng thấy rằng hàm lượng chất tan và tanin trong nguyên liệu của 2 giống

Trung du và Keo Am Tích cao hơn Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên. Tuy nhiên

để sản xuất chè GABA, điều quan trọng nhất là cần phải lựa chọn giống chè có

hàm lượng axit amin tổng số cao và đặc biệt là hàm lượng axit glutamic cao

bởi vì khi lên men chè, dưới tác động của hệ thống enzym, axit glutamic sẽ

chuyển hóa thành GABA [70,71]. Trong nghiên cứu này, hàm lượng glutamic

và tổng axit amin càng cao thì khả năng sinh ra GABA càng cao. Xét theo khía

cạnh này thì 2 giống Kim Tuyên và Phúc Vân Tiên là có tiềm năng hơn cả.

Kết quả nêu trên phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trước đây khi họ

chỉ ra hàm lượng axit amin GABA cao hơn trong chè GABA sản xuất bằng quá

trình lên men kỵ khí từ chè có tổng lượng axit amin cao và trong sản phẩm chè

cũng duy trì được tổng axit amin cao [121,145]. Kết quả tương tự về nồng độ

axit amin cao hơn cũng được tìm thấy trong trà GABA trong công bố của Wang

và cộng sự [127]. Axit amin thiết yếu không được tổng hợp trong cơ thể con

người. Chúng cần được cung cấp thông qua thực phẩm. Các axit amin khác

nhau có các chức năng khác nhau trong cơ thể con người. Hàm lượng axit amin

tăng lên trong trà GABA sẽ cung cấp một lựa chọn tốt để sản xuất chè GABA

từ những nguyên liệu giàu axit amin.

Trên cơ sở kết quả đánh giá 5 chỉ tiêu thành phần hóa học: độ ẩm, hàm

lượng tanin, hàm lượng chất hòa tan, hàm lượng axit amin tổng số và thành

81

phần axit amin riêng biệt của 4 giống chè cho thấy 2 giống chè Kim Tuyên và

Phúc Vân Tiên đều phù hợp cho sản xuất chè GABA. Tuy nhiên hàm lượng

axit amin tổng số và hàm lượng axit amin glutamic của giống Phúc Vân Tiên

lại cao hơn giống Kim Tuyên, vì vậy giống chè Phúc Vân Tiên đã được chúng

tôi lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.14. So sánh hàm lượng thành phần trong nguyên liệu của các

giống chè (% chất khô)

Hàm lượng (% chất khô)

TT

Giống chè

Axit amin tổng Glutamic Tanin Chất hòa tan

1 Keo Am Tích

2,47

0,282

28,23

41,98

2 Phúc Vân Tiên

2,69

0,556

27,95

40,61

3 Kim Tuyên

2,58

0,524

26,97

40.70

4 Trung du

2,01

0,203

31,48

43,15

3.1.7. Tiêu chuẩn chất lượng chè nguyên liệu để sản xuất chè giàu GABA

Để sản xuất chè lên men có hàm lượng GABA cao và ổn định thì chất

lượng chè tươi nguyên liệu là yếu tố quan trọng. Vì vậy, từ những kết quả thu

được, chúng tôi đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chè tươi nguyên liệu

được sử dụng cho mục đích sản xuất chè GABA như trong Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Tiêu chuẩn chè nguyên liệu dùng cho sản xuất chè giàu GABA

STT Chỉ tiêu Đơn vị Hàm lượng

A Cảm quan

Màu sắc Xanh tự nhiên

Hình thức Một tôm 3 lá

Hương Thơm tự nhiên

B Thành phần hóa học

Hàm lượng nước % (TLT) 70 - 78

Chất hòa tan % (TLK) 39 - 41

Tanin % (TLK) 26- 28

Axit amin tổng số % (TLK) 2,45 - 2,64

82

Axit glutamic 0,50 - 0,55

3.1.8. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.1

(a) Từ bộ sưu tập gồm 263 chủng vi khuẩn lactic đã sàng lọc được 4

chủng có khả năng sinh tổng hợp gama-aminobutyric axit (GABA) cao, kí hiệu

lần lượt là: VTCC-B-439, VTCC-B-411, 66 và 67. Các đặc điểm hình thái đã

được thẩm định lại, và được định danh bằng phân tích trình tự rRNA. Nhờ đó,

chủng VTCC-B-439 được định danh là Lactobacillus plantarum; chủng VTCC-

B-411 là L. casei, hai chủng 66 và 67 là Lactobacillus brevis.

(b) Cả 4 chủng vi khuẩn này đều có khả năng tạo GABA trên lá chè tươi

bằng lên men. Hai chủng L. plantarum VTCC-B-439 và chủng L. casei VTCC-

B-411 có khả năng tạo GABA cao gần gấp 3 lần so với chủng L. brevis 66 và

L. brevis 67.

(c) Bằng thực nghiệm đơn yếu tố và phương pháp tối ưu hóa, đã xác định

được các thông số kỹ thuật thích hợp và tối ưu cho quá trình sản xuất sinh khối vi

khuẩn làm chủng giống. Theo đó, môi trường MT2 với tỷ lệ bổ sung nguồn ni tơ,

carbon và glutamate đã được chọn, đồng thời yêu cầu thời gian nuôi cấy 51 h,

nhiệt độ 32oC và pH 7,4 đã được xác định đối với chủng L. casei VTCC-B-411.

(d) Bằng phân tích các chỉ số chất lượng (độ ẩm, chất hòa tan, tanin, tổng

axit amin, GABA) của 4 giống chè ở Việt Nam (Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên,

Kim Tuyên, Trung Du) đã xác định và khuyến nghị chọn giống chè Phúc Vân

Tiên và Kim Tuyên làm nguyên liệu để sản xuất chè đen giàu GABA. Dựa vào

kết quả phân tích chất lượng, một tiêu chuẩn nguyên liệu cho sản xuất chè giàu

GABA cũng đã được đề xuất.

3.2. Tác dụng của lên men yếm khí tới hiệu quả tích lũy gaba và chất lượng

chè đen giàu GABA

3.2.1. Thăm dò khả năng tích lũy GABA do quá trình lên men yếm khí

Thí nghiệm có 2 mẫu, mẫu 1 là chè đen được chế biến theo quy trình truyền

thống: Nguyên liệu  làm héo  vò  lên men hiếu khí  sấy khô  chè

83

đen thành phẩm. Mẫu 2 được bổ sung lên men yếm khí: Nguyên liệu  làm

héo  vò  lên men yếm khí  lên men hiếu khí sấy khô  chè đen thành

phẩm. Điều kiện lên men của mẫu 1 (đối chứng): Lên men hiếu khí ở 35oC, thời

gian 90 ph, của mẫu 2 (thí nghiệm): Lên men yếm khi ở 35oC, thời gian 90 ph.

Sử dụng cả 4 giống chè: Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên, Trung Du.

Các chỉ số phân tích gồm: Hàm lượng GABA trong thành phẩm, đánh giá cảm

quan về hương, đánh giá cảm quan về vị, chỉ số phụ màu sắc nước chè. Kết quả

thực nghiệm được thể trong Bảng 3.16.

Bảng 3.16. Hàm lượng GABA và các chỉ số chất lượng của bán thành

phẩm chè đen lên men theo 2 phương án

Mẫu 1 (Đối chứng)

Mẫu 2 (Thí nghiệm)

GABA

Tổng

Tổng

TT Giống chè

nguyên liệu

Vị

điểm

GABA

Vị

điểm

mg/100g

G A B A

H ư ơ n g

H ư ơ n g

hương vị

hươngvị

1 Keo Am Tích

135 4,25 4,25

8,50

175 4,00 4,00 8,00

60

2 Phúc Vân Tiên

175 5,00 5,00 10,00

215 4,50 4,25 8,75

72

3 Kim Tuyên

173 4,75 4,75

9,50

195 4,50 4,25 8,75

73

4

Trung Du

140 4,50 4,75

9,25

170 4,00 4,20 8,20

66

Qua số liệu ở bảng thấy rằng chất lượng cảm quan về hương và vị ở mẫu

đối chứng tốt nhất, tiếp theo cùng hạng là giống chè Phúc Vân Tiên và Kim

Tuyên ở mẫu thí nghiệm. Hàm lượng GABA ở mẫu thí nghiệm cao nhất thuộc

về giống chè Phúc Vân Tiên. Căn cứ vào mục tiêu của luận án là lựa chọn

phương án lên men để có hàm lượng GABA trong chè là cao nhất, nên giống

chè Phúc Vân Tiên sẽ được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.

3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng quá trình lên men yếm khí

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men yếm khí đến hàm lượng GABA tích

lũy trong chè

Đối tượng nghiên cứu là giống chè Phúc Vân Tiên. Khoảng khảo sát nhiệt độ là 25oC đến 35 oC với các điểm mốc thí nghiệm: 25, 27, 29, 31, 33 và 35oC. Chỉ

84

tiêu chất lượng khảo sát là hàm lượng GABA tính theo mg/100 g chất khô của

chè. Kết quả thực nghiệm nêu trong Bảng 3.17. Từ bảng số liệu này cho thấy sau nhiệt độ 29oC hàm lượng GABA của mẫu thí nghiệm tăng không đáng kể, thậm chí giảm đi và không tăng nữa ở nhiệt độ 33oC đến 35oC. Điều này có

nghĩa là quá trình tạo GABA trong bán thành phẩm xảy ra mạnh nhất ở khoảng nhiệt độ từ 27oC đến 31oC.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng nhiệt độ lên men yếm khí đến hàm lượng GABA

Nhiệt độ (oC) 25 27 29 31 33 35

Hàm lượng GABA 150 165 175 179 176 176 (mg/100g CK)

3.3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến hàm lượng GABA

tích lũy trong chè

Sau khoảng nhiệt độ 29oC hàm lượng GABA có dấu hiệu tăng chậm lại,

để chọn thời gian có hàm lượng GABA tăng nhanh và cao nhất, cố định nhiệt độ lên men ở 29oC, còn thời gian lên men được thực hiện ở các mốc: 5, 7, 9,

11, 13 và 15 h. Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 3.18. Từ kết quả

của bảng thấy hàm lượng GABA tăng sau 5 h lên men và đạt cao nhất ở thời

gian 11 h, sau đó hàm lượng GABA không tăng mà giảm đi sau 13 h đến 15 h

lên men. Như vậy, thời gian lên men tạo hàm lượng GABA cao nhất là khoảng

thời gian từ 9 h đến 13 h.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến hàm lượng

GABA trong chè

Thời gian lên men (h) 5 7 9 11 13 15

Hàm lượng GABA 120 145 170 180 177 176 (mg/100g CK)

Lên men trong sản xuất chè đen là công đoạn gần như quyết định đến chất

lượng cảm quan (hương, vị, màu sắc nước chè) của sản phẩm sau này. Đây là

giai đoạn xúc tác của các enzym có sẵn trong chè để chuyển hóa các chất trong

lá chè, tạo ra những dẫn xuất mới, mang đặc trưng của từng loại sản phẩm.

85

Theo ý kiến của nhiều chuyên gia thì chất lượng của quá trình lên men phụ

thuộc rất nhiều vào các yếu tố: Nhiệt độ lên men, thời gian lên men và độ ẩm

tương đối của không khí tại khu vực lên men chè.

Trong quá trình lên men, nhóm hợp chất thay đổi nhiều nhất là polyphenol.

Từ những hợp chất này tạo ra những dẫn xuất ảnh hưởng đến màu sắc nước pha

và vị của chè như theaflavin (TFs) và thearubigins (TRs).

3.2.3. Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí

Các mục tiêu cần tối ưu, gồm:

𝑦1: Hàm lượng GABA trong chè đen bán thành phẩm mẫu thí nghiệm

(mg/100g CK) tiến tới đạt cao nhất.

𝑦2: Điểm cảm quan về mùi của chè đen bán thành phẩm mẫu thí nghiệm

(không có thứ nguyên) tiến tới lớn nhất (chỉ số này của mẫu đối chứng mặc

định công nhận 5,0 điểm).

𝑦3: Điểm cảm quan về vị chè đen bán thành phẩm mẫu thí nghiệm (không

có thứ nguyên) tiến tới cao nhất (chỉ số này của mẫu đối chứng mặc định công

nhận 5,0 điểm).

Các yếu tố ảnh hưởng:

𝑥1 : Nhiệt độ lên men từ 27oC đến 31oC 𝑥2 : Thời gian lên men từ 9 h đến 13 h Các mốc thí nghiệm của x1:

𝑥̅1 = 27oC

𝑜 = 29oC 𝑥1 𝑜 = 11 h 𝑥2

+ = 31oC 𝑥1 + = 13 h 𝑥2

𝑥̅2 = 9 h

Số thí nghiệm cần thực hiện N = 32 = 9

Tiến hành thực nghiệm theo ma trận, kết quả phân tích được trình bày tại

Bảng 3.19. Từ số liệu ở Bảng 3.19, tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp hàm

mong đợi [2].

Hàm mong đợi của các mục tiêu có dạng d = exp [-exp (-y’)], trong đó y’ là

86

giá trị của chỉ tiêu tối ưu thu được bằng thực nghiệm ở từng thí nghiệm trong ma

trận thực nghiệm, bo, b1 là 2 hệ số cần phải tính toán. Việc tính toán bo, b1 và hàm

mục tiêu d, thực hiện theo phương pháp trong tài liệu đã dẫn, sẽ thu được kết quả

ở Bảng 3.20 (chọn dmax = 0,8 và dmin = 0,2). Kết quả tính toán ở bảng cho thấy tại

thí nghiệm số 4, kỳ vọng của 3 mục tiêu đạt cao nhất. Điều kiện thí nghiệm ở mẫu

số 4 chính là lân cận của vùng tối ưu. Khi giá trị các biến lấy ở vùng lân cận đó thì

tổng kỳ vọng của đồng thời của 3 mục tiêu đạt trị số lớn nhất.

Bảng 3.19. Hàm lượng GABA và các chỉ số chất lượng cảm quan của các

mẫu thí nghiệm theo ma trận

TT 𝒙̃2,h 𝒙̃1,oC 𝒚𝟏 𝒚𝟐 𝒚𝟑

179 4,75 4,50 1 𝑥̅2(9) 𝑥̅1(27)

183 4,75 4,50 2 𝑥̅1(27)

𝑜(11) 𝑥2 +(13) 𝑥2

189 4,5 4,25 3 𝑥̅1(27)

202 4,5 4,75 4 𝑥̅2(9)

200 4,5 4,5 5

192 4,25 4,5 6

𝑜(11) 𝑥2 +(13) 𝑥2 𝑥̅2(9)

175 4,75 4,5 7

4,75 4,5 180 8

𝑚𝑖𝑛

𝑚𝑎𝑥

𝑚𝑖𝑛

𝑚𝑎𝑥

𝑚𝑎𝑥

𝑜(11) 𝑥2 +(13) 𝑥2 = 179 mg/100g; 𝑦2

= 4,75; 𝑦2

= 4,25; 𝑦3

𝑜(29) 𝑥1 𝑜(29) 𝑥1 𝑜(29) 𝑥1 +(31) 𝑥1 +(31) 𝑥1 +(31) 𝑥1 = 202 mg/100g; 𝑦1

𝑚𝑖𝑛

= 4,25.

4,25 4,5 198 9

𝑦1 = 4,75; 𝑦3

Bảng 3.20. Kết quả tính toán các hàm mong đợi

𝟑 √𝒅𝟏𝒅𝟐𝒅𝟑

TT Thí nghiệm d1 d2 d3 d1d2d3

Số 1 15,66 0,76 0,60 7,14 1

Số 2 15,98 0,76 0,60 7,28 2

Số 3 15,46 0,60 0,43 4,25 3

Số 4 15,50 0,60 0,76 7,98 1,97 4

87

Số 5 15,34 0,60 0,60 6,24 5

𝟑 √𝒅𝟏𝒅𝟐𝒅𝟑

TT Thí nghiệm d1 d2 d3 d1d2d3

6 Số 6 15,70 0,43 0,60 4,31

7 Số 7 15,34 0,76 0,60 6,99

8 Số 8 15,74 0,76 0,60 7,17

9 Số 9 15,18 0,43 0,60 4,43

Kiểm định lời giải của quá trình tối ưu bằng thực nghiệm:

Kết quả tính toán trung bình nhân với kỳ vọng của 3 mục tiêu sẽ nhận được

trả lời là thí nghiệm số 4 có D lớn nhất. Ứng với thí nghiệm này có: 𝑥1 = 29oC,

𝑥2 = 9 h. Để kiểm định lời giải có độ tin cậy chấp nhận được hay không, đã tiến

+= 30oC

𝑥̅1 = 28oC,

hành thực nghiệm với các giá trị lân cận của 𝑥1 và 𝑥2 , cụ thể tiến hành thí nghiệm với các mốc của các biến như sau:

𝑥1

+= 10 h

𝑜 = 29oC, 𝑜 = 9 h,

𝑥̅2 = 8 h,

𝑥1

𝑥2

𝑥2

Tổng số có 9 thí nghiệm, chỉ xét đến mục tiêu 𝑦1 là hàm lượng GABA

của chè đen bán thành phẩm. Kết quả thực nghiệm được nêu trong Bảng 3.21.

Giá trị hàm mục tiêu 𝑦1 ở ma trận xuất phát (bảng 3.19) là 202 mg/100g,

ta có sai số giữa thí nghiệm kiểm định với lời giải tối ưu là 1 mg/100g. Với sai

lệch này ta có thể tạm thời khẳng định: Vùng tối ưu của các biến ảnh hưởng

đến chất lượng cảm quan và hàm lượng GABA trong chè đen khi cải tiến quá

trình lên men (thêm lên men yếm khí) là 𝑥1 = 29oC ± 1oC, 𝑥2 = 9 h ± 1 h. Bảng 3.21. Hàm lượng GABA của 9 mẫu thí nghiệm kiểm định

TT 𝒙̅1 𝒙̅2 Hạm lượng GABA 𝒚𝟏 (mg/100g)

1 - (28) - (8) 203

2 - (28) 0 (9) 203

3 - (28) + (10) 202

4 0 (29) - (8) 203

88

5 0 (29) 0 (9) 200

TT 𝒙̅1 𝒙̅2 Hạm lượng GABA 𝒚𝟏 (mg/100g)

+ (10) 6 0 (29) 201

- (8) 7 + (30) 200

0 (9) 8 + (30) 200

∑ = 1811

+ (10) 9 + (30) 199

𝑦̅1 = 1811/9 ≈ 201,2

3.2.4. So sánh chất lượng của chè đen lên men yếm khí với chè đen được

sản xuất theo quy trình truyền thống

Mục đích của khảo sát này là để so sánh chất lượng của 2 sản phẩm chè

đen. Sản phẩm theo công nghệ sản xuất chè đen truyền thống ở nước ta (chỉ lên

men hiếu khí) và sản phẩm chè đen có bổ sung quá trình lên men yếm khí, sau

đó mới tiến hành lên men hiếu khí. Thực nghiệm nhằm rút ra kết luận việc cải

tiến quy trình công nghệ sản xuất chè đen truyền thống hiện nay nếu cải tiến

bằng cách tiến hành lên men yếm khí trước lúc tiến hành lên men hiếu khí thì

sản phẩm tạo ra có gì ưu việt hơn không.

