Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tạo đột biến In vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ

SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN

CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG

QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

HÀ NỘI, NĂM 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NGÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HOÀNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ

SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN

CỦA CÁC DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG

QUẬN CHÚA (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG

MÃ SỐ: 62.62.01.10

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI, NĂM 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, hình

ảnh, kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng

để bảo vệ một học vị nào trước đây.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án này đã

được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận

được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của nhiều tập thể và cá nhân.

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn

Thị Lý Anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi và chia sẻ

những khó khăn cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành

luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, các thầy giáo, cô giáo, cán bộ

công nhân viên của Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt

Nam đã sẻ chia kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình

thực hiện đề tài nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể các thầy giáo, cô giáo Bộ môn Di truyền

và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học, Ban Quản lý đào tạo, Ban Giám đốc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ về mặt học vấn cũng như tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Cao đẳng Cộng đồng Hải

Phòng đã tạo điều kiện cho tôi có thể đảm bảo thời gian để học tập và thực hiện

luận án.

Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, động viên

chân tình của các thành viên trong gia đình, các bạn bè, đồng nghiệp,... Tôi xin

được trân trọng ghi nhớ và cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2014

Tác giả

Vũ Hoàng Hiệp

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Yêu cầu của đề tài 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

5 Đóng góp mới của luận án 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 5

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng 7

1.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng 7

1.1.4 Yêu cầu dinh dưỡng 8

1.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước 9

1.2.1 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới 9

1.2.2 Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam 11

1.3 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây

hoa cẩm chướng 12

1.4 Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo

giống cây trồng 16

1.4.1 Đột biến tạo biến dị di truyền 16

1.4.2 Các tác nhân gây đột biến 17

1.4.3 Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng 21

iii

1.5 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong

chọn tạo giống cây trồng 24

1.5.1 Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 24

1.5.2 Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro 25

1.5.3 Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro 29

1.5.4 Sàng lọc thể đột biến 29

1.6 Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng 30

1.6.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 30

1.6.2 Kết quả nghiên cứu trong nước 35

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.2 Nội dung nghiên cứu 41

2.2.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 41

2.2.2 Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây

cẩm chướng 41

2.2.3 Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh

giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi 41

2.2.4 Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị

của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên 42

2.2.5 Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị

có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR 42

2.2.6 Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến

được tuyển chọn 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 42

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. 47

2.3.3 Phương pháp gây tạo đột biến in vitro 47

2.3.4 Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến

bằng chỉ thị phân tử SSR 50

2.3.5 Phương pháp theo dõi, đánh giá 53

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55

2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 54

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa 56

3.1.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu 55

3.1.2 Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro 56

3.1.3 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 62

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 63

3.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro

bằng EMS và tia gamma nguồn 60Co 65

3.2.1 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy

in vitro bằng EMS 65

3.2.2 Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy

in vitro bằng tia gamma nguồn 60Co 75

3.2.3 Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây

hoa cẩm chướng in vitro 80

3.3 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in

vitro 84

3.3.1 Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm

chướng sau xử lý 85

3.3.2 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro

cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh 86

3.3.3 Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro

cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 88

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh

biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 89

3.4.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm

chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng 96

3.4.2 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng

sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96

3.4.3 Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của

cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 96

3.4.4 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý

giai đoạn ngoài đồng ruộng 97

3.5 Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng

bằng kỹ thuật SSR 103

3.5.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 103

3.5.2 Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi 104

3.5.3 Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi 115

3.5.4 Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu 117

3.5.5 Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm

chướng 117

3.6 Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn 121

3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu 122

3.6.2 Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột

biến được tuyển chọn. 124

3.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn

chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 125

3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm 126

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 129

1 Kết luận 129

2 Đề nghị 130

Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 131

Tài liệu tham khảo 132

Phụ lục 141

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AFLP

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

Amplicon fragment length polymorphism

BA Benzyl adenin

BAP 6-Benzylamino purine

CT Công thức

CS Cộng sự

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

DES Dimethylsulfate

ĐC Đối chứng

EI Ethylenimine

EMS Ethylmethane sulphonate

FAO Food and Agriculture Organization

IAA 3-Indoleacetic acid

IAEA International Atomic Energy Agency

IBA α-Indol butyric acid

Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50

LPB Protocorm-Like-Bodies

MS Môi trường Murashige and Skoog

NEU Nitrosoethylurea

NMU Nitrosomethylurea

NXB Nhà xuất bản

PIC Polymorphic Information Content

r Hệ số tương quan

RAPD Random amplified polymorphic DNA

RFLP Restriction fragment length polymorphisms

SSR Simple sequence repeats

TDZ Thidiaruzon

α NAA α-Napthaleneaxetic acid

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng Trang

1.1 Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm 2000 10

1.3 Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến ở

một số quốc gia tính đến năm 2007 23

2.1 Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng

SSR-PCR 39

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 55

3.2 Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh

trưởng của chồi in vitro 58

3.3 Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh

trưởng của chồi in vitro 61

3.4 Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới

khả năng ra rễ của chồi in vitro 63

3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm

chướng in vitro ngoài vườn ươm 64

3.6 Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây

cẩm chướng 66

3.7 Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy 69

3.8 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ 72

3.9 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ 72

3.10 Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ 73

3.11 Ảnh hưởng của liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co đến khả năng

sống và sinh trưởng của chồi in vitro 76

3.12 Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy 76

3.13 Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi sau xử lý tia gamma nguồn 60Co 79

viii

3.14 Ảnh hưởng của liều lượng xử lý EMS và tia gamma nguồn 60Co đến

khả năng sống, sinh trưởng của chồi 81

3.15 Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi in vitro sau xử lý kết hợp EMS

và tia gamma nguồn 60Co 84

3.16 Khả năng ra rễ của chồi in vitro sau xử lý 85

3.17 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong

điều kiện khí canh 87

3.18 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến trong

điều kiện ngoài đồng ruộng 88

3.19 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau

xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 92

3.20 Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng

sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng 93

3.21 Tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ

giai đoạn ngoài đồng ruộng 94

3.22 Tỷ lệ biến dị của các dạng chồi cẩm chướng sau xử lý giai đoạn

ngoài đồng ruộng 95

3.23 Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý

giai đoạn ngoài đồng ruộng sau 99

3.24 Thống kê số băng DNA thu được của các mẫu giống cẩm chướng 104

3.25 Hệ số PIC của 20 mồi SSR 116

3.26 Tỷ lệ dị hợp tử của dòng, giống cẩm chướng 117

3.27 Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng 118

3.28 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống 123

3.29 Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và hệ số nhân

của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 125

3.30 Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng H6 và H7 126

3.31 Ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây

in vitro ngoài vườn ươm 127

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên hình Trang

1.1 Hình ảnh một số loài hoa cẩm chướng phổ biến 6

1.2 Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng

tại Nhật Bản năm 2008 18

1.3 Số giống cây trồng được tạo ra theo phương pháp gây tạo đột biến

trên thế giới qua các năm 21

1.4 Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2008 22

1.5 Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ 27

2.1 Mẫu giống hoa nghiên cứu 39

3.1 Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA với nộng độ khác nhau 59

3.2 Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin với nộng độ

khác nhau 60

3.3 Cây cẩm chướng giai đoạn ngoài vườn ươm 65

3.4 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ EMS đến tỷ lệ chết của chồi in vitro

cây cẩm chướng 68

3.5 Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý EMS với thời gian xử lý 2 giờ 70

3.6 Các dạng chồi thu được sau xử lý EMS 71

3.7 Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co 77

3.8 Các dạng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co 79

3.9 Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co 83

3.10 Một số dạng biến dị về hình thái thân lá 90

3.11 Hình ảnh một số dạng biến dị về màu sắc hoa 91

3.12 Cấu trúc một số dạng biến dị về màu sắc hoa 102

3.13 Kết quả điện di DNA tổng số 103

3.14 Kết quả phân tích với mồi CB003a 105

3.15 Kết quả phân tích với mồi CB004a 106

3.16 Kết quả phân tích với mồi CB006a 106

3.17 Kết quả phân tích với mồi CB011a 106

3.18 Kết quả phân tích với mồi CB016a 106

3.19 Kết quả phân tích với mồi CB018a 108

3.20 Kết quả phân tích với mồi DCB134 108

3.21 Kết quả phân tích với mồi DCB224 109

3.22 Kết quả phân tích với mồi DCB109 109

3.23 Kết quả phân tích với mồi DCB140 110

3.24 Kết quả phân tích với mồi CB027a 110

3.25 Kết quả phân tích với mồi CB020a 111

3.26 Kết quả phân tích với mồi DCB221 111

3.27 Kết quả phân tích với mồi DCB131 112

3.28 Kết quả phân tích với mồi CB026a 112

3.29 Kết quả phân tích với mồi CB047a 113

3.30 Kết quả phân tích với mồi DCB135 113

3.31 Kết quả phân tích với mồi CB057a 114

3.32 Kết quả phân tích với mồi CB041a 114

3.33 Kết quả phân tích với mồi CF003a 115

3.34 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng 118

3.35 Mẫu dòng đột biến được lựa chọn nghiên cứu nhân giống in vitro 122

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Trong nông nghiệp cùng với việc phát triển các cây lương thực, thực phẩm

cây hoa cũng đã trở thành một lĩnh vực thu hút được sự quan tâm và đầu tư bởi sản

xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế.

Trong những loài hoa cắt cành, cẩm chướng ngày càng được biết đến và ưa

chuộng bởi màu sắc đẹp, phong phú, kiểu dáng hoa đa dạng, hoa tươi lâu, dễ vận

chuyển, bảo quản… Cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành

được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị

Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu

cũng như xuất khẩu của Việt Nam. Ở nước ta hiện nay, chủ yếu trồng các giống

cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) do đó không chủ

động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở rộng sản xuất và xuất khẩu

bởi không có bản quyền giống. Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không

chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật

nhằm nâng cao năng suất chất lượng hoa mà còn phải tạo ra được những giống hoa

cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái

và có bản quyền của Việt Nam.

Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo giống có màu

sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đường lai xa, đa bội hóa và gây

tạo đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Tuy nhiên đối với cây hoa

cẩm chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn thụ tinh

rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con

đường gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được

nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại

những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Theo báo cáo của

Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có 3.200 giống cây

trồng đột biến thuộc trên 200 loài khác nhau được công nhận và ứng dụng trong

sản xuất (IAEA, 2013). Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu

chi phí và thời gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro

đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế

ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc

cải tiến giống cây trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Bằng

phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn

định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng

phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ. Phương pháp này được đánh giá

là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997).

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như

Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma để gây đột biến in vitro cho nhiều

loại cây trồng được nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công

tác chọn tạo giống cây trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004;

Luan và cs., 2007; Shin et al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a, 2009b,

2011b,…). Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên cứu xử lý đột biến in vitro trong

chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng còn nhiều hạn chế. Xuất

phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến

in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột

biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” phục vụ cho

công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng ở nước ta.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được

phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm

nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.

3. Yêu cầu của đề tài

- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận

Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in

vitro bằng tác nhân gây đột biến.

- Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong

nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao:

+ Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro

cây hoa cẩm chướng.

+ Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân

in vitro cây hoa cẩm chướng.

+ Xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho

chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.

- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro.

- Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện

tự nhiên.

- Đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến có triển vọng đã

phân lập bằng chỉ thị SSR.

- Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh, môi

trường ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm năng

được tuyển chọn.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống đối với cây cẩm chướng bao

gồm các nội dung nhân giống vô tính in vitro, tạo vật liệu di truyền mới bằng

phương pháp gây tạo đột biến bởi tác nhân hóa học, vật lý kết hợp nuôi cấy in

vitro, ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định thể đột biến và xây dựng quy trình

nhân giống vô tính in vitro cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển

chọn.

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị

về việc nhân giống in vitro và phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột

biến in vitro của cây hoa cẩm chướng. Đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc

nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng.

Các kết quả của đề tài là cơ sở để tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu tạo

dòng đột biến mới làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống bằng

xử lý đột biến in vitro không chỉ đối với cây cẩm chướng mà còn có thể mở rộng

với nhiều đối tượng cây trồng khác.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng,

giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong thực tiễn về nhân

giống hiện nay.

Đề tài đã ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây

dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa

cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.

Đã tạo được các vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo

giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng.

5. Đóng góp mới của luận án

Các kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia

gamma nguồn 60Co cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng có thể

làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.

Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm

sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến mới về màu sắc hoa trong điều kiện tự

nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị

phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ (không xử lý đột biến).

Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến

có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến được tạo ra, phục

vụ cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm

chướng mới.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại

Theo Jawaharlal et al. (2005), cẩm chướng có tên tiếng Anh: Carnation; tên

khoa học: Dianthus caryophyllus L. Hoa cẩm chướng thuộc:

- Giới thực vật: Plantae

- Lớp 2 lá mầm: Magnoliopsida

- Phân lớp cẩm chướng: Caryophyllidae

- Bộ cẩm chướng: Caryophyllales

- Họ cẩm chướng: Caryophyllaceae

- Chi: Dianthus

- Loài: Caryophyllus.

Theo Jurgens et al. (2003), Jawaharlal et al. (2005) họ cẩm chướng có 80

chi và trên 2.000 loài, phân bố chủ yếu ở Bắc bán cầu, tập trung nhiều ở vùng Địa

Trung Hải, một số ít ở Nam bán cầu và miền núi nhiệt đới. Ở Việt Nam gặp trên

10 chi với 25 loài (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2006; Trung tâm Dữ liệu

thực vật Việt Nam, 2007).

Loài D. caryophyllus: dựa trên hình dạng, kích thước hoa và hình thái cây

loài này được chia thành các nhóm: hoa chuẩn - Standards (sims), hoa chùm -

Sprays (miniatures). Hoa chuẩn là dạng hoa một bông to trên một cành. Hoa chùm

là dạng có một số lượng lớn hoa nhỏ trên cành, có thể sinh ra cành hoa có nhiều

nhánh nhỏ với rất nhiều hoa (Galbally and Galbally, 1997). Thông thường, cẩm

chướng là cây lưỡng bội, tuy nhiên các thể tứ bội cũng đã được tìm thấy. Phần lớn

các giống cây trồng hiện nay là các thể lưỡng bội (Sato et al., 2000).

Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng

để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra

giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm. Năm 1846, họ

đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra

hoa quanh năm. Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ. Sau

đó hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới đã được tạo ra, trong đó các giống như

North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu. Từ các

giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng

khác nhau (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005).

Trong sản xuất hiện nay ngoài các giống thuộc loài D. caryophyllus được sử

dụng chủ yếu dưới dạng hoa cắt còn có các giống thuộc hai loài, D. barbatus và D.

chinensis được trồng dưới dạng hoa thảm và hoa chậu (Jawaharlal et al., 2005; Lê

Đức Thảo, 2010).

Loài D. barbatus: Thân cứng cáp, nhẵn, cao 25 - 50 cm. Lá dẹp, màu xanh

nhạt hay xanh đậm, dài 3 - 7 cm. Hoa mọc thành chùm khít nhau, rộng 1 - 2 cm,

màu trắng, hồng đỏ, tím hay hai màu giữa các lá bắc khá to, mùi thơm nhẹ. Một số

giống thuộc loài này như giống Wee Willie và Summer Beauty thường trồng bằng

hạt vào đầu mùa xuân và ra hoa vào đầu mùa hè (Jawaharlal et al., 2005; Lê Đức

Thảo, 2010).

Loài D. chinensis: Thân thảo lâu năm, có chiều cao 30 - 50 cm, thân cây

trưởng thành thường có các rãnh, lá phẳng, rộng, màu xanh nhạt đến xanh đậm,

chiều dài lá 3 - 5 cm, chiều rộng 2 - 4 mm. Hoa có nhiều màu sắc khác nhau, đường

kính hoa 3 - 4 cm, cánh hoa thường có lông. Loài D. chinensis tập trung chủ yếu ở

vùng ôn đới. Có 2 giống phổ biến thuộc loài này là Hồng Nhật Bản (D. chinensis

var Heddewigii) và Hồng tua (D. chinensis var Lacinatus) (Jawaharlal et al., 2005).

Dianthus chinensis Dianthus barbatus Dianthus caryophyllus

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài hoa cẩm chướng phổ biến

(Nguồn: Flickriver, 2012)

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng

- Rễ: Cẩm chướng có bộ rễ chùm, chiều dài của rễ 15 - 20 cm, phân bố tập

trung ở tầng đất mặt 20 cm, một số ít có khả năng ăn sâu tới 40 - 45 cm (Lê Đức

Thảo, 2010; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

- Thân: Thân thuộc dạng thân thảo, nhỏ và mảnh, phân nhánh nhiều, và nửa

hóa gỗ. Thân rất dễ gẫy ở đốt. Các đốt thân thường gẫy khúc. Thân thường có màu

xanh nhạt, bao phủ một lớp phấn trắng xung quanh. Cẩm chướng loại thấp cây cao

30 - 50 cm, thường mọc thành bụi, các đốt thân dài 2 - 3 cm. Loại cao cây 50 - 80

cm, đốt dài 4 - 6 cm (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012).

- Lá: Lá mọc đối từ các đốt thân, gốc lá ôm lấy thân, phiến lá dày, hình lưỡi

mác, mép lá trơn, mặt lá nhẵn, không có độ bóng. Trên mặt lá phủ một lớp phấn

trắng, mỏng và mịn, lớp phấn này có tác dụng làm giảm sự bốc hơi nước (Đặng

Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

- Hoa: Có hai dạng hoa chính: hoa chùm và hoa đơn. Hoa nằm trên đầu

cành và có nhiều màu sắc khác nhau. Ngay cả trên một hoa cũng có thể có 2 - 3

màu khác nhau. Hoa đẹp, có mùi thơm nhẹ. Nụ hoa có đường kính 2 - 2,5 cm. Khi

hoa nở hoàn toàn có đường kính 6 - 8 cm. Chiều cao bông hoa khoảng 4 - 7,5 cm

(Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

- Hạt: Hạt cẩm chướng nhỏ. Mỗi quả thường có từ 300 - 600 hạt (Nguyễn

Thị Kim Lý và cs., 2012).

1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng

- Ánh sáng: Theo Jawaharlal et al. (2005) cẩm chướng là cây ưa sáng và

thích hợp với thời gian chiếu sáng ngày dài. Thời gian chiếu sáng trong ngày càng

dài, cây càng nhanh phân hóa hoa, hoa nở đều, chất lượng hoa tốt. Theo Nguyễn

Thị Kim Lý và cs. (2009) cường độ ánh sáng thích hợp là 1.500 - 3.000 lux, tối

thích là 2.000 - 2.500 lux. Trong quá trình phát triển, cường độ ánh sáng cao (trên

3.000 lux) cây sẽ ra hoa sớm, cường độ ánh sáng thấp (dưới 1.000 lux) quá trình ra

hoa sẽ muộn. Nhìn chung độ dài chiếu sáng trong ngày thích hợp với cây hoa cẩm

chướng là 13 giờ (Jawaharlal et al., 2005).

- Nhiệt độ: Cẩm chướng là cây ôn đới nên thích hợp với khí hậu mát mẻ.

Nhiệt độ thích hợp cho cây từ 15 - 220C. Theo Jawaharlal et al. (2005) nhiệt độ

ban đêm có ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát triển của hoa cẩm chướng, nhiệt độ

ban đêm thích hợp là 10 - 110C vào mùa đông, 13 - 15,50C vào mùa hè. Chênh

lệch nhiệt độ ngày, đêm có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng hoa. Nhìn chung

chênh lệch nhiệt nhiệt độ ngày đêm khoảng 100C là tốt nhất (Jawaharlal et al.,

2005; Gharge, 2009; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

- Nước: Ẩm độ thích hợp 60 - 70%, ẩm độ tối thích 65% (Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012). Nếu độ ẩm ổn định sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho cây hút chất

dinh dưỡng và muối khoáng, cây sinh trưởng tốt, năng suất và phẩm chất hoa cao.

- Không khí: Cẩm chướng ưa khí hậu mát mẻ và thông thoáng. Theo

Jawaharlal et al. (2005) khi trồng trong nhà kính với nhiệt độ 14 - 150C nên duy trì

nồng độ CO2 ở mức 500 - 750 ppm. Trong điều kiện thuận lợi nếu phun bổ sung

CO2 có thể làm tăng năng suất hoa từ 10 - 30%.

- Đất đai: Yêu cầu đất có kết cấu tơi xốp. Độ pH thích hợp từ 6,0 - 6,5.

Theo Nguyễn Thị Kim Lý và cs. (2012) mức EC từ 1,2- 1,5 là phù hợp với cây

cẩm chướng. Đất trồng hoa cẩm chướng tốt nhất là đất cát pha sét, giầu hàm lượng

hữu cơ, có khả năng thoát nước tốt (Jawaharlal et al., 2005).

1.1.4. Yêu cầu dinh dưỡng

Theo Nguyễn Thị Kim Lý và cs. (2012) chất lượng và sản lượng hoa phụ

thuộc rất lớn vào dinh dưỡng. Mức dinh dưỡng không thích hợp sẽ làm cây chóng

tàn hoa, hoa nhỏ. Thông thường 1 m2 đất trồng trong một năm cây cẩm chướng sẽ

hấp thu lượng từ 3 - 5 g đạm, 2 - 3 g lân, 7 - 12 g kali.

Từ đặc điểm, nguồn gốc và yêu cầu ngoại cảnh của cây cẩm chướng cho

thấy, cây cẩm chướng thích hợp với khí hậu mát mẻ. Vì vậy, ở các nước, cẩm

chướng thường được phát triển mạnh ở các vùng núi cao như Côn Minh (Trung

Quốc) hay thung lũng Rift (Kenya) có độ cao từ 1.000 - 1.800 m so với mực nước

biển. Ngoài ra, các vùng này cũng phù hợp với quá trình thụ phấn của cẩm

chướng nên thuận lợi cho việc lai tạo, tạo vật liệu khởi đầu và các dòng, giống

mới cho sản xuất (Lê Đức Thảo, 2010).

Ở Việt Nam, một số vùng có đặc điểm khí hậu rất phù hợp với cây cẩm

chướng như Đà Lạt, Sapa (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012). Hiện nay cây cẩm

chướng cũng được trồng rộng rãi ở một số vùng như Hà Nội, Hải Phòng, Thành

phố Hồ Chí Minh,… (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2009).

1.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước

1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới

Trên thế giới, cẩm chướng là hoa cắt cành được trồng phổ biến tại châu Âu,

châu Á, châu Phi và châu Mỹ.

Italia là nước có diện tích trồng hoa cẩm chướng nhiều nhất, năm 2001 sản

lượng hoa cắt nước này đạt 3.200 triệu cành. Ở Hà Lan, tuy diện tích trồng hoa

cẩm chướng không bằng diện tích trồng hoa tuylip nhưng sản lượng cũng đạt trên

2.500 triệu cành/năm, đứng thứ 2 trên thế giới và có xuất khẩu sang châu Âu, Bắc

Mỹ và Nhật Bản. Ở Ba Lan, cẩm chướng chiếm 60% sản lượng hoa cắt, mỗi năm

nước này sản xuất được khoảng 600 triệu cành, đứng thứ 3 trên thế giới (Đặng

Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

Hoa cẩm chướng đã được trồng thương mại ở Australia từ năm 1954, đến

năm 2005 Australia có khoảng trên 100 ha tập trung tại tiểu bang Victoria, Nam

Úc, Tây Úc với sản lượng khoảng 140 triệu bông hoa cắt mỗi năm (Office of Gene

Technology Regulator, 2005).

Colombia là nước trồng cẩm chướng cho hoa tốt nhất trên thế giới và được

coi là thiên đường của hoa cẩm chướng. Với điều kiện tự nhiên rất phù hợp, cây

cẩm chướng đã phát triển trên 35 năm. Trong tổng số 4.200 ha hoa cắt thì cẩm

chướng chiếm 45,8% tổng lượng hoa xuất khẩu của nước này (Nguyễn Thị Kim

Lý và cs., 2012). Năm 2000 diện tích trồng hoa cẩm chướng đạt 1.868 ha với sản

lượng 591 triệu cành/ năm (Thiranjan, 2005).

Cẩm chướng cũng là loại hoa phát triển mạnh ở Kenya. Năm 2000, Kenya

có khoảng 115 ha với sản lượng 303 triệu cành/ năm (Thiranjan, 2005). Diện tích

trồng hoa cẩm chướng của Kenya chủ yếu tập trung ở vùng Ritf Valley. Cây cẩm

chướng được trồng làm cảnh ngoài đồng ở độ cao khoảng 1.800 m và trồng trong

nhà plastic ở độ cao 2.700 m so với mực nước biển (Cox et al., 1987).

Ở Thổ Nhĩ Kỳ, hoa cẩm chướng được trồng với diện tích lớn chiếm 21%

(Nguyễn Thị Kim Lý, 2009). Diện tích trồng hoa cẩm chướng tại Thổ Nhĩ Kỳ phát

triển rất nhanh năm 2000 có 3.365 ha đến năm 2005 đã có 8.160 ha, Trong 5 loài

hoa xuất khẩu, hoa cẩm chướng luôn là loại hoa xuất khẩu hàng đầu ở nước này.

Năm 2005, xuất khẩu đạt 21.386.821 USD trong tổng số 24.356.565 USD xuất

khẩu từ 5 loại hoa (hoa hồng, cẩm chướng, hoa lan, cúc, đồng tiền) (Gulay, 2009).

Tại Israel tỷ lệ diện tích trồng hoa cẩm chướng chiếm 7,5% tổng diện tích

trồng hoa, mỗi năm doanh thu xuất khẩu đạt 119 triệu USD (Nguyễn Thị Kim Lý

và cs., 2012).

Bảng 1.1. Diện tích trồng và năng suất hoa cẩm chướng ở một số nước năm 2000

Tên quốc gia Diện tích Sản lượng Tên quốc Diện tích Sản lượng

(triệu cành) gia (triệu cành) (ha) (ha)

Hà Lan 739 Ba lan 217 278 -

Colombia 1.868 591 Mỹ 214 -

Tây Ban Nha 308 Pháp 150 210 -

Kenya 303 Italia 115 150 -

Nhật Bản - Israel 602 350 125

Thổ Nhĩ Kỳ 107 -

(Nguồn: Thiranjan, 2005)

Trung Quốc là nước có nhiều vùng sản xuất hoa cẩm chướng, trong đó Côn

Minh là nơi trồng hoa cẩm chướng có chất lượng cao (Nguyễn Thị Kim Lý và cs.,

2012). Cẩm chướng chiếm khoảng 25% tổng lượng hoa trên thị trường tại Bắc

Kinh và Côn Minh (Yang et al., 1998). Tỉnh Vân Nam của Trung Quốc có kim

ngạch xuất khẩu hoa cắt cành ngày càng cao. Theo thống kê tháng 11 năm 2006

đạt 10,4 triệu USD với sản lượng 4,3 nghìn tấn, trong đó cẩm chướng là một trong

3 loại hoa xuất khẩu chủ lực (Khuyết danh, 2007).

1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam

Ở Việt Nam hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào trồng từ đầu thế kỷ

XIX, chủ yếu trồng ở những nơi có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Sapa (Nguyễn Thị

Kim Lý, 2009). Những năm gần đây, cẩm chướng đã được trồng ở nhiều vùng

trong cả nước như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, Thành phố Hồ Chí Minh. Các vùng

chuyên hoa như An Hải (Hải Phòng), Tây Tựu - Từ Liêm, Phú Thượng - Tây Hồ

(Hà Nội). Với lợi thế về điều kiện khí hậu cẩm chướng đã được trồng cả ở mùa hè

ở Đà Lạt, Sapa và đang dần chiếm lĩnh thị trường trong nước (Lê Đức Thảo,

2010).

Theo số liệu thống kê, xuất khẩu tháng 3/2010, xuất khẩu hoa cẩm chướng

đạt 1,23 triệu cành, giá trị xuất khẩu đạt 0,26 triệu USD. Trong đó thị trường Nhật

Bản chiếm số lượng lớn với 0,94 triệu cành, trị giá 0,19 triệu USD (Khuyết danh,

2010). Hàng năm Đà Lạt cung cấp khoảng 0,3 - 0,5 triệu cành hoa cẩm chướng các

loại. Từ năm 2008 đến nay, diện tích trồng hoa cẩm chướng trong nhà kính ở Lạc

Dương và Đà Lạt tăng từ gần 214 ha lên hơn 290 ha. Trong năm 2013, các hộ

nông dân tại Đà Lạt đã liên kết với Công ty DaLat Hasfarm trong việc trồng hoa

xuất khẩu, xây dựng 50 ha nhà kính trồng hoa, trong đó 20% trồng hoa cúc, 80%

trồng hoa cẩm chướng. Ước giá trị lợi nhuận trong 6 tháng đầu năm 2013 với sản

xuất xuất khẩu hoa cẩm chướng cũng đạt tương đương với hoa cúc, trung bình trên

dưới 10 triệu đồng/1.000m2/tháng (Huy Hoàng, 2013).

Như vậy có thể thấy cẩm chướng là một trong những loài hoa được trồng từ

rất lâu và phổ biến ở châu Âu, châu Á và châu Mỹ. Đây là loại hoa có tiềm năng

phát triển rất lớn và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản

xuất hoa của nước ta nói riêng và thế giới nói chung. Tuy nhiên việc phát triển cây

hoa cẩm chướng ở nước ta còn nhiều hạn chế, sản lượng và chất lượng hoa cẩm

chướng còn thấp chưa đáp ứng được yêu cầu của người tiêu dùng. Vì vậy việc

nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật, đặc biệt là khâu chọn tạo giống hoa cầm

chướng ở nước ta là rất cần thiết.

1.3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây hoa

cẩm chướng

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại

nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Cơ sở lý luận của phương pháp đó là dựa trên cơ sở tính toàn năng và đặc

tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật.

Theo Haberlandt (1902), mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều mang

toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều

kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó

chính là tính toàn năng của tế bào.

Quá trình phân hóa tế bào là quá trình tế bào hợp tử phân chia hình thành

nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt. Sau đó từ các tế bào phôi

sinh chúng tiếp tục biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ

quan có chức năng khác nhau. Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức

năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp

cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự

phân hóa tế bào. Quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào là con đường để

có thể tái sinh được cơ thể thực vật nguyên vẹn từ các tế bào, mô chuyên hóa khi

nuôi cấy in vitro.

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ nhiều mục đích khác nhau.

Trong lĩnh vực giống cây trồng nó được ứng dụng để làm phong phú vật liệu di

truyền cho công tác chọn tạo giống, nhân nhanh và duy trì những giống và các thể

có ý nghĩa khoa học, làm sạch bệnh vi rút, phục tráng những giống thoái hoá,...

Trong đó, ứng dụng nhân giống vô tính cây trồng là lĩnh vực được quan tâm hơn

cả. Vi nhân giống (Micropropagation) hay nhân giống bằng nuôi cấy mô là lĩnh

vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Ưu thế của phương pháp nhân giống vô tính in vitro so với các phương

pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, là có

hệ số nhân cao, có thể đạt tới 103 - 1012 lần/năm. Ngoài ra, phương pháp này

không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là

phương pháp đặc biệt ưu việt với các loại cây khó nhân giống bằng con đường

nhân giống hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn chế mà

lại cần nhân nhanh. Phương pháp nhân giống in vitro có thể tạo ra một quần thể

đồng nhất với số lượng lớn, cây giống khoẻ mạnh, sạch bệnh, có thể phục tráng

một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, có thể trao đổi quốc tế nguồn gen

và lưu giữ, bảo quản dưới dạng cây con in vitro. Nó đã được ứng dụng rất có hiệu

quả cho rất nhiều loại cây trồng như cây hoa, cây lương thực, cây ăn quả, cây công

nghiệp và cây dược liệu,… (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Việc ứng dụng kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro đã mang lại những thành công hết sức to lớn trên hầu hết các loại cây trồng.

Theo thống kê, Trung Quốc đã có đến 700 chủng loại thực vật đã được nhân giống

bằng cách nuôi cấy mô. Ở nước ta kỹ thuật nhân giống in vitro đã được ứng dụng

thành công ở nhiều loài cây hoa như hoa hồng, hoa tường anh, hoa trà, hoa cúc,

hoa loa kèn, hoa lan, .... và rất nhiều loài cây ăn quả, cây thuốc.

Ứng dụng nhân giống in vitro đối với cây hoa cẩm chướng cũng đã được rất

nhiều tác giả trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu

cho thấy:

Nhân giống in vitro đối với cây cẩm chướng có thể bằng nhiều phương thức

khác nhau như: Nuôi cấy thông qua tái sinh tạo mô sẹo, phương thức này có thể sử

dụng nguồn vật liệu từ các bộ phận của cây nhưng phổ biến là sử dụng tái sinh từ lá

(Archana and Kothari, 2002; Mehta et al., 2007), tái sinh từ rễ (Seo et al., 2007);

Nuôi cấy tạo chồi trực tiếp từ các bộ phận, phương thức này được áp dụng phổ biến

trong nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng nói riêng và các loài thực vật nói

chung. Nguồn vật liệu nuôi cấy có thể sử dụng nhiều cơ quan khác nhau sử dụng

chóp rễ, chồi nách, chồi đỉnh, lá, nụ hoa (Archana and Kothari, 2002; Meena et al.,

2006; Bora et al., 2007). Tuy nhiên, chồi đỉnh, chồi nách được sử dụng phổ biến vì

chúng là những chồi nguyên thủy (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007) và cho

hệ số nhân chồi cao hơn so với các bộ phận khác (Bora et al., 2007).

Để khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy có thể sử dụng nhiều loại hóa

chất khác nhau như hypochlorite calcium (9,0 - 10%) trong 5 - 30 phút,

hypochlorite sodium (0,5 - 5,0%) trong 5 - 50 phút, oxy già (3,0 - 12%) trong 5 -

15 phút, chlorua thủy ngân (0,1 - 1,0%) trong 2 - 10 phút, nitrate bạc (1,0%) trong

thời gian 5 - 30 phút, … (Gamborg and Philips, 1995). Các kết quả nghiên cứu

trên một số giống cẩm chướng cho thấy, đối với cây hoa cẩm chướng sử dụng

chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút

cho hiệu quả hơn cả (Lê Đức Thảo, 2010).

Môi trường nuôi cấy là cơ sở và là điều kiện cần thiết để đảm bảo cho sự

nuôi cấy thành công các tế bào, mô thực vật tách rời. Tùy từng bộ phận, giai đoạn

và mục đích nuôi cấy khác nhau mà các môi trường có thành phần khác nhau. Các

kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với các giống khác nhau, các bộ phận nuôi cấy

khác nhau thì môi trường nuôi cấy tối ưu có sự khác nhau (Meena et al., 2006;

Esmaiel et al., 2013).

Các nghiên cứu về môi trường tái sinh mô sẹo từ lá cây cẩm chướng cho

thấy tùy từng giống khác nhau có thể sử dụng môi trường MS bổ sung 0,5 - 2,0

mg/l α-NAA và 0,5 - 3,0 mg/l BAP hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin sẽ cho hiệu quả

cao (Archana and Kothari, 2002; Mosquera et al., 2009; Mehta et al., 2007;

Sayeed et al., 2011; Esmaiel et al., 2013). Theo Archana and Kothari (2002) khi

sử dụng môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l α-AA hoặc 3,0 mg/l BAP +

1,0 mg/l α-NAA chồi có khả năng hình thành trực tiếp từ mô lá mà không hình

thành mô sẹo. Đối với việc tái sinh mô sẹo từ rễ thì việc bổ sung 1,0 mg/l

Thidiazuron (TDZ) và 1,0 mg/l α-NAA sẽ cho hiệu quả cao (Seo et al., 2007).

Môi trường tạo chồi thích hợp đối với cây cẩm chướng là MS bổ sung 0,25

- 0,5 mg/l α-NAA + 0,5 - 1,0 mg/l BA hoặc 0,5 - 2,0 mg/l kinetin (Aparna et al.,

2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al.,

2011; Esmaiel et al., 2013). Tuy nhiên việc bổ sung BA hoặc kinetin nồng độ cao

trong môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng tỷ lệ chồi bị thủy tinh hóa (Mahdiyeh et al.,

2011).

Môi trường tạo rễ thích hợp là MS bổ sung 0,5 - 1,0 mg/l IBA; 1,0 mg/l α-

NAA hoặc IAA có thể kết hợp với 0,25 - 0,5 g/l than hoạt tính (Aparna et al.,

2004; Mehta et al., 2007; Aamir et al., 2008; Sayeed et al., 2011; Mahdiyeh et al.,

2011; Esmaiel et al., 2013). Casanova et al. (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của

lượng agar trong môi trường nuôi cấy cẩm chướng cho thấy khi bổ sung agar

trong môi trường nuôi cấy từ 0 - 12 g/l làm giảm dần khả năng sử dụng nước, làm

giảm khả năng tái sinh chồi của mẫu. Các chỉ tiêu hàm lượng nước trong chồi,

khối lượng tươi, số lượng, kích cỡ của các tế bào và số lượng chồi tái sinh cũng

giảm. Do đó, độ ẩm tương đối và nước có sẵn trong môi trường nuôi cấy không

chỉ ảnh hưởng đến hình thái mẫu mà còn ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý của

chồi.

Có thể sử dụng nhiều loại giá thể để thích ứng cây cẩm chướng in vitro

ngoài vườn ươm như: đất (Bora et al., 2007), cát, cát + đất và cát + trấu hun

(Nguyễn Quang Thạch và cs., 1996); cát + đất + phân hữu cơ (1:1:1) (Omid,

2011); trấu hun và hạt perlite (7:3) (Lê Đức Thảo và cs., 2009); cát + phân hữu cơ

(1:1) (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012). Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng

công nghệ khí canh để thích ứng cây cẩm chướng in vitro trong điều kiện tự nhiên

cũng đã thu được kết quả khả quan (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010).

Qua các nghiên cứu nêu trên về nhân giống in vitro cây cẩm chướng có thể

kết luận như sau:

- Về bộ phận nuôi cấy: có thể nuôi cấy từ nhiều bộ phận khác nhau: rễ, đỉnh

sinh trưởng, đoạn thân, lá. Tuy nhiên mẫu nuôi cấy từ chồi nách phát triển tốt hơn.

- Về phương pháp khử trùng mẫu: Có thể sử dụng nhiều loại hóa chất khử

trùng khác nhau, nhưng sử dụng chlorua thủy ngân nồng độ 0,1% để khử trùng

mẫu cấy trong thời gian 5 - 10 phút cho hiệu quả cao.

- Về môi trường nuôi cấy: môi trường cơ bản MS với hàm lượng đường từ

2 - 3% được sử dụng phổ biến. Môi trường này sẽ được bổ sung thêm chất điều

tiết sinh trưởng thực vật thông dụng như: BA, kinetin, α-NAA và IBA với nồng

độ thấp (0,2 - 2 mg/l) ở dạng riêng rẽ hay tổ hợp tùy thuộc vào từng giai đoạn

nuôi cấy (tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ,…).

- Về giá thể trồng cây in vitro tại vườn ươm: có thể sử dụng nhiều loại giá

thể khác nhau, tuy nhiên cây phát triển tốt hơn khi sử dụng giá thể thoáng khí.

1.4. Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo giống

cây trồng

1.4.1. Đột biến tạo biến dị di truyền

Đột biến (mutation) là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền

của tính biến dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hoá

của sinh vật. Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến

đổi bất kỳ tính trạng nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt,

đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy. Một số đột biến được biểu hiện ra

kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến

sức sống. Có những đột biến lặn, nhưng cũng có những đột biến trội. Sự thay đổi

kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau

như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành.

Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các

loại đột biến khác nhau như: đột biến gen: Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn DNA,

thường liên quan đến 1 hay 1 cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể: tái

sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn,... Các đột biến này còn có thể gọi là sai hình nhiễm

sắc thể (Phạm Thành Hổ, 2010).

Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể

thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật. Vì vậy, các nhà

chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự

biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới (Bùi Chí Bửu và Nguyễn

Thị Lang, 2007).

Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên). Do tác động của

tập hợp các yếu tố (vật lý, hoá học,…) có trong môi trường sống, và do những biến

loạn về trao đổi chất trong tế bào gây ra những biến đổi cấu trúc gen dẫn tới xuất

hiện những thể đột biến mới. Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến

nhân tạo): bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến như các tác nhân vật lý (tia

X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…), các tác nhân hoá học (các

chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh,

những tác nhân alkyl hoá, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid,...)

Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tuỳ thuộc vào

từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến thường rất

thấp (khoảng 10-6) và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại

càng thấp hơn (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Ngày nay các nhà chọn

giống không chỉ trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát. Vì vậy, việc

gây đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần

xuất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói

chung và cây trồng nói riêng. Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực

nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới.

1.4.2. Các tác nhân gây đột biến

Các tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố sinh học, hoá học và vật lý.

Các nhân tố này có thể làm gia tăng tần số đột biến lên 10 đến 100 nghìn lần. Các

loại tác nhân thường dùng bao gồm:

- Tác nhân hóa học: bao gồm các chất như DES, EMS, EI, NEU, NMU,

NaM3, 1,4- Biadiazo - acetyl Butane, ...

- Tác nhân vật lý: tia X (từ đèn UV), phóng xạ điện từ (tia X từ máy X -

quang, tia gamma từ nguồn 60Co và 137Cs, phóng xạ hạt (chùm neutron nóng hoặc

chậm từ lò phản ứng, chùm neutron nhanh từ lò phản ứng, các hạt beta phóng ra

từ 32P và 35S), ion beam và electron beam.

Theo thống kê của tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) năm

2008, tại Nhật Bản nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác

nhân đột biến khác nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7%.

Trong đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo

giống đột biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng nuôi

cấy in vitro đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5%. Tác nhân hóa học mặc

dù được sử dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia

ion mới được sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỷ lệ 5,8% (Nakagawa, 2008).

Trên thế giới năm 2009, tỷ lệ đóng góp của tác nhân vật lý chiếm 87%, tác nhân

Tia ion 5,80% Tia X 9,50%

Tia bức xạ khác 2,10%

Tác nhân hóa học 6,60%

Tia gamma 60,30%

Nuôi cấy in vitro 15,70%

hóa học chiếm 13% (FAO và IAEA, 2009).

Hình 1.2. Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng

tại Nhật Bản năm 2008

(Nguồn: Nakagawa, 2008)

Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hoá học có hiệu quả hơn tác

nhân vật lý. Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu xạ ở các cây nông nghiệp xuất hiện 10

- 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hoá học cho phép thu nhận

từ 30 - 60%. Hơn nữa tác nhân gây đột biến hoá học thường làm xuất hiện những

biến dị đặc biệt hơn (Đào Thị Thanh Bằng và cs.,1997).

1.4.2.1. EMS và ứng dụng EMS trong công tác chọn tạo giống cây trồng

EMS - Methylethane sulphonate, công thức hoá học: CH3SO2OC2H5, khối

lượng phân tử 124,16 gmol-1, tỷ trọng 1,1452 (220C), Điểm nóng chảy < 250C,

Điểm sôi 213 - 213,50C.

EMS có thể gây đột biến ít nhất bằng 3 cách: thêm nhóm methyl (- CH3)

hay ethyl (- C2H5) vào guanine tạo base đồng đẳng của adenine dẫn đến bắt cặp bổ

sung sai; làm mất guanine do đã bị alkyl hoá (mất purine) tạo lỗ hổng trên DNA,

khi sao chép có thể làm đứt mạch; liên kết chéo giữa các mạch của một hoặc các

phân tử DNA khác nhau làm mất nucleotide.

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hoá học, EMS là chất được sử dụng phổ

biến và cho hiệu quả cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Dung dịch hoá

chất gây đột biến này phải được chuẩn bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung

dịch gốc. Tốc độ thuỷ phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời

gian (hafl life). Qua các kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ thuỷ phân của EMS phụ

thuộc rất lớn vào nhiệt độ. Trong nước cất (pH = 7) ở nhiệt độ 200C, hafl life của

EMS là 93 giờ, ở 300C là 26 giờ và ở 370C là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang,

2007). Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch

trước khi xử lý không quá 30 phút và giữ trong bóng tối trong suốt thời gian xử lý

(Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997)

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang

có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của EMS. Xử lý chất này

làm giảm sự sinh trưởng 30 - 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo

cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hoá chất EMS trên các bộ phận

như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển. Tuy nhiên, đối với mỗi

giống, bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hoá chất gây đột biến.

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức độ nhất

định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng

sống của đối tượng lại giảm xuống. Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây

trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể đem lại hiệu

quả gây đột biến di truyền cao.

1.4.2.2. Đột biến phóng xạ và ứng dụng trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Tia gamma và tia X là 2 tác nhân chiếu xạ cơ bản trong gây tạo đột biến

thực nghiệm. Được dùng phổ biến nhất là tia gamma với nguồn 60Co và 137Cs do

có bước sóng rất ngắn và vận tốc rất lớn, không có khối lượng và điện tích, không

bị lệch trong điện trường và có sức xuyên khá lớn.

Cơ chế gây đột biến của tác nhân phóng xạ

Theo Kuzin and Yurov (1968) cơ chế của quá trình tương tác gây đột biến

gồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn 1: Có tính chất vật lý, sự tương tác của các bức xạ tạo ra các

quá trình ion hoá và sự biến đổi các hợp chất ở mức phân tử và dưới phân tử.

- Giai đoạn 2: Có tính chất hoá học, giai đoạn này diễn ra các phản ứng tương

tác của các sản phẩm sơ cấp do kết quả tương tác của bức xạ với các đại phân tử

chưa bị biến tính của các cấu trúc sinh học, tạo ra các peoxit hữu cơ đồng thời diễn

ra các phản ứng oxi hoá dẫn tới sự tạo thành các hợp chất mới.

- Giai đoạn 3: Có tính chất sinh học, là giai đoạn phát huy tác dụng của các

phản ứng lên hoạt động của các tế bào sống. Tức là các biến đổi hoá học gây nên

do bức xạ dưới mức tế bào, chẳng hạn như làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của

màng tế bào.

Quá trình tác động qua nhiều giai đoạn như trên gọi là tác động gián tiếp của

bức xạ lên tế bào sống. Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy các tia bức xạ còn gây ra

tác động trực tiếp lên một số cấu trúc dưới tế bào, gây ảnh hưởng trực tiếp đến quá

trình tổng hợp DNA và tổng hợp protit trong tế bào sống, đặc biệt là các biến đổi

trong cấu trúc DNA, làm phát sinh đột biến di truyền (Phạm Thành Hổ, 2010).

Quá trình phát sinh đột biến cảm ứng rất phức tạp, liên quan và phụ thuộc

vào nhiều yếu tố: đặc tính lý học của loại tia phóng xạ; liều lượng, cường độ

phóng xạ; sự phục hồi các biến dị tiềm năng và các yếu tố khác như: dưỡng khí,

nhiệt độ, lượng nước trong mô, một số chất hoạt hoá, điều kiện sinh thái, giai đoạn

phát triển, kiểu gen của vật liệu xử lý.

Để tạo ra các giống cây đột biến bằng công nghệ này, tùy theo từng đối

tượng cây trồng người ta có thể chiếu xạ trực tiếp các bộ phận của cây như mầm,

chồi, hạt phấn, nhụy, hạt giống hay toàn bộ cây ở những giai đoạn khác nhau. Bên

cạnh đó có thể kết hợp chiếu xạ với phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để

tạo callus, PLB,... sau đó chiếu xạ (Chakrabarty and Datta, 2010). Tùy vào liều

lượng và thời gian xử lý chiếu xạ sẽ tạo ra những đứt gẫy nhiễm thể hoặc những

thay đổi về cấu trúc gene. Những mẫu sau khi chiếu xạ có thể được gieo trồng trực

tiếp hoặc được nhân lên và tái sinh cây in vitro. Sau đó trồng ra ngoài đồng ruộng

và đánh giá, chọn lọc qua nhiều thế hệ. Những dòng, giống ưu việt sẽ được nhân

lên để sản xuất đại trà.

1.4.3. Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều

phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển. Bằng các phương

pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất

cao, ổn định cần ít nhất từ 6 - 10 thế hệ. Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp

đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm) chỉ cần 3 - 6 thế hệ (Đào Thị Thanh Bằng

và cs., 1997). Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề

mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự nhiên về

một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn

một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó

không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng

phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm

khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của

giống (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005). Với phương pháp đột biến thực nghiệm,

sử dụng các tác nhân lý, hoá gây đột biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong

quần thể. Việc xử lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính

3000

2500

nhảy vọt đáng kể. Do đó có thể tạo ra giống mới khác xa giống cũ.

g n ố i g

2000

1500

g n ợ ư

l

1000

ố S

500

1966

1971

1976

1981

1991

2001

2006

2008

1986 Năm

Hình 1.3. Số giống cây trồng được tạo ra theo phương pháp gây tạo đột biến

trên thế giới qua các năm

(Nguồn: Si, 2009)

Với các thành tựu mới về vật lý, hoá học, con người đã sử dụng các tia

phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hoá học (tác nhân hoá học) như colchicine,

Bắc mỹ 6,23% Châu Phi

Châu Mỹ La tinh 1,56%

1,99%

Châu Âu 29,61%

Châu Á; 60,30%

Châu Úc; 0,31%

EMS,... trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được nhiều thành tựu.

Hình 1.4. Tỷ lệ các giống đột biến trên các châu lục vào năm 2008

(Nguồn: FAO/IAEA, 2008)

Theo Ban Di truyền và Chọn giống thực vật của tổ chức Nông nghiệp Quốc

tế và Tổ chức Năng lượng nguyên tử Quốc tế, tính đến năm 1996, số lượng các

giống đột biến thu được là 1.737 giống từ hơn 50 nước trên thế giới. Các giống đột

biến này được tạo ra từ 154 loài thực vật. Trong đó có 187 giống hoa cúc, 35

giống cây cảnh, 34 giống hoa phong lan, 30 giống xương rồng và rất nhiều loài

khác (Đào Thị Thanh Bằng và cs.,1997). Trong 70 năm qua, hơn 2.543 giống đột

biến từ 175 loài thực vật bao gồm cây cảnh, ngũ cốc, hạt có dầu, đậu, rau, trái cây

và các loại cây lấy sợi đã được tạo ra từ 50 quốc gia trên khắp thế giới

(Maluszynski et al., 2000; Chopra, 2005). Đến năm 2009 đã có 3.100 giống mới

của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công bố bởi hơn 60

quốc gia khác nhau và trên các vùng châu lục khác nhau. Trong năm 2010 bổ sung

thêm 12 giống đột biến và năm 2013 bổ sung thêm 4 giống (trong đó Việt Nam bổ

sung thêm 3 giống hoa cúc) nâng tổng số giống lên đến 3.212 giống đột biến trên

toàn thế giới (FAO và IAEA, 2009, 2010, 2013). Từ những kết quả thu được

chứng tỏ đây là một trong những phương pháp có hiệu quả để tạo ra giống mới.

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đánh giá, một trong những thành tựu xuất sắc

của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực

nghiệm.

Tỷ lệ các giống đột biến được tạo ra ở các châu lục cũng khác nhau trong

đó nhiều nhất là châu Á (chiếm 60,31%) và thấp nhất là châu Úc (0,31%). Bên

cạnh đó, các giống đột biến phần lớn tập trung ở các giống cây ngũ cốc (chiếm

70%), sau đó là các cây họ đậu (18%), cây có dầu (4%) và những loại khác.

Bảng 1.3. Số giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp gây tạo đột biến

ở một số quốc gia tính đến năm 2007

TT Quốc gia Tổng số giống TT Quốc gia Tổng số giống

cây đột biến cây đột biến

1 Trung Quốc 36 638 13 Brazil

2 Ấn Độ 35 272 14 Slovakia

3 Nhận Bản 34 232 15 Anh

4 Nga 27 214 16 Bangladesh

5 Hà Lan 26 176 17 Thụy Điển

6 Đức 26 176 18 Cote d’lvoire

7 Mỹ 26 128 19 Guyana

8 Pháp 23 43 20 Bỉ

9 Việt Nam 23 42 21 Iraq

10 Pakistan 22 42 22 Đan Mạch

11 Bulgaria 21 38 23 Úc

12 Canada 19 37 24 Hàn Quốc

(Nguồn: Si, 2009)

1.5. Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong chọn tạo

giống cây trồng

1.5.1. Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp kết hợp giữa

kỹ thuật nuôi cấy mô với phương pháp gây tạo đột biến. Sự kết hợp này sẽ làm

tăng tần số biến dị di truyền lên nhiều lần so với phương pháp thông thường, rút

ngắn thời gian trong công tác chọn tạo giống mới mang lại khả năng tạo biến dị rất

cao. Phương pháp này còn có khả năng tạo đột biến ở giai đoạn sớm của quá trình

hình thành và phát triển cá thể (phôi non hoặc callus). Nhờ vậy, tần số đột biến cao

và khả năng thu nhận những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen trở nên dễ dàng

hơn. Nuôi cấy in vitro không những là công cụ hữu hiệu để lưu giữ, duy trì và

nhân những thể đột biến lạ, quý hiếm mà còn là phương pháp phân lập và làm

thuần những dòng đột biến nào đó. Trong nhiều trường hợp, nuôi cấy in vitro là

cách có hiệu quả nhất để duy trì và bảo quản những biến dị di truyền, đặc biệt là

những thể đột biến khảm, nhờ đó khắc phục được sự đào thải của những tế bào

quý hiếm do tính cạnh trạnh trong mô (Lê Đức Thảo, 2010).

Sự phát triển của phương pháp nuôi cấy in vitro đã tạo điều kiện cho việc

sử dụng các kỹ thuật đột biến để cải thiện cải giống cây trồng. Kỹ thuật này là

phương pháp hiệu quả nhất để cải thiện giống cây trồng (Mohan, 2010). Gây tạo

đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm như, thuận tiện trong xử lý số

lượng lớn các cây con do kích thước nhỏ, hiệu quả sử dụng chất gây đột biến hóa

học cao và liều lượng xử lý thấp hơn. Phương pháp có tiềm năng rất lớn đối với

chọn tạo giống hoa cây cảnh. Ưu điểm chính của phương pháp là khả năng cải

thiện một hoặc một vài tính trạng quan trọng của một giống mà về cơ bản ít có

thay đổi kiểu gen còn lại (Ibrahim and Debergh, 1998).

Nguyễn Tiến Thịnh và Lê Văn Thức (2007) cho rằng, mẫu vật truyền thống

trong chiếu xạ đột biến ở cây trồng nhân giống bằng hình thức sinh dưỡng như

hom, cành giâm, củ, hành, thân bò,… thường có kích cỡ to và số lượng tế bào lớn

nên không thuận tiện trong thao tác chiếu xạ đột biến sử dụng những nguồn bức xạ

tiện lợi và phổ biến, ví dụ như thiết bị gamma cell. Quan trọng hơn nữa là khó

khăn trong việc phân lập thể đột biến thuần từ cấu trúc khảm về sau. Việc sử dụng

kết hợp tác nhân gây đột biến với kỹ thuật nuôi cấy in vitro giúp giải quyết hiệu

quả các hạn chế và khó khăn trên. Ngoài ra, sau xử lý đột biến hiện tượng đột biến

không chỉ xảy ra ở các mắt mầm của những mẫu vật trên, mà còn có thể ở bất kỳ

những vùng mô nào đó có trên mẫu. Các phương pháp trồng trọt và chọn lọc

truyền thống không khai thác được tiềm năng đột biến này.

Kỹ thuật đột biến kết hợp với nuôi cấy mô tế bào là phương pháp có hiệu

quả nhất đối với việc cải thiện giống ở các loài có thể nhân giống bằng phương

pháp vô tính như chuối, táo, cọ, khoai tây, cúc, hồng,... (Ahloowalia and

Maluszynski, 2001). Theo Chahal and Gosal (2002) tạo đột biến thông qua nuôi

cấy mô có những ưu điểm như: nhiều yếu tố có tính chất ngoại cảnh có thể được

kiểm soát tốt hơn; sử dụng tế bào trần, tế bào riêng rẽ làm cho cơ hội chọn lọc có

tính chất “lưỡng bội” bị giảm thiểu tối đa; có rất ít cơ hội cho sự hình thành thể

khảm nếu cây tái sinh có nguồn gốc từ một tế bào; tần suất đột biến thường khá

cao bởi mỗi tế bào thường được tiếp xúc trực tiếp với tác nhân gây đột biến; chọn

lọc in vitro đối với nhiều stress sinh học và phi sinh học có thể đạt hiệu quả tốt khi

cho xử lý ở mức độ tế bào trong môi trường nuôi cấy; hàng triệu tế bào (cây tiềm

năng) có thể được thanh lọc chỉ trong một hộp petri (Mohan, 2010).