Thực nghiệm được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1 nêu ở phần phương

pháp. Điều kiện lên men hiếu khí theo chế độ thời gian 90 ph, nhiệt độ 25oC,

lên men yếm khí với mẫu thí nghiệm theo chế độ đã tối ưu hóa: nhiệt độ

29oC trong 8 h. Các mẫu chè được đánh giá qua 3 chỉ tiêu: hàm lượng GABA

(mg/100g chè), điểm cảm quan về hương, điểm cảm quan về vị. Các chỉ số

phụ để đánh giá khi cần thiết như màu nước, ngoại hình. Cường độ màu của

nước chè được chuẩn bằng dung dịch I2 0,1N. Đơn vị đo là số ml I2 0,1N/100

89

ml nước cất.

Bảng 3.22. Các chỉ tiêu chất lượng của 2 mẫu chè lên men và kiểm chứng

Mẫu kiểm chứng Mẫu thí nghiệm

Mùi

Thơm dịu đặc trưng

Thơm dịu

5,0

4,75

Vị

Êm, có hậu vị

Êm, hậu vị nhẹ

5,0

4,50

0,7 ml I2

Màu sắc

5,0

4,75

0,5 ml I2 0,1N/100ml

0,1N/100ml

Nâu đen nhạt,

Nâu đen đậm

Ngoại hình

5,0

4,50

xoắn chặt, có tuyết

xoắn lỏng

Tổng điểm

20,0

18,50

GABA (mg/100g)

75

203

Mô tả Điểm Mô tả Điểm

Kết quả thực nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình và trình bày trong

Bảng 3.22. Qua số liệu trong bảng có thể thấy rằng việc bổ sung công đoạn lên

men yếm khí trước khi tiến hành lên men hiếu khí đã làm tăng hàm lượng

GABA trong chè đen lên gấp gần 3 lần mẫu đối chứng. Hàm lượng GABA 203

mg/100g chè của mẫu thí nghiệm có thể được xem là giới hạn cao nhất có thể

đạt được của chỉ tiêu này. Tuy nhiên về các mặt cảm quan, mẫu thí nghiệm vẫn

có thể tiệm cận được với mẫu kiểm chứng.

Điểm cảm quan của mẫu thí nghiệm sai lệch với mẫu kiểm chứng không nhiều

nhưng xét về mục tiêu cần đạt của đề tài thì việc bổ sung giai đoạn lên men yếm khí

là một giải pháp có hiệu quả. Phương án công nghệ này sẽ được đề cập tiếp ở giai

đoạn sau và có thể sẽ được triển khai ở quy mô lớn hơn phòng thí nghiệm.

3.2.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.2

(a) Hàm lượng GABA của 4 mẫu chè đen thành phẩm có lên men yếm khí

đều cao hơn so mức GABA trong chè đen không lên men yếm khí, và cao hơn

GABA trong lá chè nguyên liêu trước khi lên men.

(b) Chè giống Phúc Vân Tiên có hàm lượng cao nhất trong nguyên liệu

90

(72 mg/100g), trong chè đen truyền thống (175 mg/100g) và trong sản phẩm

lên men yếm khí (215 mg/100g). Chất lượng cảm quan của chè đen thành phẩm

từ giống chè này là tương đương với chè đen không lên men yếm khí cùng một

nguyên liệu.

(c) Khảo sát đơn yêu tố và tối ưu hóa đa yếu tố cho thấy vùng tối ưu của

các biến ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan và hàm lượng GABA trong chè

đen thành phẩm theo phương pháp lên men yếm khí là nhiệt độ 29oC ± 1oC và

thời gian ủ lên men là 9 h ± 1.

(d) Hàm lượng GABA và tính chất cảm quan của chè đen giàu GABA sản

xuất từ nguyên liệu chè Phúc Vân Tiên bằng lên men yếm khí với 2 thông số

lên men đã tối ưu hóa đã cho kết quả kiểm định phù hợp. Cụ thể, hàm lượng

GABA đạt mức 203 mg/100g và tổng điểm cảm quan 18,5, trong khi chè đen

sản xuất theo phương pháp truyền thống có tổng điểm cảm quan 20 nhưng hàm

lượng GABA chỉ là 75 mg/100g.

3.3. Tác dụng của lên men yếm khí kết hợp lên men bằng vi khuẩn lactic

tới hiệu quả tích lũy gaba và chất lượng chè đen giàu GABA

3.3.1. Xác định khoảng thay đổi có ý nghĩa công nghệ của các yếu tố ảnh

hưởng đến lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Quá trình lên men yếm khí với vi khuẩn lactic được đánh giá là tốt nếu đạt

được các điều kiện: 1- Hàm lượng GABA tạo ra trong chè đen sản phẩm cao

hơn các loại chè đen đang sản xuất tại Việt Nam; 2- Các chỉ tiêu cảm quan của

sản phẩm như hương vị, màu sắc của nước chè, hình thái bên ngoài của sản

phẩm nếu đạt được tương đương thì tốt hoặc ít nhất cũng có khả năng tiệm cận

được với các loại chè đen đang lưu hành ở thị trường Việt Nam.

Căn cứ vào mục tiêu thứ nhất đặt ra như trên, luận án đã lựa chọn các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn

lactic bao gồm: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm vi khuẩn, nhiệt độ lên men,

thời gian lên men và độ ẩm của chè vò.

Nhiệm vụ đặt ra ở nội dung nghiên cứu này là tìm giải pháp để giải bài toán đa

91

mục tiêu, trong đó ưu tiên số một là hàm lượng GABA trong chè với 4 yếu tố ảnh

hưởng như đã xác định ở trên. Không thể một lúc giải quyết ngay được bài toán đa

mục tiêu, đa yếu tố. Ở đây sẽ tiến hành nghiên cứu qua 8 bước như sau:

Bước 1: Tìm khoảng xác định có ý nghĩa công nghệ của các yếu tố ảnh

hưởng.

Bước 2: Sơ bộ tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men

yếm khí. Hàm mục tiêu ở giai đoạn này là hàm lượng GABA trong chè bán

thành phẩm cần đạt cực đại.

Bước 3: Tiến hành thực nghiệm theo điều kiện tối ưu đã xác định ở bước

2. Đánh giá toàn diện theo 3 mục tiêu: Hàm lượng GABA trong chè đen bán

thành phẩm (𝑦1, mg/100g chè), điểm cảm quan về hương của chè đen bán thành

phẩm (𝑦2 không có thứ nguyên) và điểm cảm quan về vị của chè đen bán thành

phẩm (𝑦3 không có thứ nguyên).

Bước 4: Thực hiện thí nghiệm với mẫu đối chứng (chỉ lên men yếm khí,

không có chế phẩm vi khuẩn lactic). Đánh giá tổng thể và so sánh các chỉ tiêu

chất lượng của mẫu này với mẫu thí nghiệm ở bước 3.

Bước 5: Điều chỉnh các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đã áp dụng

ở bước 3 để tìm giải pháp nâng cân đối về quyền lợi của cả 3 mục tiêu. Nghĩa

là tìm ra một chế độ công nghệ, mà theo đó không có một chỉ tiêu chất lượng

nào của mẫu thí nghiệm đạt cực đại hay cực tiểu, mà chỉ nhận những giá trị mà

xét một cách tổng thể thì có thể đạt được gần mẫu đối chứng mà người sử dụng

có thể chấp nhận được.

Bước 6: Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí bằng chế phẩm vi khuẩn

lactic khi 3 chỉ tiêu tối ưu của mẫu thí nghiệm bị chặn (𝑦1 bị chặn dưới, 𝑦2và

𝑦3 bị chặn trên).

Bước 7: Xây dựng quy trình công nghệ lên men yếm khí bằng các chế

phẩm dạng khô của vi khuẩn lactic.

Bước 8: Nghiên cứu sự biến đổi chất lượng cảm quan của chè giàu GABA

92

trong thời gian bảo quản.

3.3.1.1. Ảnh hưởng của lượng sinh khối giống khởi động

Vi khuẩn lactic được nhân sinh trong môi trường MT2 với các yếu tố tối

ưu đã xác định. Môi trường nuôi có OD600 = 2,6 ± 0,1 được sử dụng làm tác

nhân lên men. Tỷ lệ cấy giống từng thí nghiệm được ấn định: 2, 4, 6, 8 và 10

g/100g chè thí nghiệm, nhiệt độ lên men 35oC, thời gian lên men 12 h. Mỗi mẫu

lấy 0,5 kg chè vò, trộn đều với dịch giống vi khuẩn lactic, cho vào túi zip và

hút hết không khí bên trong rồi tiến hành ủ. Sau 12 h lên men, chè được sấy

khô đến độ ẩm W = 5%. Tiến hành định lượng GABA trong các mẫu. Kết quả

được thể hiện trên Hình 3.12. Nhìn vào hình có thể thấy rằng khoảng thay đổi

có ý nghĩa của yếu tố này là từ 4% đến 8%. Tuy nhiên lượng vi sinh vật ban

đầu ảnh hưởng mạnh đến hương và vị của chè, với mục tiêu của quá trình tối

ưu hoá lần này là tìm điều kiện thích hợp để làm tăng giá trị cảm quan của chè

và chấp nhận hàm lượng GABA có thể bị giảm xuống ít nhất nhưng tổng lượng

của chúng phải vượt qua 203mg/100g vì vậy chúng tôi lựa chọn chuyển khoảng

xác định tỷ lệ giống và quyết định lựa chọn mức 2%-6%. Điều này đồng nghĩa

với việc khi lượng chế phẩm tăng lên thì hàm lượng GABA tăng nhưng giá trị

cảm quan của chè giảm, vì vậy lựa chọn phương án giảm lượng chế phẩm để

0.8

0.73

0.7

0.6

tăng tính cảm quan của chè.

) g 0 0 1 / g m

(

0.5

0.41

0.4

0.33

0.28

0.3

A B A G g n ợ ư

l

0.2

0.12

m à H

0.1

0

2

4

6

8

10

Tỷ lệ giống (%)

Hình 3.12. Hàm lượng GABA ở chè lên men bởi vi khuẩn lactic

93

với các tỷ lệ giống khác nhau

3.3.1.2. Lựa chọn độ ẩm lên men thích hợp

Dịch lỏng giống (canh trường) Lactobacillus VTCC-B-411 được bổ sung

vào trong các túi chè (10% thể tích giống), trộn đều và hút hết khí bên trong túi

ủ ở 35oC trong 12 h lên men yếm khí. Sau đó lấy chè trong mỗi túi đem đi sấy

khô, rồi chiết với 10 ml nước để lắc ở 35oC trong 2 h. Đem dịch chiết định

lượng GAB bằng phương pháp quang phổ. Kết quả được nêu ở Hình 3.13. Từ

kết quả cho thấy, hàm lượng GABA trên chè tăng lên từ 0,3 đến 0,8mg/100g

khi độ ẩm chè lên men thay đổi từ 50% đến 70%. Khoảng có ý nghĩa công nghệ

0.9

0.78

0.8

0.75

là 55% đến 70%.

) l

0.7

m / g m

(

0.6

0.53

0.5

0.48

0.5

0.4

0.33

A B A G g n ợ ư

l

0.3

m à H

0.2

0.1

0

50

55

60

65

70

75

Độ ẩm (%)

Hình 3.13. Hàm lượng GABA ở chè lên men bởi vi khuẩn lactic

với độ ẩm lên men khác nhau

3.3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men và nhiệt độ lên men

Chè sau khi được làm héo thời gian từ 7 đến 8 h, được vò 2 lần với thời

gian vò 30 ph, bổ sung giống vi sinh vật, tiến hành lên men yếm khí trong thời

gian từ 0 h đến 12 h, nhiệt độ từ 15oC đến 35oC. Cứ sau mỗi 2 h mẫu chè được

tiếp tục lên men hiếu khí trong thời gian 90 ph, sấy khô tại nhiệt độ từ 100oC-

94

105oC. Kết quả nghiên cứu đã được xử lý thống kê và được trình bày trong

Bảng 3.22. Từ những số liệu trong bảng thấy rằng khoảng thay đổi có ý nghĩa

công nghệ của yếu tố nhiệt độ lên men là từ 25 đến 35oC, khoảng thay đổi của

yếu tố thời gian lên men là 6 đến 12 h.

Từ kết quả của những thí nghiệm ở phần trên, có thể có một số ghi nhận:

1- Với lượng giống khởi động 6%, hàm lượng GABA trong chè đạt cao nhất

(gần 0,8 mg/100g); 2- Ở nhiệt độ lên men 25oC, thời gian lên men 8-10 h thì

hàm lượng GABA trong chè đạt được mức cao nhất là trên 275 mg/100g.

Đây là những số liệu ban đầu làm cơ sở cho tối ưu hóa quá trình lên men

yếm khí với chế phẩm vi khuẩn lactic.

Bảng 3.23. Hàm lượng GABA trong chè đen giống Phúc Vân Tiên lên

men ở những thời gian và nhiệt độ khác nhau

Nhiệt độ lên men (oC)

Thời

15 h

25 h

35 h

gian

TT

lên

Kí hiệu

GABA

Kí hiệu

GABA

Kí hiệu

GABA

men (h)

mẫu

mg/100g

mẫu

mg/100g

mẫu

mg/100g

1

0

PVT.0.15.CĐ

37,7

PVT 0.25.CĐ

37,7

PVT 0.35.CĐ

37,7

2

2

PVT 2.15.CĐ 143,4 PVT 2.25.CĐ

188,7

PVT 2.35.CĐ

163,2

3

4

PVT 4.15.CĐ 159,1 PVT 4.25.CĐ

219,3

PVT 4.35.CĐ

198,9

4

6

PVT 6.15.CĐ 179,5 PVT 6.25.CĐ

239,7

PVT 6.35.CĐ

219,3

5

8

PVT 8.15.CĐ 195,3 PVT 8.25.CĐ

275,4

PVT 8.35.CĐ

229,5

6

10

PVT.10.15.CĐ 194,8 PVT.10.25.CĐ 275,2 PVT.10.35.CĐ 224,2

7

12

PVT 12.15.CĐ 192,2 PVT 12.25.CĐ 274,4 PVT 12.35.CĐ 228,7

Ghi chú: Ý nghĩa của kí hiệu mẫu. Thí dụ: PVT. 2.15.CĐ có nghĩa là giống chè Phúc Vân Tiên, túi chè đã lên men 2 h ở nhiệt độ 15oC, sản phẩm là chè đen.

3.3.2. Tối ưu hóa quá trình lên men yếm khí kết hợp lên men lactic

Từ những thí nghiệm ở mục 3.3.1 thấy rằng có thể hạn chế khoảng thay

đổi có ý nghĩa của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men yếm khí có sự

tham gia của lên men bằng chế phẩm vi khuẩn lactic như sau:

- Lượng giống khởi động, 𝑥1 Є [2 - 6%] so với khối lượng chè;

95

- Thủy phần của chè vò, 𝑥2 Є [55 - 70%];

- Nhiệt độ lên men, 𝑥3 Є [25 - 35oC]; - Thời gian lên men, 𝑥4 Є [8 - 12 h].

𝒚

𝒙̃1

𝒙̃2

𝒙̃3

Bảng 3.24. Hàm lượng GABA (mg/100g chè) theo ma trận khuyết 1/2

TT

𝒙̃4 = 𝒙𝟏𝒙𝟑

mg/100g

1

+ (8)

+ (70)

+ (35)

+ (12)

268

2

- (4)

+ (70)

+ (35)

- (8)

269

3

+ (8)

- (55)

+ (35)

+ (12)

265

4

- (4)

- (55)

+ (35)

- (8)

264

5

+ (8)

+ (70)

- (25)

- (8)

267

6

- (4)

+ (70)

- (25)

+ (12)

274

7

+ (8)

- (55)

- (25)

- (8)

263

8

- (4)

- (55)

- (25)

+ (12)

267

Mục đích của mục nghiên cứu này là tìm các giá trị thích hợp của

𝑥1, 𝑥2, 𝑥3 và 𝑥4 sao cho hàm lượng GABA trong chè bán thành phẩm

𝑦 (mg/100g chè) đạt cực đại. Để giải quyết vấn đề này sẽ sử dụng phương

pháp tối ưu hóa Box - Willson với ma trận thực nghiệm khuyết 50%. Số thí

nghiệm của ma trận N = 2n-1 (n là số yếu tố ảnh hưởng, trong trường hợp này là

4). Vậy số thí nghiệm cần thực hiện là N = 24-1 = 8. Trong trường hợp này dấu

của 𝑥̃4 có thể lấy theo các tổ hợp dấu của 𝑥̃1𝑥̃2 hoặc 𝑥̃1𝑥̃3 hoặc 𝑥̃2𝑥̃3. Ma trận sử

dụng ở đây dấu của 𝑥̃4 = 𝑥̃1𝑥̃3. Kết quả thực nghiệm theo ma trận được trình

bày ở Bảng 3.24.

Quá trình tính toán và kiểm tra số liệu được thực hiện theo trình tự đã giới thiệu

ở mục (3.1.3.9). Kết quả tính toán đã xác định được phương trình hồi quy như sau:

𝑦 = 267 - 1,5𝑥̃1 + 2,1𝑥̃2 - 0,8𝑥̃3 + 1,2𝑥̃4. Mô hình nay cho biết nếu các biến thực

nghiệm ở mức 0 (mức trung bình) thì 𝑥̃i = 0, do đó 𝑦 = 267 mg/100g chè. Kể từ mức

trung bình, khi 𝑥1 tiến về cận dưới thì 𝑦 tăng, nếu tiến về cận trên thì 𝑦 giảm. Các

biến số khác, cũng có thể căn cứ vào dấu của hệ số để xác định được hướng chuyển

96

dịch của chúng theo yêu cầu của hàm mục tiêu 𝑦 (max hay min).

Sau khi kiểm tra theo các chuẩn Cocren, Student và Fisher, thấy rằng số

liệu ở Bảng 3.24 được đo cùng một độ chính xác như nhau (ngưỡng sai số α =

0,05; P = 0,95). Các hệ số của phương trình hồi quy đều có nghĩa và mô hình

tìm được thích ứng với bảng số liệu 3.24.

Xác định bước nhảy của các biến:

- Bước nhảy của 𝑥1 = 0,5% - Bước nhảy của 𝑥2 = 1,5 - 2% - Bước nhảy của 𝑥3 = 1oC - Bước nhảy của 𝑥4 = 30 ph

Thực hiện quá trình tối ưu hóa

Thí nghiệm đầu tiên, các yếu tố đặt ở mức trung bình (mức không). Các

thí nghiệm tiếp theo, các yếu tố chuyển dịch theo hướng và bước nhảy đã xác

định ở trên. Kết quả thực nghiệm trình bày ở Bảng 3.25. Trên bảng này giá trị

cực đại của 𝑦 nhận được ở thí nghiệm thứ 4, ứng với các điều kiện của các yếu

tố ảnh hưởng là: Tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5% so với lượng mẫu; Độ ẩm chè vò 68% (lấy tròn số); Nhiệt độ lên men: 27oC; Thời gian lên men: 11,5 h.

Bảng 3.25. Kết quả thực nghiệm theo ma trận tối ưu hóa

𝒚 (mg/100g chè)

(Phương pháp độ dốc)

TT

𝒙𝟏 (%) 4

𝒙𝟐(%) 62,5

𝒙𝟑 (oC) 30

𝒙𝟒 (h) 10

1

265

2

3,5

64

29

10,5

268

3

3,0

65,5

28

11

273

4

2,5

68

27

11,5

275

5

2,0

69,5

26

12

272

6

1,5

71

25

12,5

269

3.3.3. So sánh chất lượng chè đen bán thành phẩm từ 2 phương án lên men

yếm khí không và có sử dụng chế phẩm vi khuẩn

Từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.3.2 nêu trên, nhận được thông tin về điều

kiện của các yếu tố ảnh hưởng mà tại những vùng lân cận của chúng, nhận được

97

giá trị gần tối ưu của sản phẩm chè đen. Hàm lượng GABA trong trường hợp

này đã đạt đến giá trị gần tối ưu. Như vậy, mục tiêu quan trọng nhất của đề tài

luận án đã đạt được. Tuy nhiên chè thành phẩm ngoài hàm lượng GABA thì

những chỉ tiêu chất lượng cảm quan (hương, vị, cường độ màu của nước chè,

v.v) cũng là những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tổng thể về kết quả một giải

pháp công nghệ.