1.5.2. Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro

Việc xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro có thể theo nhiều cách

khác nhau, tùy thuộc vào tác nhân gây đột biến, loại cây trồng, bộ phận xử lý và

mục đích. Qua tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả cho thấy việc

gây tạo đột biến kết hợp có thể theo các phương thức sau:

- Xử lý trước khi nuôi cấy in vitro: thường áp dụng đối với xử lý bằng tác

nhân vật lý. Cây được trồng vào các chậu, lựa chọn cây sinh trưởng phát triển tốt

đem xử lý, có thể xử lý từng bộ phận của cây hoặc toàn cây. Cây được lựa chọn để

xử lý đột biến thường là những dòng thích nghi tốt với điều kiện địa phương, chỉ

thiếu một vài tính trạng cần thiết nào đó (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,

2007). Các bộ phận của cây sau xử lý được tách ra và đưa vào nuôi cấy in vitro

(giai đoạn này có thể nuôi cấy tạo mô sẹo sau đó chọn lọc mô sẹo tái sinh cây hoặc

có thể nuôi cấy không thông qua mô sẹo mà tạo chồi trực tiếp, sau đó chọn lọc các

dạng biến dị). Theo Predieri and Virgilio (2007) các chồi in vitro cần được sàng

lọc và nhân qua ít nhất 3 thế hệ M1V3 sau đó tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng

ngoài đồng ruộng theo dõi, phân lập đánh giá để thu thập các thể đột biến có lợi.

Bằng phương pháp này Datta et al. (2005) đã nghiên cứu xử lý đột biến in

vitro cho cây hoa cúc bằng chiếu xạ gamma với liều 500 rad. Tác giả đã xử lý trên

bốn giống khác nhau (Flirt, Puja, Maghi và Sunil) sau đó đưa vào nuôi cấy in

vitro, chọn lọc các dạng biến dị và tái sinh cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài

đồng ruộng, tác giả đã phân lập được một số dạng đột biến trong đó có 5 dạng biến

đổi về màu sắc, hình thái hoa có triển vọng. Barakat et al. (2010) đã nghiên cứu

chiếu xạ tia gamma cho cánh hoa cúc với liều 0,5 Gγ và 1,0 Gγ, chồi tái sinh từ

mô sẹo đã tạo ra nhiều dạng màu sắc hoa và dạng cánh hoa khác nhau.

- Xử lý trong nuôi cấy in vitro: phương pháp này có thể áp dụng cho cả hai

tác nhân vật lý và hóa học. Theo phương pháp này giống cây trồng cần xử lý được

lựa chọn bộ phận đưa vào nuôi cấy mô (có thể nuôi cấy tái sinh mô sẹo nếu xử lý

mô sẹo hoặc nuôi cấy tạo chồi nếu xử lý chồi), sau đó xử lý gây tạo đột biến bằng

các tác nhân vật lý hoặc hóa học (có thể xử lý riêng rẽ từng tác nhân hoặc xử lý kết

hợp cả 2 tác nhân). Bước tiếp theo là phân lập các dạng đột biến sau đó tiến hành

nhân qua các thế hệ. Ở giai đoạn này nếu mục đích chọn tạo giống chống chịu

người ta thường chọn lọc các dạng đột biến bằng phương pháp chọn lọc có áp lực

chọn lọc (chọn lọc tính chịu mặn, tính kháng bệnh, tính chịu nhiệt,…) (Jain, 2010).

Sau đó sẽ tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh

giá thu thập các dạng đột biến, lựa chọn các dòng triển vọng đánh giá sự sai khác ở

mức độ phân tử bằng marker DNA (Joanna et al., 2012).

Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp được áp dụng

phổ biến và đã mang lại rất nhiều thành công trên các đối tượng cây trồng khác

nhau (Mohan, 2010). Theo phương pháp này Seetohul et al. (2009) đã nghiên cứu

xử lý đột biến in vitro cho cây khoai sọ. Chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường

dinh dưỡng, sau đó được xử lý chiếu xạ gamma với liều 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,

20, 40 và 60 Gγ. Dựa trên đặc điểm hình thái, tác giả phân lập được 44 dạng đột

biến sau đó sử dụng kỹ thuật RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền của 11 dạng,

kết quả cho thấy giữa chúng có sự đa dạng di truyền cao.

Hình 1.5. Trình tự các bước xử lý đột biến in vitro bằng chiếu xạ

(Nguồn: Novak and Brunner, 1992)

Đào Thị Thanh Bằng và cs. (2007) đã chiếu xạ mô sẹo hoa cúc bằng tia

gamma (Co60) ở các liều từ 1 - 15 Krad. Sau khi cây con tái sinh và cấy chuyển 3

lần, cây con được đưa vào môi trường ra rễ. Nhiều thể khảm và đột biến solid đã

xuất hiện ở thế hệ M1V4 và đã thu được 3 thể đột biến solid về màu sắc quan trọng

đó là hoa màu hồng, hoa màu vàng và hoa có chóp cánh màu xanh.

Suprasanna et al. (2009) đã xử dụng lá non cây mía đưa vào nuôi cấy tạo

mô sẹo, sau đó xử lý chiếu xạ với liều 10, 20, 30, 40 và 50 Gγ. Mô sẹo được cấy

chuyển 3 lần để loại bỏ chất phóng xạ và chuyển sang nuôi cấy trong môi trường

có bổ sung muối NaCl với nồng độ khác nhau (42,8 - 256,7 mM). Kết quả tác giả

đã chọn lọc được 147 cây con có khả năng chịu đựng được nồng độ muối khác

nhau. Tác giả đã sử dụng 60 cặp mồi RADP để đánh giá sự đa dạng di truyền giữa

các dòng đột biến. Kết quả lựa chọn được 44 dòng có tiềm năng.

Orkun and Sema (2011) đã nghiên cứu sử dụng chồi củ khoai tây đưa vào

nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ với liều lượng 5, 10 , 15, 20 , 25, 30 và 50 Gγ.

Sau đó chọn lọc trên môi trường bổ sung muối NaCl với nồng độ khác nhau. Kết

quả tác giả đã chọn lọc được một số dòng đột biến có khả năng chịu mặn.

Muhamad et al. (2013), nghiên cứu xử lý đột biến in vitro cho chồi cây

nghệ bằng chiếu xạ gamma với liều lượng 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120 và 140 Gγ.

Tác giả đã chọn lọc được 8 dạng đột biến (LP1 - LP8). Sau đó sử dụng mồi RADP

để đánh giá sự đa dạng di truyền. Kết quả cho thấy giữa các dòng đột biến có sự đa

dạng di truyền cao. Tác giả cũng đã xác định được LD50 là 10 Gγ.

- Xử lý trước và trong nuôi cấy in vitro: Theo cách này chúng ta sẽ trồng

cây vào các chậu, lựa chọn cây sinh trưởng phát triển tốt đem xử lý, có thể xử lý

từng bộ phận của cây hoặc toàn cây. Các bộ phận của cây sau xử lý được tách ra

và đưa vào nuôi cấy in vitro (giai đoạn này có thể nuôi cấy tạo mô sẹo sau đó chọn

lọc mô seo tái sinh cây hoặc có thể nuôi cấy không thông qua mô sẹo mà nuôi cấy

tạo chồi sau đó chọn lọc các dạng biến dị). Bước tiếp theo tiếp tục xử lý bằng các

tác nhân vật lý hoặc hóa học (có thể xử lý riêng rẽ từng tác nhân hoặc xử lý kết

hợp cả 2 tác nhân). Sau đó phân lập các dạng đột biến sau đó tiến hành nhân qua

các thế hệ. Ở giai đoạn này nếu mục đích chọn tạo giống chống chịu người ta

thường chọn lọc các dạng đột biến bằng chọn lọc có áp lực chọn lọc (chọn lọc tính

chịu mặn, tính kháng bệnh, tính chịu nhiệt,…). Các chồi sau xử lý được tạo cây

hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh giá thu thập các

dạng đột biến. Lựa chọn các dòng triển vọng đánh giá sự sai khác ở mức độ phân

tử bằng marker DNA. Bằng phương pháp này Datta and Chakrabarty (2009) đã xử

lý chiếu xạ liều lượng 1,5; 2,0 và 2,5 Krad trên cây hoa cúc đang ra hoa giống

Puja, Lilith, Maghi, Purnima và Colchi Bahar. Lựa chọn hoa đột biến khảm đưa

vào nuôi cấy tạo mô sẹo, sau đó tiếp tục xử lý chiếu xạ gamma với liều 0,5 và 1,0

Krad. Mô sẹo được cấy chuyển để tạo cây hoàn chỉnh sau đó trồng ra ngoài vườn,

theo dõi đánh giá. Kết quả tác giả đã phân lập được một số dạng hoa biến đổi về

màu sắc, cấu trúc hoa, trong đó có một số dạng có tiềm năng.

1.5.3. Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro

Tất cả các bộ phận của cây đều có thể làm vật liệu để xử lý đột biến. Tuy

nhiên mỗi bộ phận, cơ quan của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau đối với tác

nhân gây đột biến do vậy mỗi bộ phận đều có ưu, nhược điểm riêng, nhưng mô

phân sinh, đỉnh chồi và chồi mắt được ưu tiên lựa chọn vì chúng là những cơ quan

nguyên thủy (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Theo Jain (2010) vật liệu

để xử lý gây tạo đột biến in vitro có thể sử dụng nhiều nguồn khác nhau như chồi

nách, chồi đỉnh, lá, rễ, nụ hoa, củ, hạt, hạt phấn, mô sẹo,… tùy thuộc vào loại cây

trồng và mục đích gây tạo đột biến. Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang

(2007) đối với cây hoa cúc việc sử dụng cánh hoa để tái sinh sẽ tạo ra nhiều biến

dị đối với tính trạng màu sắc hơn so với việc sử dụng cuống hoa.

1.5.4. Sàng lọc thể đột biến

Việc sàng lọc các dạng đột biến trong gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in

vitro có thể tiến hành theo nhiều cách khác nhau tùy thuộc vào điều kiện, phương

pháp xử lý và mục đích xử lý.

- Chọn lọc không có tác nhân chọn lọc: Theo Mohan (2010) các tế bào, mô

sẹo, chồi in vitro sau xử lý được nhân qua ít nhất 3 thế hệ để loại bỏ thể khảm sau

đó được tái sinh tạo cây hoàn chỉnh. Các cây tái sinh sẽ được trồng trên đồng

ruộng để chọn lọc các biến dị. Lựa chọn các dạng biến dị có tiềm năng, đánh giá

sự sai phác di truyền ở mức độ phân tử bằng các marker DNA.

- Chọn lọc có tác nhân chọn lọc: Theo phương pháp này các tế bào, mô sẹo,

chồi in vitro sau xử lý được nhân lên qua nhiều thế hệ sau đó sàng lọc dựa vào khả

năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố hoặc chất ức chế trong môi trường

dinh dưỡng, hoặc dưới các điều kiện stress của môi trường (Predieri and Virgilio,

2007). Các tế bào, mô sẹo, chồi in vitro sau khi sàng lọc sẽ được tái sinh thành cây

hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài đồng ruộng để theo dõi đánh giá. Lựa chọn các

dạng biến dị có tiềm năng, đánh giá sự sai khác di truyền ở mức độ phân tử bằng các

marker phân tử. Với phương pháp này việc đánh giá sự sai khác di truyền ở mức độ

phân tử có thể thực hiện ngay sau khi sàng lọc các dạng biến dị từ nuôi cấy in vitro.

1.6. Một số kết quả nghiên cứu cây hoa cẩm chướng

1.6.1. Kết quả nghiên cứu trên thế giới

Với những ưu điểm của mình hoa cẩm chướng đã trở thành một trong

những loài hoa được trồng phổ biến trên thế giới và được nhiều người ưu thích,

cũng chính vì điều này đã thúc đẩy các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm

chọn tạo ra những giống hoa chất lượng cao, có khả năng sinh trưởng phát triển tốt

thích ứng với nhiều vùng sinh thái phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng.

1.6.1.1.Các kết quả nghiên cứu về chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng

Trong các nghiên cứu tạo giống cẩm chướng, hướng chọn tạo giống đột

biến đã có được những kết quả rất khả quan.

Cassells et al. (1993), đã nghiên cứu tạo đột biến trên cây cẩm chướng bằng

cách sử dụng tia X. Vật liệu xử lý là các đoạn thân có mang các mắt ngủ của giống

cẩm chướng Mystère. Kết quả đã thu được các cây cẩm chướng có sự đa dạng về

màu sắc hoa, kiểu dáng lá. Tỷ lệ tạo cây biến dạng là 2%. Phân tích về kiểu gen

cho thấy có sự sai khác so với cây trước khi tạo đột biến.

Một số đột biến về màu sắc hoa cẩm chướng (hoa màu đỏ với sọc trắng) đã

được tạo ra khi xử lý đột biến in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng chiếu xạ và

hóa học (Singh et al., 2000)

Manreet et al. (2002) đã nghiên cứu xử lý chiếu xạ gamma cho chồi nách

cây cẩm chướng với liều chiếu 1,0; 1,5 và 2,0 Krad. Kết quả cho thấy chiếu xạ dẫn

đến giảm số lượng chồi ban đầu nhưng hiệu quả dần dần biến mất sau 8 tuần nuôi

cấy. Các chồi này sau đó được nhân nhanh kết quả cho thấy chồi được xử lý cho tỷ

lệ nhân cao hơn so với đối chứng.

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của EMS đến sự sinh trưởng phát triển của các

chồi in vitro cây cẩm chướng với nồng độ 0,1; 0,5 và 1,0% ở 3 ngưỡng thời gian

15, 30 và 60 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy EMS đã làm giảm khả năng sống

và sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng in vitro (Tejaswini et al., 2006).

Bằng cách sử dụng kỹ thuật chọn lọc in vitro một số giống cẩm chướng có

khả năng sinh tổng hợp phenol ở mức độ cao, lượng đường và protein giảm đã

được tạo ra (Mehta, 2007).

Roychowdhury et al. (2011a) nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến từ hạt cây

hoa cẩm chướng bằng hóa chất N-nitroso methyl urea (NMU), ethyl methane

sulphonate (EMS) và sodium azide (SA) với 3 mức nồng độ 0,1%, 0,4% và 0,7%.

Kết quả cho thấy nồng độ 0,4% cho hiệu quả cao với cả 3 loại hóa chất gây đột biến.

Roychowdhury and Jagatpati (2011a) đã nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến

từ hạt cây hoa cẩm chướng bằng hóa chất colchicin (Col), ethyl methane

sulphonate (EMS) và sodium azide (SA) với 3 mức nồng độ 0,1%, 0,4% và 0,7%.

Kết quả cho thấy EMS và SA làm giảm tỷ lệ nẩy mầm của hạt và khả năng sống

của cây, trong khi đó tỷ lệ nẩy mầm của hạt tỷ lệ thuận với nồng độ khi xử lý bằng

Colchicin, tuy nhiên cây con có khả năng sống kém.

Roychowdhury and Jagatpati (2011b), đã nghiên cứu gây tạo đột biến từ lá

cây hoa cẩm chướng bằng hóa chất colchicine (Col), ethyl methane sulphonate

(EMS) và maleic hydrazide (MH) ở 3 mước nồng độ 0,1%, 0,4% và 0,7%; xử lý

hạt bằng EMS ở nồng độ 0,5%, 1,0% với 2 mức thời gian xử lý là 4 giờ và 6 giờ.

Kết quả cho thấy xử lý lá bằng Col ở nồng độ 0,4% và xử lý hạt bằng EMS ở nồng

độ 0,5% trong thời gian 4 giờ cho hiệu quả cao.

Roychowdhury et al. (2011b) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chiếu xạ

gamma tới cấu trúc hình thái của lỗ khí khổng trên bề mặt lá cây cẩm chướng ở thế

hệ M2. Kết quả nghiên cứu cho thấy DNA cây xử lý chiếu xạ biến đổi khác với đối

chứng sự thay đổi cao nhất ở liều 40 và 60 Gγ. Ở liều 20 Gγ và 30 Gγ sự biến đổi

DNA là không nhiều hơn so với cây đối chứng. Các kết quả cũng cho thấy mức độ

ploidy không bị ảnh hưởng bởi bức xạ gamma ngay cả ở liều cao.

Nakayama et al. (2012) đã nghiên cứu phân tích sự đột biến màu hoa cẩm

chướng (Dianthus caryophyllus) khi xử lý bằng chiếu xạ chùm tia ion- beam. Kết

quả cho thấy sự tác động của chiếu xạ dẫn tới những thay đổi trong việc tổng hợp

hợp chất anthocyanin, flavonoids và các hợp chất liên quan, điều này dẫn tới sự

thay đổi sắc tố và sẽ tạo ra kiểu hình mới.

Các kết quả nghiên cứu về chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho

thấy việc ứng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo đối với cây trồng nói chung

và cây hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa

cẩm chướng mới với những tính trạng mới được tạo ra nhờ xử lý gây tạo đột biến.

Việc xử lý gây tạo đột biến đối với cây hoa cẩm chướng có thể sử dụng nhiều bộ

phận (Hạt, đoạn thân mang mắt ngủ, mô sẹo, chồi in vitro, cây con ngoài đồng

ruộng, …) và tác nhân gây đột biến khác nhau (vật lý, hóa học).

1.6.1.2. Các nghiên cứu về ứng dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền

trên cây cẩm chướng

Trong những năm gần đây nhờ sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh

học phân tử, các nhà khoa học đã thiết lập được bản đồ chi tiết về các chỉ thị DNA

đánh dấu liên kết với nhiều gen quy định tính trạng nông sinh học quan trọng của

cây trồng, trên cơ sở đó chúng ta có thể tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các

chỉ thị DNA. Chỉ thị phân tử (marker phân tử) đã được sử dụng rộng rãi trong việc

phân tích di truyền ở cây trồng do việc sử dụng dễ dàng và khả năng ứng dụng

rộng rãi của nó (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

Scovel et al. (1998) đã nghiên cứu chỉ thị phân tử DNA kiểm soát kiểu hình

hoa của cẩm chướng bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Tác giả đã xác định được một

mồi RAPD có liên kết chặt với gen lặn kiểm soát kiểu hình cánh hoa. Mồi này đã

được nhân dòng và sử dụng để tạo ra chỉ thị RFLP và chỉ thị RFLP này có thể

phân biệt với độ chính xác 100% giữa kiểu hình hoa kép và hoa đơn.

Benedetti et al. (2003) dùng phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA

(RADP) với 10 mồi phân tích ở 30 giống và 70 con lai F1 của 2 giống Roland và

Milady. Kết quả cho thấy, độ bền hoa cắt chịu ảnh hưởng của số lượng rất phức

tạp các gen đa thành phần với những ảnh hưởng phụ khác nhau.

Smulders et al. (2003) sử dụng 14 microsatellite markers dựa trên thư viện

cDNA để phân tích 82 mẫu giống hoa cẩm chướng khác nhau, kết quả tác giả đã

xác định được 11 microsatellite markers liên quan chặt chẽ với alen để phân biệt

sự khác biệt về mặt di truyền của cây cẩm chướng

Youbo et al. (2004) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 87 giống cẩm

chướng bằng kỹ thuật RAPD sử dụng 10 cặp mồi, kết quả cho thấy 87 giống cẩm

chướng nghiên cứu được phân thành 10 nhóm khác nhau.

Takashi et al. (2004) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để xác định gen kiểm soát

kháng bệnh héo xanh vi khuẩn của các dòng cẩm chướng lai từ giống No1 và

giống Pretty Favvare. Tác giả đã sử dụng tổng cộng 505 mồi RAPD để kiểm tra,

đánh giá. Kết quả xác định được mồi WG44 - 1050 có liên quan nhất với sức đề

kháng với bệnh héo vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất lớn trong việc lựa

chọn để nhân giống cây cẩm chướng có tính kháng bệnh héo vi khuẩn.

Để đánh giá 19 đặc điểm hình thái (15 tính trạng chất lượng và 4 tính trạng

số lượng) trong 55 con lai giữa Dianthus giganteus và Dianthus carthusianorum

cùng với các cây bố mẹ, Lee et al. (2005) đã sử dụng 340 mồi RAPD, dựa vào phân

tích trên marker RAPD, tác giả đã xác định được các tỉ lệ phân li ở đời con tuân theo

các định luật Menđen từ đó xác định kiểu gen của cây bố mẹ và kiểu gen của các cá

thể lai là đồng hợp hay dị hợp dựa trên số băng quan sát được.

Việc nghiên cứu các chỉ thị phân tử có liên kết với các gen kiểm soát các

tính trạng của cây hoa cẩm chướng cũng được một số tác giả nghiên cứu. Takashi

et al. (2006) đã sử dụng 696 mồi RAPD có liên kết với gen lặn kiểm soát dạng

kiểu hình hoa đơn thu được từ loài Dianthus capitatus. Tác giả đã phát hiện ra 3

mồi là OM19 - 800, AT90 - 1000, DT52 - 700 có thể dùng để nhận dạng phát hiện

ra các cây hoa cẩm chướng đơn. Các mồi này có liên kết chặt với gen kiểm soát

dạng kiểu hình cánh đơn.

Benedetti et al. (2006) đã nghiên cứu xác định các marker phân tử liên quan

tuổi thọ của hoa cẩm chướng. Tác giả đã sử dụng phương pháp khuếch đại ngẫu

nhiên DNA (RAPD) với 30 cặp mồi phân tích ở 12 giống. Kết quả cho thấy 22 cặp

mồi có liên quan đến việc kiểm soát quá trình tổng hợp ethylene. Điều này có ý

nghĩ rất lớn trong việc nghiên cứu kéo dài tuổi thọ của hoa.

Khi nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo vi khuẩn của cây cẩm chướng,

trên cơ sở phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên DNA (RAPD) và phương pháp lặp

lại trình tự đơn giản (SSR) với 137 mồi RAPD và 9 mồi SSR phân tích ở 134 dòng

lai giữa “Carnation Nou No1” và “Pretty Favvave”. Yagi và cộng sự đã chỉ ra rằng

khả năng kháng bệnh héo vi khuẩn của cây cẩm chướng có liên quan đến ít nhất 2

gen nhỏ (Yagi et al., 2006).

Việc tìm ra các chỉ thị phân tử để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các

dòng, giống cẩm chướng có vai trò hết sức quan trọng đối với công tác bảo tồn,

chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới. Tetsuya et al. (2009) đã nghiên cứu phát

triển chỉ thị phân tử SSR ở cây cẩm chướng. Tác giả đã tìm ra được 13 cặp mồi

SSR để đánh giá sự sai khác di truyền của cây cẩm chướng gồm CF003a, CB003a,

CB004a, CB011a, CB016a, CB018a, CB020a, CB026a, CB027a, CB041a,

CB057a và CB060a.

Yagi et al. (2012) đã nghiên cứu tìm marker phân tử cho việc lựa chọn dòng

cẩm chướng kháng bệnh héo vi khuẩn. Tác giả đã nghiên cứu phát triển một số

lượng lớn chỉ thị SSR, trong đó phát hiện mồi CES1161 và CES2643 có liên kết

chặt chẽ với gen kháng bệnh héo vi khuẩn đối với cây hoa cẩm chướng.

Khi nghiên cứu xây dựng thư viện cDNA cây cẩm chướng dựa trên kỹ thuật

giải trình tự gen, Koji và cộng sự đã xác định được 17.362 trình tự lặp lại đơn giản

tiềm năng (SSRs). Tác giả chủ yếu tập trung vào việc phát hiện gen có liên quan

đến việc quy định màu sắc hoa và sinh tổng hợp ethylene. Kết quả cho thấy hầu

hết các gen liên quan đến chất diệp lục, trao đổi carotenoid và anthocyanin có liên

quan chặt chẽ đến việc hình thành màu sắc của hoa (Koji et al., 2012).

1.6.2. Kết quả nghiên cứu trong nước

Hiện nay, việc nghiên cứu nhằm phát triển cây hoa ở nước ta đã được nhiều

tác giả quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ tập trung nhiều vào một số

loại cây hoa chính như hoa hồng, cúc, đồng tiền, hoa lan, lay ơn,… Với cây hoa

cẩm chướng các nghiên cứu vẫn còn hạn chế.

* Các kết quả nghiên cứu về nhân giống và tuyển chọn giống cây cẩm

chướng:

Từ năm 1996 đến năm 2001 ở nước ta đã có một số tác giả nghiên cứu về

nhân giống vô tính in vitro cho cây hoa cẩm chướng (Nguyễn Quang Thạch và

cs.,1996; Lâm Hồng Hải và cs., 1997; Lê Sỹ Dũng và cs., 2001) đã khẳng định hoàn

toàn có thể ứng dụng nhân giống bằng kỹ thuật in vitro cho cây hoa cẩm chướng.

Lê Đức Thảo (2004) tiến hành nghiên cứu tuyển chọn giống hoa cẩm

chướng và nhân giống bằng giâm cành. Tác giả đã nghiên cứu 15 giống cẩm

chướng nhập nội từ Trung Quốc và Hà Lan và đã kết luận, sử dụng IBA nồng độ

1000 ppm và trồng trên giá thể trấu hun là tốt nhất để giâm cành cây cẩm chướng.

Lê Đức Thảo và cs. (2008) đã nghiên cứu tuyển chọn một số giống cẩm

chướng đơn (Standard carnation) nhập nội tại Sapa - Lào Cai, tác giả đã tuyển chọn

được 5 giống có triển vọng cho sản xuất gồm các giống SP1, SP3, SP5, SP11, SP13.

Một số giống cẩm chướng chùm (Spay carnation) nhập nội có triển vọng (giống

SP15, SP17 và SP25) cũng đã được đánh giá là những giống có khả năng sinh

trưởng phát triển tốt trong điều kiện khí hậu ở nước ta (Lê Đức Thảo và cs., (2009a).

Bên cạnh việc nghiên cứu về tuyển chọn giống và các biện pháp kỹ thuật

nâng cao năng suất, chất lượng hoa cẩm chướng các nghiên cứu về nhân giống bằng

phương pháp nuôi cấy mô tế bào cũng được nhiều tác giả trong nước quan tâm. Lê

Đức Thảo và cs. (2009b) đã nghiên cứu quy trình nhân giống hoa cẩm chướng SP25

(Dianthus caryophyllus Make up) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Tác giả đã

sử dụng chồi đỉnh và chồi nách của cây cẩm chướng để nuôi cây. Kết quả nghiên

cứu cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống SP25 giai đoạn khử trùng mẫu dùng

HgCl2 0,1% trong thời gian 6 phút cho tỷ lệ sống cao; giai đoạn nhân nhanh sử dụng

môi trường MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,1

mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao; giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sử dụng môi

trường MS + 10% nước dừa + 2% đường + 8g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l

IBA cho tỷ lệ ra rễ cao; giai đoạn thích ứng cây ngoài vườn ươm dùng giá thể trấu

hun - hạt perlite (7:3) cho tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển tốt.

Việc ứng dụng công nghệ khí canh trong nhân giống cây trồng đã đem lại

hiệu quả cao so với các phương pháp truyền thống ở nhiều giống cây trồng (khoai

tây, cà chua, …). Để đánh giá khả năng nhân giống của cây cẩm chướng bằng

công nghệ khí canh, Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống

hoa cẩm chướng bằng phương pháp này. Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng kỹ

thuật khí canh để nhân giống cây cẩm chướng trong vụ hè cho hiệu quả cao (hệ số

nhân giống đạt từ 2,21 - 3,07 chồi/cây mẹ). Cây cẩm chướng trồng trên hệ thống

khí canh sinh trưởng, phát triển và cho chất lượng hoa cao hơn so với cây trồng địa

canh. Tỷ lệ hoa loại 1 cao hơn, thời gian cắm lọ dài hơn 2 - 3 ngày so với trồng

trên địa canh (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010).

Lê Văn Tường Huân và Nguyễn Hoàng Trung Hiếu (2013) đã nghiên cứu

tối ưu hóa khả năng tạo cụm chồi cho nhân nhanh in vitro ở cây hoa cẩm chướng.

Tác giả đã sử dụng đỉnh chồi cẩm chướng tách từ các chồi in vitro đem nuôi cấy

trên môi trường cơ bản có MS bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 0 - 4,0 mg/l

BA hoặc 0 - 4,0 mg/l kinetin riêng lẻ hay kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l để

thăm dò khả năng tạo cụm chồi. Kết quả nghiên cứu cho thấy BA và kinetin khi sử

dụng riêng lẻ cho hiệu quả cao hơn, môi trường MS bổ sung 20 g/l saccharose,

8g/l agar, 1,0 mg/l BA cho khả năng tạo cụm chồi tốt nhất.

* Các kết quả nghiên cứu về xử lý đột biến nhân tạo trên cây cẩm chướng

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu gây đột biến bằng hoá chất EMS và chiếu xạ

tia gamma cho cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng cho đến nay

mới chỉ có một số công trình được công bố chính thức.

Nguyễn Thị Lý Anh và cs. (2009a) đã nghiên cứu ảnh hưởng của EMS đến

cây cẩm chướng nuôi cây mô giống Quận Chúa. Tác giả đã xử lý EMS cho đoạn

thân mang mắt ngủ của cây cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa với các nồng

độ 0,2; 0,4. 0,6; 0,8; 1,0% ở 3 mức thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ. Kết quả nghiên

cứu cho thấy EMS làm giảm khả năng sống, khả năng sinh trưởng phát triển của

cây cẩm chướng in vitro và làm tăng tỷ lệ biến dị. Tác giả đã xác định được

ngưỡng xử lý mang lại hiệu quả là xử lý ở nồng độ 0,4% trong thời gian 2 giờ.

Cũng bằng phương pháp trên tác giả đã nghiên cứu xử lý EMS cho cây cẩm

chướng nuôi cây mô giống Trắng Đà Lạt với các nồng độ 0,2; 0,4. 0,6; 0,8; 1,0% ở

3 mức thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ. Kết quả nghiên cứu cho thấy EMS làm giảm

khả năng sống, khả năng sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng in vitro và

làm tăng tỷ lệ biến dị. Tác giả đã xác định được ngưỡng xử lý mang lại hiệu quả là

ở nồng độ 0,4% trong thời gian 1 giờ (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009b).

Khi nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chiếu xạ in vitro bằng tia gamma cho cây

hoa cẩm chướng. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tia gamma làm giảm hệ số nhân,

chiều cao chồi ra rễ và làm chậm sự ra rễ của chồi. Tác giả cũng đã thu được một

số dạng biến dị ngoài đồng ruộng như đa thân, thấp cây (Lê Đức Thảo và Nguyễn

Thị Kim Lý, 2009; Lê Đức Thảo, 2010).

Nguyễn Thị Lý Anh và cs. (2009c) đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý tia

gamma đối với cây hoa cẩm chướng. Kết quả nghiên cứu cho thấy xử lý gamma

đã làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng in vitro so với đối chứng. Sau xử lý

đã thu được một số dạng biến dị, tác giả cũng đã đưa ra kết luận xử lý chiếu xạ với

liều 3 Krad là thích hợp.

Nguyễn Thị Lý Anh và cs. (2011a, 2011b) đã nghiên cứu xử lý đột biến in

vitro bằng hóa chất EMS và chiếu xạ cho cây hoa cẩm chướng. Sau xử lý đã sàng

lọc được 2 dạng đột biến có triển vọng về màu sắc, tác giả đã sử dụng 20 cặp mồi

SSR để đánh giá sự sai khác DNA của hai dạng đột biến so với giống gốc.

Qua tổng hợp các kết quả nghiên cứu cho thấy:

- Cẩm chướng là loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn trong các

loài hoa cắt cành trên thế giới (chiếm 17%) và trong các loài hoa xuất khẩu ở nước

ta. Việc đẩy mạnh sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm hoa cẩm chướng ở

Việt Nam còn nhiều hạn chế, trong đó vấn đề bản quyền giống đang là khó khăn

trong việc tiếp cận thị trường hoa thế giới.

- Đột biến đóng vai trò quan trọng trong chọn giống cây trồng, nhờ vào quá

trình đột biến mà chúng ta đã tạo ra nhiều giống hoa mới, đặc sắc có năng suất

cao, khả năng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh,... trên lĩnh vực hoa cảnh nói riêng

và trong ngành chọn giống nói chung.

- Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro là phương pháp có nhiều ưu

điểm so với phương pháp truyền thống: tần số đột biến cao và khả năng thu nhận

những thể đột biến đồng nhất về kiểu gen dễ dàng hơn; có thể xử lý một số lượng

lớn tế bào, mô, cây con mà không đòi hỏi diện tích lớn như các phương pháp

truyền thống; có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau của cây (tế bào, mô sẹo,

chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả năng rút ngắn thời gian so phương pháp

truyền thống (chỉ cần 3 - 6 thế hệ).

- Các kết quả nghiên cứu về chọn tạo giống đột biến hoa cẩm chướng cho

thấy việc ứng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến nhân tạo đối với cây trồng nói chung

và cây hoa cẩm chướng nói riêng mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa

cẩm chướng mới với những tính trạng mới được tạo ra nhờ xử lý gây tạo đột biến.

- Đối với cây cẩm chướng, việc xử lý đột biến có nhiều thuận lợi hơn so với

các loại cây lương thực do tính chất sử dụng của nó ít dẫn đến sự lo ngại về sức

khoẻ của con người. Ngoài ra, các mục tiêu của việc xử lý đột biến trên cây hoa

thường liên quan đến một số chỉ tiêu chính như màu sắc hoa, kích thước hoa, tính

chống chịu,… Vì vậy, có thể nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng và

các loại hoa nói chung bằng xử lý đột biến là một phương pháp đầy triển vọng

trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất.

- Các kết quả nghiên cứu về cây cẩm chướng ở nước ta chủ yếu là tuyển chọn

giống nhập nội, kỹ thuật nhân giống; các nghiên cứu về chọn tạo giống còn rất ít.

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

- Mắt ngủ của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng giống Quận Chúa (tên

khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương mại Princess). Giống cẩm

chướng Quận Chúa được nhập nội từ Hà Lan năm 2005, được trồng phổ biến tại

Việt Nam và đã được đánh giá là giống triển vọng, có khả năng thích ứng tốt với

điều kiện khí hậu của Việt Nam.

Đặc điểm: hoa đơn, cánh kép màu trắng, mép cánh viền tím và xẻ răng cưa;

thân và lá màu xanh đậm, sinh trưởng khỏe.

Hình 2.1. Mẫu giống hoa nghiên cứu

- Các thiết bị dụng cụ hóa chất trong nuôi cấy mô tế bào.

- Hóa chất gây tạo đột biến: Ethylmethane sulphonate (EMS)

- Phản ứng PCR - SSR được tiến hành 20 mồi SSR của hãng Bioneer (bảng 2.1)

Bảng 2.1. Trình tự nucleotit của các primer được sử dụng trong các phản ứng SSR-PCR

STT Primer Trình tự nucleotit

1 CB003a

2 CB004a

3 CB011a F: TCTGCTTGATCTAATGGTGGACA R: ATGGCTTTCTCTAGGCTTTGGG F: GATTTGGGTGGGGCGTGA R: CCATCCTCCTCCTTTCTATCTTCCCT F: GGATTGTTTGGACTAGGATGA R: AGGACATGGATGATTTACAGTG

STT Primer Trình tự nucleotit

4 CB016a

5 CB018a

6 CB020a

7 CB026a

8 CB027a

9 CB041a

10 CB047a

11 CB057a F: CCTGGTGTTGATAATGAATACG R: AATAGCCTCCTCTCCTCTCCTC F: AGTGTCTAAGAGTCTAAGGTTGTG R: GTAATACAATGGCATAACTTCA F: GTGTGTGAAATGGAAAAAGTGTG R: CCGTGTATAAGAACCATGAAAGCA R: GGAGGGAGTAGAAAATAGTGTG F: CCGAGTGGAAGAGAGAGAG F: TGTTATGCAAAATTAGGCGAGAGAG R: AAAATCTGGAAAGGACTTGGC R: ACGAAGTAATTTACATATTTTTATCAG F: CCCCCGCATGAGCATAC R: GATAAACTTTTCTCTCTCTCATCTCTC F: AGGCTAAAATGCTGTGTCTCGT F: GTTATCCGCCATTGTTGCT R: AAAAACATAACTCCAAATACCTCC

12 CDA221 F: CAACTGGTATTGAGAAGTGTTG R: AACCTTGAAATGGATTTGG

13 CF003a

14 DCB109

15 DCB131

16 DCB134

17 DCB135

18 DCB140

19 DCB224

20 CB060a F: CAGTTGAAGAAGTTTGAATGAATCGC R: TTCTCTCTCTAAACCCCCCCAA F: ATAATTCACTTAACGGAAGGC R: AATTAAGGTCCACTACATCCC F: AGAGCCCCTCCGATG R: AGGTCTGTCCGTACGGTAC F: AAGAAGCATGCAATCATCTT R: CATTACAATCATATCACCCGT F: CATTACAATCATATCACCCGT R: AGCGCAATTCAGGACTAAT F: TTCTCCTTCACTTGACTACGA R: TCCAAACTGATATTCCCATTA F: CGTCACAAGCTCTAAATCTTT R: AACCAAAAACCCTTCAACAC F: CCCTTTCAAACCCTAATAAAACT R: AACTCTATGTTATATCCGGACCT

(Nguồn: Smulders et al., 2003; Tetsuya et al., 2009)

- Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như tris bazơ, agarose,

isopropanol, ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB,

Nacl, ETDA,…

- Các hóa chất cho phản ứng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat (dNTPs)

của Sigma, Taq - DNA polymeraza của Fermentas.

- Giá thể: sử dụng giá thể đất phù sa, trấu hun.

- Phân bón: Urê, Supe lân, Kali nitrat, Canxi nitrat, Axit boric

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sự sinh

trưởng của chồi in vitro:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số

nhân, sự sinh trưởng của chồi in vitro.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ số

nhân, sự sinh trưởng của chồi in vitro.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS

tới khả năng ra rễ của chồi in vitro.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng

của cây in vitro ngoài vườn ươm.

2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây

cẩm chướng

- Nghiên cứu xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cứu xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro. - Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây cẩm

chướng in vitro.

2.2.3. Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh

giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi

- Nghiên cứu phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái.

- Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi phân lập được sau xử lý.

- Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của các dạng chồi trong điều

kiện vườn ươm.

2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị của

cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên

Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo dõi phân lập

các dạng biến dị.

2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có

triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR

Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm năng đánh giá sự sai khác di truyền ở

mức độ phân tử bằng chỉ thị SSR.

2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến

được tuyển chọn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hệ số nhân, sinh

trưởng của chồi in vitro.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin trong môi trường MS tới khả năng ra rễ

của chồi in vitro.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng

của cây in vitro ngoài vườn ươm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến tỷ lệ mẫu

sống và phát sinh chồi

Trong thí nghiệm này chúng tôi đã nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu trước khi

đưa vào nuôi cấy khởi động như sau: Mẫu lấy về được rửa sạch dưới vòi nước,

cắt tỉa, bóc hết lớp lá bao tránh không để giập, ngâm trong xà phòng loãng 5 phút, rửa sạch dưới vòi nước và nước cất, tiếp tục khử trùng bằng cồn 700 trong vòng 30 giây. Sau đó sử dụng hóa chất để khử trùng ở các thời gian khác nhau. Rửa lại 3 lần bằng

nước cất vô trùng và dùng dao vô trùng cắt bỏ phần mô bị tổn thương. Cắt mẫu

thành các đoạn nhỏ có độ dài khoảng 1,0 cm mang mắt ngủ đem cấy vào môi trường

nuôi cấy khởi động. Mỗi công thức bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại.

Công thức Hóa chất Thời gian khử trùng (phút)

5 CT1 HgCl2 (0,1%)

7 CT2 HgCl2 (0,1%)

9 CT3 HgCl2 (0,1%)

NaOCl (5,0%) 10 CT4

NaOCl (5,0%) 15 CT5

NaOCl (5,0%) 20 CT6

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường

MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng như sau:

- ĐC: MS - CT5: MS + 0,5 mg/l kinetin

- CT1: MS + 0,5 mg/l BA - CT6: MS + 1,0 mg/l kinetin

- CT2: MS +1,0 mg/l BA - CT7: MS + 1,5 mg/l kinetin

- CT3: MS + 1,5 mg/l BA - CT8: MS + 2,0 mg/l kinetin

- CT4: MS + 2,0 mg/l BA

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin và auxin đến hệ

số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro

- ĐC: MTTU - CT5: MTTU + 0,25 mg/l IAA

- CT1: MTTU + 0,25 mg/l α-NAA - CT6: MTTU + 0,5 mg/l IAA

- CT2: MTTU + 0,5 mg/l α-NAA - CT7: MTTU + 0,75 mg/l IAA

- CT3: MTTU + 0,75 mg/l α-NAA - CT8: MTTU + 1,0 mg/l IAA

- CT4: MTTU + 1,0 mg/l α-NAA

(MTTU: là môi trường có hệ số nhân chồi, sinh trưởng thân, lá và chất lượng

chồi tốt nhất được chọn ra qua thí nghiệm 2).

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính và α-NAA trong

môi trường MS đến khả năng ra rễ của chồi in vitro

- ĐC: MS

- CT1: MS + 0,25 g/l α-NAA

- CT2: MS + 0,5 g/l than hoạt tính

- CT3: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA

- CT4: MS + 1,0 g/l than hoạt tính

- CT5: MS + 1,0 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm

- CT1: Đất phù sa

- CT2: Trấu hun

- CT3: Đất + trấu hun (1:1)

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý EMS đến

sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của chồi in vitro cây cẩm chướng

Đoạn thân của chồi in vitro của cây cẩm chướng được cắt thành các mẫu có

kích thước khoảng 1,0 cm mang một mắt ngủ sau đó đem xử lý EMS với nồng độ

và thời gian khác nhau. Phương pháp thực hiện theo mục 2.3.3.

Nồng độ EMS (%) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Thời gian (giờ)

1 ĐC CT1.1 CT1.2 CT1.3 CT1.4 CT1.5

2 ĐC CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5

3 ĐC CT3.1 CT3.2 CT3.3 CT3.4 CT3.5

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ tia gamma

nguồn Co60 đến sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của chồi in vitro cây

cẩm chướng

Đoạn thân mang mắt ngủ của chồi in vitro cây cẩm chướng được cấy trên

các đĩa petri sau đó đem xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co tại Bệnh viện K Hà

Nội ở các liều hấp thụ khác nhau. Phương pháp thực hiện theo mục 2.3.3.

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 Liều lượng xử lý (Gγ) 0,0 10 20 30 40 50 60 70 Công thức ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ EMS và liều lượng chiếu

xạ tia gamma nguồn 60Co đến sinh trưởng, phát triển và phát sinh hình thái của

chồi in vitro cây cẩm chướng

Các mẫu có kích thước khoảng 1,0 cm mang một mắt ngủ được xử lý EMS

kết hợp với xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với nồng độ và liều lượng khác

nhau. Phương pháp thực hiện theo mục 2.3.3.

Liều lượng xử lý TT Công thức Nồng độ EMS (%) gamma (Gγ)

1 ĐC 0,0 0,0

2 0,1 10 CT1

3 0,1 20 CT2

4 0,1 30 CT3

5 0,2 10 CT4

6 0,2 20 CT5

7 0,2 30 CT6

8 0,3 10 CT7

9 0,3 20 CT8

10 0,3 30 CT9

11 0,4 10 CT10

12 0,4 20 CT11

13 0,4 30 CT12

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi phân lập được

sau xử lý

Các dạng chồi phân lập được sau xử lý được cấy chuyển sang môi trường tạo

rễ (MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA) để đánh giá khả năng ra rễ

của các dạng chồi. Mỗi dạng chồi cấy 150 mẫu chia thành 3 lần nhắc lại.

Thí nghiệm 10: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của các dạng

chồi trong điều kiện vườn ươm trên hệ thống khí canh

Chồi sau xử lý được tái tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng trên hệ thống khí

canh sử dụng dung dịch Anthura với chu kỳ phun 15 phút/1 lần, mỗi lần phun 15

giây (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010). Mỗi dạng chồi trồng 150 cây chia làm 3

lần nhắc lại (hàng cách hàng và cây cách cây 5cm).

Thí nghiệm 11: Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng

biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên

Chồi sau xử lý đã qua giai đoạn thích ứng ngoài vườn ươm được đưa ra trồng

trong nhà lưới có mái che theo quy trình trồng cẩm chướng của Viện nghiên cứu Rau

quả. Thí nghiệm được bố trí tuần tự, không nhắc lại. Mỗi công thức trồng 150 cây.

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ

lệ sống của mẫu

Trong thí nghiệm này chúng tôi đã nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu trước

khi đưa vào nuôi cấy khởi động bằng dung dịch HgCl2 0,1% với các mức thời gian

3, 5, 7, 9 và 11 phút

Thí nghiệm 13: Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển và

hệ số nhân của chồi in vitro

Dựa trên các kết quả nghiên cứu của các tác giả, mẫu được nuôi cấy trên

môi trường dinh dưỡng như sau:

- CT1 (ĐC): MS - CT3: MS + 1,0 mg/l kinetin

- CT2: MS + 1,0 mg/l BA - CT4: MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin trong môi trường MS tới

khả năng ra rễ của chồi in vitro

- CT1: MS + 0,5 g/l than hoạt tính

- CT2: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA

- CT3: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,50 mg/l α-NAA

- CT4: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA

- CT5: MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 1,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 15: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và

sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm

CT1: Đất phù sa; CT2: Trấu hun; CT3: Đất + trấu hun (1:1)

2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS

(Murahige & Skoog, 1962 với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l innositol)

có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng.

Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hoàn chỉnh mẫu được nuôi cấy trong

trụ miệng hẹp 250 ml. Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh độ pH bằng

6,0 trước khi tiệt trùng và được khử trùng ở 1200C, trong thời gian 20 phút. Mẫu

được nuôi cấy ở nhiệt độ 20 - 220C, cường độ chiếu sáng 2.000 lux, thời gian

chiếu sáng 16 giờ/ngày. Các công thức thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu

nhiên, mỗi công thức thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại.

Các thí nghiệm đưa cây in vitro ra ngoài vườn ươm được tiến hành như sau:

Khi cây đạt tiêu chuẩn (cây cao trên 3,5 cm, có từ 4 - 5 rễ trở lên, rễ dài khoảng 2,5 -

3,0 cm) thì rút nhẹ nhàng ra khỏi bình, rửa sạch môi trường bám ở rễ và đem trồng

vào các giá thể đã được lựa chọn ở vườn ươm. Các giá thể được đựng trong khay

nhựa có kích thước 30 x 60 cm. Mỗi công thức trồng 150 cây, chia làm 3 lần nhắc lại.

2.3.3. Phương pháp gây tạo đột biến in vitro

Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình của Novak và

Brunner (1992) có cải tiến như sau:

* Phương pháp xử lý gây tạo đột biến bằng hóa chất EMS

- Chuẩn bị nguồn vật liệu để xử lý: Đoạn thân mang mắt ngủ của chồi in

vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa được đưa vào nuôi cấy trên môi trường MS

(cấy 1.500 mẫu). Sau thời gian một tháng, lựa chọn các chồi sinh trưởng phát triển

tốt, đồng đều nhau, hình thái thân lá bình thường, cắt đoạn thân ra thành các đoạn

mang mắt ngủ có độ dài khoảng 1,0 cm (chỉ lấy các đoạn ở giữa).

- Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: Lựa chọn mẫu đồng đều nhau đem ngâm

vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định. Mỗi công thức xử lý

60 mẫu cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại. (Dung dịch EMS pha sau khi đã

chuẩn bị mẫu xong để hạn chế sự thủy phân làm giảm hiệu quả). Sau đó đưa các

bình này vào máy lắc đặt trong bóng tối với các mức thời gian khác nhau. Các mẫu

sau khi xử lý đem rửa bằng nước cất vô trùng 5 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có

lót giấy thấm đã được khử trùng. Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên

môi trường nhân nhanh chồi (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l

innositol và 1,0 mg/l kinetin), theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu.

- Phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái: việc phân lập các dạng

chồi sau xử lý ở giai đoạn nuôi cấy in vitro dựa trên đặc điểm hình thái thân, lá của

các dạng chồi.

- Nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh các dạng chồi phân lập: Các dạng chồi

đã được phân lập được nhân nhanh qua 5 thế hệ (M1V5), sau đó đưa vào nuôi cấy

trong môi trường tạo rễ (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l

innositol, 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA).

- Thích ứng cây ngoài vườn ươm: Để tăng khả năng sống của các cây in

vitro, khi cây đạt tiêu chuẩn, được đưa ra thích ứng ngoài vườn ươm, trồng trên hệ

thống khí canh sử dụng dung dịch Anthura với chu kỳ phun 15 phút/1 lần, mỗi lần

phun 15 giây (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010).

- Trồng cây ra giá thể: Cây trồng trong điều kiện khí canh sau 2 tuần được

đưa xuống trồng trong các khay nhựa chứa giá thể đất + trấu hun (theo tỷ lệ 1:1).

- Phân lập các dạng biến dị ngoài đồng ruộng: Sau 2 tuần trồng trong giá

thể cây được đưa ra trồng trong nhà lưới có mái che. Thực hiện trồng và chăm sóc

theo quy trình trồng hoa cẩm chướng của Viện nghiên cứu Rau quả. Theo dõi đo

đếm các chỉ tiêu, phân lập các dạng biến dị ngoài đồng ruộng. Để hạn chế thể khảm

tiến hành theo dõi hoa của các chồi phía dưới. Nếu hoa có sự khác nhau tiến hành

tách chồi đưa vào nuôi cấy in vitro. Sau đó tạo cây hoàn chỉnh và đưa ra trồng ngoài

đồng ruộng, theo dõi sự biểu hiện về các đặc điểm so với lần trồng đầu.

- Đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến được lựa chọn: Lựa

chọn các dòng đột biến có tiểm năng để đánh giá sự sai khác về di truyền ở mức

độ phân tử bằng chỉ thị SSR.

* Phương pháp xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co:

- Chuẩn bị nguồn vật liệu để xử lý: như phương pháp xử lý bằng EMS

- Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: các đoạn thân được cắt thành từng đoạn

nhỏ dài 1,0 cm mang một mắt ngủ được cấy trên môi trường MS trong các đĩa

petri với số lượng 60 mẫu/ đĩa. Mỗi công thức xử lý 180 mẫu chia thành 3 lần nhắc lại. Sau đó mẫu được đem đi chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều lượng

đã định tại Bệnh viện K Hà Nội. Sau khi xử lý xong mẫu được cấy chuyển sang

môi trường nhân nhanh (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l

innositol và 1,0 mg/l kinetin).

Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp xử lý EMS

* Phương pháp xử lý đột biến kết hợp hóa chất EMS và chiếu xạ tia gamma

nguồn 60Co

- Chuẩn bị nguồn vật liệu để xử lý: như phương pháp xử lý bằng EMS và

xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.

- Xử lý tác nhân gây tạo đột biến: Lựa chọn mẫu đồng đều nhau đem ngâm

vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định. Mỗi công thức xử

lý 60 mẫu cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại. Sau đó đưa các bình này

vào máy lắc đặt trong bóng tối với thời gian 2 giờ. Các mẫu sau khi xử lý đem rửa

bằng nước cất vô trùng 5 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có lót giấy thấm đã được

khử trùng. Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS

trong các đĩa petri. Sau đó mẫu được đem đi chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với

liều lượng đã định tại Bệnh viện K Hà Nội. Mẫu sau xử lý được cấy chuyển sang

môi trường nhân nhanh (MS bổ sung 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose, 100 mg/l

innositol và 1,0 mg/l kinetin).

Các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp xử lý bằng EMS và chiếu

xạ tia gamma nguồn 60Co riêng rẽ.

Xác định nồng độ EMS và liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co tối ưu

dựa trên các tiêu chí: tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ chồi biến dị cao; số chồi biến dị nhiều

và có nhiều dạng chồi có tiềm năng (sinh trưởng phát triển tốt, xuất hiện nhiều

biến dị có lợi,…).

2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng

chỉ thị phân tử SSR

Để tiến hành phân tích và đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống hoa

cẩm chướng ở mức độ phân tử, DNA của 7 mẫu hoa cẩm chướng được nhân bản

bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR (Smulders et al., 2003; Tetsuya et al.,

2009). Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%.

2.4.4.1. Phương pháp chiết tách DNA

Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số của các mẫu cẩm

chướng dựa theo phương pháp của Obara and Kako (1998) có cải tiến. Quy trình

tách chiết như sau:

B1: Mô lá được cắt nhỏ, nghiền 0,1 g mẫu lá trong Nitơ lỏng bằng chày cối

sứ thành dạng bột mịn (dung dịch trở lên đồng nhất), cho vào ống eppendorf 1,5 ml

B2: Bổ sung 800 µl đệm chiết CTAB buffer có nhiệt độ 600C và 60 µl dung

dịch SDS 10% vào mẫu rồi cho vào máy vortex đảo đều.

B3: Ủ mẫu trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 650C trong 30 phút, lấy ra để nguội

ở nhiệt độ phòng.

B4: Bổ sung chloroform (tỷ lệ 1:1) về thể tích so với dịch mẫu sau đó đảo đều.

B4: Ly tâm 12.000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 15 phút. Hút dịch nổi

phía trên sang ống eppendorf mới, bỏ cặn.

B5: Bổ sung 2,0 µl RNAse (nồng độ 10 µg/ml) vào dung dịch thu được, ủ ở

nhiệt độ 370C trong 1 giờ.

B6: Bổ sung 2 - propanol với tỷ lệ 1:1 về thể tích để thu tủa DNA. Ly tâm

12000 vòng/phút ở nhiệt độ 40C trong 10 phút để thu tủa.

B7: Loại bỏ dịch nổi phía trên, rửa kết tủa DNA bằng Ethanol 70% 2 lần,

rồi làm khô DNA ở nhiệt độ phòng.

B8: Hòa tan DNA bằng đệm TE. Kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA

bằng cách điện di 5 µl dung dịch DNA trên gel agarose 1% với thang nồng độ

DNA chuẩn là 25 µg.

2.4.4.2. Phương pháp PCR – SSR

Thành phần của hỗn hợp phản ứng SSR-PCR bao gồm:

+ Taq buffer 1X: 1,5 µl

+ MgCl2 2mM: 1,0 µl

+ dNTP 10µM: 0,15 µl

+ Primer F (1µM): 1,0 µl

+ Primer R (1µM): 1,0 µl

+ DNA khuôn: 0,2 µl

+ Taq-polymeraza: 0,15 µl

10,0 µl + H2O:

Tổng: 15 µl

Phản ứng PCR được thực hiện qua nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn biến tính: thực hiện biến tính ở nhiệt độ 950C trong thời gian 1

phút. Ở giai đoạn biến tính đầu tiên là 950C trong thời gian 5 phút; giai đoạn này

có thể khác nhau tùy từng loại DNA khuôn.

+ Giai đoạn gắn mồi: được thực hiện ở nhiệt độ 37 - 550C tùy theo từng

mồi. Các đoạn mồi sẽ bắt cặp với DNA khuôn mạch đơn ở các vị trí bổ sung.

+ Giai đoạn kéo dài chuỗi: thực hiện ở nhiệt độ 720C trong thời gian 2 phút

(thời gian kéo dài chuỗi cũng được điều chỉnh tùy theo từng mồi để có thể thu

được các sản phẩm PCR mong muốn). Đối với phản ứng SSR- PCR vì đây là nhiệt

độ tối ưu cho sự hoạt động của enzym Taq - polymeraza. Dưới sự xúc tác của

enzym này những đoạn mồi đã bắt cặp với DNA khuôn sẽ được kéo dài về phía 5’

của sợi dùng làm khuôn.

- Tóm tắt chu trình nhiệt cho phản ứng PCR - SSR:

Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ

1 Biến tính 95 5 phút 1

2 Biến tính 95 1 phút

3 Bắt cặp mồi Tm 1 phút 30

4 Kéo dài mạch 72 2 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 5 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 1 

(Tm: nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA khuôn, tùy theo từng mồi trong

mỗi phản ứng PCR - SSR).

Điện di trên gel agarose kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR: sản phẩm sau

phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 3,5% để kiểm tra.

2.4.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose

Chuẩn bị gel agarose:

B1: Cân agarose cho vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X (khối lượng cân

tùy theo nồng độ cần), khuấy nhẹ.

B2: Đun trong lò vi sóng để hòa tan hoàn toàn agar. Chú ý không để agar

sôi trào ra và phải tan hoàn toàn (không nhìn thấy hạt lợn cợn).

B3: Chuẩn bị khay đổ gel, lau rửa sạch và lắp sẵn lược.

B4: Để gel nguội bớt xuống nhiệt độ 50 - 600C, cho vào Ethidium bromide,

lắc nhẹ cho đều (dung dịch gel có màu hơi hồng).

B5: Đổ gel vào khay. Để trong 30 phút cho gel đông hoàn toàn.