Mục đích nghiên cứu ở mục này là bằng thực nghiệm để đánh giá bán thành

phẩm của 2 giải pháp lên men, tổng thể trên các chỉ tiêu chất lượng để từng bước

tiếp theo hoàn thiện giải pháp cải tiến ở công đoạn lên men chè đen. Để đạt được

mục đích này, tiến hành thực nghiệm 2 mẫu song song: Mẫu đối chứng là chè

lên men yếm khí ở điều kiện tối ưu (theo điều kiện ở mục 3.2.2 và 3.2.3), lên

men hiếu khí ở 90 ph, ở 25oC và mẫu thí nghiệm là chè lên men yếm khí có bổ

sung chế phẩm vi khuẩn lactic ở điều kiện tối ưu (ở mục 3.3.2), lên men hiếu

khí giống như mẫu đối chứng.

Kết quả ở mục 3.2.2 ta nhận được hàm lượng GABA của mẫu đối chứng đạt

cực đại là 203 mg/100g chè, còn thực nghiệm ở mục 3.3.2 ta nhận được hàm lượng

GABA của mẫu thí nghiệm cực đại 275 mg/100g chè. Để bảo đảm tính ổn định

của phương pháp, ở đây sẽ lặp lại thí nghiệm cho cả 2 mẫu. Phân tích các chỉ

số cảm quan, kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.26.

Bảng 3.26. Các chỉ số cảm quan của 2 mẫu chè có chế độ lên men yếm khí

có và không sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Chỉ tiêu

Mẫu đối chứng

Mẫu thí nghiệm

(không sử dụng vi khuẩn lactic)

(Có sử dụng vi khuẩn lactic)

cảm quan

Mô tả

Điểm

Mô tả

Điểm

Mùi

Thơm đặc trưng, dễ chịu

4,75 Thơm nhẹ, hơi khé

4,25

Vị

Chát dịu, có hậu vị rõ

4,75 Chát nhẹ, có hậu vị nhẹ

4,25

4,25

4,00

Màu nước 0,6 ml I2 0,1N/100ml

0,7 ml I2 0,1N/100ml

Ngoại hình Nâu đen, xoắn chặt

4,25 Nâu đen, xoắn

3,75

Tổng điểm

18,0

16,25

GABA

203 mg/100g chè

275 mg/100g chè

98

Từ số liệu ở bảng 3.26 nhận thấy rõ một xu thế là trong điều kiện mà

GABA được tạo ra nhiều thì chất lượng cảm quan của chè đen giảm. Để nâng

cao chất lượng cảm quan của chè đen thì cần phải tìm một chế độ lên men yếm

khí phù hợp sao cho lượng GABA trong sản phẩm cao nhưng vẫn đảm bảo chất

lượng cảm quan tăng lên.

Nhìn vào mô hình hồi quy của hàm lượng GABA trong chè khi tiến hành

tối ưu hóa (mục 3.3.2) có thể rút ra nhận xét:

- Để cho hàm lượng GABA giảm xuống thì cần gia tăng giới hạn của lượng

giống vi khuẩn khởi động, gia tăng giới hạn trên của nhiệt độ lên men.

- Để cho hàm lượng GABA giảm thì giảm giới hạn trên của thủy phần

trong chè và giảm giới hạn trên của thời gian lên men.

Từ nhận xét trên đây cần thiết tìm phương án thí nghiệm để nâng cao chất

lượng tổng thể của chè đen.

3.3.4. Tối ưu hóa lên men yếm khí chè đen bằng phương pháp thang điểm

có sử dụng hệ số quan trọng cho các chỉ tiêu chất lượng

Các kết quả nghiên cứu trước đây (Nguyễn Việt Tấn, 2021) cho biết ở điều

kiện nhiệt độ lên men 25oC, thời gian lên men yếm khí 8 h thì hàm lượng GABA

trong mẫu thí nghiệm đạt đến 275 mg/100g, trong khi chỉ số này ở mẫu đối

chứng chỉ là 75 mg/100g, và ở mẫu số có lên men yếm khí nhưng không sử

dụng chế phẩm vi khuẩn, là 135 mg/100g. Mẫu đầu tiên có hàm lượng GABA

cao nhất, nhưng các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm lại thấp hơn so với hai

mẫu đối chứng.

Mục đích nghiên cứu trong phần này là khảo sát quá trình lên men chè đen

với 3 yếu tố ảnh hưởng là x1 (lượng giống vi khuẩn động), x2 (nhiệt độ lên men)

và x3 (thời gian lên men). Mục tiêu của nghiên cứu là xác định được các giá trị

x1, x2 và x3. Theo đó, hàm lượng GABA trong sản phẩm cần đạt cao hơn 203

99

mg/100g, còn các chỉ tiêu chất lượng cảm quan tiệm cận đến 4,75 (điểm). Các

con số 203 mg/100g và 4,75 điểm là các chỉ tiêu chất lượng của mẫu đối chứng

số 2 (có lên men yếm khí nhưng không sử dụng chế phẩm vi sinh vật).

3.3.4.1. Nội dung tối ưu hóa

Để đạt được mục đích và mục tiêu của nhiệm vụ đề ra, quá trình tối ưu hóa

sẽ thực hiện qua 3 bước như sau:

Bước 1 - Xác định các điều kiện để lượng GABA >203 mg/100g, gồm (a)

Xác định ma trận thực nghiệm theo 3 yếu tố. Mỗi yếu tố thực hiện thí nghiệm

ở 3 mức: mức dưới, mức cơ bản và mức trên. Tổng số thí nghiệm là 27; (2)

Phân tích hàm lượng GABA ở 27 thí nghiệm chọn ra những thí nghiệm có hàm

lượng GABA > 203 mg/100g.

Bước 2 - Xác định các điều kiện của thí nghiệm mà tại đó tổng giá trị của

3 mục tiêu bài toán (hàm lượng GABA, chỉ tiêu hương và vị của sản phẩm)

đạt tốt nhất, gồm: (a) Lặp lại các thí nghiệm đã lựa chọn được ở điểm (b) của

bước 1, phân tích các chỉ tiêu cần tối ưu là: y1 (hàm lượng GABA mg/100g),

y2 (điểm số về hương, không có thứ nguyên), và y3 (điểm số về vị, không có

thứ nguyên); (b) Từ ma trận thực nghiệm ở bước 1, xác định được giá trị lớn

nhất và bé nhất của y1.

Từ kết quả thực nghiệm ở điểm (a) của bước 2, xác định được giá trị lớn nhất

và bé nhất của y2 và y3. Chọn hệ số quan trọng của các mục tiêu: d(y1) = 1,3; d(y2)

= 1,0; d(y3) = 1,0. Tính tổng điểm của 3 mục tiêu và lựa chọn thí nghiệm có tổng

điểm cao nhất, xem là phương án tốt nhất (Đào Thị Việt Hà, 2029).

Bước 3: Lặp lại thí nghiệm với các giá trị của các yếu tố ở vùng lân cận để

xác định điều kiện mà tại đó các chỉ tiêu cần tối ưu tiệm cận gần nhất đến khu

vực tối ưu (tối ưu có điều kiện).

3.3.4.2. Kết quả thực hiện tối ưu hóa

(a) Xác định giá trị của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men yếm khí

nhằm đạt lượng GABA lớn hơn 203 mg/l trong sản phẩm:

100

Lập ma trận thực nghiệm:

Lượng giống khởi động x1, thí nghiệm ở các điểm:

1 = 2%, x0

1 = 4%, x+

1= 6 %.

x-

Nhiệt độ lên men x2, thí nghiệm ở các điểm mốc:

2 = 23oc, x0

2 = 25oc, x+

2= 27oc.

x-

Thời gian len men x3, thí nghiệm ở các điểm mốc:

3 = 8 h, x0

3 = 10 h, x+

3= 12 h.

x-

Với 3 yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố thực hiện thí nghiệm ở 3 điểm mốc,

lập được ma trận thực nghiệm trực giao với 27 thí nghiệm. Thực hiện thực

nghiệm theo ma trận đã lập. Mỗi thí nghiệm sau khi kết thúc, tiến hành phân

tích hàm lượng GABA.

Kết quả thực nghiệm theo ma trận:

Kết quả phân tích hàm lượng GABA của 27 mẫu thí nghiệm được trình

bày ở Bảng 3.27. Qua số liệu của bảng, xác định được các thí nghiệm có hàm

lượng GABA cao hơn 203 mg/100g. Các thí nghiệm đó là: Số 3, số 4, số 5, số

6, số 8, số 9, số 11, số 12, số 13, số 14, số 15, số 17, số 18, số 19, số 20, số 21,

số 22, số 23, số 24, số 25, số 26 và số 27.

Loại bỏ những thí nghiệm mà tại đó, hàm lượng GABA chênh lệch so với

mẫu đối chứng (203 mg/100 g) quá ít, không có ý nghĩa nhiều về mặt công

nghệ. Những mẫu đó là số 1, 2, 3, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 21 và 23.

Số mẫu còn lại (12 mẫu) tiếp tục được tiến hành khảo sát để tìm ra phương án

tốt nhất, xét theo quyền lợi của cả 3 mục tiêu đồng thời.

(b) Tìm phương án phù hợp cho lên men yếm khí chè đen với 3 chỉ tiêu

chất lượng và 3 yếu tố ảnh hưởng:

+ Lựa chọn các mẫu vượt trội trong 12 mẫu được chọn:

Mười hai mẫu có hàm lượng GABA đạt yêu cầu được tiến hành phân tích

cảm quan. Mẫu sản phẩm được phân tích theo 3 chỉ số chất lượng: y1 (hàm

lượng GABA, mg/100g); y2 (điểm cảm quan về hương, không có thứ nguyên);

101

và y3 (điểm cảm quan về vị, không có thứ nguyên).

Bảng 3.27. Kết quả phân tích hàm lượng GABA (mg/100g) của 27 mẫu

thí nghiệm

Số TT TNo

Lượng GABA

Số TT TNo

Lượng GABA

198

15/ xo

228

1, x+

2, x0

3:

1/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, 𝑥̅3:

201

201

16/ x+

3:

2/ 𝑥̅1, xo

2,, 𝑥̅3:

1, , 𝑥̅2, x0

205

17/ x+

205

1, x0

2, x0

3:

3/ 𝑥̅1, x+

2, 𝑥̅3:

219

18/ x+

267

1, x+

2, x0

3:

4/ xo

1, 𝑥̅2, 𝑥̅3:

245

211

3:

5/ 𝑥̅1, xo

2, 𝑥̅3:

19/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, x+

256

208

6/ xo

1, x+

2, x+

3:

2, 𝑥̅3:

20/ 𝑥̅1, x0

200

216

7/ x+

2, x+

3:

1 , 𝑥̅2, 𝑥̅3:

21/ 𝑥̅1, x+

206

226

8/ x+

22/ xo

3:

1 , xo

2, 𝑥̅3:

1, 𝑥̅2, x+

257

23/ xo

213

1, x+

2, x+

3:

9/ x+

2, x+

3

1 , x+

200

24/ xo

237

1, x+

2, x+

3:

3:

10/ 𝑥̅1, 𝑥̅2, x0

204

25/ x+

260

1, x-

2, x+

3:

2, x0

3

11/ 𝑥̅1, xo

209

26/ x+

266

1, x0

2, x+

3:

2, x0

3:

12/ 𝑥̅1, x+

213

27/ x+

282

1, x+

2, x+

3:

13/ xo

3:

1, 𝑥̅2, x0

14/ xo

226

1, x+

2, x0

3:

Đối với sản phẩm chè, tầm quan trọng của hương và vị được đánh giá ngang

nhau, chọn hệ số quan trọng k = 1; Với hàm lượng GABA trong chè đen được

xem là mục tiêu chủ đạo của nghiên cứu, cho nên chỉ số này, được đánh giá về hệ

số quan trọng k = 1,3. Kết quả phân tích 12 mẫu được thể hiện trong Bảng 3.28.

Bảng 3.28. Kết quả phân tích các chỉ số cuối 12 mẫu

Hương

Vị

GABA

Tổng điểm

Mẫu số

Mô tả sản phẩm

cảm quan

(y2)

(y3)

(y1)

4

Hương dịu, vị dịu

4,50

4,50

219

9,00

5

Hương nhẹ, vị đậm

4,50

4,75

245

9,25

6

Hương dịu, vị dịu

4,50

4,50

256

9,00

9

Hương dịu, vị gắt

4,00

4,00

257

8,00

14

Hương dịu, vị dịu

4,50

4,50

226

9,00

15

Hương dịu, vị đậm

3,75

4,25

228

8,00

102

Hương

Vị

GABA

Tổng điểm

Mẫu số

Mô tả sản phẩm

cảm quan

(y2)

(y3)

(y1)

18

Hương nhẹ, vị hơi chua

3,75

4,25

267

8,00

22

Hương dịu, vị hơi gắt

4,25

4,25

226

8,50

24

Hương dịu, vị hơi gắt

4,25

4,25

237

8,50

25

260

8,00

Hương hơi nồng, vị hơi chua

4,00

4,00

26

Hương nồng, vị hơi gắt

3,75

4,25

266

8,00

27

Hương nồng, vị gắt

3,75

3,75

282

7,50

+ Xây dựng thang điểm và sử dụng hệ số quan trọng của các chỉ tiêu chất

lượng để cô lập vùng gần tối ưu của các biến ảnh hưởng [2]:

Xây dựng thang điểm cho chỉ tiêu y2 (hương của chè): Trên cột giá trị của

hương ở bảng 2, thấy y2max = 4,5, y2min = 3,75; Hiệu số ymax - ymin = 0,75. Chọn

thang điểm là 10, từ đây ta xây dựng được các mốc điểm cho y2.

Lập bảng tổng hợp đánh giá toàn diện 3 chỉ tiêu chất lượng (y1, y2, y3) của

sản phẩm: Căn cứ trên các thang điểm và sử dụng hệ số quan trọng của các chỉ

tiêu chất lượng (k1 = 1,3; k2 = 1; k3=1) ta lập được bảng tổng hợp về tổng số

Giá trị thật của y2 3,75 3,83 3,92 4,00 4,08 4,16 4,25 4,33 4,41 4,50

Giá trị quy đổi

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10

của y2

điểm quy ước của 3 mục tiêu đồng thời một lúc.

219 226 233 240 247 254 261 268 275 282

Giá trị thật của y1

10

Giá trị quy đổi của y1 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0

Giá trị thật của y3 3,75 3,86 3,97 4,08 4,19 4,30 4,41 4,52 4,63 4,75

Giá trị quy đổi

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10

của y3

Theo cách tương tự, ta lập được mục tiêu thang điểm cho y1 và y3.

Khi tính điểm quy đổi cho các giá trị của mục tiêu, đã làm tròn số theo

quy định như sau: Nếu > 5 thì làm tròn số phía trên, nếu ≤ 5 thì làm tròn số phía

103

dưới. Ví dụ: 3,067 làm tròn số là 3,07; 0,324 làm tròn số là 0,32. Bảng tổng

điểm của các chỉ tiêu chất lượng của chè đen được thể hiện trong Bảng 3.29.

Từ kết quả tính toán trình bày ở bảng này cho phép rút ra một số kết luận:

- Ba mẫu thí nghiệm số 5, số 6 và số 14 có tổng điểm quy đổi của 3 chỉ

tiêu chất lượng cao nhất.

- Có những thí nghiệm hàm lượng GABA trong chè rất cao nhưng các chỉ

tiêu chất lượng (hương và vị) của chè lại rất thấp vì vậy tổng điểm quy đổi cũng

thấp, không thể chấp nhận được. Điều này cho ta thấy là việc lựa chọn hệ số

quan trọng của y1, y2, y3 là tương đối phù hợp.

- Vùng thích hợp nhất, tại đó tổng điểm quy đổi của cả 3 chỉ tiêu chất

lượng đạt trị số gần tối ưu, ứng với điều kiện của các yếu tố ảnh hưởng là:

 Lượng vi khuẩn giống khởi động (OD600 = 2,6), x1 ϵ [2-4%]

 Nhiệt độ lên men x2 ϵ [25÷27oc]

 Thời gian lên men x3 ϵ [6÷8 h].

Ứng với các điều kiện trên đây, tổng điểm quy đổi của y1 + y2 + y3 dao

động ở khoảng lớn nhất từ 20,6 - 25,8. Đây là vùng gần tối ưu mà nhiệm vụ của

nghiên cứu phải giải đáp.

(c) Tiến hành thực nghiệm để kiểm định lời giải của bài toán:

Thực nghiệm kiểm định được tiến hành với các mốc thí nghiệm của các

biến ảnh hưởng: x1 = 3%; x2 = 26oC; x3 = 7 h. Mẫu thực nghiệm được phân tích

các chỉ số: Cảm quan về hương, cảm quan về vị và hàm lượng của GABA

(mg/100g) của mẫu chè. Kết quả phân tích đạt được:

 Cảm quan về hương: 4,50

 Cảm quan về vị: 4,75

 Hàm lượng GABA (mg/100g): 254

104

Các số liệu của mẫu thí nghiệm này đều nằm lân cận của các mẫu 5, 6 và 14.

Bảng 3.29. Điểm tổng hợp của 3 chỉ tiêu chất lượng chè

Y1

Y2

Y3

Hệ số

Hệ số

Hệ số

Thí nghiệm số

Tổng điểm quy đổi Y1+Y2+Y3

Số đo thật

Số đo thật

Số đo thật

Điểm trên thang

Điểm quy đổi

Điểm trên thang

Điểm quy đổi

Điểm trên thang

Điểm quy đổi

8,0

8,0

4

219

1,3

1,0

1,3

4,50

1,0

10

10,0

4,50

1,0

19,3

10,0

10,0

5

245

1,3

4,5

4,8

4,50

1,0

10

10,0

4,75

1,0

24,8

6

256

1,3

6,0

7,8

4,50

1,0

10

10,0

4,50

1,0

8,0

8,0

25,8

9

257

1,3

6,0

7,8

4,00

1,0

4,0

4,0

4,00

1,0

4,0

4,0

15,8

14

226

1,3

2,0

2,6

4,50

1,0

10

10,0

4,50

1,0

8,0

8,0

20,6

15

228

1,3

2,0

2,6

3,75

1,0

1,0

1,0

4,25

1,0

6,0

6,0

9,6

18

267

1,3

8,0

10,4

3,75

1,0

1,0

1,0

4,25

1,0

6,0

6,0

17,4

22

226

1,3

2,0

2,6

4,25

1,0

7,0

7,0

4,25

1,0

6,0

6,0

15,6

24

237

1,3

4,0

5,2

4,25

1,0

7,0

7,0

4,25

1,0

6,0

6,0

18,2

25

260

1,3

7,0

9,1

4,00

1,0

4,0

4,0

4,00

1,0

5,0

5,0

18,1

26

266

1,3

8,0

1,0

1,0

1,0

4,25

1,0

10,4

3,75

6,0

6,0

17,4

27

282

1,3

1,0

1,0

1,0

3,75

1,0

10,0

13,0

3,75

1,0

1,0

15,0

105

3.3.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.3

Từ những kết quả thu được bằng thực nghiệm, có thể tóm tắt và kết luận

nội dung nghiên cứu 3.3 như sau:

(a) Bổ sung thêm công đoạn lên men yếm khí trong công nghệ sản xuất

chè đen truyền thống đã làm tăng hàm lượng GABA trong sản phẩm. Nhưng

nếu sử dụng thêm vi khuẩn lactic (chủng VTCC-B-411) trong giai đoạn lên

men yếm khí sẽ làm tăng hàm lượng GABA hơn nữa, trong khi đảm bảo chất

lượng cảm quan của sản phẩm có thể tiệm cận được với các mẫu đối chứng và

mẫu có lên men yếm khí nhưng không sử dụng vi sinh vật.