Điện di: Sau khi gel đã đông hoàn toàn, nhẹ nhàng tháo lược ra khỏi bản

gel (tránh làm vỡ giếng). Đặt bản gel vào bể chạy điện di. Cài đặt điều kiện chạy

điện di: 80V - 120 mA - 75 phút.

Soi gel và chụp ảnh điện di: Soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản

phẩm khuếch đại dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb.

2.4.4.4. Phương pháp phân tích số liệu

Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng

ở các mẫu nghiên cứu theo thang DNA chuẩn (DNAmarker), xuất hiện băng là

“1”, không xuất hiện băng là “0’’. Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương

trình NTSYSpc 2.1 của Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp

mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng được dựa theo công thức của Nei and Li

(1979):

Jij=

2nij ni+nj

Trong đó: - nij là số băng DNA có ở cả hai mẫu i và j

- ni và nj là tổng số băng RAPD của từng cá thể i và j tương ứng.

- Jij là hệ số tương đồng giữa hai mẫu i và j

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content)- Chỉ số thông tin đa hình

2 PIC=1- ∑ pi

(Nei, 1973).

Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen thứ i.

Tỷ lệ dị hợp tử (H%):

Số mồi xuất hiện ≥ 2 alen/ 1locus SSR H%= x 100 Tổng số mồi sử dụng - Số mồi khuyết số liệu

2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá

2.4.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi

* Các chỉ tiêu theo dõi trong phòng:

Tổng số mẫu sống Tỷ lệ mẫu sống (%)= x 100 Tổng số mẫu cấy

Tổng số mẫu phát sinh chồi Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi (%)= x 100 Tổng số mẫu cấy

Tổng số chồi tạo ra Hệ số nhân chồi (lần)= Tổng số chồi đưa vào nuôi cây

Chiều cao chồi trung bình (cm)= ∑ hin 1 n

Trong đó: hi là chiều cao của chồi thứ i; n số chồi được theo dõi

Tổng số lá Số lá trung bình (lá/chồi)= Tổng số chồi theo dõi

Tổng số chồi tạo rễ Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%)= x 100 Tổng số chồi theo dõi

Tổng số rễ Số rễ trung bình (rễ/cây)= Tổng số chồi theo dõi

Tổng độ dài của rễ Chiều dài rễ trung bình (cm)= Tổng số rễ được theo dõi

Tổng số biến dị Tỷ lệ chồi biến dị (%)= x 100 Tổng số chồi theo dõi

- Thời gian xuất hiện rễ (ngày)

- Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50: Lethal dose).

* Các chỉ tiêu chất lượng chồi:

+++ : Tốt - Chồi mập, lá to, xanh đậm.

++ : Trung bình - Chồi to trung bình, lá to trung bình, xanh.

+ : Kém - Chồi nhỏ, xanh nhạt hoặc vàng.

* Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng:

Các chỉ tiêu đánh giá ngoài đồng ruộng theo Quy phạm khảo nghiệm tính

khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định của Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây

trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới, 2008).

- Chiều cao cây (cm): Đo từ sát mặt đất đến điểm cao nhất của cây (chóp lá

hoặc đỉnh nụ).

- Số cặp lá trên cây (lá): Đếm toàn bộ số lá có trên cây.

- Tổng độ dài của 7 lóng dưới hoa (cm): Đo độ dài của 7 lóng trên cùng.

- Độ dài của lóng thứ 5 dưới hoa (cm): Đo độ dài của lóng thứ 5 dưới hoa.

- Độ dài lá tại đốt thứ 5 dưới hoa (cm): Đo tại điểm giữa đốt 2 đầu của lóng.

- Chiều rộng của lá tại đốt thứ 5 dưới hoa (cm): dùng thước Palme đo tại

nơi có độ rộng lớn nhất của lá.

- Chiều cao tràng hoa (cm): Dùng thước Palme đo độ dài của tràng hoa.

- Độ dài đài hoa (cm): Dùng thước Palme đo độ dài của đài hoa.

- Đường kính hoa (cm): Đo khi hoa đã nở hoán toàn.

- Số cánh hoa: Đếm tổng số cánh hoa khi hoa bắt đầu tàn.

- Độ dài cánh hoa lớp ngoài cùng (cm): Dùng thước Palme đo độ dài của

cánh hoa lớp ngoài cùng.

- Chiều rộng cánh hoa lớp ngoài cùng (cm): Dùng thước Palme đo tại nơi

rộng nhất của cánh hoa lớp ngoài cùng.

- Số lớp cánh hoa (lớp).

- Bề mặt cánh hoa: Được đánh giá dựa trên độ phẳng của bề mặt cánh.

- Rìa cánh hoa: Được đánh giá dựa trên mức độ xẻ thùy của rìa cánh hoa.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA) theo

chương trình Irristat 5.0S và Excel.

Số liệu phân tích SSR được xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1.

Sử dụng thuật toán nội suy Lagrange để xây dựng mô hình toán học.

Sử dụng phương pháp Reed and Muench (1983) và phương pháp Behrens

and Karber (1935) để xác định liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50).

2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu từ năm 2009 – 2013.

- Địa điểm nghiên cứu: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện Nông

nghiệp Việt Nam.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa

Để việc xử lý đột biến in vitro cho cây hoa cẩm chướng giống Quận Chúa

mang lại hiệu quả cao, đề tài đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây

hoa cẩm chướng nhằm xác định môi trường thích hợp để nuôi cấy khi xử lý gây tạo

đột biến. Trong nội dung này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chế

độ khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu nhiễm; Nghiên cứu ảnh hưởng của các

chất điều tiết sinh trưởng tới khả năng phát sinh, sinh trưởng của chồi và rễ cây hoa

cẩm chướng in vitro; Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể ra cây.

3.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu

Chế độ khử trùng có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của quá trình tạo vật

liệu khởi đầu. Giai đoạn này cần đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao,

mô phân hoá và sinh trưởng tốt. Đề tài đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 2

chất khử trùng (HgCl2, NaOCl) ở các mức thời gian khác nhau.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống

(sau 4 tuần nuôi cấy)

Thời gian Tỷ lệ Tỷ lệ Thời gian Hóa chất khử Công thức khử trùng mẫu nhiễm mẫu sống phát sinh trùng (phút) (%) chồi (%) (%)

22,00 71,33 8,93 5 HgCl2 (0,1%) CT1

11,33 74,67 9,73 7 HgCl2 (0,1%) CT2

8,00 68,67 11,67 9 HgCl2 (0,1%) CT3

NaOCl (5%) 24,00 61,33 8,47 10 CT4

NaOCl (5%) 17,33 69,33 11,13 15 CT5

NaOCl (5%) 12,67 62,67 13,67 20 CT6

CV% 4,40

0,83 LSD0,05

Kết quả nghiên cứu (bảng 3.1) cho thấy, hóa chất và thời gian khử trùng có

ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ mẫu bị nhiễm và tỷ lệ mẫu sống. Khi tăng thời gian

khử trùng tỷ lệ mẫu nhiễm có xu hướng giảm, thời gian phát sinh chồi tăng. Tuy

nhiên tỷ lệ mẫu sống có xu hướng giảm do thời gian ngâm mẫu dài hóa chất khử

trùng đã gây tổn thương sinh lý làm cho mẫu chết. Kết quả thí nghiệm cũng cho

thấy đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để

khử trùng mẫu có hiệu quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công thức thí

nghiệm được nghiên cứu công thức 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút)

cho hiệu quả tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 74,67%, tỷ lệ mẫu nhiễm 11,33%, thời

gian phát sinh chồi 9,73 ngày). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu

của một số tác giả (Nguyễn Quang Thạch và cs., 1997; Lê Đức Thảo và cs., 2010).

3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro

Nhân nhanh chồi là giai đoạn quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ

nhân giống in vitro. Giai đoạn này cần phải đạt được các yêu cầu:

- Tạo ra được hệ số nhân chồi cao nhất (thời gian nuôi cấy ngắn, đạt số

lượng chồi nhiều).

- Các chồi tạo ra phải đồng nhất, có sức sinh trưởng tốt, khi tạo thành cây

hoàn chỉnh (có rễ) đem trồng có tỷ lệ sống cao, cây phát triển mạnh, khả năng dị

dạng thấp.

- Hiệu quả kinh tế cao (tiết kiệm được tối đa nguyên liệu, sử dụng môi

trường đơn giản, hoá chất rẻ tiền dễ tìm).

Ở giai đoạn nhân nhanh việc xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp

có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân nhanh chồi. Kết quả của

giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng các tác nhân kích thích sự phân

hoá cơ quan mà đặc biệt là phân hoá chồi như nhóm cytokinin (Nguyễn Quang

Thạch và cs., 2005).

Để tìm ra môi trường nhân nhanh thích hợp cho việc nhân giống in vitro

cây cẩm chướng giống Quận Chúa chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nghiên

cứu ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS tới và sự sinh trưởng chồi

và hệ số nhân chồi.

3.1.2.1. Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân và sự sinh

trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa

Mẫu được cắt bỏ lá tách riêng chồi ngọn và đoạn thân mang mắt ngủ. Chồi

ngọn được đưa vào nuôi cấy trên môi trường MS để tạo nguồn mẫu cho các thí

nghiệm sau. Đoạn thân được cắt thành các mẫu có kích thước 1,0 cm mang mắt

ngủ sau đó đưa vào nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 6,5 g/l agar,

30 g/l saccarose, 100 mg/l innositol và bổ sung BA và kinetin với nồng độ khác

nhau. Định kỳ theo dõi, sau 4 tuần đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Công BA Kinetin Chiều cao chồi Số Hệ số nhân Chất

lá/chồi chồi lượng thức (mg/l) (mg/l) (cm)

ĐC 0 0 7,63 +++ 1,94 5,06

0,5 0 7,42 +++ 2,53 4,12 CT1

1,0 0 7,51 +++ 2,74 3,96 CT2

1,5 0 6,91 ++ 2,19 3,81 CT3

2,0 0 6,80 ++ 2,03 3,46 CT4

0 0,5 6,74 +++ 2,30 4,95 CT5

0 1,0 7,50 +++ 3,00 4,83 CT6

0 1,5 6,95 ++ 2,43 4,26 CT7

0 2,0 6,60 ++ 2,27 3,68 CT8

CV% 1,10 2,70 2,10

0,14 0,11 0,16 LSD0,05

Ghi chú: +++: Tốt (chồi mập, lá xanh thẫm);

++: Trung bình (chồi hơi nhỏ, lá trung bình, màu xanh).

Sau 4 tuần 100% mẫu nuôi cấy đều phát sinh chồi. Các công thức sử dụng

môi trường MS có bổ sung kinetin hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối

chứng (sử dụng môi trường MS). Tuy nhiên, ở mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ

sung khác nhau thì số chồi phát sinh và sự sinh trưởng thân lá của các chồi cũng

có sự khác nhau khác nhau. Số liệu cho thấy khi tăng nồng độ BA, hoặc kinetin từ

0,5 mg/l lên 1,0 mg/l thì tỷ lệ phát sinh chồi và hệ số nhân chồi tăng và đạt cao

nhất tại nồng độ 1,0 mg/l (đạt 2,74 chồi/tháng khi bổ sung 1,0 mg/l BA; 3,00

chồi/tháng khi bổ sung 1,0 mg/l kinetin). Khi tiếp tục tăng nồng độ BA hoặc

kinetin lên 1,5 mg/l và 2,0 mg/l thì số chồi phát sinh và hệ số nhân chồi có chiều

hướng giảm. Trong các công thức thí nghiệm công thức CT6 (MS + 1,0 mg/l

kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt trung bình 3,00 chồi/tháng, thấp nhất là

đối chứng (môi trường MS) chỉ đạt 1,94 chồi/tháng.

Qua quan sát cho thấy các công thức thí nghiệm bổ sung BA cụm chồi thấp,

đốt thân ngắn, các cặp lá xếp xít lại với nhau so với các công thức thí nghiệm bổ

sung kinetin và đối chứng.

Trong các môi trường dinh dưỡng được nghiên cứu môi trường dinh dưỡng

MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin là môi trường có hiệu quả đối với giai đoạn nhân

nhanh chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa.

Hinh 3.1. Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung BA

với nồng độ khác nhau

CT 5

CT 6

CT 7

CT 8

ĐC

Hinh 3.2. Chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung kinetin

với nồng độ khác nhau

3.1.2.2. Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của

chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa

Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy, đối với một số giống

cẩm chướng việc phối hợp giữa 2 nhóm cytokinin và auxin trong môi trường MS

cho hiệu quả tốt trong việc nhân nhanh chồi (Mehta et al.,2007; Bora et al., 2007).

Để đánh giá hiệu quả của việc phối hợp giữa cytokinin và auxin trong môi trường

nuôi cấy đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa, trong thí nghiệm này chúng

tôi đã tiến hành thí nghiệm bổ sung kết hợp kinetin và IAA hoặc α-NAA với nồng

độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Mẫu được đưa vào nuôi cấy trên môi

trường dinh dưỡng MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin và IAA hoặc α-NAA với nồng

độ thay đổi từ 0,0 đến 1,0 mg/l. Định kỳ theo dõi, sau 4 tuần đo đếm các chỉ tiêu

(bảng 3.3).

Khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ IAA và α-NAA với các mức

0,25; 0,50; 0,75 đến 1,0 mg/l thì chiều cao và hệ số nhân chồi, chất lượng có xu

hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ 2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với

đối chứng (sử dụng môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin), đặc biệt khi tăng

nồng độ IAA hoặc α-NAA lên đến 1,0 mg/l thì chiều cao chồi, số lá/chồi, hệ số

nhân chồi và chất lượng chồi giảm mạnh (2,11 chồi/tháng ở CT4; 2,16 chồi/tháng ở

CT8). Sự có mặt của auxin ngoài tác dụng thúc đẩy sự hình thành chồi còn có tác

dụng kích thích hình thành mô sẹo, vì vậy hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi của

auxin đối với giống Quận Chúa không cao. So sánh giữa các công thức thấy rằng, ở

cùng nồng độ thì các công thức bổ sung α-NAA cho hệ số nhân chồi cao hơn là bổ

sung IAA.

Từ kết quả thí nghiệm 2 và thí nghiệm 3 cho thấy trong các môi trường

nhân nhanh đã nghiên cứu ở trên thì môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho

hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi tốt nhất cho giống Quận Chúa.

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân,

sinh trưởng của chồi in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

Công Kinetin IAA α-NAA Chiều cao Số lá/ Hệ số Chất

chồi (cm) chồi nhân chồi lượng thức (mg/l) (mg/l) (mg/l)

ĐC 1,0 0 0 4,83 7,85 +++ 2,99

1,0 0,25 0 4,84 7,38 +++ 2,64 CT1

1,0 0,5 0 4,29 6,78 +++ 2,36 CT2

1,0 0,75 0 4,17 6,12 ++ 2,29 CT3

1,0 1,0 0 3,98 5,89 ++ 2,11 CT4

1,0 0 0,25 4,71 7,57 +++ 2,72 CT5

1,0 0 0,5 4,40 7,10 +++ 2,41 CT6

1,0 0 0,75 4,05 6,85 ++ 2,33 CT7

1,0 0 1,0 3,77 6,16 ++ 2,16 CT8

CV% 2,00 3,20 2,20

0,15 0,37 0,09 LSD0,05

Ghi chú: +++: Tốt (chồi mập, lá xanh thẫm);

++: Trung bình (chồi hơi nhỏ, lá trung bình, màu xanh).

3.1.3. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

Sau giai đoạn nhân nhanh là giai đoạn tạo rễ cho chồi in vitro (tái tạo cây

hoàn chỉnh). Giai đoạn này có ảnh hưởng lớn đến quá trình đưa cây ra môi trường

tự nhiên sau này.

Qua nghiên cứu chúng tôi thấy, cây cẩm chướng in vitro rất dễ ra rễ, chúng

có thể ra rễ ngay trong điều kiện môi trường dinh dưỡng MS mà không cần bổ

sung thêm bất kỳ chất điều tiết sinh trưởng nào. Tuy nhiên để chồi cẩm chướng ra

rễ nhanh hơn, cây in vitro có chất lượng tốt hơn khi đưa ra vườn ươm, việc tiến

hành các thí nghiệm nhằm tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu để tạo cây hoàn

chỉnh là rất cần thiết.

Theo Sayeed et al. (2011), nồng độ auxin thấp trong môi trường nuôi cấy

có tác dụng kích thích sự hình thành rễ của mô nuôi cấy. Ngược lại nồng độ auxin

cao lại kìm hãm sự phát sinh hình thái bình thường và kích thích hình thành mô

sẹo. Ngoài auxin, than hoạt tính cũng có tác dụng tốt đến quá trình ra rễ của cây in

vitro.

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung

α-NAA và than hoạt tính với nồng độ khác nhau. Theo dõi đo đếm các chỉ tiêu.

Kết quả nghiên cứu (bảng 3.4) cho thấy: Các công thức thí nghiệm khác

nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ, số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá

trên cây ở các công thức thí nghiệm rất khác nhau.

- Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ ở các công thức thí nghiệm đều cao hơn so với đối

chứng (đạt 92,22 đến 100%), cao nhất là công thức CT3 (100%).

- Các công thức có bổ sung α-NAA và than hoạt tính cho tỷ lệ mẫu phát

sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn so với các công thức chỉ sử dụng than hoạt

tính và đối chứng (MS).

- Công thức thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l

α-NAA cho số rễ và chiều dài rễ cao hơn so với các công thức thí nghiệm khác

(số rễ: 10,69 rễ/chồi; chiều dài rễ: 3,03 cm).

- Các công thức thí nghiệm đều ra rễ sớm hơn rất nhiều so với đối chứng,

sớm nhất là công thức CT3 (8 ngày), muộn nhất là đối chứng (14 ngày)

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS

tới khả năng ra rễ của chồi in vitro (sau 3 tuần nuôi cấy)

Công Than α-NAA Thời Chiều Số lá/ Số rễ/ Chiều Tỷ lệ

HT chồi chồi gian cao mẫu Thức (mg/l) dài rễ

xuất cây phát (g/l) (lá) (rễ) (cm)

hiện rễ sinh rễ (cm)

(ngày) (%)

ĐC 0,0 0,0 14 5,12 8,04 6,62 1,86 83,33

0,0 0,25 9 4,77 7,98 10,47 2,51 96,67 CT1

0,5 0,0 11 4,45 8,22 7,29 1,98 92,22 CT2

0,5 0,25 8 4,93 8,34 10,69 3,03 100,0 CT3

1,0 0,0 11 4,35 7,66 9,16 2,07 93,33 CT4

1,0 0,25 10 4,26 7,20 9,26 2,67 96,67 CT5

CV% 2,00 1,50 2,20 4,30

0,17 0,22 0,35 0,19 LSD0,05

Như vậy đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa trong các môi trường

nuôi cấy được sử dụng nêu trên thì môi trường MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính

và 0,25 mg/l α-NAA có hiệu quả tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất.

3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng

của cây in vitro ngoài vườn ươm

Đưa cây ra vườn ươm là giai đoạn có ý nghĩa quan trọng quyết định khả

năng ứng dụng công nghệ nuôi cấy in vitro vào thực tiễn sản xuất. Các cây in vitro

vốn đang được sống trong điều kiện môi trường nhân tạo hoàn toàn thuận lợi, do

vậy trước khi đưa ra trồng ngoài đồng ruộng cây cần được thích nghi hoá với điều

kiện tự nhiên. Do đó việc xác định được phương pháp ra cây thích hợp để cây có

tỷ lệ sống cao, sinh trưởng phát triển tốt có vai trò quan trọng trong quy trình nhân

giống in vitro. Hiện nay, chúng ta có thể áp dụng nhiều phương pháp ra cây khác

nhau như phương pháp địa canh, thuỷ canh và khí canh. Tuy nhiên, phương pháp

thủy canh và khí canh đòi hỏi hệ thống thiết bị, máy móc, dung dịch dinh dưỡng,…

cho nên không phải lúc nào chúng ta cũng có thể áp dụng được phương pháp này.

Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng một số

loại giá thể địa canh đến khả năng sống, sự sinh trưởng phát triển của cây cẩm

chướng in vitro ngoài vườn ươm. Khi cây đạt tiêu chuẩn (cao trên 3,5 cm, có từ 4 -

5 rễ, rễ dài 2,0 - 3,0 cm) đưa ra trồng trên các giá thể khác nhau (Đất phù sa; Trấu

hun; Đất + trấu hun theo tỷ lệ 1: 1), sau 3 tuần theo dõi đo đếm các chỉ tiêu.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm (sau 3 tuần)

Thành phần Tỷ lệ Chiều Số lá/ Chất Công

sống cao cây lượng Thức cây

(%) (cm) (lá)

Đất phù sa 83,33 8,10 ++ 12,17 CT1

Trấu hun 92,01 8,76 ++ 12,73 CT2

Đất + trấu hun (1:1) 13,70 +++ 93,76 9,47 CT3

CV% 2,30 1,20

0,47 0,35 LSD0,05

Ghi chú: +++: Tốt (cây mập, lá xanh thẫm);

++: Trung bình (cây nhỏ, lá trung bình, màu xanh nhạt).

Sự sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm thể hiện ở sự

tăng trưởng chiều cao, sự ra lá, màu sắc thân lá. Kết quả nghiên cứu (bảng 3.5) cho

thấy công thức cho tỷ lệ sống cao thì đồng thời cây cũng sinh trưởng phát triển tốt.

Trong các loại giá thể được sử dụng giá thể đất (CT1) cho tỷ lệ sống thấp

(83,33%), giá thể đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt

(93,76%). Qua quan sát cho thấy khi sử dụng giá thể đất (CT1), sau khi phun nước

tưới đất thường bị chặt, cho nên chồi sinh trưởng phát triển kém hơn. Giá thể trấu

hun có khả năng tạo điều kiện thông thoáng giúp bộ rễ phát triển tuy nhiên khả

năng giữ nước và chất dinh dưỡng của loại giá thể này kém hơn.

Đất Trấu hun Đất +trấu hun (1:1)

Hình 3.3. Cây cẩm chướng giai đoạn ngoài vườn ươm

Kết luận: Qua kết quả thí nghiệm nuôi cấy in vitro cây cẩm chướng giống

Quận Chúa cho thấy:

- Phương pháp khử trùng thích hợp là sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 7

phút.

- Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi là môi trường dinh dưỡng MS

bổ sung 6,5 g/l agar, 30g/l saccarose, 100 mg/l innositol và 1,0 mg/l kinetin.

- Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 6,5 g/l

agar, 30g/l saccarose, 100 mg/l innositol, 0,25 mg/l α-NAA và 0,5 mg/l than hoạt

tính.

- Ở giai đoạn thích ứng ngoài vườn ươm, với phương pháp địa canh sử

dụng giá thể đất + trấu hun theo tỷ lệ 1:1 sẽ đem lại hiệu quả cao.

3.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro bằng

EMS và chiếu xạ gamma nguồn Co60

3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in

vitro bằng EMS

3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm

chướng

EMS là chất gây đột biến hoá học có tác động trực tiếp vào gen của tế bào

qua phương thức thẩm thấu qua bề mặt mô. Đối với từng loại cây, từng giống,

từng bộ phận của cây có sự mẫn cảm với tác nhân gây đột biến khác nhau. Nếu

thời gian xử lý và nồng độ xử lý không thích hợp sẽ làm cho mô tế bào chết trước

khi dạng đột biến phát sinh. Vì vậy, cần phải xác định nồng độ và thời gian xử lý

thích hợp mới có thể mang lại hiệu quả cao. Để xác định được nồng độ và thời

gian xử lý EMS thích hợp cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa chúng tôi đã tiến

hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh và sinh trưởng

của các chồi in vitro. Kết quả được trình bày tại bảng 3.6.

EMS có ảnh hưởng rất rõ đến khả năng sống của mẫu. Cụ thể ở các công

thức xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh theo chiều tăng của nồng độ EMS và

thời gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công thức xử lý nồng độ 0,2%

trong thời gian 1 giờ (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công thức xử lý

nồng độ 1,0% trong thời gian 3 giờ (18,89%). Khi tăng thời gian xử lý EMS thì tỷ

lệ mẫu sống ở các công thức giảm đi rõ rệt. Với thời gian xử lý 2 giờ ở nồng độ

thấp nhất (0,2%) tỷ lệ sống giảm 2,22%, ở nồng độ cao nhất (1,0%) tỷ lệ sống

giảm 5,55% so với khi xử lý ở thời gian 1 giờ. Ở cả 3 mức thời gian xử lý, khi

tăng nồng độ EMS lên 0,8% thì tỷ lệ chết của các mẫu nuôi cấy tăng lên rất mạnh.

Điều này chứng tỏ sự ảnh hưởng của EMS tới khả năng sống và khả năng phát

sinh chồi không những ở nồng độ mà còn ở thời gian xử lý.

Ảnh hưởng của EMS không những chỉ thể hiện ở khả năng sống của mẫu

mà còn ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát sinh chồi của mẫu cấy. Ở các công

thức xử lý EMS cho kết quả tỷ lệ phát sinh chồi thấp hơn nhiều so với đối chứng,

chỉ đạt từ 69,74% - 93,93%. Trong các công thức xử lý EMS, với thời gian xử lý 1

giờ và 2 giờ, công thức xử lý EMS nồng độ 0,4% cho tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất,

tuy nhiên với thời gian xử lý 3 giờ thì tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất ở công thức xử

lý nồng độ 0,2%. Điều này chứng tỏ khi tăng nồng độ và thời gian xử lý EMS đến

một mức độ nào đó nó sẽ có tác động kích thích sự phát sinh chồi, nếu tiếp tục

tăng thì tỷ lệ phát sinh chồi sẽ giảm. Khi nồng độ EMS tăng lên, chiều cao chồi và

số lá/chồi giảm. Như vậy, hiệu ứng của hoá chất gây đột biến ngoài khả năng làm

biến đổi cấu trúc di truyền còn tạo ra những tổn thương sinh lý làm suy giảm sức

sinh trưởng của chồi.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây cẩm chướng

(sau 5 tuần nuôi cấy)

Nồng độ Tỷ lệ mẫu sống Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi Chiều cao chồi Số lá

EMS (%) (%) (cm) (lá/chồi)

(%) 1 giờ 2 giờ 3 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ

0,0 100,0 98,89 97,78 100,0 98,58 97,67 4,17 4,04 3,89 7,68 7,76 7,62

0,2 91,11 88,89 83,33 91,66 88,26 84,15 3,78 3,50 3,18 7,28 6,78 6,46

0,4 86,67 82,22 78,89 93,93 91,11 82,68 3,56 3,22 2,89 6,80 6,26 5,76

6 7

0,6 81,62 70,00 62,22 88,90 86,50 82,19 3,18 2,89 2,59 6,26 5,93 5,64

0,8 48,89 45,56 39,97 80,40 77,38 74,66 2,49 2,22 2,03 5,66 5,32 4,32

32,22 26,67 18,89 73,83 71,86 69,74 2,19 1,91 1,78 4,72 4,82 4,70 1,0

CV% 2,20 2,10 2,20 1,20 1,20 1,20

0,11 0,11 0,11 0,12 0,12 1,12 LSD0,05

Dựa vào kết quả nghiên cứu, bằng thuật toán nội suy chúng tôi đã xây dựng

được mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ

mẫu chết với các mức thời gian khác nhau.

Thời Mô hình toán học Hệ số

gian tương

xử lý quan

Y = - 62,16x + 1157,07 x2 – 4145,10 x3 + 5626,30 x4 – 2508,33 x5

(r)

1 giờ 0,941

Y = 2,22 +195,48x - 997,26 x2+2299,84 x3 - 2109,11 x4 + 689,48 x5

Y = 1,17 + 52,91 x-57,06 x2+563,85 x3-1107,81 x4+581,77 x5 2 giờ 0,975

3 giờ 0,980

Trong đó: Y là tỷ lệ mẫu chết; x là nồng độ EMS xử lý.

Dựa vào mô hình toán học này chúng ta có thể dự báo được tỷ lệ mẫu chết

với từng nồng độ EMS xử lý, từ đó có thể xác định được khoảng nồng độ xử lý

đem lại hiệu quả di truyền cao mà ít gây chết cho mẫu xử lý.

90

081

80

073

068

70 )

061

%

60

054

051

50

038

1 giờ

40

030

2 giờ

( t ế h c u ẫ m ệ l

30

3 giờ

ỷ T

021

018

017

20

013

011

009

10

002

001

000

0

00

01 Nồng độ EMS xử lý (%)

Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý EMS đến tỷ lệ chết

của chồi in vitro cây cẩm chướng

Ở cả 3 mức thời gian 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ khi nồng độ EMS tăng từ 0,0% đến

0,6% thì tỷ lệ chết của các chồi in vitro tăng chậm ở các công thức, nhưng khi nồng

độ EMS tăng lên đến 0,8 và 1,0% thì tỷ lệ chết của các chồi đột ngột tăng mạnh.

Bằng phương pháp Reed and Muench (1983) chúng tôi xác định được liều

gây chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50) khi xử lý EMS với các mức thời gian 1, 2 và

3 giờ như sau:

LD50, EMS,1 giờ = 0,79%;

LD50, EMS,2 giờ = 0,76%;

LD50, EMS, 3 giờ = 0,71%.

Bảng 3.7. Sự biến động tỷ lệ mẫu chết quan các tuần nuôi cấy

Thời Nồng độ EMS (%) Thời gian gian xử nuôi cấy 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 lý (giờ)

4,00 6,67 9,33 38,00 61,33 1 0,00

Tuần 1 6,00 12,67 21,33 42,67 69,33 2 0,00

0,00 12,00 18,00 33,33 52,67 76,67 3

6,67 12,67 17,33 51,11 67,78 1 0,00

Tuần 2 6,00 15,33 30,00 54,44 73,33 2 0,00

0,67 15,33 21,11 37,78 58,67 81,11 3

8,89 13,33 18,33 51,11 67,78 1 0,00

Tuần 3 11,11 17,78 30,00 54,44 73,33 2 0,00

16,67 21,11 37,78 60,56 81,11 3 2,22

8,89 13,33 18,33 51,11 67,78 1 0,00

Tuần 4 11,11 17,78 30,00 54,44 73,33 2 1,11

16,67 21,11 37,78 60,56 81,11 3 2,22

8,89 13,33 18,33 51,11 67,78 1 0,00

Tuần 5 11,11 17,78 30,00 54,44 73,33 2 1,11

16,67 21,11 37,78 60,56 81,11 3 2,22

Ở các công thức thí nghiệm, số mẫu chết tập chung chủ yếu ở tuần thứ nhất

và tuần thứ 2 sau cấy, ở các công thức xử lý nồng độ thấp và thời gian ngắn số

mẫu chết kéo dài sang tuần thứ 3. Điều này cho thấy sự tác động của EMS ở nồng

độ khác nhau đến khả năng sống của các chồi in vitro có sự khác nhau.

CT2.1 CT2.2 CT2.3 CT2.4 CT2.5

Hình 3.5. Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý EMS với thời gian xử lý 2 giờ

(sau 4 tuần nuôi cấy)

3.2.1.2. Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của

các dạng chồi in vitro của cây cẩm chướng

Biến dị là biểu hiện ảnh hưởng của các tác nhân gây đột biến. Sự tác động

của tác nhân gây đột biến có thể làm thay đổi cấu trúc di truyền. Điều này có thể

gây ra những biến đổi về hình thái, sức sinh trưởng, khả năng phát sinh chồi,…

chúng ta có thể nhận biết được bằng mắt thường. Để đánh giá mức độ tác động của

EMS chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng chồi sau xử lý. Kết quả thu được 5

dạng chồi:

- Dạng A: Chồi phát triển bình thường.

- Dạng B: Chồi có biến đổi về hình thái lá: lá ngọn hình quạt, đốt thân chỉ

có 1 lá to, lá dính vào nhau tạo thành vòng tròn ở phần gốc, phần đầu hơi mở tạo

hình loa. đốt thân mang 3 lá, các lá bao chặt thân tạo chồi có dạng vòi.

- Dạng C: Chồi thấp, các đốt thân rất ngắn các lá xếp xít lại với nhau, các lá

dày, cứng màu xanh đậm.

- Dạng D: Chồi đa thân: thân được tạo bởi nhiều thân ghép lại với nhau tạo

thân dạng dẹt.

- Dạng E: Chồi có khả năng sinh sản mạnh: các chồi này có khả năng đẻ

chồi rất mạnh, tạo thành cụm chồi.

Dạng A Dạng B

Dạng C Dạng D Dạng E

Hình 3.6. Các dạng chồi thu được sau xử lý EMS

EMS không những ảnh hưởng đến khả năng sống, khả năng phát sinh chồi

của mẫu mà còn ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của chồi cũng như

sự biến đổi hình thái của chồi. Ở các công thức thí nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tăng

dần theo sự tăng của nồng độ và thời gian xử lý EMS.

Với thời gian xử lý 1 giờ: Ở nồng độ xử lý 0,2%, tỷ lệ chồi bình thường

chiếm 86,75%; tỷ lệ các chồi biến dị chiếm 13,20%, xuất hiện 3 chồi biến dị: dạng

chồi B, C và dạng chồi D. Ở nồng độ xử lý 1,0 %, tỷ lệ chồi bình thường chiếm

47,50%; tỷ lệ chồi biến dị chiếm 52,50%, tuy nhiên chồi biến dị cũng chỉ có 3

dạng chồi B, C và dạng chồi D. Với nồng độ xử lý từ 0,4%, 0,6%, 0,8% kết quả

thu được cả 4 dạng chồi biến dị B, C, D, E trong đó có 2 dạng chồi có khả năng

sinh trưởng phát triển tốt là chồi dạng D và chồi dạng E.

Khi tăng thời gian xử lý lên 2 giờ, ở nồng độ xử lý 0,2%, tỷ lệ chồi bình

thường chiếm 81,82%; tỷ lệ các chồi biến dị chiếm 18,51%, (tăng 5,31% so với

thời gian xử lý 1 giờ), xuất hiện 4 chồi biến dị: dạng chồi B, C, D và dạng chồi E (Ở

cùng nồng độ này với thời gian xử lý 1 giờ chỉ xuất hiện 3 dạng chồi). Ở nồng độ xử

lý 1,0%, tỷ lệ chồi bình thường chiếm 42,12%; tỷ lệ chồi biến dị chiếm 57,88%, tuy

nhiên chồi biến dị chỉ có 2 dạng chồi B và dạng chồi C (trong khi đó với cùng nồng

độ xử lý trong thời gian 1 giờ cho kết quả 3 dạng chồi biến dị xuất hiện là dạng chồi

B, C và dạng chồi D). Ở nồng độ xử lý 0,4%; 0,6% và 0,8% tương tự như thí

nghiệm xử lý 1 giờ chúng ta cũng thu được cả 4 dạng chồi biến dị B, C, D, E. Ở

nồng độ xử lý 1,0% EMS số dạng chồi giảm chỉ còn 3 dạng chồi (dạng A, B, C).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

cây cẩm chướng với thời gian xử lý 1 giờ

Công Nồng độ Tỷ lệ các dạng chồi (%)

thức EMS Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Tỷ lệ chồi

(%) A B C D E biến dị

97,76 2,24 0,00 0,00 0,00 2,24 0,0 ĐC

86,75 8,10 2,16 3,00 0,00 13,20 0,2 CT1.1

74,40 17,32 2,54 4,19 1,55 15,60 0,4 CT1.2

64,91 22,32 4,78 4,28 3,70 34,75 0,6 CT1.3

54,62 33,25 6,12 3,82 2,19 45,72 0,8 CT1.4

47,50 34,72 15,45 2,33 0,00 52,50 1,0 CT1.5

Khi tăng thời gian xử lý lên 2 giờ chúng ta thấy tỷ lệ chồi biến dị tăng lên.

Tuy nhiên, điều này chủ yếu là do tỷ lệ chồi dạng B và dạng C tăng. Khi quan sát

động thái xuất hiện của dạng chồi D, E ta thấy, khi tăng nồng độ xử lý từ 0,2% lên

0,4% thì tỷ lệ 2 dạng chồi này tăng sau đó nếu tiếp tục tăng nồng độ EMS thì tỷ lệ

này lại giảm xuống.

Với thời gian xử lý 3 giờ, ở các công thức thí nghiệm tỷ lệ chồi biến dị tăng

dần theo sự tăng của nồng độ EMS, thấp nhất là công thức CT3.1 (29,93%), cao

nhất là công thức CT3.5 (64,49%). Ở nồng độ xử lý 0,2%, cũng đã xuất hiện cả 4

dạng chồi biến dị chiếm 29,93%, (tăng 16,73% so với thời gian xử lý 1 giờ và

14,42% so với ở thời gian xử lý 2 giờ). Ở nồng độ xử lý 1,0%, tỷ lệ chồi bình

thường giảm xuống chỉ còn 31,40%, tuy nhiên chồi biến dị chỉ xuất hiện 2 dạng

chồi B và dạng chồi C. Ở nồng độ xử lý 0,8%, số dạng chồi biến dị xuất hiện đã

giảm xuống so với các thí nghiệm trước chỉ còn 3 dạng (dạng chồi B, C và E). Ở

nồng độ xử lý từ 0,4%, 0,6%, tương tự như thí nghiệm xử lý 1 giờ và 2 giờ chúng

ta cũng thu được cả 4 dạng chồi biến dị B, C, D, E, tuy nhiên tỷ lệ thấp hơn.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

cây cẩm chướng với thời gian xử lý 2 giờ

Công Nồng độ Tỷ lệ các dạng chồi (%)

thức EMS Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Tỷ lệ chồi (%) A B C D E biến dị

ĐC 0,0 95,81 4,19 0,00 0,00 0,00 4,19

0,2 81,82 10,08 3,13 3,29 1,69 18,51 CT2.1

0,4 70,24 17,55 3,75 4,64 3,81 28,25 CT2.2

0,6 61,36 27,11 5,42 3,69 2,41 38,53 CT2.3

0,8 51,15 32,51 10,63 3,47 2,25 49,53 CT2.4

42,12 36,42 21,46 0,00 0,00 57,88 CT2.5 1,0

Như vậy, khi xử lý ở nồng độ cao và thời gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị

nhiều tuy nhiên số chồi biến dị thực tế thu được và các dạng biến dị xuất hiện lại

giảm do nồng độ cao mức độ gây tổn thương về mặt sinh lý lớn nhưng hiệu quả di

truyền không cao, đa số các chồi bị chết. Dạng biến dị tăng chủ yếu ở dạng biến dị

B, C, trong đó dạng chồi C là dạng chồi sinh trưởng phát triển kém.

Ở các mẫu đối chứng mặc dù không xử lý tác nhân gây đột biến nhưng vẫn

thấy xuất hiện một số chồi biến dị (dạng B) với tỷ lệ thấp, điều này chứng tỏ sự

tồn tại biến dị soma trong nuôi cấy in vitro. Điều này hoàn toàn phù hợp với các

công bố của các tác giả (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Bùi Chí Bửu và

Nguyễn Thị Lang, 2007).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái của chồi in vitro

cây cẩm chướng với thời gian xử lý 3 giờ

Công Nồng độ Tỷ lệ các dạng chồi (%)

thức EMS Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Tỷ lệ chồi

(%) A B C D E biến dị

0,0 94,13 5,87 0,00 0,00 0,00 5,87 ĐC

0,2 69,71 19,71 4,69 3,50 2,39 29,93 CT3.1

0,4 66,33 21,73 5,39 4,36 2,20 33,33 CT3.2

0,6 53,59 31,46 9,31 3,57 2,08 46,01 CT3.3

0,8 44,71 38,06 14,33 2,90 0,00 56,33 CT3.4

34,76 35,44 29,80 0,00 0,00 64,49 1,0 CT3.5

Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương quan giữa

nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được mô hình toán học biểu

diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ biến dị của chồi với các mức thời

gian xử lý khác nhau. Dựa vào mô hình này chúng ta có thể dễ dàng dự đoán được

tỷ lệ chồi biến dị đối với mỗi mức nồng độ xử lý EMS khác nhau.

Mô hình toán học

Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5

Hệ số tương quan (r) Thời gian xử lý

Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5

1 giờ 0,985

Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5

0,997 2 giờ

0,978 3 giờ

Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý.

Kết luận: EMS có ảnh hưởng rất rõ rệt đến khả năng sống, sự bật chồi và tạo các

chồi biến dị từ đoạn thân mang mắt ngủ của giống cẩm chướng Quận Chúa.

- Khi xử lý ở nồng độ thấp nhất (0,2%) và thời gian ngắn nhất (1giờ), tỷ lệ

mẫu sống giảm xuống còn 91,11% và tỷ lệ các chồi biến dị tăng gấp 5,89 lần so

với đối chứng.

- Ở nồng độ cao nhất (1,0%) và xử lý trong thời gian dài nhất (3 giờ) gây

chết 81,01% mẫu thí nghiệm, cho 64,49% chồi biến dị.

- Nồng độ EMS càng cao, thời gian xử lý càng dài thì tỷ lệ các dạng chồi

biến dị càng tăng. Tuy nhiên, dạng chồi biến dị lại giảm, dạng chồi tăng chủ yếu là

dạng B và dạng C, trong đó dạng chồi C có khả năng sinh trưởng, phát triển kém,

khó có khả năng hình thành rễ, sinh trưởng, phát triển trong điều kiện tự nhiên.

Vì vậy, nồng độ EMS và thời gian thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in

vitro đối với cây cẩm chướng giống Quận Chúa là 0,4% trong thời gian 2 giờ. Ở

nồng độ và thời gian xử lý này cho tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ bật chồi cao (tỷ lệ sống:

82,22%, tỷ lệ phát sinh chồi: 91,11%), số lượng chồi biến dị thu được nhiều (cả

bốn dạng chồi biến dị: B, C, D, E). Đây cũng là nồng độ thích hợp đối với việc xử

lý gây tạo đột biến từ hạt và lá của cây hoa cẩm chướng (Roychowdhury and

Jagatpati. 2011a, 2011b; Roychowdhury et al., 2011a). Tuy nhiên với vật liệu lựa

chọn để xử lý khác nhau thì thời gian xử lý có sự khác nhau.

3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in

vitro bằng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co

3.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co tới sự phát

sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro

Ứng dụng gây tạo đột biến bằng xử lý chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro trong

công tác chọn tạo giống hoa cây trồng là hướng đi có triển vọng. Trên đối tượng cây

hoa cẩm chướng đã có nhiều công bố trên thế giới (Butiati, 1985; Cassells, 1993;

Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009, 2011; Roychowdhury et al., 2011b). Tuy nhiên

với mỗi loài thực vật, mỗi bộ phận của cây có mức độ phản ứng khác nhau đối với tác

nhân gây đột biến. Để xác định ngưỡng xử lý chiếu xạ tia gamma cho mắt ngủ cây

cẩm chướng in vitro chúng tôi tiến hành xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co trên vật

liệu là đoạn thân mang mắt ngủ chồi in vitro cây cẩm chướng, với các liều hấp thụ 10,

20, 30, 40, 50, 60, 70Gγ.

Ở các công thức thí nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều

lượng xử lý chiếu xạ gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh

chồi. Khi liều lượng xử lý tăng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong các

công thức thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao nhất tại CT1 (tỷ lệ

sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt 91,99%), khi xử lý ở liều hấp thu 70

Gγ thì 100% mẫu bị chết. Liều lượng xử lý gamma nguồn 60Co không những ảnh

hưởng đến khả năng sống, khả năng phát sinh chồi của mẫu mà còn ảnh hưởng rất

lớn đến sự sinh trưởng và chất lượng chồi, liều lượng xử lý càng cao chiều cao

chồi giảm, độ dài của lóng thân giảm.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co đến khả năng sống và sinh trưởng của chồi in vitro (sau 5 tuần nuôi cấy)

Công Liều hấp Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu phát Chiều cao Số lá

thức thu (Gγ) sống (%) sinh chồi (%) chồi (cm) (lá/chồi)

0 ĐC 98,00 100,00 4,16 5,52

10 91,33 91,99 3,88 5,34 CT1

20 82,67 88,71 3,45 5,67 CT2

75,33 86,74 4,00 5,76 30 CT3

49,33 70,22 3,04 4,83 40 CT4

50 29,33 52,22 2,14 4,62 CT5

60 8,67 24,44 1,87 2,48 CT6

0,00 0,00 0,00 0,00 70 CT7

2,30 0,11 2,00 0,15 CV% LSD0,05

Từ kết quả thu được, bằng thuật toán nội suy Lagrange chúng tôi đã xây

dựng mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma

nguồn 60Co với tỷ lệ mẫu chết. Dựa vào mô hình toán học có thể dự báo được tỷ lệ

mẫu chết với từng liều lượng xử lý, từ đó có thể xác định được khoảng liều lượng

xử lý đem lại hiệu quả di truyền cao mà ít gây chết cho mẫu xử lý.

Y = 57,83.10-10x7 + 1,42.10-6x6 - 1,38.10-4x5 + 6,65.10-3x4 –

0,166x3 + 1,995x2– 8,096x +2

Trong đó: Y là tỷ lệ mẫu chết (%);

x là liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co (Gγ).

Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được liều lượng

gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50 = 38,57 Gγ.

Bảng 3.12. Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần nuôi cấy

Thời gian Liều hấp thụ (Gγ)

nuôi cấy 0,0 10 20 30 40 50 60 70

Tuần 1 0,00 2,67 6,67 10,67 20,67 48,67 68,67 79,33

Tuần 2 0,67 8,67 14,67 22,00 39,33 61,33 77,33 88,67

Tuần 3 0,67 8,67 16,00 23,33 48,00 70,67 81,33 100,00

Tuần 4 2,00 8,67 17,33 24,67 50,67 70,67 81,33 100,00

Tuần 5 2,00 8,67 17,33 24,67 50,67 70,67 81,33 100,00

Sự biến động tỷ lệ mẫu chết qua các tuần ở các công thức thí nghiệm có sự

khác nhau. 100% mẫu chết khi xử lý ở liều hấp thụ 70 Gγ. Ở các công thức xử lý

liều hấp thụ thấp (10 Gγ - 40 Gγ) sau 4 tuần tỷ lệ chết mới ổn định. Ở các công

thức xử lý liều hấp thụ cao hơn (50 Gγ - 60 Gγ) tỷ lệ chết ổn định sau 3 tuần. Như

vậy có thể thấy sự tác động của tia gamma nguồn 60Co đến khả năng sống của chồi

in vitro cây cẩm chướng lâu hơn so với EMS. Điều này cho thấy khi xử lý chiếu xạ

gamma nguồn 60Co, phải sau 4 tuần nuôi cấy mới có thể xác định chồi in vitro có

khả năng sống.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7

Hình 3.7 Chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co

3.2.2.2. Ảnh hưởng của chiếu xạ gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh biến dị hình thái

chồi in vitro cây cẩm chướng

Tia gamma là tác nhân gây đột biến vật lý tác động trực tiếp vào hệ gen của

tế bào. Nó có khả năng biến các phân tử thành những phân tử mang điện tích và

tạo nên sự ion hóa. Nhờ sự ion hóa mà trong tế bào xảy ra những biến đổi về mặt

hóa học vật liệu di truyền và những chất khác khi hấp thụ năng lượng bức xạ. Kết

quả quá trình này dẫn tới những biến đổi trong phân tử DNA, gây ra đột biến

điểm, đôi khi gây ra sự gẫy đứt tạo nên đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể (Phạm

Thành Hổ, 2010). Như vậy nó không chỉ ảnh hưởng đến khả năng sống và tái sinh

chồi của mẫu cấy mà còn gây tạo biến dị hình thái các chồi in vitro. Số liệu thực

nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ các chồi biến dị hình thái vào

liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sau xử lý chúng

tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (hình 3.8):

Dạng A: chồi phát triển bình thường (đối chứng);

Dạng F: chồi sinh trưởng phát triển kém, thân lá màu vàng;

Dạng G: chồi thân lá cứng, lá dài, dầy, màu xanh đậm;

Dạng H: chồi có khả năng đẻ nhánh mạnh, thân lá màu xanh đậm, lá ngắn,

phần ngọn bao lại với nhau tạo dạng búp chè;

Dạng I: chồi sinh trưởng phát triển kém, đốt thân ngắn, lá to, màu xanh vàng;

Dạng K: chồi sinh trưởng phát triển kém, thân lá ngắn màu vàng, lá phần

ngọn bao chặt lại dạng búp chè.

Sự phân bố của các dạng chồi ở các công thức thí nghiệm không giống nhau

(bảng 3.13). Ở đối chứng không chỉ có chồi dạng A mà còn xuất hiện dạng F. Khi

xử lý ở liều hấp thụ 20 Gγ đến 50 Gγ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. Ở

liều hấp thụ thấp 10 Gγ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tăng liều

lượng xử lý lên 60 Gγ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. Ở liều lượng xử lý cao, tỷ lệ

chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm. Đặc biệt dạng chồi G, H

(chồi có khả năng sinh trưởng phát triển tốt) có xu hướng giảm mạnh. Sự xuất hiện

các dạng chồi biến dị hình thái sau khi chiếu xạ gamma cũng đã được Barakat and

Heba (2011) công bố khi nghiên cứu trên cây hoa Baby (Gypsophila paniculata L.).

Dạng A Dạng F Dạng G

Dạng H Dạng I Dạng K

Hình 3.8. Các dạng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co

Bảng 3.13. Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi sau xử lý tia gamma nguồn 60Co

Công Liều Tỷ lệ Dạng Dạng F Dạng G Dạng H Dạng I Dạng thức hấp thụ biến dị A (%) (%) (%) (%) (%) K (%) (Gγ) (%)

ĐC 96,20 3,80 0,00 0,00 0,00 0,00 3,80 0

10 89,68 6,53 0,00 3,79 0,00 0,00 10,32 CT1

20 64,04 9,53 7,39 7,39 6,35 5,29 35,96 CT2

30 52,99 10,72 13,69 8,93 6,54 7,14 47,01 CT3

40 41,54 18,00 8,92 6,77 10,16 14,61 58,46 CT4

50 22,34 25,12 8,37 8,37 13,71 22,09 77,66 CT5

60 0,00 0,00 0,00 0,00 16,67 83,33 100,00 CT6

70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 CT7

Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi cũng đã xây dựng được mô hình toán học

biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co và tỷ lệ chồi

biến dị.

Y = 7,255.10-8x6 – 15,33.10-6x5 + 12,865.10-4x4 – 5,05.10-2x3 +

0,92x2 – 4,639x + 3,80

Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); x liều hấp thụ (Gγ).

Dựa vào mô hình toán học chúng ta có thể tính toán được tỷ lệ biến dị với

các liều lược xử lý tia gamma nguồn 60Co khác nhau.

Liều lượng xử lý chiếu xạ gamma nguồn 60Co thích hợp cho mắt ngủ cấy

cẩm chướng in vitro là 30 Gγ. Ở liều lượng này cho tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát

sinh chồi cao, số chồi lượng chồi và dạng chồi biến dị thu được nhiều (dạng F, G,

H, I, K). Đặc biệt là các dạng chồi có khả năng sinh trưởng phát triển tốt (dạng

chồi G) chiếm tỷ lệ cao ở liều lượng xử lý này. Liều lượng xử lý nêu trên cũng phù

hợp với kết quả xử lý trên giống cẩm chướng Trắng viền tím, Đỏ (Nguyễn Thị Lý

Anh và cs., 2019c).

3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Cocho cây hoa

cẩm chướng in vitro

3.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co

tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng

Để xác định mức độ ảnh hưởng của nồng độ EMS và liều lượng chiếu xạ

đến khả năng sống, khả năng phát sinh chồi của các mẫu được xử lý, chúng tôi tiến

hành xử lý EMS với các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% kết hợp chiếu xạ tia gamma

nguồn 60Co với mức hấp thu 10, 20, 30 Gγ. Sau 5 tuần nuôi cấy đo đếm các chỉ

tiêu (bảng 3.14).

Kết quả thí nghiệm cho thấy liều lượng xử lý có ảnh hưởng rất rõ đến khả

năng sống và phát sinh chồi của các mẫu xử lý. Khi tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ

mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công thức thí nghiệm, tỷ

lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại công thức CT1 (Tỷ lệ mẫu

sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công

thức CT12 (Tỷ lệ mẫu sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%). Số liệu cho

thấy sự thay đổi liều lượng xử lý gamma nguồn 60Co có ảnh hưởng đến tỷ lệ mẫu

chết lớn hơn sự thay đổi nồng độ EMS. Số liệu về chiều cao, số lá của chồi ở các

công thức cho thấy, tác nhân gây đột biến không những ảnh hưởng đến khả năng

sống, khả năng phát sinh chồi mà còn ảnh hưởng rất đến sự sinh trưởng phát triển

của chồi. Khi tăng liều lượng xử lý EMS hoặc gamma thì chiều cao, số lá của chồi

giảm. Ở các công thức xử lý liều cao, lóng của chồi ngắn hơn khi xử lý liều thấp.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của liều lượng xử lý EMS và tia gamma nguồn 60Co đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi (sau 5 tuần nuôi cấy)

Công Nồng độ Liều hấp Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Chiều cao Số lá

thức EMS thụ chồi sống phát sinh (lá/chồi)

(%) (Gγ) (cm) (%) chồi (%)

4,15 5,03 0 ĐC 0 100,0 95,33

3,75 4,89 0,1 CT1 10 89,33 87,33

3,62 4,37 0,1 CT2 20 86,67 80,67

3,54 4,20 0,1 CT3 30 78,00 72,00

3,60 4,76 0,2 CT4 10 88,00 80,00

3,51 4,24 0,2 CT5 20 86,67 73,33

3,60 4,07 0,2 CT6 30 69,33 52,00

3,53 4,59 0,3 CT7 10 84,00 74,67

3,52 4,06 0,3 CT8 20 77,33 54,67

3,09 3,90 0,3 CT9 30 66,67 32,67

2,91 4,25 0,4 CT10 10 76,00 68,67

2,32 3,73 0,4 CT11 20 68,67 42,67

2,04 3,56 CT12 30 60,00 24,67 0,4

2,50 1,70 CV%

0,14 0,12 LSD0,05

3.2.3.2. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co đến sự phát sinh

biến dị hình thái chồi in vitro

Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính của tỷ lệ các chồi

biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao tỷ lệ chồi biến dị càng

lớn. Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (hình 3.9):

- Dạng A: Chồi phát triển bình thường.

- Dạng F: Chồi sinh trưởng phát triển kém, thân lá màu vàng.

- Dạng G: Chồi sinh trưởng phát triển mạnh, thân mập, lá màu xanh đậm,

thân lá cứng.

- Dạng L: Chồi mập, màu xanh đậm, các lá to, dầy, lá phần ngọn cuộn lại tạo

hình ống.

- Dạng M: Chồi bị thủy tinh hóa, thân lá mọng nước.

- Dạng N: Chồi có khả năng đẻ nhánh mạnh, từ các đốt thân có rất nhiều

chồi tạo như hình bông hoa, lá ngắn, thân lá màu xanh đậm.

- Dạng O: Chồi thân nhỏ, mềm, lá ngắn mầu xanh vàng, tạo từng thành cụm.

- Dạng P: Chồi có khả năng phát sinh chồi mạnh, lá to bản, dầy, các lá dính

lại với nhau ở phần cuống lá.

Số liệu cho thấy sự phân bố của các dạng chồi ở các công thức thí nghiệm

không giống nhau. Ở đối chứng chỉ xuất hiện 2 dạng chồi là chồi dạng A và dạng

chồi M. Sự biến động về số dạng chồi biến dị cũng có xu hướng tương tự như khi

xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co. Khi tăng liều xử lý thì tỷ

lệ chồi biến dị có xu hướng tăng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm

ở các công thức xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả năng

sinh trưởng phát triển tốt) chỉ xuất hiện ở công thức CT4 đến CT10. Công thức CT5

(xử lý 0,2% EMS kết hợp chiếu xạ gamma nguồn 60Co ở liều hấp thu 20 Gγ) xuất

hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi tiềm năng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%).

Xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị

hơn hơn so với xử lý riêng rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009a,

2009b, 2011b).