(b) Khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa thực nghiệm đa yếu tố ảnh hưởng đã

xác định được các thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm

khí + vi khuẩn lactic) ứng với các điều kiện của các yếu tố ảnh hưởng là: Tỷ lệ

giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên

men: 11,5 h. Hàm ượng GABA của sản phẩm đạt cực đại là 275 mg/100g chè so

với 203 mg/100g của sản phẩm lên men yếm khí (không có vi khuẩn lactic).

(c) Các chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm chè đen lên men kép đạt hài hòa

nhất khi bài toán tối ưu hóa đạt được các thông số tương đồng với các thông số

quá trình cho hàm lượng GABA cao nhất như mục (b). Cụ thể, với các điều

kiện lên men: Tỷ lệ giống vi khuẩn khởi động 2-4% lượng chè lên men, nhiệt

độ lên men 26oC, thời gian lên men 7 h (tổng giá trị quy đổi của y1 + y2 + y3 đạt

giá trị cao nhất).

3.4. Thực nghiệm sản xuất chè giàu GABA quy mô Pilot

3.4.1. Sản xuất chè ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ

3.4.1.1. Quy trình và thông số kỹ thuật sản xuất chè đen giàu GABA

(a) Sơ đồ quy trình:

Tiến hành sản xuất 3 loại chè đen theo 3 quy trình khác nhau: Chè đen

theo quy trình phổ thông, chè đen giàu GABA với bổ sung công đoạn lên men

106

yếm khí, và chè đen giàu GABA có bổ sung công đoạn lên men vi khuẩn lactic

trong môi trường yếm khí. Công thức chè thứ nhất có vai trò làm đối chứng để

so sánh chất lượng với loại thứ hai, còn công thức chè thứ hai dùng làm đối

chứng (đối chứng 2) để so sánh chất lượng với chè thứ 3. Sơ đồ quy trình công

nghệ sản xuất 3 loại chè đen nêu trên như trên Hình 3.14.

Hình 3.14. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất 3 loại chè đen

(b) Thông số công nghệ của 3 quy trình

Các thông số của quy trình QT1:

- Làm héo: 7 - 8 h, độ ẩm chè 63 - 65%;

- Vò chè 2 lần, mỗi lần 30 ph;

107

- Độ ẩm chè vò 62-64%;

- Lên men hiếu khí 90 ph, nhiệt độ lên men 25oC;

- Sấy ở nhiệt độ 100 - 105oC;

- Độ ẩm cuối cùng của chè: 5% ± 0,2.

Các thông số của quy trình QT2:

- Làm héo và vò chè: Giống như QT1;

- Lên men yếm khí: Theo chế độ tối ưu ở mục (3.2.2): Thời gian 8 h,

nhiệt độ 29oC;

- Lên men hiếu khí và sấy: giống như QT1.

Các thông số của QT3:

- Làm héo và vò chè: Giống như QT1;

- Lên men yếm khí: Theo chế độ tối ưu nêu ở mục 3.3.2. Lượng chế phẩm

sử dụng 2,5% so với lượng mẫu, nhiệt độ lên men 27oC, thời gian lên men 11,5

h, độ ẩm của chè vò 68%;

- Lên men hiếu khí và sấy: Giống như QT1.

3.4.1.2. Thực nghiệm sản xuất 3 loại chè đen

(a) Làm héo chè:

Dùng 40 kg chè búp rải lên máng làm héo, bề dày lớp chè khoảng 20 cm.

Thổi không khí vào lớp chè: 6 m/s. Nhiệt độ không khí: 35 - 36oC; Thời gian

làm héo: 6 - 6,5 h; Đảo: 2 h đảo chè 1 lần

(b) Vò chè:

Chè được vò 3 lần, chế độ như sau: Lần 1, vò 45 ph; Lần 2, vò 45 ph;

Lần 3, vò 40 ph. Sau mỗi lần vò, tiến hành sàng tơi để loại bỏ vụn chè. Sau 3

lần vò xác định được độ dập tế bào là 78%. Thủy phần của chè vò khoảng 67%.

(c) Lên men:

Lên men theo QT1: Lấy 10 kg chè vò rải lên khay, đặt vào phòng lên

men. Nhiệt độ lên men 25oC. Để đảm bảo nhiệt độ này trong khối chè thì nhiệt

108

độ máy điều hòa phải đặt ở chế độ 22 - 23oC, thời gian lên men 90 ph.

Lên men theo QT2: Lấy 10 kg chè vò cho vào túi nilon, ép chặt để đẩy

không khí trong túi ra ngoài, kẹp chặt miệng túi. Đặt ở chế độ lên men: thời

gian 8 h, nhiệt độ 29oC. Sau khi lên men yếm khí, chè được đưa ra khỏi túi và

rải lên khay để lên men hiếu khí. Chế độ lên men hiếu khí giống như QT1.

Lên men theo QT3: Lấy dịch sinh khối vi khuẩn lactic cần thiết trộn đều

vào 2,5 kg chè vò. Sau đó lấy 2,5 kg chè vò trộn đều vào 2,5 kg đã có chế phẩm,

thu được 5 kg chè vò có vi khuẩn. Lấy 5 kg chè vò trộn đều với 5 kg đã có vi

khuẩn ta được 10 kg chè vò làm mẫu để lên men. Cho tất cả 10 kg chè vò đã

trộn đều chế phẩm vào túi, hút hết không khí trong túi. Đặt túi chè vào phòng

lên men có nhiệt độ 27oC. Thời gian lên men 11,5 h. Sau đó tiến hành lên men

hiếu khí giống như QT2.

Sấy chè: Cả ba mẫu chè sau khi lên men theo QT1, QT2, QT3 được sấy

cùng một chế độ: 100 - 105oC. Độ ẩm cuối cùng của ba mẫu chè là 5 ± 0,2%.

3.4.1.3. Đánh giá chất lượng cảm quan 3 loại chè đen

Các loại chè đen được đánh giá qua các chỉ số: Ngoại hình, màu nước,

mùi, vị. Sau khi đánh giá thì xác định tổng số điểm và xếp loại cho từng loại

chè theo 3 quy trình. Kết quả đánh giá được thể hiện trong Bảng 3.30.

109

Qua số liệu ở bảng 3.30 rút ra một số nhận xét sau đây:

Bảng 3.30. Các chỉ số chất lượng của chè đen sản xuất theo QT1, QT2 và QT3

Ngoại hình

Màu nước

Mùi

Vị

Sản

GABA

Điểm

Xếp

xuất

tổng

loại

theo

mg/100g

Mô tả

Điểm Mô tả

Điểm Mô tả

Điểm

Mô tả

Điểm

QT

QT1 4,75 4,75 5,00 5,00 19,50 Tốt 85

Nâu đen hơi đậm, xoăn đều Thơm rõ đặc trưng chè đen Chát dịu, có hậu vị rõ nét và kéo dài Nâu đỏ nhạt, đặc trưng của chè đen, sáng

QT2 4,50 4,75 4,75 4,75 18,75 Tốt 200

Chát dịu, có hậu vị rõ nét Nâu đỏ, sáng có viền vàng, sáng Thơm nhẹ, đặc trưng chè đen Nâu đen đậm vừa xoăn hơi chặt, hình thái đẹp

110

QT3 4,25 4,50 4,50 4,25 17,50 Khá 270 Nâu đỏ đậm Thơm hơi nồng Nâu đen đậm, xoắn chặt Chát nhẹ, hơi ngái, có hậu vị

- Khi bổ sung quá trình lên men yếm khí thì các chỉ tiêu chất lượng cảm

quan của chè đen theo quy trình QT2 và quy trình QT3 thấp hơn so với mẫu

đối chứng ở quy trình QT1.

- Khi lên men yếm khí có bổ sung chế phẩm vi khuẩn lactic thì tổng số

điểm cảm quan của chè theo quy trình QT3 thấp hơn so với quy trình QT2.

- Hàm lượng GABA trong chè của QT2 và QT3 đều cao hơn so với các

giá trị tương ứng so với mẫu thí nghiệm ở quy mô nhỏ phòng thí nghiệm.

- Chè đen sản xuất theo quy trình QT3 có hàm lượng GABA cao hơn hẳn

2 mẫu của quy trình khác. Tuy tổng điểm cảm quan của mẫu này thấp hơn chè

của 2 mẫu kia nhưng xét về mục tiêu nghiên cứu của đề tài luận án thì quy trình

QT3 hoàn toàn đã đạt được.

- Việc nâng cao chất lượng cảm quan của chè đen giàu GABA theo quy

trình QT3 theo hướng tiếp cận được với quy trình QT2, đòi hỏi phải xác định

lại một số thông số kỹ thuật ở một số công đoạn trong quy trình sản xuất.

- Việc nâng quy mô sản xuất từ điều kiện phòng thí nghiệm lên quy mô

pilot sẽ dẫn đến các chỉ tiêu chất lượng của chè bị thay đổi là điều không thể

tránh khỏi.

3.4.2. Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA quy

mô pilot 10 Kg nguyên liệu/mẻ

3.4.2.1. Hoàn thiện công đoạn làm héo búp chè

Sử dụng nguyên liệu giống chè Phúc Vân Tiên, thu hoạch vào tháng 9 năm

2019. Tiến hành thực nghiệm 3 lần, mỗi lần 40 kg chè tươi và chia làm 4 phần,

mỗi phần 10 kg để héo theo 4 công thức ứng với 4 thời gian khác nhau 6 - 9 h. Kí

hiệu H1, H2, H3, và H4 cho các công thức có thời gian làm héo tương ứng 6, 7,

8, và 9 h. Chè được rải đều trên các khay, trong thời gian héo, cứ sau 1 h, chè trong

từng khay được đảo trộn một lần, nhiệt độ trong phòng biến động trong khoảng

27 - 30oC, độ ẩm không khí biến động trong khoảng 75 - 85%. Chè sau khi héo

111

được chế biến tiếp (vò, lên men và sấy khô) để thu được chè đen giàu GABA. Chè

đen thành phẩm được đánh giá chất lượng bằng phương pháp cảm quan theo tiêu

chuẩn ngành TCVN 3218 - 2012. Tiến hành đánh giá chất lượng của búp chè trong

quá trình làm héo, kết quả được trình bày ở Bảng 3.31.

Qua kết quả ở bảng 3.31 nhận thấy trong quá trình héo nhẹ, độ ẩm của lá

chè giảm dần và tính chất cơ lý của lá chè thay đổi theo. Lá chè trở nên mềm

dẻo, màu sắc của lá ngả dần sang màu vàng. Đặc biệt lá chè xuất hiện mùi thơm

của quả chín đây là biểu hiện tốt về chất lượng của sản phẩm sau này.

Để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian héo đến chất lượng của chè

đen, cần làm ra chè đen thành phẩm bằng cách đưa chè héo đi chế biến theo chế

độ, bao gồm vò, lên men và sấy. Dùng máy vò Trung Quốc 265 để vò chè, thời

gian vò khoảng 40 ph, độ dập tế bào 70-80 %. Lên men yếm khí trong 12 h, lên

men hiếu khí trong 90 ph. Sấy chè bằng máy sấy đến độ ẩm 10%.

Để đánh giá chất lượng cảm quan của chè đen thành phẩm, dùng phương

pháp thử nếm. Kết quả thu được ở Bảng 3.32. Từ kết quả nghiên cứu chỉ ra ở

bảng này cho thấy thời gian héo nhẹ ảnh hưởng khá rõ đến chất lượng của chè

đen. Khi thời gian héo 6 h, chè đen có màu nước, mùi và vị gần giống như chè

xanh, chưa có những đặc trưng của chè đen. Khi làm héo tới 9 h lá chè có màu

nước vàng hơi đậm và vị chát nhạt hơn. Khi làm héo nhẹ 4-6 h, chè đen có mùi

thơm đặc trưng, màu nước vàng, vị chát dịu và chất lượng sản phẩm được đánh

giá là tốt nhất. Vì vậy chọn thời gian làm héo là 7-8 h. Thời gian héo 7-8 h được

112

sử dụng cho các quá trình nghiên cứu các chế độ công nghệ tiếp theo.

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của thời gian héo đến sự biến đổi tính chất

của lá chè

Hăng xanh

Xanh tươi

Búp chè dòn, dể bẻ gẫy

Độ ẩm Thời Tính chất của lá chè héo của lá gian chè (%) héo (h) Mùi Màu sắc Trạng thái

Thoáng mùi

Xanh hơi vàng

Búp chè tương đối mềm

thơm của hoa

ở lá 2 và lá 3, lá

ở lá 1, lá 2 và 3, cuộng

77,4 0

quả chín

1 còn xanh

còn dòn, dễ bẻ gẫy

Thơm nhẹ, dễ

Xanh hơi ngả

Búp chè tương đối mềm

chịu của quả

vàng ở cả 3 lá,

ở cả 3 lá, cuộng dẻo

73,7 4

chín

cuộng vẫn còn

hơn, khó bẻ gẫy

xanh

Thơm dễ chịu

Xanh hơi ngả

Búp chè mềm, dẻo. Một

của quả chín

vàng ở phần lớn

số lá 1 có hiện tượng

3 lá, cuộng của

khô ở mép lá

73,0 5

một số búp chè

đã ngả vàng

Thoáng mùi

Xanh hơi ngả

Búp chè mềm, dẻo. Một

thơm của hoa

màu vàng ở cả

số lá 1 có hiện tượng

quả chín

3 lá và cuộng

khô ở mép lá, một số lá

72,5 6

cũng bắt đầu

trở nên dòn

ngả màu vàng

Thoáng mùi lạ Cuộng và lá 3

Cuộng chè hơi cứng,

màu vàng sáng,

nhiều lá 1 có hiện tượng

7 71,9

lá 1 và 2 thoáng

khô ở mép lá, một số lá

màu vàng

3 trở nên hơi dòn

113

70,25 8

Bảng 3.32. Ảnh hưởng của thời gian héo nhẹ đến chất lượng của chè GABA bán thành phẩm

Ngoại hình

Màu nước

Mùi

Vị

Thời gian

Tổng

Đánh

héo (h)

điểm

giá

Mô tả

Điểm Mô tả

Điểm Mô tả Điểm Mô tả Điểm

H1

6

Kém xoăn, nhiều mảnh

2,50 Vàng sáng

3,50 Thơm nhẹ 4,20 Chát rõ

4,00

14,44

Đạt

Thơm đặc

H2

7

Tương đối xoăn, có tuyết

4,50 Vàng sánh

4,25

4,25 Chát dịu 4,50

17,50 Khá

trưng

H3

8

Xoăn, hơi thô, có tuyết

4,25 Vàng hơi đậm 4,25 Thơm nhẹ 4,50 Chát nhạt 4,25

17,30 Khá

Kém xoăn, hơi thô, thoáng

H4

9

2,75 Vàng hơi đậm 3,25 Thơm nhẹ 4,00 Chát nhạt 4,25

14,60

Đạt

mảnh

114

3.4.2.2. Hoàn thiện công đoạn vò chè

Mục đích chính của giai đoạn vò chè khi sản xuất chè đen là tạo điều kiện để

thay đổi mạnh mẽ sự phát triển và chiều hướng của các biến đổi hoá sinh xảy ra

trong lá chè tươi chuyển sang các biến đổi ô xy hoá các chất dưới tác dụng của

enzym ô xy hoá. Điều này chỉ có thể đạt được khi các tế bào của lá chè bị phá vỡ

trong các máy vò chuyên dùng để dịch ép trào ra mặt lá, men tiếp xúc với các chất

và để ô xy (O2) thâm nhập sâu vào tế bào của lá. Sử dụng máy vò đơn do Trung

Quốc chế tạo để vò chè, dung tích của máy vò 50 kg nguyên liệu chè/mẻ, vò 2 lần

với thời gian vò 30 ph, độ dập tế bào khoảng 70 đến 80%.

Chè sau khi làm héo được đem sang khu vực vò chè. Chế độ vò 3 lần theo

3 chế độ thời gian khác nhau và sau mỗi lần vò đều sàng tơi, sau đó lấy mẫu kiểm

tra độ dập tế bào và các tính chất cảm quan, kết quả thể hiện ở Bảng 3.33. Từ

bảng nhận thấy mặc dù ở chế độ vò 50-45-45, cánh chè khá xoăn, gọn nhưng lại

nhiều mảnh vụn làm ảnh hưởng không tốt tới ngoại hình và độ dập tế bào cũng

không cao hơn nhiều so với chế độ vò 45-45-40. Do vậy chúng tôi chọn chế độ

vò như sau: Vò 3 lần, thời gian vò: 45-45-40 (ph) để có độ dập tế bào: 78,5%.

Bảng 3.33. Ảnh hưởng của thời gian vò đến chất lượng chè vò

Thời gian

Độ dập

STT

Tính chất cảm quan

một lần vò (ph)

tế bào (%)

1

45-40-35

70,5

Hơi thô, màu vàng xanh, mùi hăng

2

45-45-40

78,5

Khá xoăn, màu nâu, thoáng hăng

Khá xoăn, gọn, nhiều vụn, màu nâu,

3

50-45-45

79,8

thoáng hăng

3.4.2.3. Hoàn thiện công đoạn lên men

Để tạo ra chè đen giàu GABA, chè sau vò trước tiên được tiến hành lên

men yếm khí nhằm tạo ra hợp chất GABA, sau đó lên men hiếu khí nhằm tạo

nên các tính chất đặc trưng của chè đen. Tại buồng lên men, không khí có các

thông số như sau: Nhiệt độ: 29 - 30oC; Độ ẩm tương đối: 95-96%; Tốc độ lưu

thông không khí: 2 m/s. Để duy trì nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí

115

trong buồng lên men, đã dùng máy phun ẩm và lưu thông không khí.

(a) Lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic:

Để tạo môi trường lên men yếm khí, chè được cho vào bao hai lớp (PE/PP),

sau đó dùng tay nén chặt chè, vuốt không khí ra khỏi bao và buộc chặt miệng

bao, mỗi bao chứa khoảng 10 kg chè. Các bao chè được đặt vào trong buồng

lên men và tiến hành lên men theo 3 chế độ về thời gian: 7 h; 7 h 30 ph và 8 h.

Khi kết thúc lên men yếm khí, mẫu chè được dỡ khỏi túi để xếp lên khay và

tiến hành quá trình lên men hiếu khí. Chế độ lên men hiếu khí được đặt ở điều

kiện thích hợp như đã xác định ở các nội dung trước.

Để sấy khô, đã sử dụng máy sấy băng tải hiện có của nhà máy, máy có năng suất 400 - 500 kg/h, chế độ sấy như sau: Nhiệt độ 100-105oC; Thời gian

20 ph; Độ ẩm của chè sau sấy 3-5%. Chè sau sấy được làm nguội trước khi lấy

mẫu kiểm tra và bao gói.