Dạng A Dạng F

Dạng G Dạng L

Dạng M Dạng N

Dạng O Dạng P

Hình 3.9. Các dạng chồi thu được sau xử lý kết hợp EMS

và tia gamma nguồn 60Co

Bảng 3.15. Tỷ lệ chồi biến dị và các dạng chồi in vitro sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co (sau 4 tuần nuôi cấy)

Công Nồng độ Liều hấp thụ Dạng A Dạng F Dạng G Dạng L Dạng M Dạng N Dạng O Dạng P Tỷ lệ chồi

thức EMS(%) gamma (Gγ) biến dị (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

ĐC 95,92 0,00 0,00 0,00 4,08 0,00 0,00 0,00 4,08 0,0 0,0

86,79 4,73 0,00 0,00 8,50 0,00 0,00 0,00 13.21 10 0,1 CT1

79,65 5,33 0,00 0,00 10,18 4,84 0,00 0,00 20,35 20 0,1 CT2

71,26 11,63 0,00 0,00 10,95 6,17 0,00 0,00 28,74 30 0,1 CT3

72,66 8,48 3,26 0,00 8,36 7,26 0,00 0,00 27,34 10 0,2 CT4

8 4

57,50 7,98 9,12 0,00 11,30 8,72 0,00 5,37 42,50 20 0,2 CT5

37,89 18,40 6,90 0,00 13,80 9,20 6,90 6,90 62,11 30 0,2 CT6

45,96 13,27 6,60 0,00 11,18 11,18 2,49 9,32 54,04 10 0,3 CT7

34,34 15,48 7,16 4,78 11,13 11,45 6,26 9,39 65,66 20 0,3 CT8

29,49 18,49 5,44 6,54 12,04 12,04 6,02 9,95 70,51 30 0,3 CT9

39,62 16,36 4,36 7,38 12,26 11,12 0,00 8,90 60,38 10 0,4 CT10

28,90 25,52 0,00 7,82 15,65 7,82 3,91 10,36 71,10 20 0,4 CT11

27,77 27,87 0,00 8,96 18,15 0,00 8,62 8,62 72,23 30 CT12 0,4

3.3. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in vitro

3.3.1. Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng

sau xử lý

Các chồi được xử lý bằng tác nhân gây tạo đột biến được sàng lọc và nhân

qua 5 thế hệ (M1V5) sau đó được cấy chuyển sang môi trường ra rễ, tạo cây hoàn

chỉnh (môi trường dinh dưỡng MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-

NAA). Kết quả sau 4 tuần theo dõi số liệu được ghi tại bảng 3.16.

Bảng 3.16. Khả năng ra rễ của chồi in vitro sau xử lý (sau 4 tuần)

Dạng chồi

Tỷ lệ chồi tạo rễ Thời gian xuất hiện Chiều cao cây Số rễ (rễ/cây) Chiều dài rễ (cm)

(%) (cm) (ngày)

Dạng A 98,89 4,82 8,04 6,93 3,01

Dạng B 88,89 4,72 9,0 6,44 1,87

Dạng C 37,78 1,52 15,0 0,78 0,58

Dạng D 83,33 3,76 11,0 6,21 1,41

Dạng E 76,67 3,45 12,0 5,76 1,36

Dạng F 85,56 3,64 10,95 5,02 2,17

Dạng G 100,0 5,14 7,28 7,27 3,22

Dạng H 88,89 4,72 9,31 6,44 2,74

Dạng I 0,00 - - - -

Dạng K 46,67 2,45 12,36 3,76 1,23

Dạng L 87,22 2,99 8,71 5,55 2,34

Dạng M 0,00 - - - -

Dạng N 83,33 3,67 11,24 4,16 1,95

Dạng O 68,89 2,66 9,07 3,96 1,79

Dạng P 72,22 2,55 13,19 4,85 1,89

CV% 3,70 3,00 2,60 3,20

0,22 0,52 0,23 0,11 LSD0,05

Tỷ lệ chồi tạo rễ của các dạng chồi có sự khác nhau, cao nhất là dạng chồi

G (100%), thấp nhất là dạng chồi C (37,78%). Tỷ lệ chồi tạo rễ của các dạng chồi

B, C, D, E, F, H, K, L, N, O, P đều thấp hơn rất nhiều so với chồi bình thường

(dạng chồi A), đặc biệt dạng chồi I và dạng chồi M không có khả năng sống khi

cấy sang môi trường ra rễ.

Các dạng chồi có khả năng sinh trưởng thân lá tốt thường có khả năng ra

rễ tốt, số rễ trung bình của chồi G cao nhất đạt (7,27 rễ/chồi), thấp nhất là chồi C

(0,78 rễ/chồi). Trong môi trường ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị

khác ra rễ muộn hơn rất nhiều so với dạng A. Khả năng ra rễ của các dạng đột

biến có sự khác nhau. Chồi dạng B bắt đầu xuất hiện rễ sau 9 ngày, chồi dạng D

bắt đầu xuất hiện rễ sau 11 ngày, dạng chồi E bắt đầu xuất hiện rễ sau 12 ngày và

muộn nhất là chồi dạng C bắt đầu xuất hiện rễ sau 15 ngày, trong khi đó chồi

dạng A chỉ sau 8 ngày đã xuất hiện rễ. Trừ dạng chồi G, các chồi đột biến không

những xuất hiện rễ chậm, số rễ/chồi thấp mà chiều dài của rễ cũng ngắn hơn

nhiều so với chồi bình thường.

3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây

cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh

Để đánh giá khả năng sống và sinh trưởng của các dạng chồi phân lập lập

được sau khi tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi đã đưa cây ra ngoài vườn ươm và

trồng bằng kỹ thuật khí canh. Dựa trên kết quả nghiên cứu của tác giả đã công bố

(Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2010) trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng dung

dịch Anthura nồng độ bằng ¾ dung dịch chuẩn với chế chu kỳ phun dinh dưỡng

15 phút 1 lần, mỗi lần 15 giây. Sau 2 tuần đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.17).

Sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi rất khác nhau, các dạng chồi

biến dị có khả năng sống và sinh trưởng thân lá thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi

bình thường. Tỷ lệ sống của các dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G

(100%) sau đó là chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả

năng sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O không có

khả năng sống ngay cả trong điều kiện vườn ươm. Một trong những nguyên nhân

chính là do số lượng rễ được tạo ra trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh của chồi

dạng I, M, O, C, K rất thấp.

Bảng 3.17. Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến

trong điều kiện khí canh (sau 2 tuần)

Dạng chồi Tỷ lệ cây Chiều cao Số lá Chất lượng

sống cây (lá/cây)

(%) (cm)

98,89 Dạng A 7,06 +++ 5,61

93,33 Dạng B 4,32 +++ 4,55

3,33 Dạng C 3,27 + 3,37

82,22 Dạng D 4,62 ++ 4,32

76,67 Dạng E 4,01 ++ 4,03

62,22 Dạng F 5,67 ++ 4,14

100,0 Dạng G 7,37 +++ 6,42

83,33 Dạng H 4,32 ++ 4,55

13,33 Dạng K 3,26 + 2,03

80,00 Dạng L 4,90 ++ 3,67

65,56 Dạng N 4,22 ++ 4,19

0,00 Dạng O - - -

45,56 Dạng P 5,16 ++ 3,25

2,50 0,21 5,30 0,33 CV% LSD0,05

Ghi chú: +++: Tốt (cây mập, lá xanh thẫm);

++: Trung bình (cây nhỏ, lá trung bình, màu xanh nhạt);

+: Cây sinh trưởng phát triển kém (thân, lá nhỏ, mầu vàng).

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy sự sinh trưởng phát triển của các dạng

chồi có khả năng sống trong điều kiện vườn ươm cũng có sự tương đồng với giai

đoạn tạo rễ. Những dạng chồi có tỷ lệ sống cao cũng là những dạng chồi sinh

trưởng phát triển tốt. Như vậy khi sử dụng phương pháp gây tạo đột biến trong

nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng những dạng chồi có khả năng sinh

trưởng phát triển, khả năng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh kém ở giai đoạn nuôi cấy in

vitro (như dạng I, M, O, C) chúng ta có thể loại ngay từ giai đoạn nuôi cấy in vitro.

3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây

cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Cây in vitro hoàn chỉnh đã được thích ứng với điều kiện tự nhiện bằng kỹ

thuật khí canh được chuyển ra trồng trong nhà lưới có mái che. Sau 5 tuần theo

dõi đo đếm số liệu (bảng 3.18).

Bảng 3.18 Sự sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi sau xử lý đột biến

trong điều kiện ngoài đồng ruộng (sau 5 tuần)

Dạng chồi Tỷ lệ cây sống Chiều caoTB Số lá

(%) (cm) (lá/cây)

89,67 Dạng A 12.28 10,65

78,33 Dạng B 11,83 10,57

0,00 Dạng C - -

62,67 Dạng D 11,86 10,63

55,22 Dạng E 10,67 10,27

41,33 Dạng F 10,69 10,09

96,67 Dạng G 14.83 12,91

63,78 Dạng H 10,01 9,54

0,00 Dạng K - -

45,33 Dạng L 9,75 9,13

65,67 Dạng N 10,33 9,67

0,00 Dạng P - -

CV% 2,20 2,80

0,17 0,20 LSD0,05

Sự sinh trưởng của các dạng chồi trong điều kiện đồng ruộng có sự khác

nhau. Qua theo dõi cho thấy hầu hết các dạng chồi có khả năng thích ứng trong

điều kiện vườn ươm kém (dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng

1 tuần. Khả năng sống và sinh trưởng của các dạng chồi ở giai đoạn ngoài đồng

ruộng cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phòng thí nghiệm và giai đoạn

khí canh. Các dạng chồi sinh trưởng tốt ở giai đoạn nuôi cấy in vitro và khí canh

khi đưa ra trồng ngoài đồng ruộng cũng sinh trưởng phát triển tốt hơn. Cụ thể

dạng chồi G, A có khả năng sinh trưởng phát triển tương đối tốt, tỷ lệ sống cao

đạt trên 80%, thân lá phát triển tốt. Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống

thấp (đạt từ 41,33 đến 65,67%). Điều này chứng tỏ sự tác động của tác nhân gây

đột biến không những làm biến đổi về mặt hình thái mà còn ảnh hưởng đến khả

năng sinh trưởng phát triển của cây cẩm chướng ở giai đoạn ngoài đồng ruộng.

3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh biến

dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng

Để đánh giá hiệu quả của sự tác động của các tác nhân gây đột biến chúng

tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình thái và khả năng sinh

trưởng phát triển của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi

chúng tôi đã phân lập được một số dạng biến dị về thời gian sinh trưởng, hình

thái lá và màu sắc hoa và được phân thanh 3 nhóm (hình 3.10; 3.11) như sau:

Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá xẻ thùy, lá hình ống.

Nhóm 2: Chồi nách phát triển.

Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa, gồm 7 dạng:

H1: Hoa màu tím.

H2: Hoa màu phấn hồng viền tím.

H3: Hoa màu trắng viền đỏ.

H4: Hoa màu trắng sọc tím.

H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa không có viền tím.

H6: Hoa trắng viền phấn hồng.

H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm.

Tỷ lệ các dạng biến dị ở các công thức xử lý khác nhau được ghi tại bảng

3.19, 3.20 và 3.21.

Đối chứng Lá hình ống

Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển

Hình 3.10. Một số dạng biến dị về hình thái thân lá

Đối chứng H1

H2 H3

H4 H5

H6 H7

Hình 3.11. Hình ảnh một số dạng biến dị về màu sắc hoa

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của xử lý EMS đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Biến dị phát sinh (%)

Hình thái lá Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 Màu sắc hoa H5 H4 H6 H7 Tổng số Nồng độ EMS (%) Thời gian xử lý (giờ) Công thức Chồi nách phát triển

ĐC 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00

0,2 1 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,00 CT1

0,4 1 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 5,34 CT2

0,6 1 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 3,33 0,0 0,0 0,0 6,00 CT3

0,8 1 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 3,33 0,0 0,0 8,67 CT4

9 2

1,0 1 3,33 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 9,34 CT5

0,2 2 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,0 0,0 0,0 4,67 CT6

0,4 2 2,0 0,0 2,67 4,0 1,33 0,0 5,33 2,0 0,0 3,33 18,66 CT7

0,6 2 2,67 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 3,33 4,0 0,0 0,0 15,34 CT8

0,8 2 2,67 0,0 3,33 0,0 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 11,34 CT9

1,0 2 4,67 3,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,0 0,0 0,0 12,0 CT10

0,2 3 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 8,01 CT11

0,4 3 0,0 0,0 3,33 3,33 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 0,0 12,00 CT12

0,6 3 3,33 2,67 3,33 2,67 0,0 0,0 1,33 2,67 0,0 0,0 16,00 CT13

0,8 3 4,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 6,67 0,0 0,0 14,67 CT14

1,0 3 4,0 5,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,67 0,0 0,0 13,79 CT15

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của xử lý tian gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Liều hấp Biến dị phát sinh (%)

thụ (Gᵧ) Hình thái lá Chồi nách Màu sắc hoa Tổng số Công thức phát triển Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ĐC 0,00

10 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 CT1 2,67

9 3

20 2,0 2,0 0,0 0,0 0,0 3,33 3,33 0,0 0,0 0,0 CT2 10,66

30 4,67 2,67 0,0 0,0 0,0 4,67 4,0 0,67 0,0 0,0 CT3 16,67

40 2,67 3,33 0,0 0,0 0,0 2,67 3,33 0,0 0,0 0,0 CT4 12,00

50 2,67 3,33 0,0 0,0 0,0 3,33 4,67 0,0 0,0 0,0 CT5 14,00

60 2,0 4,0 0,0 0,0 0,0 2,0 5,33 0,0 0,0 0,0 CT6 13,33

70 - - - - - - - - - - - CT7

Bảng 3.21. Tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co giai đoạn ngoài đồng ruộng

Nồng độ Liều hấp Biến dị phát sinh (%) Công EMS thụ (Gᵧ) Hình thái lá Chồi nách Màu sắc hoa thức Tổng số (%) phát triển Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H6 H7 H4 H5

0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 0,0 ĐC 0,0

10 1,33 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 0,0 4,00 0,0 0,0 0,1 CT1

20 2,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,67 2,0 0,0 6,67 0,0 0,0 0,1 CT2

9 4

30 2,67 2,67 0,0 0,0 0,0 2,67 2,67 0,0 10,67 0,0 0,0 0,1 CT3

10 3,33 2,0 1,33 0,0 1,33 4,0 3,33 0,0 15,33 0,0 0,0 0,2 CT4

20 3,33 2,0 4,0 0,0 2,67 5,33 5,33 0,0 24,66 2,0 0,0 0,2 CT5

30 3,33 5,33 0,0 3,33 0,0 1,33 4,67 3,33 21,32 0,0 0,0 0,2 CT6

10 5,33 4,67 0,67 2,67 0,0 2,0 6,0 0,0 21,34 0,0 0,0 0,3 CT7

20 6,0 4,0 0,0 0,0 0,0 2,67 6,0 0,0 18,67 0,0 0,0 0,3 CT8

30 4,0 3,33 3,33 2,67 0,0 3,33 4,67 0,0 21,33 0,0 0,0 0,3 CT9

10 4,67 5,33 0,0 2,67 0,0 4,0 5,33 0,0 22,01 0,0 0,0 0,4 CT10

20 4,0 4,0 2,67 1,33 0,0 2,67 6,0 0,0 20,66 0,0 0,0 0,4 CT11

30 6,0 4,0 0,0 0,0 0,0 0,67 8,0 0,0 18,67 0,0 0,0 0,4 CT12

Bảng 3.22. Tỷ lệ biến dị của các dạng chồi cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Biến dị phát sinh (%)

Dạng Hình thái lá Màu sắc hoa (%) Tổng số Chồi nách chồi (%) phát triển Lá hình ống Lá cuộn H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

0,46 0,20 0,85 0,19 0,04 1,17 0,50 0,02 0,15 4,43 A 0,85

0,33 0,00 0,07 0,00 0,00 0,26 0,70 0,00 0,00 2,06 B 0,44

9 5

0,06 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,09 D 0,00

0,00 0,46 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,63 E 0,00

0,70 0,00 0,00 0,00 0,00 0,35 1,74 0,00 0,00 3,04 F 0,00

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,20 0,00 0,00 0,00 0,20 G 0,00

0,24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,17 0,00 0,00 0,00 0,65 H 0,24

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,07 L 1,07

0,24 0,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,24 0,00 0,00 0,00 N 0,00

3.4.1. Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm

chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng

Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái thân lá,

chồi nách phát triển và mầu sắc hoa), trong đó có 5 dạng biến dị về màu sắc hoa

(H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không xuất hiện khi xử lý EMS. Ở các công

thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian xử lý EMS.

Tuy nhiên ở các công thức xử lý nồng độ cao và thời gian dài, các biến dị về hình

thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về mầu sắc hoa tăng chủ yếu ở dạng H5

(dạng biến dị không có lợi). Trong các công thức thí nghiệm công thức CT7 (xử

lý EMS nồng độ 0,4% trong thời gian 2 giờ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều

nhất (15,99%). Đặc biệt dạng hoa H7 chỉ xuất hiện ở công thức này.

3.4.2. Ảnh hưởng của xử lý tia gamma nguồn 60Cođến tỷ lệ biến dị của cây

cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Khi xử lý tia gamma nguồn 60Co xuất hiện 2 nhóm biến dị (biến dị về hình

thái lá và biến dị về màu sắc hoa), biến dị khả năng phát triển chồi nách mạnh

không xuất hiện. Trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4,

H5, H6), dạng H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý tia gamma nguồn 60Co riêng rẽ. Ở các công thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ có xu hướng tăng khi

tăng liều lượng xử lý từ 10 - 30 Gγ sau đó lại giảm nếu tiếp tục tăng liều lượng

xử lý. Tương tự như khi xử lý bằng EMS ở các công thức xử lý liều lượng cao,

các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tăng chủ yếu ở

dạng H5 (dạng biến dị không có lợi). Tỷ lệ biến dị về mầu sắc hoa thu đươc khi xử lý tia gamma nguồn 60Co thấp hơn so với xử lý bằng EMS. Trong các công

thức thí nghiệm công thức CT3 (xử lý liều 30 Gγ) cho biến dị về màu sắc hoa

nhiều nhất (9,34%). Đặc biệt là dạng hoa H6 chỉ xuất hiện ở công thức này.

3.4.3. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Cođến tỷ lệ

biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma

nguồn 60Co đã làm tăng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ EMS hoặc

gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công thức CT5 (24,66%) và thấp nhất tại

công thức CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma nguồn 60Co cho

kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá, biến dị về phát triển

chồi nách và biến dị về màu sắc hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc

hoa chỉ thu được 5 dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất

hiện. Ở các công thức thí nghiệm số cây biến dị tỷ có xu hướng tăng khi tăng liều

lượng xử lý. Tương tự như khi xử lý riêng rẽ bằng EMS hoặc chiếu xạ gamma

nguồn 60Co, ở các công thức xử lý chiếu xạ liều lượng cao, các biến dị về hình

thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị về hoa tăng chủ yếu ở dạng H5 (dạng

biến dị không có lợi). Sự tác động kết hợp giữa EMS và tia gamma nguồn 60Co đã

làm xuất hiện thêm một dạng biến dị về mầu sắc hoa mới (dạng H3) so với xử lý

riêng rẽ từng tác nhân.

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện các dạng biến dị về mầu sắc hoa

ở các công thức thí nghiệm cũng có sự tương đồng với giai đoạn nuôi cấy in

vitro. Công thức thí nghiệm cho hiệu quả cao ở giai đoạn nuôi cấy in vitro cũng

là công thức cho hiệu quả cao ở giai đoạn ngoài đồng ruộng.

Để tìm hiểu mối quan hệ giữa các dạng chồi biến dị phân lập được sau xử

lý ở giai đoạn nuôi cấy in vitro và các dạng biến dị sau xử lý ở giai đoạn ngoài

đồng ruộng chúng tôi đã theo dõi và phân lập các dạng biến dị từ các dạng chồi

này, kết quả được ghi tại bảng 3.22.

Kết quả cho thấy, các dạng biến dị về màu sắc tập chung chủ yếu ở dạng

chồi A (dạng chồi bình thường), một số ít xuất hiện ở dạng chồi B, F, G, H. Dạng

biến dị H5 chiếm tỷ lệ cao ở dạng chồi F (dạng chồi sinh trưởng phát triển kém).

Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị về hình thái lá và khả năng phát

triển chồi nách mạnh.

3.4.4. Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai

đoạn ngoài đồng ruộng

Về đặc điểm hình thái của một số dạng biến dị về màu sắc hoa ở các chỉ

tiêu khác nhau có sự khác nhau.

Về chiều cao cây: Chiều cao cây của các dạng H1, H3, H4, H6, H7 và

dạng đối chứng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao cây trung bình thấp

hơn (98 ± 9,23 cm) thân lá nhỏ. Qua theo dõi cho thấy trong các giai đoạn phát

triển khác nhau, các cá thể trong các dòng đột biến có tốc độ tăng trưởng tương

tự nhau. Trong giai đoạn chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực, các dòng

bắt đầu có tốc độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình của các dòng

bắt đầu có sự thay đổi. Sự thay đổi chiều cao này liên quan trực tiếp đến các cá

thể có quá trình chuyển biến từ giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng sang giai đoạn

sinh trưởng sinh thực.

Số cặp lá trên thân giữa các dạng biến dị và đối chứng không có sự khác

biệt nhiều, số cặp lá dao động từ 31 đến 37 cặp lá, cao nhất là dạng H2 (37 cặp

lá), thấp nhất là dạng H6 (31 cặp lá). Hình dạng lá của các dòng đột biến không

có sự khác biệt so với đối chứng (hình elip).

Về kích thước hoa khi nở dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3, H4

có kích thước lớn hơn dạng đối chứng và các dạng còn lại.

Về cấu trúc cánh hoa có sự khác biệt: Bề mặt cánh hoa dạng đối chứng,

H4 và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng; Rìa cánh

hoa dạng H2 và dạng H7 có sự khác biệt so với đối chứng và các dạng còn lại

(rìa cánh hoa răng cưa nhẹ, nông). Độ rộng của cánh hoa ngoài cùng của các

dạng đột biến cũng có sự khác nhau, các dạng H2, H3 và H4 có độ rộng trên 3

cm, các dạng còn lại biến động từ 2,1 đến 2,8 cm. Về số lượng nhị ở các dạng

không có sự khác nhau tuy nhiên độ dài của vòi nhị của dạng H1 và dạng H3 dài

hơn. Số lương nhị hoa dao động từ 11 (dòng H5) đến 19 (dòng H1), trong đó

dòng H2, H4, H6 không có sự khác biệt so với giống đối chứng.

Quan quan sát đặc điểm hình thái của các dòng đột biến về mầu sắc (H1,

H2, H3, H4, H5, H6 và H7) cho thấy dòng H2, H6 và H7 có hoa tương đối cân

đối, Thân lá cứng, cây sinh trưởng phát triển tốt.

Bảng 3.23. Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng

Dạng hoa Đ/C H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

Đặc điểm

Chiều cao cây (cm) 114±6,11 107±6,23 121±4,61 113±5,73 118±8,61 98±9,23 115±4,31 116±6,61

Số cặp lá (cặp lá) 35±2,17 30±2,29 37±2,21 34±3,10 36±2,23 30±3,27 34±2,09 36±1,82

Chồi nách Không Không Không Không Có Không Không Không

Tổng độ dài của 7 lóng 31,92±2,61 29,7±3,53 33,8±2,73 31,5±3,23 32,2±3,19 27,94±2,63 30,23 32,15±3,61

9 9

dưới hoa (cm)

Độ dài của lóng thứ 5 6,87±0,65 6,2± 0,69 7,48± 0,73 7,11± 0,71 7,23± 0,89 6,61±0,53 6,96 7,14± 0,78

dưới hoa (cm)

Hình dạng lá Elip Elip Elip Elip Elip Elip Elip Elip

Độ dài của lá tại đốt thứ 7,73± 0,59 7,8± 0,53 7,58± 0,47 7,98± 0,62 8,3± 0,76 6,92±0,65 7,69±0,54 7,86± 0,57

5 dưới hoa (cm)

Chiều rộng lá tại đốt thứ 0,56± 0,05 0,54±0,03 0,61± 0,04 0,59± 0,04 0,54±0,05 0,51±0,04 0,56±0,04 0,58± 0,06

5 ngay dưới hoa (cm)

Dạng hoa Đ/C H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

Đặc điểm

Màu sắc lá Xanh Xanh đậm Xanh Xanh Xanh Xanh vàng Xanh Xanh

Số cánh đài 5 6 5 5 5 5 6 5

Chiều cao của tràng hoa 3,81 ± 0,21 3,6± 0,08 4,3± 0,23 4,1± 0,18 4,7± 0,17 3,12±0,13 3,96±0,22 4,1± 0,16

Độ dài của đài hoa (cm) 2,95 ± 0,04 2,72±0,03 3,27±0,04 3,15±0,02 3,02±0,06 2,67±0,08 2,91±0,03 3,12±0,03

Đường kính hoa (cm) 6,1 ± 0,7 5,23± 0,5 6,85± 0,3 6,72± 0,4 7,1± 0,6 5,2± 0,6 6,3±0,5 6,5± 0,6

1 0 0

Số cánh hoa 61± 2,1 65± 2,7 58± 1,2 56± 2,3 69± 3,2 51± 3,7 58±1,7 60± 2,5

Số lớp cánh hoa 7 7 6 5 6 5 6 5

Bề mặt cánh hoa Gấp nếp Phẳng Phẳng Phẳng Gấp nếp Gấp nếp Phẳng Phẳng

Răng cưa Răng cưa Xẻ thùy Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Rìa cánh hoa sâu sâu nhẹ sâu sâu sâu nông sâu

Độ dài cánh hoa ngoài 5,1 ± 0,24 4,9± 0,06 5,6 ± 0,06 5,2± 0,09 5,5± 0,12 4,7± 0,16 5,0± 0,07 5,1± 0,04

cùng (cm)

Chiều rộng cánh hoa 2,7 ± 0,16 2,4± 0,03 3,3± 0,05 3,1± 0,06 3,4± 0,11 2,1± 0,13 2,6± 0,06 2,8± 0,04

100

Dạng hoa Đ/C H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7

Đặc điểm

ngoài cùng (cm)

Trắng, tím Tím Phấn hồng, Trắng, đỏ Trắng, tím Trắng, tím Hồng, tím Trắng, Màu cánh hoa phấn hồng Tím đỏ

Trắng viền Tím hoàn Phấn hồng Trắng viền Trắng viền Trắng viền Hồng viền Trắng viền

tím ở toàn viền tím đỏ đỏ ở đường tím ở tím nhẹ ở tím phấn hồng

1 0 1

đường viền ở đường viền đường đường ở đường Phân bố màu sắc trên rìa viền, bên viền, cánh viền cánh hoa trong có hoa lớp

sọc tím trong mất

màu tím

16 19 16 14 16 11 16 13 Số lượng nhị

Không Có Không Có Không Không Không Không Sự lồi ra của nhụy

101

Đối chứng Dạng H1

Dạng H2 Dạng H3

Dạng H4 Dạng H5

Dạng H6 Dạng H7

Hình 3.12. Cấu trúc một số dạng biến dị về màu sắc hoa

102

3.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng

bằng kỹ thuật SSR

Kỹ thuật di truyền và công nghệ sinh học đã tạo ra một tiềm năng to lớn

cho công tác chọn tạo giống cây trồng. Việc áp dụng những kỹ thuật ở mức độ

phân tử đã giúp rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả trong công tác chọn và

nhân giống cây trồng. Để đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến

đã gây tạo được, đề tài đã sử dụng 20 cặp mồi SSR để đánh giá sự sai khác di

truyền DNA và hệ số tương đồng di truyền giữa 6 dòng đột biến và giống gốc.

3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Dựa theo phương pháp của Obara and Kako (1998) có cải tiến để tách

chiết DNA tổng số của 7 mẫu cẩm chướng Kiểm tra nồng độ và chất lượng DNA

bằng cách điện di 5 µl dung dịch DNA trên gel agarose 3,5% với thang nồng độ

DNA chuẩn là 25 µg.

Kết quả điện di trên gel agarose 3,5% cho thấy các băng DNA thu được

của các mẫu giống khá gọn và đồng đều chứng tỏ DNA tách chiết đạt độ tinh

sạch cao, không bị gẫy đứt hay lẫn tạp. Mặt khác không thấy những vệt sáng phía

dưới, điều đó chứng tỏ ARN cũng được loại bỏ khỏi dịch tách chiết DNA. Kết

quả điện di cho thấy DNA có nồng độ tương đối cao, chất lượng tốt đủ tiêu chuẩn

để thực hiện các nghiên cứu SSR-PCR.

Hình 3.13. Kết quả điện di DNA tổng số

103

3.5.2. Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi

Để tiến hành phân tích và đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống hoa

cẩm chướng ở mức độ phân tử của 6 dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 và

giống Quận Chúa (ĐC) được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR.

Các sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%.