Kết quả kiểm tra chất lượng chè đen GABA được trình bày tại Bảng 3.34

và Bảng 3.35. Từ hai bảng này thấy với thời gian lên men yếm khí 7 h, hàm

lượng GABA thấp nhất (247 mg/100g chè). Nhưng giá trị này của quy trình

QT3 vẫn cao hơn so với mẫu chè từ quy trình QT2 như nêu trong mục trước.

Với thời gian lên men 7 h, điểm cảm quan cũng cao nhất trong 3 phương án về

thời gian lên men yếm khí.

Mục tiêu nghiên cứu ở mục này là tìm giải pháp công nghệ để nâng cao

các chỉ số cảm quan, đặc biệt là hương và vị của chè đen sản xuất theo QT3

(lên men yếm khí với chế phẩm vi khuẩn lactic). Kết quả cho thấy là ở chế độ

lên men 7 h thì chỉ số về mùi và vị của chè đã có bước cải thiện.

Bảng 3.34. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến các chỉ tiêu

hóa lý của chè đen giàu GABA

TT Chỉ tiêu

116

1 Độ ẩm (%) 2 Hàm lượng Tanin (% CK) 3 Hàm lượng chất hoà tan (% CK) 4 Hàm lượng GABA (mg/100g) 5 Hàm lượng tro tổng số (% khối lượng) Hàm lượng/ thời gian lên men 7 h 30 ph 5,0 15,1 34,8 254 5,0 7 h 5,0 15,8 34, 4 247 5,0 8 h 5,0 14,6 34,0 253 5,0

(b) Đề xuất quy trình sản xuất chè đen giàu GABA bằng bổ sung công đoạn

lên men yếm khí có sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic

Sơ đồ quy trình sản xuất chè đen giàu GABA hoàn thiện với bổ sung công

đoạn lên men yếm khí kết hợp lên men sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic được

trình bày trên Hình 3.15. Quy trình có thể áp dụng cho các quy mô khác nhau.

Một cách đơn giản, quy trình có thể biểu diễn như sau:

Chè 1 tôm 3 lá  héo 7 h  vò chè 3 lần (40 - 45 - 45 ph)  lên men yếm khí (7 h, nhiệt độ 29oC)  lên men hiếu khí  sấy khô 100 - 105oC tới độ ẩm

5 ± 0,3%)  sàng  chè đen thành phẩm + bụi vụn chè.

117

Hình 3.15. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA

Bảng 3.35. Ảnh hưởng của thời gian lên men yếm khí đến các chỉ tiêu cảm quan của chè đen GABA

Ngoại hình

Màu nước

Mùi

Vị

Thời gian

Điểm

Xếp

lên men

tổng số

loại

Mô tả

Điểm

Mô tả

Điểm

Mô tả

Điểm Mô tả Điểm

Đỏ nâu sáng có viền

Chát dịu, rõ

7 h

Nâu, khá xoăn 4,25

4,25

Thơm nhẹ

4,25

4,25

17,0

Khá

vàng.

hậu

Nâu đen, xoăn

Đỏ nâu sáng, rõ viền

Thơm, hài hòa dễ

Chát dịu, rõ

7 h 30 ph

4,25

4,25

4,0

4,0

16,5

Đạt

vàng

hậu

chịu

chặt

Nâu đen, xoăn

8 h

4,75

Đỏ nâu sáng

4,0

Thoáng chua

2,75 Hơi nhạt

3,75

14,95

Đạt

chặt

118

3.4.3. Áp dụng quy trình đã hoàn thiện để sản xuất chè đen giàu GABA

quy mô pilot với một số giống chè Việt Nam

Ở nội dung mục 3.1 đã trình bày kết quả phân tích các thành phần và đặc

điểm của 4 giống chè phổ biến và có chất lượng cao ở phía Bắc Việt Nam là

Keo Am Tích, Phúc Vân Tiên, Kim Tuyên và Trung Du. Trong 4 giống chè

này sau khi xem xét các yếu tố, đã chọn ra giống chè Phúc Vân Tiên để triển

khai các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, để xem xét tính ổn định và tính phổ

biến của quy trình QT3 đã được đề xuất, cần sử dụng cả 4 giống chè để tiến

hành thực nghiệm, nhằm đánh giá chất lượng của sản phẩm cuối cùng. Mục

đích chính của phần nội dung nghiên cứu này là để xem xét QT3 có thể áp dụng

cho nhiều giống chè khác hay không. Mặt khác, cũng qua đây để đánh giá xem

các thông số công nghệ được đề xuất có phù hợp với đặc điểm của các giống

chè khác hay không.

Thử nghiệm sản xuất sử dụng mỗi loại chè 15 kg búp 1 tôm 3 lá. Tất cả

các thông số công nghệ được áp dụng chung cho cả 4 mẫu, mỗi mẫu lấy 10 kg

chè vò, đóng túi như nhau. Sau khi sấy khô, đem phân tích hàm lượng GABA

và đánh giá các chỉ tiêu cảm quan của các mẫu.

Kết quả phân tích và đánh giá được thể hiện ở Bảng 3.36. Qua số liệu ở

bảng thấy rằng sản phẩm chè đen giàu GABA của giống chè Phúc Vân Tiên

và Kim Tuyên là tương đồng nhau. Sản phẩm từ giống chè Trung Du có hàm

lượng GABA tuy cao hơn Keo Am Tích nhưng tổng điểm cảm quan lại thấp

hơn. Nhìn chung thì cả 2 giống chè này cho sản phẩm chè đen chất lượng kém.

Sản phẩm chè đen từ 2 giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên là có thể chấp

nhận được.

Hai sản phẩm của 2 giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên được đóng gói

119

để khảo sát sự biến đối chất lượng của chúng trong thời gian bảo quản.

Bảng 3.36. Các chỉ số cảm quan và hàm lượng GABA (mg/100g) của các mẫu chè

Ngoại hình Màu nước Mùi Vị Mẫu Điểm Xếp GABA

Nâu đỏ

Phảng phất mùi

Hơi chua

Keo Am

Nâu đậm, có

4,00

tương đối

4,00

chè đen hơi

4,00

nhé, có hậu

3,25

15,25

Đạt

208

Tích

xoắn

đậm

nồng

vị

Nâu đen vừa,

Tương đối

Phúc

Nâu đỏ

Thơm nhẹ, có

xoắn tương đối

4,25

4,25

4,50

chát, có hậu

4,25

17,25

Khá

265

Vân Tiên

nhạt, sáng

mùi ngái nhé

chặt

vị

Nâu đỏ

Có vị chát

Kim

Nâu đen vừa,

Thơm nhẹ, có

4,25

nhạt, có

4,25

4,25

nhẹ, có hậu

4,25

17,00

Khá

265

Tuyên

xoắn chắc

mùi nấu nhẹ

ánh

vị

Trung

Nâu đen đậm,

Mùi không rõ

Hơi chua,

3,75

Nâu đậm

3,75

3,75

3,50

14,75 Kém

212

Du

nhiều vụn chè

rệt

hậu vị gắt

120

chè tổng loại mg/100g Mô tả Điểm Mô tả Điểm Mô tả Điểm Mô tả Điểm

3.4.4. Sự biến đổi chất lượng cảm quan của chè đen giàu GABA giống Phúc

Vân Tiên và Kim Tuyên trong quá trình bảo quản

3.4.4.1. Biến đổi độ ẩm của chè theo thời gian bảo quản

Nghiên cứu bảo quản được tiến hành từ ngày 10 tháng 8 năm 2019 đến 10

tháng 8 năm 2020 tại phòng thí nghiệm trường Cao đẳng Công nghiệp Thực

phẩm (Việt Trì). Các thời điểm lấy mẫu phân tích: Lần 1, ngày 10/8/2019 (thời

tiết mùa thu); Lần 2, ngày 10/01/2020 (thời tiết mùa đông); Lần 3, ngày

10/04/2020 (thời tiết mùa xuân); Lần 4, ngày 10/07/2020 (thời tiết mùa hạ);

Lần 5, ngày 10/8/2020 (thời tiết mùa thu). Lấy mẫu phân tích xác định độ ẩm

của chè ở từng thời điểm đã định đối với từng loại bao bì (từ B1 đến B3) và kết

quả nêu ở Bảng 3.37, Bảng 3.38 và Bảng 3.39.

Bảng 3.37. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được bảo

quản trong bao bì túi chất dẻo PE (B1)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Độ ẩm (%)

Phúc Vân Tiên 6,0 6,2 6,7 6,9 7,0

Kim Tuyên 6,5 6,7 6,8 7,0 7,0

Bảng 3.38. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được

bảo quản trong bao bì màng giấy (B2)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (Mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Độ ẩm (%)

Phúc Vân Tiên 16,0 6,5 7,9 7,7 6,4

121

Kim Tuyên 6,5 7,2 7,4 7,0 6,8

Bảng 3.39. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian của các mẫu chè được

bảo quản trong bao bì túi phức hợp hút chân không (B3)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (Mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Độ ẩm (%)

Phúc Vân Tiên 6,0 6,1 6,2 6,1 6,1

Kim Tuyên 6,5 6,6 6,6 6,6 6,6

Từ số liệu trong 3 bảng trên có thể thấy tất cả các mẫu chè được bảo quản

qua đúng 1 chu kỳ thời tiết 4 mùa, tức là qua các thời điểm: mát vào mùa thu,

lạnh vào mùa đông, ấm vào mùa xuân và nóng vào mùa hạ. Độ ẩm của chè có

sự biến động theo mùa. Độ ẩm của chè bảo quản trong 3 loại bao bì gồm túi

chất dẻo, túi phức hợp, biến động không nhiều, đặc biệt là túi phức hợp, độ

ẩm của chè gần như không thay đổi trong suốt 1 năm bảo quản. Điều này là

ưu điểm của loại bao bì này vì thế chúng được sử dụng để bảo quản chè sản

phẩm chè xanh, chè đen.

3.4.4.2. Sự biến đổi chất lượng cảm quan của chè theo thời gian bảo quản

trong các loại bao bì khác nhau

Hội đồng thử nếm gồm 7 thành viên để đánh giá chất lượng chè GABA bằng

phương pháp cảm quan theo thang điểm của chè đen và đánh giá chất lượng theo

Theo TCVN 3218 : 2012. Kết quả đánh giá Bảng 3.40, Bảng 3.41 và Bảng 3.42. Từ

những số liệu trong các bảng cho thấy ở tất cả các mẫu chè được bảo quản trong

3 loại bao bì, chất lượng sản phẩm chè giảm theo thời gian.

Chè được bảo quản trong nhóm bao bì túi giấy chất lượng sản phẩm giảm

hơn nhiều hơn so với được bảo quản trong túi PE và túi phức hợp. Điều này có

thể được giải thích do khi bảo quản bằng bao bì túi giấy, ô xy và ẩm có thể

xâm nhập vào để tiếp xúc với chè làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng chè. Bảo

quản trong túi PE, lượng ô xy còn lại rất ít do nằm ở khoảng không gian xung

122

quanh các phần tử chè nên chất lượng của chè ít bị ảnh hưởng hơn.

Bảng 3.40. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu

chè được bảo quản trong bao bì túi chất dẻo PE (B1)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Điểm cảm quan tổng hợp

Phúc Vân Tiên 18,60 17,75 17,00 16,50 14,25

Kim Tuyên 18,40 17,50 16,50 15,75 14,00

Bảng 3.41. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu

chè được bảo quản trong bao bì màng giấy (B2)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Điểm cảm quan tổng hợp

Phúc Vân Tiên 18,60 17,25 16,25 15,25 13,25

Kim Tuyên 18,40 17,00 15,00 14,75 13,00

Trong khi đó, bảo quản trong túi phức hợp hút chân không thì lượng ô xy

gần như không còn và do bao bì có khả năng chống xuyên thấm rất tốt, nên chất

lượng chè hầu như không bị ảnh hưởng. Điều này đã góp phần làm chè bảo

quản trong túi phức hợp cao hơn được bảo quản trong túi PE và túi giấy.

Như vậy, từ việc nghiên cứu bảo quản chè lên men có thể trong quá trình

bảo quản, chất lượng của chè bị biến động theo thời tiết và phụ thuộc vào bao

bì dùng để bao gói chè. Do đó, bao bì kín bằng vật liệu màng phức hợp hút chân

không có tác dụng hạn chế ô xy xâm nhập nên chất lượng chè ít biến đổi theo

123

thời gian bảo quản.

Bảng 3.42. Sự biến đổi chất lượng cảm quan theo thời gian của các mẫu

chè được bảo quản trong bao bì túi phức hợp (B3)

Thời điểm (tháng) 0 3 6 9 12

Thời tiết (mùa) Thu Đông Xuân Hạ Thu

Mẫu thực nghiệm Điểm cảm quan tổng hợp

Phúc Vân Tiên 18,60 18,60 18,60 18,20 17,75

18,40 18,40 18,00 17,50

18,40 Kim Tuyên 3.4.5. Tóm tắt kết quả và kết luận nội dung mục 3.4

(a) Đã thực hiện sản xuất 3 loại chè đen ở quy mô pilot 10 kg nguyên

liệu/mẻ theo 3 quy trình: Truyền thống (QT1); Có bổ sung công đoạn yếm khí

(QT2); Có bổ sung lên men yếm khí kết hợp lên men lactic (QT3). Ở quy mô

pilot, tương tự xu hướng ở quy mô nhỏ, hàm lượng GABA trong chè của quy

trình QT3 vẫn cao hơn đáng kể so với chè đen của quy trình QT2 và QT3. Hơn

thế nữa, hàm lượng GABA trong chè của QT2 và QT3 đều cao hơn so với các

giá trị tương ứng trong chè sản xuất ở quy mô nhỏ phòng thí nghiệm.

(b) Do bổ sung quá trình lên men yếm khí nên các chỉ tiêu chất lượng cảm

quan của chè đen theo quy trình QT3 và quy trình QT2 đều giảm nhẹ so với

quy trình QT1, cụ thể theo xu hướng: QT3 ≤ QT2 < QT1.

(c) Đã hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chè đen giàu GABA theo

phương pháp lên men kép, quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ, theo đó tập

trung ở công đoạn làm héo, vò chè, và lên men. Sau đó đã áp dụng quy trình đã

hoàn thiện này để sản xuất chè đen giàu GABA quy mô pilot với 4 giống chè

Việt Nam. Hai giống chè Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên vẫn vẫn được ghi nhận

có hàm lượng GABA cao nhất (265 mg/100g) và có tổng điểm chất lượng cảm

quan tương đương nhau (17,25 và 17,0 điểm).

(d) Chất lượng của chè giàu GABA từ giống Phúc Vân Tiên và Kim Tuyên

bị biến động theo thời tiết và phụ thuộc vào bao bì đóng gói chè. Bao bì kín

như túi màng phức hợp hút chân không duy trì tốt nhất chất lượng chè trong

124

suốt thời gian bảo quản 12 tháng ở nhiệt độ thường.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

1. Đã sàng lọc, lựa chọn, thẩm định đặc điểm hình thái, và định danh

được 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh tổng hợp gama-

aminobutyric axit (GABA). Hai chủng vi khuẩn L. casei VTCC-B-411 và L.

plantarum VTCC-B-439 có khả năng sinh tổng hợp GABA rất cao, không

những trong môi trường nuôi cấy nhân tạo mà còn trên cơ chất lá chè tươi. Các

thông số công nghệ tối ưu cho quá trình sản xuất giống vi khuẩn lên men đã

được xác định, bao gồm thành phần môi trường nuôi cấy bổ sung N, C,

glutamate, nhiệt độ 32oC, pH 7,4, thời gian 51 h.

2. Trong 4 giống chè trồng phổ biến ở Việt Nam là Keo Am Tích, Phúc

Vân Tiên, Kim Tuyên, và Trung Du, đã xác định và kiến nghị chọn chè Phúc

Vân Tiên và Kim Tuyên làm nguyên liệu để sản xuất chè đen giàu GABA vì

cho sản phẩm chè đen có hàm lượng GABA cao cùng chất lượng cảm quan

tốt hơn.

3. Lên men yếm khí nguyên liệu chè Phúc Vân Tiên trong môi trường

nghèo ô xy đã có tác dụng làm tăng rõ rệt hàm lượng GABA trong thành phẩm

chè đen (215 mg/100g) so với mức GABA trong chè đen không lên men yếm

khí (175 mg/100g), và trong lá chè nguyên liệu (72 mg/100g). Quá trình lên

men yếm khí không làm thay đổi đáng kể chất lượng cảm quan của chè đen

thành phẩm.

4. Đã xác định, tối ưu hóa và kiểm định thực nghiệm 2 thông số quan

trọng của công đoạn lên men yếm khí trong quy trình công nghệ sản xuất chè

đen giàu GABA là nhiệt độ 29oC ± 1oC và thời gian ủ lên men 9 h ± 1. Với các

thông số này, chè đen Phúc Vân Tiên cho hàm lượng GABA đạt mức 203

mg/100g và có tổng điểm cảm quan đạt 18,5.

5. Lên men chè bằng vi khuẩn lactic phối hợp cùng lúc với lên men yếm

125

khí đã làm tăng hàm lượng GABA cao hơn đáng kể so với từng quá trình riêng

rẽ, trong khi vẫn đảm bảo được ở mức độ nhất định chất lượng cảm quan của

chè đen thành phẩm.

6. Từ khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa đa yếu tố, đã xác định được các

thông số thích hợp và tối ưu cho quá trình lên men kép (yếm khí + vi khuẩn

lactic). Theo đó, tỷ lệ giống vi khuẩn 2,5%, độ ẩm chè vò 68%, nhiệt độ lên men

27oC, thời gian lên men 11,5 h. Trong điều kiện này, hàm lượng GABA của sản

phẩm đạt 275 mg/100g và các chỉ tiêu chất lượng ở mức hài hòa nhất có thể.

7. Đã thiết lập và hoàn thiện được quy trình công nghệ sản xuất chè đen

giàu GABA ở quy mô pilot 10 kg nguyên liệu/mẻ. Quy trình đã được áp dụng

trong sản xuất thử nghiệm cho sản phẩm chè có hàm lượng GABA 265 mg/100g

và có tổng điểm chất lượng cảm quan cao (17,25).

8. Chất lượng của chè giàu GABA bị biến động theo thời tiết và phụ thuộc

vào bao bì đóng gói. Tuy nhiên, với bao bì kín như túi màng phức hợp, chất lượng

của chè được duy trì trong suốt thời gian bảo quản 12 tháng.

2. Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ để làm tăng hàm

lượng GABA và chất lượng cảm quan của sản phẩm chè đen giàu GABA.

2. Mở rộng nghiên cứu nhằm áp dụng cho sản xuất các loại chè giàu

GABA khác như chè xanh, chè ô long, nước chè.

3. Tiếp cận chuyển giao công nghệ cho một số cơ sở sản xuất chè ở Việt Nam.

126

*******

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CỦA LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Việt Phương, Vũ Đình Chương, Đào Thị Việt

Hà (2019). Nghiên cứu, khảo sát lựa chọn giống chè phù hợp để sản xuất

chè GABA. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Bộ Công Thương, 37, 39-41.

2. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Thịnh, Nguyễn Duy Lâm (2020). Tuyển

chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzym glutamate-

decarboxylaza hoạt lực cao nhằm sử dụng lên men chè đen thu sản phẩm

giàu gama amiobutyric axit (GABA). Tạp chí Công Thương, 21, 38-43.

3. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2020). Xác định điều kiện thích hợp

lên men chè nhằm thu sản phẩm giàu Gama-Aminobutyric Axit. Tạp chí

khoa học Trường Đại học Mở Hà Nội, 73, 79-84.

4. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2021). Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy

vi khuẩn lactic VTCC-B-439 và VTCC-B-411 để sử dụng lên men yếm khí

nhằm thu chè đen giàu Gama-Aminobutyric Axit (GABA). Tạp chí công

thương, 26, 389-393.

5. Nguyễn Việt Tấn, Nguyễn Duy Lâm (2021). Tối ưu hoá quá trình lên men

chè đen bằng vi khuẩn lactic. Tạp chí khoa học Trường Đại học Mở Hà

Nội, 86, 01-09.

127

*******

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tiếng Việt

[1] Đỗ Văn Chương (2009). Giáo trình kỹ thuật chế biến Chè. Trường Đại

học kinh tế kỹ thuật, Hà Nội.

[2] Phạm Việt Cường, Hoàng Đình Hòa (2017). Tối ưu hóa trong công

nghiệp thực phẩm và công nghệ sinh học, Nxb. Khoa học tự nhiên và

công nghệ, Hà Nội.

[3] Trịnh Tất Cường (2013), Nghiên cứu qui trình sản xuất axit gamma amino

butyric từ lên men dịch cám gạo bằng lactobacillus để ứng dụng làm thực

phẩm chức năng. Báo cáo tổng kết đề tài Bộ Khoa học và Công nghệ, Đại

học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.

[4] Đống Thị Anh Đào, và Trương Nhật Trung (2016). Làm giàu hàm lượng

Gamma- Amino Butiric Axit (GABA) trên hạt đậu xanh dưới điều kiện

nảy mầm hypoxia-anaerobic và đánh giá sự hao tổn này sau quá trình

luộc. Tạp chí Phát triển KHCN, 19 (K7).

[5] Đào Thị Việt Hà (2012). Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè lên men từ

chè Shan và ứng dụng để sản xuất nước giải khát. Luận án Tiến sỹ, Đại

học Bách Khoa Hà Nội.

[6] Đào Thị Việt Hà (2019). Sản xuất chè lên men từ chè Shan tuyết Hà Giang

phục vụ tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Báo cáo tổng kết dự án sản

xuất Bộ Công Thương của Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm

Việt Trì.

[7] Ngô Hữu Hợp (1995). Hóa sinh chè. Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

[8] Trương Hương Lan (2019). Sản xuất thử nghiệm chế phẩm gamma amino

butyric (GABA) và thực phẩm chức năng giàu GABA từ gạo lứt, đậu

tương. Báo cáo tổng kết Dự án cấp Nhà nước DAĐL.CN-03/16.

[9] Đỗ Văn Ngọc, Trịnh Văn Loan (2008). Các biến đổi hóa sinh trongquá

trình chế biến và bảo quản chè. Nxb Nông nghiệp Hà Nội.

[10] Cung Thị Tố Quỳnh (2013). Nghiên cứu và phát triển quy trình công

128

nghệ sản xuất gạo mầm và ứng dụng trong sản xuất đồ uống. Báo cáo

tổng kết đề tài cấp Bộ Khoa học và Công nghệ của Trường Đại học Bách

Khoa Hà Nội

[11] Bùi Thế Tâm, Đặng Vũ Thiệu (1999). Các phương pháp tối ưu hoá. Nxb

Giao thông vận tải, Hà Nội.

[12] Nguyễn Việt Tấn (2020). Nghiên cứu công nghệ sản xuất chè giàu

Gamma Aminobutyric Axit (GABA) bằng công nghệ lên men từ một số

giống chè tại Việt Nam. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ Công Thương của

Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm Việt Trì.

[13] Nguyễn Văn Toản, Lê Văn Luận, Hồ Đắc Nhân, Tống Thị Quỳnh Anh

(2019). Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố trong giai đoạn ngâm và ủ đến

khả năng sinh tổng hợp GABA của giống lúa tím thảo dược Vĩnh Hòa (VH1).

2. Tiếng Anh

[14] Abdou A.M., S. Higashiguchi, K. Horie, M. Kim, H. Hatta, H. Yokogoshi

(2006). Relaxation and immunity enhancement effects of γ-Aminobutyric

acid (GABA) administration in humans. Biofactors, 26, 201-208.

[15] Abe M., Takaoka N., Idemoto Y., Takagi C., Imai, T., Nakasaki K.

(2008). Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer

tea. International Journal of Food Microbiology, 124 (2), 199-203.

[16] Akihiro T., Koike S., Tani R., Tominaga T., Watanabe S., Iijima Y., Ezura

H. (2008). Biochemical mechanism on GABA accumulation during fruit

development in tomato. Plant Cell Physiol., 49, 1378-1389.

[17] Alcázar A., Ballesteros O., Jurado J.M., Pablos F., Martín M.J., Vilches

J.L., Navalón A. (2007). Differentiation of green, white, black, oolong,

and Pu-erh teas according to their free amino acids content. J. Agric.

Food. Chem., 55, 5960-5965.

[18] Ando A., T. Nakamura (2016). Prevention of GABA reduction during

dough fermentation using a baker’s yeast dal81 mutant. J. Biosci.

129

Bioeng., 122(4), 441-445.

[19] Anggraini L., Y. Marlida, N. Huda (2019). Isolation and characterization

of lactic acid bacteria producing GABA from indigenous west sumatera

fermented food. Adv. Sci. Eng. Info. Technol., 9(3), 855-860.

[20] Araujo W. L., Nunes-Nesri A., Trenkamp S., Bunik V. I., Fernie A. R.

(2008). Inhibition of 2-oxoglutarate dehydrogenase in potato tubers

suggests the enzym is linked to respiration and confirms its importance in

nitrogen assimilation. Plant Physiology, 148, 1782-1796.

[21] Bajic S.S., J. Djokic, M. Dinic, K. Veljovic, N. Golic (2019). GABA-

producing natural dairy isolate from artisanal zlatar cheese attenuates gut

inflammation and strengthens gut epithelial barrier in vitro. Front.

Microbiol., 10(527), 1-13.

[22] Bi W., Hea C., Ma Y., Shena J., Zhang L.H., Penga Y., Xiao P. (2018).

Investigation of free amino acid, total phenolics, antioxidant activity and

purine alkaloids to assess the health properties of non - Camellia tea. Acta

Pharmaceutica Sinica B, 6(2), 170-181.

[23] Bostanci S. & Koca I. (2017). A bioactive compound of tea: gamma-

aminobutyric acid (GABA). The 1st International Congress on Medicinal

And Aromatic Plants, Konya.

[24] Bouche N., & Fromm H. (2004). GABA in plants: Just a metabolite?

Trends in Plant Science, 9, 110-115.

[25] Bouche N., Fait A., Bouchez D., Møller S.G., Fromm H. (2003).

Mitochondrial succinic-semialdehyde dehydrogenase of the γ-amino-

butyrate shunt is required to restrict levels of reactive oxygen

intermediates in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America, 100, 6843-6848.

[26] Briguglio M., Dell’Osso B., Panzica G., Malgaroli A., Banfi G., Zanaboni

Dina C., Porta M. (2018). Dietary Neurotransmitters: A narrative review

130

on current knowledge. Nutrients, 10, 591-598.

[27] Cappelletti S., Piacentino D., Daria P., Sani G., Aromatario M.

(2015). Caffeine: cognitive and physical performance enhancer or

psychoactive drug?. Current Neuropharmacology, 13(1), 7188.

[28] Chen H., H. Xuanhui, J.L. Yan Liu, H. Qingyong, Z. Cuiying, W. Benjun,

Z. Ye, W. Jie (2016). Extraction, purification and anti-fatigue activity of

γ-aminobutyric acid from mulberry (Morus alba L.) leaves. Sci. Rep., 6

(18933), 1-10.

[29] Cheng T.C., Tsai J.F. (2009). GABA tea helps sleep. Journal of

Alternative and Complementary Medicine, 15(7), 697-701.

[30] Cherng S.H., Huang C.Y., Kuo W.W., Lai S.E, Tseng C.Y., Lin Y.M.,

Tsai F.J, Wang H.F. (2014). GABA tea prevents cardiac fibrosis by

attenuating TNF - alpha and Fas/FasL - mediated apoptosis in

streptozotocin - induced diabetic rats, Food and Chemical Toxicology,

65, 90-96.

[31] Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C. (2007). Production of

gammaaminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated

from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells. J. Microbiol.

Biotechnol. 17, 104-109.

[32] Chung-Ang University Industry-University Cooperation Foundation,

Rice Tech, South Korea. Assignee. Novel Strain of Lactic Acid Bacteria

Capable of Producing Gamma-Amino Buyric Acid and Preparing Method

for Gamma-Amino Butyric Acid Using the Same KR20120007917A.

2012.

[33] Coda R., Melama L., Rizzello C.G., Curiel J.A., Sibakov J., Holopainen

U., Sozer N. (2015). Effect of air classification and fermentation by

Lactobacillus plantarum VTT E-133328 on faba bean (Vicia faba L.)

flour nutritional properties. Int. J. Food Microbiol., 193, 34-42.

[34] Cooper R., Morre D.J., Morre D.M. (2005a). Medicinal benefits of green

tea Part I. Review of Non-Cancer Health Benefits. J Altern Complement

131

Med., 11, 521-528.

[35] Cooper R., Morre D.J., Morre D.M. (2005b). Medicinal benefits of green

tea Part II. Review of Anti Cancer Properties. J Altern Complement Med.,

11, 639-652.

[36] Cotter P.D., Gahan C.G.M., Hill C. (2001). Mol. Microbiol., 40, 465-475.

[37] de Carvalho L.P.S., Ling Y., Shen C., Warren J.D., Rhee K.Y. (2011).

Arch. Biochem. Biophys., 509, 90-99.

[38] Dhakal R., Bajpai V.K., Baek K.-H. (2012). Production of GABA (γ-

aminobutyric acid) by microorganisms: A review. Braz. J. Microbiol., 43,

1230-1241.

[39] Diana M., Quílez J., Rafecas M. (2014). Gamma-aminobutyric acid as a

bioactive compound in foods: A review. J. Funct. Foods, 10, 407-420.

[40] Enna S.J. (2006). GABA, Academic Press, Elsevier: San Diego, CA,

USA.

[41] Feehily C., Karatzas K.A.G. (2013). J. Appl. Microbiol. 114(1), 11-24.

[42] Foster J.W. (2004). Nat. Rev. Microbiol., 2, 898-907.

[43] Francis G.A., Scollard J., Meally A., Bolton D.J., Gahan C.G.M., Cotter

P.D., Hill C., O’Beirne D. (2007). J. Appl. Microbiol., 103, 2316-2324.

[44] Gan, R.-Y., Lui, W.-Y., Wu, K., Chan, C.L., Dai, S.H., Sui, Z.Q., Corke, H.

(2017). Bioactive compounds and bioactivities of germinated edible seeds

and sprouts: An updated review. Trends Food Sci. Technol., 59, 1-14.

[45] Gareau M.G., Sherman P.M., Walker W.A. (2010). Nat. Rev.

Gastroenterol. Hepatol., 7, 503-514.

[46] Gilliham, M., & Tyerman, S. D. (2016). Linking metabolism to

membrane signaling: The GABA-malate connection. Trends in Plant

Science, 21, 295-301.

[47] Gladkevich A., Korf J., Hakobyan V., Melkonyan K. (2006). The

peripheral GABAergic system as a target in endocrine disorders. Auton.

Neurosci., 124, 1-8.

[48] Gong Jia-shun, Zhou H.J., Zhang X.F., Song Shan, An W.J. (2005).

132

Changes of chemical components in Pu'er tea produced by solid state

fermentation of sundried green tea. Journal of Tea Science. 25(3),

126-132.

[49] Haas Doris, Pfeifer Bettina, Reiterich Christoph, Partenheimer Regina,

Reck Bernhard, Buzina Walter, Samson R.A. (2013). Identification and

quantification of fungi and mycotoxins from Pu-erh tea. International

Journal of Food Microbiology, 166(2), 316-322.

[50] Han S., S. Jeon, H. Lee, J. Lee (2017). Screening of γ -aminobutyric acid

(GABA) -producing wild yeasts and their microbiological characteristics,

Microbiology 45(3), 199-203.

[51] Han S.M. & J.S. Lee (2017). Production and its anti-hyperglycemic

effects of γ-aminobutyric acid from the wild yeast strain Pichia silvicola

UL6-1 and Sporobolomyces carnicolor 402-JB-1. Mycobiology, 45(3),

199-203.

[52] Hanshan Normal University (2011). Asgnee. Method for biologically

synthesizing gamma-aminobutyric acid by pediococcus pentosaceus

CN101654689A. 2011.

[53] Harnentis H., N. Nurmiati, Y. Marlida, F. Adzitey, N. Huda (2019). γ -

Aminobutyric acid production by selected lactic acid bacteria isolate of

an Indonesian indigenous fermented buffalo milk (dadih) origin. Vet.

World, 12, 2231-2916.

[54] Hayakawa K., M. Kimura, K. Kasaha, K. Matsumoto, H. Sansawa (2004).

Effect of a γ-aminobutyric acid-enriched dairy product on the blood

pressure of spontaneously hypertensive and normotensive Wistar - kyoto

rats. Br. J. Nutr. 92, 411-417.

[55] Hayat A., Jahangir T.M., Yar Khuhawar M.Y., Alamgir M., Hussain Z.,

Haq F.U., Syed Ghulam Musharraf S.G. (2015). HPLC determination of

gamma amino butyric acid (GABA) and somebiogenic amines (BAs) in

controlled, germinated, and fermentedbrown rice by pre-column

133

derivatization. Journal of Cereal Science, 64, 56-62.

[56] Hepsomali P., Groeger J.A., Nishihira J., Scholey A. (2020). Effects of

oral gamma-aminobutyricacid (GABA) administration on stres and sleep

in humans: A systematic review. Front. Neurosci., 14, 923-930.

[57] Hilal Y. (2017). Morphology, manufacturing, types, composition and

medicinal properties of tea (Camellia sinensis). J. Basic Appl. Plant Sci.,

1, 107-114.

[58] Hong J. & K. Kim (2019). Biochemical and biophysical research

communications crystal structure of γ-aminobutyrate aminotransferase in

complex with a PLP-GABA adduct from Corynebacterium glutamicum.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 514(3), 601-606.

[59] Hong Seung-Beom, Lee Mina, Kim Dae-Ho, Varga Janos, Frisvad Jens

C., et al. (2013). McCluskey Kevin (ed.). Aspergillus luchuensis, an

industrially important black Aspergillus in East Asia. PLOS ONE, 8(5),

63769.

[60] Hua-Fu Wang, Xiao-Qing You, Zong-Mao Chen (2002). Zhen Yong-su

(ed.). Tea: Bioactivity and Therapeutic Potential. Taylor & Francis.

p. 104.

[61] Huang C.Y., Kuo W.W., Wang H.F., Lin C.J., Lin Y.M. Chen J.L., Kuo

C.H., Chen P.K., Lin J.Y. (2014). GABA tea ameliorates cerebral cortex

apoptosis and autophagy in streptozotocin - induced diabetic rats. Journal

of Functional Foods, 6, 534-544.

[62] Hou Y., Ren H., Wang K., Cao S., Zheng, Y., Wei, Y., et al. (2022).

Influence of fresh-cut process on γ-aminobutyric acid (GABA)

metabolism and sensory properties in carrot. J. Food Sci. Technol. 59,

552-561.

[63] Huang Q. & C.Z.C. Liu (2013). Gamma-aminobutyric acid binds to

GABA B receptor to inhibit cholangiocarcinoma cells growth via the

JAK/STAT3 pathway. Dig. Dis. Sci, 58, 734-743.

[64] Huang Y.H., Zheng H.F., Liu X.L., Wang X. (2005) Studies of the variation

134

of GABA and Glu in gabaron tea process. Food Sci., 26, 117-120.

[65] Janse van Rensburg H.C., Van den Ende W. (2020). Priming with γ-

aAminobutyric acid against Botrytis cinerea Reshuffles Metabolism and

Reactive Oxygen Species: Dissecting signalling and metabolism.

Antioxidants (Basel), 9(12), 1174-1179.

[66] Jt B. & Je D. (2020). Black tea flavonoids: A focus on thearubigins and

their potential roles in diet & health. Nutr. Food Technol. Open Access 6.

[67] Kim D.H., C. Dasagrandhi, S.K. Park, S.H. Eom (2018). Optimization of

gamma-aminobutyric acid production using sea tangle extract by lactic

acid bacterial fermentation. LWT - Food Sci. Technol. (Lebensmittel-

Wissenschaft -Technol.), 90, 636-642.

[68] Kim M.J., Kim K.S. (2012). Isolation and identification of γ-

aminobutyric acid (GABA)-producing lactic acid bacteria from kimchi. J.

Korean Soc. Appl. Biol. Chem., 55, 777-785.

[69] Komatsuzaki N., Shima J, Kawamotoa S., Momosed H., Kimurab T.

(2005). Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus

paracasei isolated from traditional fermented foods. Food Microbiol. 22,

497-504.

[70] Kumar S., & N.S. Punekar (1997). The metabolism of 4-aminobutyrate

(GABA) in fungi, Mycol. Res., 101(4), 403-409.

[71] Lee M. & Peng J. (2010) Effects of fermentation time and seasons on the

γ-aminobutyric acid and glutamic acid contents of TTES - 12 GABA tea

producing. The 5th International Symposium on Machinery and

Mechatronics for Agriculture and Biosystems Engineering (ISMAB), 5-

7 April, Fukuoka, Japan.

[72] Li H. & Y. Cao (2010). Lactic acid bacterial cell factories for gamma-

aminobutyric acid. Amino Acids, 39, 1107-1116.

[73] Li H., Qiu T., Gao D., Cao Y. (2010). Medium optimization for

production of gamma-aminobutyric acid by Lactobacillus brevis

135

NCL912. Amino Acids, 38, 1439-1445.

[74] Li L., Liu B. Zheng X. (2011). Bioactive ingredients in adzuki bean

sprouts. J. Med. Plants Res., 5, 5894-5898.

[75] Liang Y., Lu J., Zhang L., Wu S., Wu Y. (2003). Estimation of black tea

quality by analysis of chemical composition and colour difference of tea

infusions. Food Chem. 80, 283-290.

[76] Liao W., C. Wang, Y. Shyu, R. Yu, K. Ho (2013). Influence of

preprocessing methods and fermentation of adzuki beans on γ-

aminobutyric acid (GABA) accumulation by lactic acid bacteria. J. Funct.

Foods, 5(3), 1108-1115.

[77] Lim H.S., I.-T. Cha, S.W. Roh, H.-H. Shin, M.-J. Seo (2017). Enhanced

production of gamma-aminobutyric acid by optimizing culture conditions

of Lactobacillus brevis HYE1 isolated from kimchi, a Korean fermented

food, J. Microbiol. Biotechnol., 27(3), 450-459.

[78] Lin S.D., Maub J.L., Hsu A.A. (2012). Bioactive components and

antioxidant properties of γ-aminobutyric acid (GABA) tea leaves. LWT -

Food Science and Technology, 46, 64-70.

[79] Lin Z., Lin Z.M., Yin J.F., Tan J.F. (2004). Influence of anaerobic

treatment on the amount of γ-aminobutyric acid and the quality of tea leaf.

Food Sci., 25, 35-39.

[80] Ling Tie-Jun, Wan Xiao-Chun, Ling Wei-Wei, Zhang Zheng-Zhu, Xia

Tao, Li Da-Xiang, Hou Ru-Yan (2010). New triterpenoids and other

constituents from a special microbial-fermented tea—fuzhuan brick

tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(8), 4945-4950.

[81] Liu Tong (2005). Chinese tea. Beijing: China Intercontinental Press.

p. 137.

[82] Liu W., D.O. Son, H.K. Lau, Y. Zhou, G.J. Prud, G.M. Leggio (2017).

Combined oral administration of GABA and DPP-4 inhibitor prevents

beta cell damage and promotes beta cell regeneration in mice, Front.

136

Pharmacol, 8(362), 1-10.

[83] Lu X., Xie C., Gu Z. (2008). Isolation of γ-aminobutyric acid producing

bacteria and optimization of fermentative medium. Biochem. Eng. J. 41,

48-52.

[84] Lv Hai-peng, Zhang Ying-jun, Lin Zhi, Liang Yue-rong (2013).

Processing and chemical constituents of Pu-erh tea: A review. Food

Research International, 53(2), 608-618.

[85] Ma Z., Richard H., Tucker D.L., Conway T., Foster J.W. (2001). J.

Bacteriol., 184, 7001-7012.

[86] MarketWatch (2021). GABA Market Size, 2021 Regions Will Have the

Highest Revenue, Which Will Emerge in Importance in the Market 2026.

Available online: https://www.marketwatch.com/press-release/gaba-

market-size-2021-regions-will-have-the-highest-revenue-which-will-

emerge-in-importance-in-the-market-2026-2021-04-25 (accessed on 10

May 2021)

[87] Martin D.L., Rimvall K. Regulation of γ-aminobutyric acid synthesis in

the brain. J. Neurochem. 1993, 60, 395-407.

[88] Martínez-Villaluenga, C., Kuo, Y.-H., Lambein, F., Frías, J., Vidal-

Valverde, C. (2006). Kinetics of free protein amino acids, free non-

protein amino acids and trigonelline in soybean (Glycine max L.) and

lupin (Lupinus angustifolius L.) sprouts. Eur. Food Res. Technol., 224,

177-186.

[89] Mau J.L., Chiou S.Y., Hsu C.A., Tsai H.L., Lin S.D. (2012).

Antimutagenic and antimicrobial activities of γ - aminobutyric acid

(Gaba) tea extract, IPCBEE, 39, 178-182.

[90] McKay D.L., Blumberg J.B. The role of tea in human health (2002). An

update. J. Am. Coll. Nutr. 21: 1-13.

[91] Michaeli, S., Fait, A., Lagor, K., Nunes-Nesi, A., Grillich, N., Yellin, A.,

Bar, D., Khan, M., Fermie, A.R., Turani, F.J. & Fromm, H. (2011). A

137

mitochondrial GABA permease connects the GABA shunt and the TCA

cycle, and is essential for normal carbon metabolism. The Plant Journal

for Cell and Molecular Biology, 67, 485-498.

[92] Mo Haizhen, Zhu Yang, Chen Zongmao (2008). Microbial fermented tea

- a potential source of natural food preservatives. Trends in Food Science

& Technology, 19(3), 124-130.

[93] Mogensen J.M., Varga, J., Thrane U., Frisvad J.C., Imai T, Nakasaki K.

(2009). Aspergillus acidus from Puerh tea and black tea does not produce

ochratoxin A and fumonisin B2. International Journal of Food

Microbiology, 132(2-3), 141-144.

[94] Nantong Licheng Biological Engineeering Co. Ltd. (2013). Asignee.

Biological method for preparing gamma-aminobutyric acid

CN102796779B. 2013.

[95] Ngo D.H., Vo T.S. (2019). An updated review on pharmaceutical

properties of gamma-aminobutyric acid. Molecules, 24, 2678-2685.

[96] Nguyen Quoc Sinh Nguyen, Nguyen Van Toan, Do Thi Bich Thuy, Le

Thanh Long, Ho Sy Vuong, Nguyen Thi Diem Huong, Nguyen Cao

Cuong, Vo Van Quoc Bao (2016). Effects of anaerobic fermentation in a

nitrogen atmosphere on bioactive compound content in Vietnamese

GABA tea. J. Agricultural Science and Technology - Nong Lam

University HCMC, 6/2016.

[97] Nikmaram N., Dar B.N., Roohinejad S., Koubaa M., Barba F.J., Greiner R.,

Johnson S.K. (2017). Recent advances in gamma-aminobutyric acid (GABA)

properties in pulses: An overview. J. Sci. Food Agric., 97, 2681-2689.

[98] Oh, S.-H., Moon, Y.-J., Oh, C.-H. (2003). γ-Aminobutyric acid (GABA)

content of selected uncooked foods. Prev. Nutr. Food Sci., 8, 75-78.

[99] Ohmori T., M. Tahara, T. Ohshima (2018). Mechanism of gamma-

aminobutyric acid (GABA) production by a lactic acid bacterium in

yogurt-sake. Process Biochem., 74, 21-27.

[100] Ou A.S.M., Tsai Y.S., Wang H.F. (2009). Biological functions and

manufacturing of GABA tea, tea and tea products. Chemistry and Health-

138

Promoting Properties, Taylor & Francis Group, LLC.

[101] Perpetuini G., R. Tofalo, F. Tittarelli, N. Battistelli, G. Suzzi, R. Tofalo

(2020). γ-aminobutyric acid produuction by Klyveromyces marxianus

strains, J. Appl. Microbiol., 129(6), 1609-1619.

[102] Phạm Quang Trung & Nguyen Công Ha (2016). Changes of Chemical

properties and functional compounds during the germination of various

brown rice in Mekong Delta Viet Nam". Agric. Food Tech, 6 (2), 1-6.

[103] Pouliot-mathieu K., C. Gardner-fortier, S. Lemieux, D. St-gelais, C.P.

Champagne, J. Vuillemard (2013). Effect of cheese containing gamma-

aminobutyric acid-producing lactic acid bacteria on blood pressure in

men. PharmaNutrition, 1(4), 141-148.

[104] Rai A.K., A. Pandey, D. Sahoo (2019). Biotechnological potential of yeasts

in functional food industry. Trends Food Sci. Technol., 83, 129-137.

[105] Ramos-Ruiz R., Martinez F., Knauf-Beiter Gertrude (2019). The effect of

GABA in plants. Cogent Food & Agriculture, 5, 1-12.

[106] Rao L.J.M., Ramalakshmi K. (2011) High impact value-added products

of tea. Recent Trends in Soft Beverages, 125-126.

[107] Rashmi D., R. Zanan, S. John, K. Khandagale (2018). γ-aminobutyric

acid (GABA): biosynthesis, role, commercial production, and

applications, first ed., pp. 413-452, 57, chapter 13.

[108] Renault H., El Amrani A., Berger A., Mouille G., Soubigou L., Taconnat L.,

Bouchereau A. (2013). γ-aminobutyric acid transaminase deficiency impairs

central carbon metabolism and leads to cell wall defects during salt stres in

Arabidopsis roots. Plant, Cell and Environment, 36, 1009-1018.

[109] Roberts M.R. (2007). Does GABA Act as a Signal in Plants? Hints from

Molecular Studies: Hints from Molecular Studies. Plant Signal. Behav.,

2, 408-409.

[110] Roohinejad S., K. Mallikarjunan M. Koubaa U. States (2018). Gamma-

Aminobutyric Acid Production of GABA by Plants. Encyclopedia of

139

Food Chemistry, pp. 528-534.

[111] Sano M., Tabata M., Suzuki M., Degawa M., Miyase T., Maeda-

Yamamoto M. (2001). Simultaneous determination of twelve tea

catechins by high-performance liquid chromatography with

electrochemical detection. The Analyst, 126, 816-820.

[112] Sasaki S., T. Yokozawa, E.J. Cho, S. Oowada, M. Kim (2006). Protective

role of γ-aminobutyric acid against chronic renal failure in rats. J. Pharm.

Pharmacol., 58(11), 1515-1525.

[113] Schneider C. & Segre T. (2009). Green Tea: Potential Health Benefits.

Am FamPhysician, 79, 591-594.

[114] Seok J.-H., Park K.-B., Kim Y.-H., Bae M.-O., Lee M.-K., Oh S.-H.

(2008). Production and characterization of kimchi with enhanced levels

of γ-aminobutyric acid. Food Sci. Biotechnol., 17, 940-946.

[115] Shimada M., T. Hasegawa, C. Nishimura, H. Kan, T. Kanno, T.

Nakamura, T. Matsubayashi (2009). Anti-hypertensive effect of g -

aminobutyric acid (GABA) -rich chlorella on high-normal blood pressure

and borderline hypertension in placebo controlled double blind study.

Clin. Exp. Hypertens., 31, 342-354.

[116] Snedden, W. A., Arazi, T., Fromm, H., & Shelp, B. J. (1995).

Calcium/calmodulin activation of soybean glutamate decarboxylase.

Plant Physiology, 108, 543-549.

[117] Suwanmanon K. & P. Hsieh (2014). Effect of γ-aminobutyric acid and

nattokinase- enriched fermented beans on the blood pressure of

spontaneously hypertensive and normotensive Wistar e Kyoto rats. J.

Food Drug Anal., 22(4), 485-491.

[118] Syu K.Y., Lin C.L., Huang H.C., Lin J.K. (2008). Determination of

theanine, GABA, and other amino acids in green, oolong, black, and pu -

erh teas with dabsylation and high - performance liquid chromatography.

J Agric Food Chem, 56, 7637-7643.

[119] Takemoto M. & Takemoto H. (2018). Synthesis of theaflavins and their

140

functions. Molecules 23: 918.

[120] Tang A. S., Chung S. W., Kwong K., Xiao Y. Chen M. Y., Ho Y. Y., Ma

S. W. (2011). Ethyl carbamate in fermented foods and beverages: Dietary

exposure of the Hong Kong population in 2007-2008. Food Additives &

Contaminants. Part B, Surveillance, 4(3), 195-204.

[121] Tsushida T., Murai T., Omori M., Okamoto J. (1987). Production of new

type tea containing a high level of γ-aminobutyric acid, Nippon

Nogeikagaku Kaishi, 61(7), 817-822.

[122] US FDA (2021). US National Library of Medicine. Substance

Registration System-Unique Ingredient Indentifier (UNII). Available

online: https://fdasis.nlm.nih.gov/srs/ (accessed on 24 March 2021).

[123] US NIH (2021). Gamma-Aminobuytyric-Acid. United States National

Institutes of Health. Available online: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.

gov/compound/ gamma-Aminobutyric-acid (accessed on 5 May 2021).

[124] Varga J., Frisvad J.C., Kocsubé S., Brankovics B., Tóth B., Szigeti G.,

Samson R.A. (2011). New and revisited species in Aspergillus section

Nigri. Studies in Mycology, 69(1), 1-17.

[125] Vinson JA. (2000). Black and green tea and heart disease: A review.

BioFactors 13: 127-132.

[126] Wan Y., Wang Q., Prud’homme G.J. (2015). GABAergic system in the

endocrine pancreas: A new target for diabetes treatment. Diabetes Metab.

Syndr. Obes., 8, 79-87.

[127] Wang H.F., Tsai Y.S., Lin M.L., Ou, A.S.M. (2006) Comparison of

bioactive components in GABA tea and green tea produced in Taiwan,

Food Chem, 96(4), 648-653.

[128] Wang J.J., Lee C.L., Pan T.M. (2003). Improvement of monacolin K, γ-

aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of

environmental conditions of Monascus purpureus NTU 601. J. Ind.

Microbiol. Biotechnol. 30, 669-676.

[129] Watchararparpai W., Laohakunjit N., Kerdchoenchuen O., (2010). An

Improved process for high quality and nutrition of brown rice production.

141

Food Science and Technology International, 16(2), 147-158.

[130] Wu C., Y.-H. Hsueh, J.-M. Kuo, S.-J. Liu (2018). Characterization of a

potential probiotic Lactobacillus brevis RK03 and efficient production of

γ-aminobutyric acid in batch fermentation, Int. J. Mol. Sci. 19 (143), 1-16.

[131] Wu Q., N.P. Shah (2018). Restoration of GABA production machinery in

Lactobacillus brevis by accessible carbohydrates, anaerobiosis and early

acidification. Food Microbiol., 69, 151-158.

[132] Xu J.-G. & Hu Q.-P. (2014). Changes in γ-aminobutyric acid content and

related enzym activities in Jindou 25 soybean (Glycine max L.) seeds

during germination. LWT Food Sci. Technol., 55, 341-346.

[133] Xu N., Wei L., Liu J. (2017). Biotechnological advances and perspectives

of gamma-aminobutyric acid production. World J. Microbiol.

Biotechnol., 33(3), 64.

[134] Yamamoto Takehiko, Juneja Lekh Raj, Chu Djoin-Chi, Kim Mujo, eds.

(1997). Chemistry and Applications of Green Tea. CRC Press, p.6.

[135] Yang S.Y., Lu F.X., Lu Z.X., Bie X.M., Jiao Y., Sun L.J., Yu B. (2008).

Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivarius

subsp thermophilus Y2 under submerged fermentation. Amino Acids, 34,

473-478.

[136] Yang, R., Yin, Y., & Gu, Z. (2015). Polyamine degradation pathway

regulating growth and GABA accumulation in germinating Fava bean

under hypoxia-NaCl stres. Journal of Agricultural Science and

Technology, 17, 311-320.

[137] Yu K., Hu S., Huang J., Mei L.H. (2011). A high-throughput colorimetric

assay to measure the activity of glutamate decarboxylase. Enzym Microb

Technol., 49(3), 272-276.

[138] Yuan C., H.V. Lin, G. Jane (2013). Gamma-aminobutyric acid production

in black soybean milk by Lactobacillus brevis FPA 3709 and the

antidepressant effect of the fermented product on a forced swimming rat

142

model, Process Biochem. 48(4), 559-568.

[139] Zeng Z., Wu C., Huang Y., Wu J. (2012). Study on flavour volatiles of γ-

aminobutyric acid (GABA) green tea. African Journal of Biotechnology,

11(51), 1333-11341.

[140] Zhang Q., S. Qing, T. Xiao, Z. Shuming, Z. Lin, T. Jie, X. Wenliang

(2019). Characterization of γ -aminobutyric acid (GABA) -producing

Saccharomyces cerevisiae and coculture with Lactobacillus plantarum for

mulberry beverage brewing. J. Biosci. Bioeng., 129(4), 447-453.

[141] Zhong Y., S. Wu, F. Chen, M. He, J. Lin (2019). Isolation of high γ -

aminobutyric acid - producing lactic acid bacteria and fermentation in

mulberry leaf powders. Experimental and Therapeutic Medicine, 18,

147-153.

[142] Zhu N., Wang T., Ge L., Li Y., Zhang X., Bao H. (2017). Gamma-amino

butyric acid (GABA) synthesis enabled by copper-catalyzed

carboamination of alkenes. Org. Lett., 19, 4718-4721.

[143] Oketch-Rabah H.A. et al. (2021). United States pharmacopedia (USP)

safety review of gamma-aminobutyric acid (GABA). Nutrients, 13, 2742.

[144] Sahab N.R.M., Subroto E., Balia R.L., Utama G.L. (2020). γ-

aminobutyric acid found in fermented foods and beveragesL curent

trends. Heliyon,6, e05526.

[145] Choi S-H, Kim I-D, Dhungana S.K., Shin D-H. (2022). Comparison of

quality and bioactive components of Korean green, white, and black teas

and their associated GABA teas. Korean J. Food Sci. Technol., 54(2),

228-234.

[146] Kanklai J., Somwong T.C., Rungsirivanich P., Thongwai N. (2021).

Screening of GABA-producing lactic acid bacteria from Thai fermented

foods and probiotic potential of Levilactobacillus brevis F064A for

GABA-fermented mulberry juice production. Microorganisms, 9(1), 33.

[147] Tanamool V., Hongsachart P., Soemphol W. (2020). Screening and

characterisation of gamma-aminobutyric acid (GABA) producing lactic

143

acid bacteria isolated from Thai fermented fish (Plaa-som) in Nong Khai

and its application in Thai fermented vegetables (Som-pak). Food Sci.

Technol., 40, 483-490.

[148] Sanchart C., Rattanaporn O., Haltrich D., Phukpattaranont P., Maneerat

S. (2017). Lactobacillus futsaii CS3, a new GABA-producing strain

isolated from Thai fermented shrimp (Kung-Som) Indian J. Microbiol.,

57, 211-217.

[149] Sa H.D., Park J.Y., Jeong S.J., Lee K.W., Kim J.H. (2015).

Characterization of glutamate decarboxylase (GAD) from Lactobacillus

sakei A156 isolated from Joet-gal. J. Microbiol. Biotechnol., 25, 696-

703.

[150] Diana M., Tres A., Quilez J., Llombart M., Rafecas M. (2014). Spanish

cheese screening and selection of lactic acid bacteria with high gamma-

aminobutyric acid production. LWT Food Sci. Technol., 56, 351-355.

[151] Yogeswara I.B.A., Maneerat S., Haltrich D. (2020). Glutamate

decarboxylase from lactic acid bacteria-A key enzyme in GABA

synthesis. Microorganisms, 8(12), 1923. doi:

10.3390/microorganisms8121923. PMID: 33287375; PMCID:

PMC7761890.

[152] Ly D., Mayrhofer S., Yogeswara I.B.A., Nguyen T.-H., Domig K.J.

(2019). Identification, classification and screening for γ-amino-butyric

acid production in lactic acid bacteria from Cambodian fermented

foods. Biomolecules. 9, 768-779.

144

*****

PHỤ LỤC

145

Phụ lục 1. ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN LACTIC

1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn axit lactic

1.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc

Các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết được cấy ria ba pha trên môi trường thạch MRS trong 72 h ở 37oC. Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo các

tiêu chí như: màu sắc, độ bóng, mức độ trơn nhẵn, trạng thái bề mặt.

1.2. Hình thái tế bào

Các chủng được tinh sạch cấy ria ba pha trên môi trường đĩa thạch MRS trong

48 h ở 37oC. Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào.

2. Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rDNA

2.1. Tách chiết ADN từ vi khuẩn

Thực hiện theo phương pháp:

- Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào

- Hoà sinh khối tế bào trong 100 l TE.

- Thêm 0,4 mg lysozyme, trộn đều, ủ 37oC trong 1 h. Trộn đều 3 ph

- Thêm 100 l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 ph trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 ph.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),

trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 ph. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống

Eppendoft khác.

- Thêm 8 l RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 ph

- Thêm 12 l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 ph ở 56oC

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI),

trộn đều. Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống

Eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000

v/p, 15 ph. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3 M và 1ml ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 ph.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 ph. Bỏ lớp dịch trên.

- Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô DNA bằng máy cô quay chân không.

146

- Hoà tan DNA trong 50-100 l nước hoặc TE.

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g)

để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong

300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn

đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100 V, cưòng

độ dòng điện 80 mA trong 30 ph, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5

l/ml) 20 ph vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.

2.2. Phản ứng khuếch đại ADN

Thành phần phản ứng như sau:

Thành phần

Thể tích (l)

10X buffer

10

dNTP 2.0 Mm

10

2

Mồi xuôi (10 pmol/l)

2

Mồi ngược (10 pmol/l)

2

Taq polymerase (5u/l)

1-2

ADN khuôn (50-100 g/l)

đủ 100

H2O

Chu trình nhiệt:

95oC - 3 ph 95oC - 30 s 30 chu kì 56oC - 15 s 72oC - 1 ph 72oC - 5 ph

40oC - 

2.3. Mồi:

Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

Mồi ngược 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'

Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Đun tan 1% agarose (dung dịch

50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và

đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l

147

dung dịch 6X loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng

dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 ph, bỏ

ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 ph vớt ra. Quan sát trên máy

soi gel.

2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Các bước như sau đây:

- Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều.

- Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 ph.

- Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

- Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 ph

- Đổ bỏ dịch dưới cột

- Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 ph

- Chuyển cột sang ống Eppendoft mới

- Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 ph

- Ly tâm 10.000 v/p trong 1 ph

- Lấy dịch phía dưới.

Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước

sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD 280 > 1,7.

2.5. Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

- Buffer 5X

9 l

- Bigdye Ready Reaction premix 18 l

- H2O 9 l

Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự:

- Termix

8 l

- Mồi (*)

1 l

- ADN khuôn

1 l (nồng độ ADN là 40-60 g/ml)

- H2O

10 l

(*) Các loại mồi sử dụng:

27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.

1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.

148

780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.'

350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.

1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'.

920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.

Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen:

96oC - 1 ph 96oC - 10 s 50oC - 5 s 25 chu kỳ 60oC - 4 ph

2.6. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

- Chuyển 20 l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

- Thêm 5 l EDTA 125 mM và 60 l ethanol 100%. Để khoảng 15 ph ở nhiệt độ

phòng.

- Ly tâm 15.000 v/p, 15 ph

- Bỏ dịch, thêm 60 l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000v/p, 10 ph

- Làm khô.

- Thêm 10 l HiDi Formamide, để ở 96oC trong 2 ph

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant

2.7. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của ADNr 16S được phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver

1.83 của Thompson và cộng sự (1997). Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên

cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây

phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980), sử dụng phương pháp của Saitou và

Nei (1987).

******

149

Phụ lục 2.

THU HỒI, LÀM KHÔ VÀ BẢO QUẢN SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG

1. Lựa chọn tốc độ ly tâm tách sinh khối

Canh trường vi khuẩn được ly tâm trong 10 ph với các tốc độ khác nhau, kết quả

được thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng PL-1. Lựa chọn tốc độ ly tâm theo mẻ

Số lượng tế bào sót trong dịch sau ly tâm

Tốc độ ly tâm

(CFU/ml)

STT

(vòng/ph)

VTCC-B-439

VTCC-B-411

1

2000

6x108

6x108

2

3000

5x105

5x105

3

5000

2x104

2x104

4

8000

2x104

2x104

Kết quả Bảng PL-1 cho thấy tốc độ ly tâm từ 5000 trở lên có thể thu được hoàn

toàn sinh khối. Dịch sau ly tâm chỉ có màu môi trường trong khi đó số lượng tế bào

vi khuẩn không còn nhiều 104 CFU/ml trong khi đó mật độ tế bào ban đầu là

1010CFU/ml. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm do quá trình thao

tác (bằng cả kỹ thuật nhuộm soi và cấy kiểm tra trên môi trường thạch đĩa MRS và

LB) đều không phát hiện vi sinh vật tạp nhiễm ngoài các chủng nuôi cấy. Như vậy có

thể nói, với kỹ thuật ly tâm tại tốc độ 5000 v/ph trong 10 ph có thể thu được hầu hết

sinh khối tế bào vi khuẩn trong dịch sau lên men. Việc tăng tốc độ ly tâm (8000 v/ph)

hay kéo dài thời gian ly tâm 15-20 ph không tăng hiệu quả thu sinh khối tế bào ngược

lại phần kết tủa tế bào trở nên bám chắc hơn vào đáy ống ly tâm không tiện cho thu

sinh khối cho các bước tiếp theo.

Khi sử dụng thiết bị ly tâm liên tục, chúng tôi sử dụng kết quả của ly tâm theo

mẻ với tốc độ ly tâm liên tục là 5000 v/ph. Kết quả phân tích lượng tế bào sót trong

dịch sau ly tâm và độ nhiễm được trình bày trong Bảng PL-2.

150

Bảng PL.2. Kết quả ly tâm liên tục

STT Chủng vi khuẩn

Lượng tế bào sót trong

Độ nhiễm

VTCC-B-439

dịch sau ly tâm (CFU/ml) 5x108

(CFU/ml) 5x103

1

VTCC-B-411

6x108

6x103

2

Sử dụng thiết bị ly tâm alphalaval ở tốc độ 5000 v/ph và tốc độ dòng chảy 200

lit/h, chúng tôi đã thu được sinh khối và đánh giá lượng tế bào sót và tạp nhiễm trong

dịch sau ly tâm. Kết quả được trình bày trong bảng cho thấy hầu hết sinh khối vi khuẩn (90%) được tách ra sau ly tâm, với mật độ tế bào ban đầu 109CFU/ml và dịch sau ly tâm là 108CFU/ml. Tuy nhiên chúng tôi đã phát hiện nhiễm tạp trong quá trình ly tâm (trong cả sinh khối và dịch sau ly tâm) với lượng nhỏ (103 CFU/ml). Sự có

mặt của vi sinh vật nhiễm (Bacillus) với tỷ lệ thấp nhưng vẫn cao hơn tiêu chuẩn Việt Nam (≤1x103) cho thấy phương pháp ly tâm liên tục không đảm bảo về mặt an toàn

sản phẩm.

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang và tỷ lệ phối trộn của chất mang

đến khả năng sống của vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu: Lactobacillus plantarum VTCC-B-439

và Lactobacillus casei VTCC-B-411 không có bào tử nên việc làm khô trong bất kỳ

hình thức nào như phun sấy hay đông khô đều dẫn đến sự chết và bất hoạt các tế bào

dinh dưỡng ở tỷ lệ khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn kỹ thuật đông

khô là quá trình làm khô trong lạnh đối với sinh khối vi khuẩn thu được sau lên men.

Dịch sinh khối thu được sau bước lọc tiếp tuyến ở trên ở dạng past, việc bổ sung chất

mang đạt độ khô 55-60% có tác dụng bảo vệ tế bào, giảm tỷ lệ chết trong quá trình

đông khô. Trong nghiên cứu này với tỷ lệ chất mang và dịch vi khuẩn 1:1 theo lượng

chất khô là 60%. Kết quả quá trình đông khô các mẫu vi khuẩn được trình bày trong

bảng 3.10 như sau:

Kết quả trong Bảng PL-3 cho thấy thời gian đông khô không phụ thuộc vào

chất mang mà phụ thuộc vào chủng vi khuẩn dao động từ 12-14 h. Việc so sánh các

công thức chất mang được tiến hành đồng thời cho mỗi chủng với 6 công thức từ 1-

6 cho thấy công thức 2 là công thức tốt hơn cả cho cả 2 chủng vi khuẩn nghiên cứu.

151

Với mật độ vi khuẩn trong dịch ban đầu dao động 109 CFU/ml thì lượng tế bào chết

sau khi đông khô dao động từ 10 -50 lần.

Chọn chất mang được xem là khâu quan trọng cho quá trình phát triển sản

phẩm sinh khối đông khô dạng bột. Vai trò của chất mang là bảo vệ hoạt động sống của tế bào trong quá trình đông khô tại nhiệt độ âm 30 đến âm 50oC.Thông thường

một số đường như lactose, maltose hoặc sữa gầy được dùng cho mục đích này. Trong

nghiên cứu này, chúng tôi chọn 3 loại chất mang là dextrin, sữa gầy và lactose với 6

công thức khác nhau: riêng rẽ (công thức 4, 5 và 6) và phối trộn (1, 2 và 3).

Bảng PL-3. Số lượng vi khuẩn trong sản phẩm sau đông khô với

các công thức chất mang khác nhau

Chủng VTCC-B-439

Chủng VTCC-B-411

Công

Đánh

Thời gian

Mật độ

Thời gian

Mật độ

thức

giá

(h)

(h)

13

CFU/g 8x108

12

CFU/g 1x109

1

Khá

13

5x1010

12

6x1010

2

Tốt

13

2x109

12

1x109

3

Khá

13

3x108

12

6x108

4

Kém

13

7x108

12

1x109

5

Khá

13

1x108

12

6x108

6

Kém

Kết quả cho thấy việc phối trộn giữa chất mang là nguồn cacbon và nitơ (công

thức 1, 2, 3 và 5) đều cho kết quả tốt hơn hẳn nếu chỉ dùng nguồn cacbon làm chất

mang (4 và 6). Công thức 2 là công thức cho kết quả tốt nhất với mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g (chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 và

Lactobacillus casei VTCC-B-411) được dùng cho nghiên cứu phát triển sản phẩm.

3. Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột)

Mẫu sau khi đông khô chia thành các phần nhỏ (khoảng 50 g), dán kín giữ trong điều kiện nhiệt độ khác nhau: -20oC, 4oC và nhiệt độ phòng (25-30oC). Kết quả

được thể hiện ở Bảng PL-4.

152

Bảng PL-4. Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản trong điều kiện khác nhau

Số lượng vi khuẩn (CFU/g) sau thời gian bảo quản (tháng)

Chủng

ĐK bảo quản (oC)

0

1

2

3

4

5

6

-20

7x1010 7x1010 7x1010 6x1010 6x1010 5x1010 4x1010

VTCC-

4

7x1010 6x1010 5x1010 3x1010 2x1010 9x109 6x1010

B-439

25-30

7x1010 4x1010 7x109 2x109 8x108 3x108 8x107

-20

6x1010 6x1010 6x1010 5x1010 5x1010 5x1010 5x1010

VTCC-

4

6x1010 6x1010 5x1010 4x1010 3x1010 1x1010 8x109

B-411

25-30

6x1010 5x1010 2x1010 8x109 3x1010 7x108 1x108

Kết quả bảng PL-4 cho thấy điều kiện bảo quản ảnh hưởng lớn đến khả năng

sống sót của chủng vi khuẩn trong chế phẩm. Trong tất cả các chủng, điều kiện bảo quản tại -20oC là tốt nhất sau đó là 4oC. Trong điều kiện này, số lượng tế bào sống

giảm (so với ban đầu) nhưng không quá 10-30 lần. Lượng vi sinh vật sống giảm mạnh

khi bảo quản trong điều kiện nhiệt độ thường, số lượng vi khuẩn sống sót giảm 50-

100 lần có trường hợp (Lactobacillus plantarum VTCCB439) giảm 1000 lần. Vì vậy,

chủng Lactobacillus casei VTCC-B-411 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tóm lại: Thu hồi sinh khối sử dụng phương pháp ly tâm theo mẻ tại tốc độ

5000 v/ph trong 10 ph có thể thu được hầu hết sinh khối tế bào vi khuẩn trong dịch

sau lên men, thích hợp cho các nghiên cứu nhỏ ban đầu trong phòng thí nghiệm. Sử

dụng kỹ thuật lọc tiếp tuyến cho hiệu suất thu hồi sinh khối cao từ thể tích lớn dịch

sau lên men và hạn chế được vi sinh vật tạp nhiễm so với phương pháp ly tâm liên

tục. Sử dụng chất mang là lactose và sữa gầy theo tỷ lệ 1:1 mang lại hiệu quả cao nhất

khi đông khô sinh khối các chủng vi khuẩn nghiên cứu, mật độ tế bào vi khuẩn sống đạt từ 1010 CFU/g. Điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn tại-20oC cho kết quả tốt nhất, số lượng tế bào sống đạt 1010CFU/g sau 6 tháng bảo quản./.

*******

153

Phụ lục 3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI CHỦNG GIỐNG VI KHUẨN

1. Tóm tắt quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn (Hình PL-1)

1.1. Thuyết minh quy trình

(a) Chủng vi khuẩn:

- Chủng Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 và Lactobacillus casei VTCC-B-

411 có khả năng sinh enzym glutamate decarboxylasetạo GABA trên lá chè.

- Các chủng vi khuẩn này được nghiên cứu, phân loại và lưu giữ tại Bảo tàng

giống Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

- Ngoài ra, các chủng này còn là chủng vi sinh vật an toàn (GRAS) và sản

phẩm của chúng được liệt kê vào danh mục các chất an toàn được dùng trong thực

phẩm do Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan

quản lý an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) cho phép sử dụng.

(b) Hoạt hóa chủng sản xuất:

Các chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 vàLactobacillus casei VTCC-B-411) giữ trong glycerol 20% ở lạnh -80oC được hoạt hóa và kiểm tra

lại độ thuần chủng bằng cách cấy ria trên đĩa thạch môi trường MRS, thời gian 48 h ở 35oC. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, kiểm tra tế bào trên kính hiển vi (tế bào chủng

Lactobacillusplantarum VTCC-B-439 có hình que và tế bào Lactobacillus casei

VTCC-B-411 có hình que ngắn xếp cặp) và đồng thời cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MRS, thời gian 48 h ở 35oC.

(c) Nhân giống cấp 1:

Chủng vi khuẩn (Lactobacillus plantarum VTCC-B-439 và Lactobacillus casei

VTCC-B-411) từ ống nghiệm được cấy vào các bình tam giác 250 ml chứa 150 ml môi trường MT2 dịch thể (pH6) với glutamate 1%, nuôi tĩnh ở 35oC. Sau 8-12 h,

kiểm tra độ tinh sạch bằng cách cấy ria vào môi trường thạch MT2. Sau 20- 24 h, lấy

1 ml dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào trên máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm. Mật độ tế bào đạt OD600 ≥ 2.5(≥1010 cfu/ml). Đồng thời quan sát khuẩn lạc trong đĩa

thạch đã cấy.

(d) Nhân giống cấp II trong thiết bị lên men 5 lít

Cấy 5% giống cấp 1 (nuôi 20-24 h) của chủng vi khuẩn (Lactobacillus

plantarum VTCC-B-439 và Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 5

154

lít chứa 3 lít môi trường MT2(pH6), nuôi khuấy 30 vòng/ph ở 35oC. Sau 8-12 h, kiểm

tra độ tinh sạch bằng cách cấy ria vào môi trường thạch MT2. Sau 20-24 h, lấy 1ml

dịch nuôi kiểm tra mật độ tế bào trên máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm. Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml). Đồng thời quan sát khuẩn lạc trong đĩa thạch

MT2 đã cấy.

Hình PL-1. Sơ đồ quy trình sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng

trong lên men chè giàu GABA

155

(e) Nhân giống cấp III trong thiết bị lên men 30 lít:

Cấy 5% giống cấp 2 (nuôi 20-24 h) của chủng vi khuẩn (Lactobacillus

plantarumVTCC-B-439 và Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men 30

lít chứa 20 lít môi trường MT2 (pH6), nuôi khuấy 30 vòng/ph, ở 35oC. Sau 8-12 h, kiểm

tra độ tinh sạch bằng cách cấy ria vào môi trường thạch MT2. Lấy 1ml dịch nuôi kiểm tra

mật độ tế bào trên máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm sau 20-24 h. Mật độ tế bào đạt

OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml). Đồng thời quan sát khuẩn lạc trong đĩa thạch MT2 đã cấy.

(g) Lên men trong thiết bị 300 lít:

Cấy 5% giống cấp 3 (nuôi 20-24 h) của chủng vi khuẩn (Lactobacillus

plantarumVTCC-B-439 và Lactobacillus casei VTCC-B-411) vào thiết bị lên men

300 lít chứa 200 lít môi trường MT2(pH6), nuôi khuấy 50 vòng/ph ở 35oC. Sau 8-12

h, kiểm tra độ tinh sạch bằng cách cấy ria vào môi trường thạch MRS. Lấy 1ml dịch

nuôi kiểm tra mật độ tế bào trên máy đo quang phổ ở bước sóng 600 nm sau 24 h.

Mật độ tế bào đạt OD600 ≥2,5 (≥1010 cfu/ml). Đồng thời quan sát khuẩn lạc trong đĩa

thạch MT2 đã cấy.

(h) Cô đặc tế bào:

Dịch nuôi các chủng vi khuẩn từ thiết bị lên men 300 lít được lọc qua thiết bị

lọc tiếp tuyến xuống còn 1/20 để thu tế bào trong thời gian 125-160 ph, thu được

khoảng 8-10 lít dịch tế bào.

(i) Trộn chất mang và đông khô:

Mẫu sau khi trộn trong tủ vô trùng, sử dụng chất mang là lactose và sữa gầy theo

tỷ lệ 1:1, đưa vào thiết bị đông khô từ 12-14 h, đến khi độ ẩm 6-8%. Sản phẩm sau

làm khô đem nghiền nhỏ thành dạng bột mịn. Lấy mẫu để kiểm tra mật độ vi sinh vật

sống (đạt > 1010 CFU/g với hai chủng LactobacillusplantarumVTCC-B-439 và

Lactobacillus casei VTCC-B-411) và mức độ vi sinh vật tạp nhiễm dựa theo TCVN.

(k) Đóng gói và bảo quản:

Sản phẩm dạng bột của các chủng VTCC-B-439 và chủng VTCC-B-411 đạt

mật độ yêu cầu, được đóng gói trong bao tráng nhôm hoặc bao plastic kín, tránh ánh

sáng. Tùy vào mục đích sử dụng, có thể đóng túi 100 - 500g. Chế phẩm được bảo

quản ở trong tủ - 20oC. Chế phẩm bảo quản 06 tháng, số lượng vi sinh vật đạt ≥ 3x1010

CFU/g.

156

2. Sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic sử dụng trong lên men chè giàu GABA

Từ quy trình sản xuất sinh khối, chúng tôi tiến hành lên men sản xuất 10 mẻ

thu sinh khối vi khuẩn. Sau mỗi mẻ sản xuất, chúng tôi kiểm tra số lượng tế bào của

chủng vi khuẩn lactic và độ sạch của mẻ lên men. Kết quả được thể hiện ở Bảng PL-

5. Kết quả bảng PL-5 cho thấy quy trình sản xuất sinh khối chủng vi khuẩn lactic có tính

khả thi và có độ ổn định cao giữa các mẻ. Dựa vào khối lượng sinh khối thu được giữa

các mẻ cũng như độ sạch của các mẻ thu hồi cho thấy quy trình mà chúng tôi xây dựng

là phù hợp với các điều kiện khí hậu ở Việt Nam.

Bảng PL-5. Kết quả lên men vi khuẩn lactic

Khối lượng sinh khối

Mật độ CFU/ml

Mẻ sản xuất

Độ sạch (%)

trước thu sinh khối

(g)

4.1010

Mẻ 1

148.5

98.9

2,1.1010

Mẻ 2

149.4

99.2

5.1010

Mẻ 3

152.7

98.7

7.1010

Mẻ 4

153.3

98.6

4.1010

Mẻ 5

151.8

98.2

1,9.1010

Mẻ 6

144.3

98.7

4.1010

Mẻ 7

151.2

98.8

5.1010

Mẻ 8

148.2

99.2

6.1010

Mẻ 9

152.4

98.6

6.1010

Mẻ 10

154.2

98.6

*******

157

Keo Am Tích

Phúc Vân Tiên

Kim Tuyên

Trung Du

Phụ lục 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM VÀ SẢN PHẨM

Hình PL4.1. Chè nguyên liệu dùng trong nghiên cứu của luận án

Hình PL4.2. Phòng chế biến chè (trái) và thiết bị sao chè (phải)

158

Hình PL4.3. Phun trộn chè với dịch thể chủng giống vi khuẩn để lên men

Hình PL4.4. Chè sau lên men yếm khí kết hợp lên men vi khuẩn lactic

159

Hình PL4.5. Hoạt động chuẩn bị mẫu nước chè để đánh giá cảm quan chất lượng

Hình PL4.6. Chè thành phẩm trong thí nghiệm bảo quản túi PE

Hình PL4.7. Sản phẩm chè giàu GABAthành phẩm

Hình PL4.8. Sản phẩm chè giàu GABA tham gia hội chợ

160