Tổng số

Bảng 3.24. Thống kê số băng DNA thu được của các mẫu giống cẩm chướng

băng DNA

ĐC H1 H2 H3 H4 H6 H7

Số lượng vạch xuất hiện STT Primer

1 CB003a 1 1 1 6 0 1 1 1

2 CB004a 0 4 3 14 1 1 3 2

3 CB006a 1 1 0 6 1 2 0 1

4 CB011a 2 2 2 14 2 2 2 2

5 CB016a 1 1 1 7 1 2 0 1

6 CB018a 1 1 1 8 1 2 1 1

7 CB020a 0 0 1 5 1 1 1 1

8 CB026a 1 1 1 11 1 3 0 4

9 CB027a 1 1 1 6 1 1 1 0

10 CB041a 1 1 0 5 1 0 1 1

11 CB047a 1 1 0 6 1 1 1 1

12 CB057a 1 1 0 5 1 0 1 1

13 CDB221 1 1 1 7 1 1 1 1

14 CF003a 1 0 1 6 1 1 1 1

15 DCB109 1 1 0 5 0 1 1 1

16 DCB131 2 0 1 7 2 1 0 1

17 DCB134 0 1 0 4 1 0 1 1

18 DCB135 2 2 1 12 2 1 2 2

19 DCB140 1 1 1 6 1 1 1 0

Tổng số băng DNA

20 DCB224 1 2 1 10 1 2 1 2

21 21 23 21 18 22 14 150

104

Kết quả phân tích (bảng 3.24) cho thấy với 140 phản ứng PCR nhân lên

được tổng số 150 băng với kích thước chiều dài nhỏ nhất khoảng 100bp và băng

có kích thước lớn nhất khoảng 1200bp.

3.5.2.1. Kết quả phân tích với mồi CB003a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB003a cho xuất hiện 1 alen với tổng số 5 băng đơn hình của 5 dòng

H1, H2, H3, H4, H6, H7 ở vị trí có kích thước khoảng 200bp. Mẫu ĐC không

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

cho kết quả.

Hình 3.14. Kết quả phân tích với mồi CB003a

3.5.2.2. Kết quả phân tích với mồi CB004a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB004a cho 8 alen với tổng số 14 băng với kích thước khác nhau (nhỏ

nhất là 550bp lớn nhất là 1100bp, trong đó của 2 dòng H4 không cho kết quả, ĐC

cho băng đơn hình ở vị trí có kích thước khoảng 1000bp. Dòng H1, H2, H6, H7

cho kết quả đa hình. Đặc biệt dòng H6 cho 4 alen. Kết quả điện di cho thấy 2

dòng H6 và H7 có sự khác biệt cho 2 băng có kích thước lớn vượt qua cả thang

chuẩn.

105

1000 bp 900 bp

500 bp

100 bp

Hình 3.15. Kết quả phân tích với mồi CB004a

3.5.2.3. Kết quả phân tích với mồi CB006a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB006a cho 3 loại băng với kích thước khác nhau (nhỏ nhất là 150bp

lớn nhất là 220bp, trong đó dòng H1, H7 không cho kết quả, dòng H3 cho băng

1000 bp

500 bp

300 bp

200 bp

100 bp

đa hình, giống ĐC và dòng H2, H6 cho kết quả đơn hình ở vị trí 200bp.

Hình 3.16. Kết quả phân tích với mồi CB006a

3.5.2.4. Kết quả phân tích với mồi CB011a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB011a, kết quả ở cả giống ĐC và 6 dòng đột biến đều xuất hiện 2 alen

với kích thước 200bp và 250bp. Như vậy với mồi CB011a không có sự sai khác

giữa các dòng, giống cẩm chướng nghiên cứu.

106

1000 bp

500 bp

300 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.17. Kết quả phân tích với mồi CB011a

3.5.2.5. Kết quả phân tích với mồi CB016a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB016a cho 3 alen với tổng số 7 băng với kích thước 150bp đến 200bp

1000 bp

500 bp

300 bp

200 bp

100 bp

ở dòng H1 không cho kết quả. Dòng H3 xuất hiện 2 alen.

Hình 3.18. Kết quả phân tích với mồi CB0016a

3.5.2.6. Kết quả phân tích với mồi CB018a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB018a cho 2 alen với tổng số 8 băng với kích thước 150bp và 200bp,

trong đó dòng H3 cho kết quả đa hình đa hình và giống ĐC và dòng H1, H2, H4,

H6, H7 cho băng đơn hình.

107

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.19. Kết quả phân tích với mồi CB018a

3.5.2.7. Kết quả phân tích với mồi DCB134

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB134 cho 2 alen có kích thước 150bp và 200bp với tổng số 4 băng.

Trong đó dòng H1, H2, H6, H7 có cùng một loại băng đơn hình khác với giống

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

ĐC. Dòng H3, H4, H7 không có kết quả.

Hình 3.20. Kết quả phân tích với mồi DCB134

3.5.2.8. Kết quả phân tích với mồi DCB224

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB224 xuất hiện 2 alen với tổng số 9 băng có kích thước 250bp và

150bp. Trong đó dòng H1, H4, H7 có cùng một loại băng đơn hình kích thước

150bp, dòng H2, H3, H6 cho băng đa hình kích thước 250bp và 150bp, giống ĐC

cho băng đơn hình kích thước 250bp.

108

1000 bp

500 bp

300 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.21. Kết quả phân tích với mồi DCB224

3.5.2.9. Kết quả phân tích với mồi DCB109

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB109, kết quả cho 1 alen có kích thước 150bp với tổng số 5 băng đơn

hình. Trong đó giống ĐC và dòng H7 không cho kết quả, dòng H1, H2, H3, H4,

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

H6 cho một băng đơn hình kích thước 150bp.

Hình 3.22. Kết quả phân tích với mồi DCB109

3.5.2.10. Kết quả phân tích với mồi DCB140

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB140, kết quả cho 1 alen có kích thước 100bp với tổng số 5 băng đơn

hình. Trong đó giống ĐC và dòng H1, H2, H3, H4, H6, H7 cho một băng đơn

hình, dòng H2 không cho kết quả.

109

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.23. Kết quả phân tích với mồi DCB140

3.5.2.11. Kết quả phân tích với mồi CB027a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB027a, kết quả xuất hiện 1alen với tổng số 6 băng băng đơn hình với

kích thước khoảng 180bp. Trong đó dòng H2 không cho kết quả, giống ĐC và

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp 100 bp

dòng H1, H3, H4, H6, H7 cho một băng đơn hình kích thước 180bp.

Hình 3.24. Kết quả phân tích với mồi CB027a

3.5.2.12. Kết quả phân tích với mồi CB020a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB020a, kết quả cho 1 alen có kích thước 150bp với tổng số 5 băng đơn

hình. Trong đó giống ĐC và dòng H1, H2, H3, H7 cho một băng đơn hình, dòng

H4 và H6 không cho kết quả.

110

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.25. Kết quả phân tích với mồi CB020a

3.5.2.13. Kết quả phân tích với mồi DCA221

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB221, kết quả cho 1 alen có kích thước khoảng 170bp với tổng số 7

băng đơn hình.

DCB221

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.26. Kết quả phân tích với mồi DCB221

3.5.2.14. Kết quả phân tích với mồi DCB131

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi DCB131 cho kết quả 2 alen có kích thước 700bp và 340bp với tổng số 7

băng. Trong đó giống ĐC và dòng H4 có cùng một loại băng đa hình, dòng H2,

H3, H7 cho băng đơn hình kích thước, dòng H1 và H6 không cho kết quả.

111

1000 bp

700 bp

500 bp

400 bp

300 bp

DCB131

100 bp

Hình 3.27. Kết quả phân tích với mồi DCB131

3.5.2.15. Kết quả phân tích với mồi CB026a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB026a cho kết quả 5 alen có kích thước nhỏ nhất khoảng 200bp và lớn

nhất trên 1000bp với tổng số 11 băng. Trong đó giống ĐC và dòng H6, H7 có

cùng một loại băng đơn hình kích thước 200bp, dòng H2, H3 cho băng đa, dòng

H1 không cho kết quả. Kết quả cũng cho thấy dòng H2, H3 cho băng có kích

thước vượt qua cả thang chuẩn, điều này cho thấy tác nhân gây đột biến đã làm

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

thay đổi rất lớn DNA của 2 dòng này.

Hình 3.28. Kết quả phân tích với mồi CB026a

112

3.5.2.16. Kết quả phân tích với mồi CB047a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB047a, kết quả cho 1 alen có kích thước khoảng 160bp với tổng số 6

băng đơn hình. Trong đó dòng H7 không cho kết quả, giống ĐC và dòng H1, H2,

H3, H4, H6 cho một băng đơn hình.

CB047a

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.29. Kết quả phân tích với mồi CB047a

3.5.2.17. Kết quả phân tích với mồi DCB135

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa với

mồi DCB135 cho kết quả xuất hiện 2 alen với tổng số 12 băng. Trong đó giống ĐC

và dòng H1, H2, H4 và H6 có cùng một loại băng đa hình; dòng H3 cho 1 băng đơn

1000 bp

hình kích thước 140bp, dòng H7 cho băng đơn hình kích thước 200bp.

DCB135

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.30. Kết quả phân tích với mồi DCB135

113

3.5.2.18. Kết quả phân tích với mồi CB057a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB057a, kết quả cho tổng số 5 băng, gồm 1 loại băng đơn hình với kích

1000 bp

thước khoảng 130bp. Trong đó dòng H3 và H7 không cho kết quả.

CB057A

500 bp

200 bp

100 bp

Hình 3.31. Kết quả phân tích với mồi CB057a

3.5.2.19. Kết quả phân tích với mồi CB041a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CB041a, kết quả cho tổng số 5 băng, gồm 1 loại băng đơn hình với kích

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

thước khoảng 150bp. Trong đó dòng H3 và H7 không cho kết quả.

Hình 3.32. Kết quả phân tích với mồi CB041a

114

3.5.2.20. Kết quả phân tích với mồi CF003a

Kết quả điện di sản phẩm PCR của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa

với mồi CF003a, kết quả cho tổng số 6 băng đơn hình với kích thước khoảng

1000 bp

500 bp

200 bp

100 bp

130bp. Trong đó dòng H6 không cho kết quả.

Hình 3.33. Kết quả phân tích với mồi CF003a

3.5.3. Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được xác định dựa vào tần

suất xuất hiện của các băng DNA hay các alen trên mỗi locus SSR. Giá trị PIC

cao tương ứng với locus đó có nhiều alen và số alen xuất hiện cao. Theo Smith et

al. (1997), hệ số PIC được coi như là thước đo tính đa hình của các alen ở từng

locus. Giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình mà còn

liên quan trực tiếp với số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay

nhỏ.

Kết quả cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi chỉ có đơn hình)

đến giá trị cao nhất là 0,83 ở cặp mồi CB004a. Hệ số PIC trung bình của 20 cặp

mồi trên 7 dòng cẩm chướng nghiên cứu là 0,26 cho thấy các locus gen khá đa

dạng.

115

Bảng 3.25. Hệ số PIC của 20 mồi SSR

Số alen xuất Tổng số băng STT Tên mồi Hệ số PIC hiện/mồi DNA/mồi

1 CB003a 6 0,00 1

2 CB004a 14 0,83 8

3 CB006a 6 0,50 3

4 CB011a 14 0,50 2

5 CB016a 7 0,45 1

6 CB018a 8 0,47 2

7 CB020a 5 0,00 1

8 CB026a 11 0,65 5

9 CB027a 6 0,00 1

10 CB041a 5 0,00 1

11 CB047a 6 0,00 1

12 CB057a 5 0,00 1

13 CDA221 7 0,00 1

14 CF003a 6 0,00 1

15 DCB109 5 0,00 1

16 DCB131 7 0,41 2

17 DCB134 4 0,38 2

18 DCB135 12 0,50 2

19 DCB140 6 0,00 1

20 DCB224 10 0,48 2

Tổng số 150 5,17 39

Trung bình 7,5 0,26 1,95

116

3.5.4. Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu

Dòng thuần là nguyên liệu quan trọng để tạo ra các tổ hợp lai có ưu thế lai

cao cũng như có các tính trạng mong muốn khác. Để đánh giá độ thuần về mặt di

truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành phân tích các

kết quả phân tích PCR-SSR dựa trên sự xuất hiện các băng của các mồi phân

tích. Kết quả phân tích (bảng 3.26) cho thấy các dòng, giống nghiên cứu có tỷ lệ

dị hợp tử (H%) thay đổi từ 14,29% đến 29,41%. Tỷ lệ dị hợp tử cao nhất ở dòng

đột biến H3 (29,41%) tiếp theo là dòng H2, H6, H1, H4, ĐC và H7. Tỷ lệ dị hợp

tử thấp nhất ở dòng H7 (14,29%). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình của cả 7 dòng,

giống cẩm chướng nghiên cứu là (21,15%). Kết quả này cho thấy các dòng,

giống cẩm chướng nghiên cứu có độ thuần di truyền rất cao.

Bảng 3.26. Tỷ lệ dị hợp tử của dòng, giống cẩm chướng

Số mồi xuất hiện dị Tỷ lệ dị hợp tử STT Tên dòng, giống hợp tử (H%)

18,75 1 H1 3

27,78 2 H2 5

29,41 3 H3 5

17,65 4 H4 3

23,53 5 H6 4

14,29 6 H7 2

16,67 7 ĐC 3

148,08 Tổng số

21,15 Trung bình

3.5.5. Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm

chướng

Số liệu thu được từ 14 mồi SSR được thống kê và phân tích bằng phần

117

mềm NTSYSpc2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền (bảng

3.27) và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền (hình 3.34).

Bảng 3.27. Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng

ĐC H1 H2 H3 H4 H6 H7

ĐC 1,00000

H1 0,6342 1,00000

H2 0,6585 0,5854 1,00000

H3 0,5854 0,5098 0,5884 1,00000

H4 0,8293 0,7561 0,6829 0,6098 1,00000

H6 0,6585 0,6829 0,7073 0,5366 0,7317 1,00000

H7 0,6098 0,6341 0,5122 0,6341 0,629 0,5122 1,00000

Hình 3.34. Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống cẩm chướng

118

Hệ số tương đồng di truyền của 6 dòng đột biến và giống Quận Chúa dao

động trong khoảng 0,5098 đến 0,8293. Mức sai khác di truyền lớn nhất là cặp

dòng H1-H3 (Hệ số tương đồng di truyển là 0,5098). Cặp giống ĐC và dòng H4

có sự tương đồng di truyền cao nhất (Hệ số tương đồng di truyền 0,8293).

Từ sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm

chướng cho thấy mức độ sai khác di truyền giữa các giống có sự khác nhau. Kết

quả xử lý số liệu cho thấy ở mức tương đồng di truyền khác nhau các dòng, giống

nghiên cứu được phân thành các nhóm khác nhau:

* Ở mức tương đồng di truyền 0,60 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng

thành 2 nhóm:

Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4, H1, H2, H6. Hệ số tương đồng di

truyền giữa các dòng, giống trong nhóm 1 dao động từ 0,6342 đến 0,8298. Hệ số

tương đồng di truyền của các dòng, giống thuộc nhóm 1 với 2 dòng H3 và H7

dao động trong khoảng từ 0,5098 (H1 - H3) đến 0,6098 (ĐC - H7).

Nhóm 2: Dòng H3 và H7 hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 và H7

là 0,6341. Hệ số tương đồng di truyền của các dòng thuộc nhóm 2 với các dòng,

giống khác dao động từ 0,5098 (H3 - H1) đến 0,6341 (H7 - H1).

* Ở mức tương đồng di truyền 0,65 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng

thành 3 nhóm:

Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4, H1, H2, H6. Hệ số tương đồng di

truyền giữa các dòng, giống trong nhóm 1 dao động từ 0,6342 đến 0,8298. Hệ số

tương đồng di truyền của các dòng, giống thuộc nhóm 1 với 2 dòng H3 và H7

dao động trong khoảng từ 0,5098 (H1 - H3) đến 0,6098 (ĐC - H7).

Nhóm 2: Dòng H3, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5098 (H3 - H1) đến 0,6341 (H3 - H7).

Nhóm 3: Dòng H7, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H7 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H7 - H2; H7 - H6) đến 0,6341 (H7 - H1;

H7 - H3).

119

* Ở mức tương đồng 0,70 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng thành 5

nhóm:

Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4. Hệ số tương đồng di truyền giữa

giống ĐC và dòng H4 là 0,8293. Hệ số tương đồng di truyền của các giống ĐC

và dòng H4 với các dòng khác dao động trong khoảng từ 0,5854 (ĐC - H3) đến

0,7317 (H4 - H6).

Nhóm 2: Dòng H1, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H1 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5098 (H1 - H3) đến 0,7561 (H1 - H4).

Nhóm 3: Gồm dòng H2 và H6, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3

và dòng H6 là 0,5366. Hệ số tương đồng di truyền giữa các dòng thuộc nhóm 2

và các dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H2 - H7) đến 0,7317 (H6 - H4).

Nhóm 4: Dòng H3, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5098 (H3 - H1) đến 0,6341 (H3 - H7).

Nhóm 5: Dòng H7, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H7 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H7 - H2; H7 - H6) đến 0,6341 (H7 - H1;

H7 - H3).

* Ở mức tương đồng 0,75 có thể chia 7 dòng, giống cẩm chướng thành 6

nhóm:

Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dòng H4. Hệ số tương đồng di truyền giữa

giống ĐC và dòng H4 là 0,8293. Hệ số tương đồng di truyền của giống ĐC và

dòng H4 với các dòng khác dao động trong khoảng từ 0,5854 (ĐC - H3) đến

0,7317 (H4 - H6).

Nhóm 2: Dòng H1, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H1 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5098 (H1 - H3) đến 0,7561 (H1 - H4).

Nhóm 3: Dòng H2, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H2 - H7) đến 0,7073 (H2 - H6).

Nhóm 4: Dòng H3, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 với các

120

dòng, giống khác dao động từ 0,5098 (H3 - H1) đến 0,6341 (H3 - H7).

Nhóm 5: Dòng H6, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H3 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H6 - H7) đến 0,7317 (H6 - H4).

Nhóm 6: Dòng H7, hệ số tương đồng di truyền giữa dòng H7 với các

dòng, giống khác dao động từ 0,5122 (H7 - H2; H7 - H6) đến 0,6341 (H7 - H1;

H7 - H3).

Kết quả phân tích DNA hoàn toàn phù hợp với sự khác biệt giữa các dòng,

giống được nghiên cứu về mặt hình thái như đặc điểm thân lá, màu sắc, cấu trúc

cánh hoa.

* Kết luận:

Sử dụng 20 cặp mồi SSR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 6 dòng

cẩm chướng đột biến chọn lọc được qua xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác

nhân EMS và chiếu xạ gamma và giống cẩm chướng Quận Chúa kết quả cho thấy:

- Các dòng đột biến đều có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc,

trong đó sự sai khác lớn nhất là dòng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1:

0,5098) và thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293).

- Trong 20 cặp mồi SSR được lựa chọn để nghiên cứu, mồi CB001a,

CDB221 không phân biệt được sự sai khác về mặt di truyền giữa các dòng, giống

hoa cẩm chướng được nghiên cứu. Mồi CB016a chỉ cho sự sai khác giữa mẫu đối

chứng và các dòng khác, không có sự sai khác giữa các dòng biến dị được nghiên

cứu. Mồi DCA221, CB047a, có thể sử dụng để phân biệt dòng H7 với các dòng

khác và đối chứng.

- Cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất là CB004a, CB026a với tổng số

băng thu được tương ứng là 13 và 11. Đặc biệt với cặp mồi này cho kết quả mẫu

H6 và H4 xuất hiện 4 băng.

3.6. Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn

Thực tiễn sản xuất hiện nay, nhân giống hoa cẩm chướng chủ yếu bằng

121

phương pháp giâm cành. Việc nhân giống bằng giâm cành qua nhiều thế hệ, cây

con thường có chất lượng kém, hệ số nhân thấp. Mặt khác ở đồng bằng Bắc bộ,

hoa cẩm chướng mới chỉ được trồng một vụ trong năm. Do đó, việc giữ giống

qua mùa hè trong điều kiện khí hậu không thuận lợi và nhân giống cho vụ sau rất

khó thực hiện (Lê Đức Thảo, 2010). Với sự phát triển vượt bậc của công nghệ

sinh học thực vật, kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in

vitro là biện pháp nhân giống hữu hiệu hữu hiệu với rất nhiều loại cây trồng. Kỹ

thuật này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ được nguyên tính

trạng của cây mẹ, hệ số nhân giống cao, cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sớm

phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc

và dễ khắc phục những điều kiện bất lợi. Các kết quả nghiên cứu cho thấy đối với

mỗi giống, loài cây trồng, các bộ phận cơ quan được đưa vào nuôi cấy khác nhau

thì môi trường nuôi cấy tối ưu có sự khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi

lựa chọn 2 dòng đột biến có màu sắc đẹp và có khả năng sinh trưởng phát triển

tốt được tạo ra từ 2 nguồn gây tạo đột biến khác nhau dòng H6 và dòng H7 để

nghiên cứu nhân giống in vitro.

Dòng H6 Dòng H7

Hình 3.35. Mẫu dòng đột biến được lựa chọn nghiên cứu nhân giống in vitro

3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu

Dựa trên kết quả nghiên cứu phương pháp khử trùng đối với cây cẩm

chướng giống Quận Chúa tại thí nghiệm 1 và kết quả nghiên cứu của các tác giả

(Lê Đức Thảo, 2010) cho thấy sử dụng HgCl2 cho hiệu quả cao trong việc khử

122

trùng mẫu. Vì vậy để tạo tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho nghiên cứu nhân giống

in vtro 2 dòng H6 và H7 trong thí nghiệm này chúng tôi đã nghiên cứu chế độ

khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy khởi động bằng dung dịch HgCl2 0,1%

trong thời gian là: 3 phút, 5 phút, 7 phút, 9 phút và 11 phút tương ứng với các

công thức từ CT1 đến CT5. Sau 4 tuần theo dõi, đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.28).

Bảng 3.28. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sống

Công Thời H6 H7

thức gian Thời Tỷ lệ Tỷ lệ Thời Tỷ lệ Tỷ lệ

khử gian mẫu mẫu mẫu mẫu gian

trùng phát nhiễm sống sống nhiễm phát

(phút) sinh (%) (%) sinh (%) (%)

chồi chồi

(ngày) (ngày)

8,56 3 64,67 60,33 8,33 71,33 56,33 CT1

9,35 5 29,33 77,67 9,33 29,29 71,03 CT2

9,82 7 7,67 76,33 9,67 75,47 8,55 CT3

9 6,67 67,78 13,67 67,11 13,93 7,56 CT4

5,33 53,63 14,33 52,96 14,05 6,63 CT5 11

CV% 2,90 3,40

0,45 0,72 LSD0,05

Kết quả thí nghiệm cho thấy: Từ ngày thứ 7, mẫu bắt đầu có hiện tượng bị

nhiễm nấm và nhiễm khuẩn. Sau ngày thứ 3 tuần, các mẫu đã tương đối ổn định,

không có hiện tượng nhiễm mới. Sau 4 tuần nuôi cấy, số mẫu sống ở mỗi công

thức cho thấy ở công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 9 phút, 11

phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm thấp nhưng tỷ lệ mẫu chết cao (chỉ đạt từ 53,63 đến

67,78%). Vì vậy số mẫu sống sót sau 4 tuần là không cao. Về khả năng bật chồi

ở mỗi công thức: Thời gian khử trùng 3, 5 và 7 phút sau 10 ngày đã xuất hiện

chồi. Thời gian khử trùng 9 và 11 phút sau 2 tuần mới xuất hiện chồi. Về đặc

123

điểm hình thái: chồi ở thời gian khử trùng 3, 5, 7 phút xanh và mập hơn so với

thời gian khử trùng 9, 11 phút. Như vậy chất khử trùng không những có tác động

khử trùng mà còn gây tổn thương bề mặt làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát

triển của các chồi. Trong các công thức thí nghiệm, công thức sử dụng HgCl2 0,1%

trong thời gian 7 phút cho hiệu quả tốt nhất (tỷ lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu

nhiễm chỉ có 7,67%; thời gian phát sinh chồi sớm). Kết quả thí nghiệm cho thấy

giữa 2 dòng đột biến (H6, H7) và giống gốc (Quận Chúa) có sự tương đồng.

3.6.2. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột

biến được tuyển chọn.

Ở giai đoạn nhân nhanh việc xác định được môi trường nuôi cấy và điều

kiện ngoại cảnh thích hợp có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân

nhanh chồi. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng các

tác nhân kích thích sự phân hoá cơ quan mà đặc biệt là phân hoá chồi như nhóm

cytokinin (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Trong thí nghiệm này dựa trên các kết quả nghiên cứu từ thí nghiệm 2 và

của các tác giả (Esmaiel et al., 2013; Lê Văn Tường Huân và Nguyễn Hoàng

Trung Hiếu, 2013) chúng tôi cũng sử dụng hai chất này BA và kinetin ở dạng

đơn chất và kết hợp để xem xét ảnh hưởng của chúng đối với sự sinh trưởng,

phát triển và hình thái các dòng cẩm chướng đột biến in vitro. Sau 4 tuần nuôi

cấy, đo đếm các chỉ tiêu.

H6 và H7 là hai dòng đột biến được tạo ra xử lý đột biến in vitro, trong đó

dòng H7 được tạo ra từ xử lý EMS, dòng H6 được tạo ra khi xử lý bằng chiếu xạ

gamma. Do vậy dòng hoa này có thể có phản ứng rất khác nhau đối với một số chất

kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Kết quả tại bảng 3.30 cho thấy trong

các công thức bổ sung BA và kinetin ở cả hai dòng hệ số nhân chồi đều đạt cao hơn

so với đối chứng. Trên dòng H6, công thức đối chứng có chiều cao chồi cao hơn,

nhưng số chồi ít. Công thức bổ sung 0,5 mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA cho hệ số nhân

chồi cao nhất (2,43). Công thức 4 là thích hợp hơn cho việc nhân nhanh dòng H6 in

vitro. Đối với dòng H7, các công thức bổ sung BA hoặc kinetin đều cho hệ số nhân

124

chồi cao hơn đối chứng, hệ số nhân chồi đạt cao nhất tại công thức 3 (2,83). Như

vây đối với dòng H7, trong các công thức thí nghiệm công thức công thức 3 (bổ

sung 1,0 mg/l kinetin) là thích hợp hơn cho việc nhân nhanh in vitro.

Bảng 3.29. Ảnh hưởng của cytokinin đến sự sinh trưởng phát triển

và hệ số nhân của hai dòng cẩm chướng H6 và H7 (sau 4 tuần theo dõi)

Công BA Kinetin H6 H7

thức (mg/l) (mg/l) Chiều Số lá Hệ số Chiều Số lá Hệ số

cao (lá/ nhân cao (lá/ nhân

chồi chồi) (chồi/ (cm) chồi) (chồi/

(cm) mẫu) mẫu)

0,0 0,0 3,63 5,09 1,83 3,85 4,35 1,59 CT1

1,0 0,0 3,47 4,93 1,94 3,54 4,86 2,08 CT2

0,0 1,0 2,52 4,54 2,10 3,25 5,54 2,83 CT3

0,5 0,5 2,65 4,58 2,43 2,83 5,21 2,07 CT4

CV% 2,40 1,10 2,80 3,4 1,40 5,10

0,15 0,11 0,12 0,23 0,14 0,22 LD0,05

Như vậy có thể thấy rằng do có sự biến đổi về bặt di truyền cho nên sự

cảm ứng của các dòng đột biến đối với chất kích thích sinh trưởng cũng có sự

khác nhau và khác so với giống bố mẹ (giống Quận Chúa).

3.6.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn

chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7

Sau giai đoạn nhân nhanh, chồi in vitro được cấy chuyển sang môi trường

có bổ sung than hoạt tính và α-NAA với nồng độ khác nhau để tạo rễ cho chồi in

vitro. Sau 3 tuần nuôi cấy, đo đếm các chỉ tiêu (bảng 3.30).

Các dòng đột biến có khả năng ra rễ khá tốt trên môi trường có bổ sung

than hoạt tính và α-NAA. Trong đó, ở môi trường chỉ có than hoạt tính, tỷ lệ ra rễ

đạt thấp (97,57% đối với dòng H6; 97,53% đối với dòng H7), còn trên môi

125

trường có bổ sung thêm α-NAA tỷ lệ ra rễ cao hơn. Tuy nhiên kết quả nghiên

cứu cũng cho thấy môi trường tạo rễ tối ưu của 2 dòng H6 và H7 có sự khác nhau

Đối với dòng H6 công thức 2 (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25 mg/l α-

NAA) là tốt nhất đối với sự ra rễ của dòng đột biến này, còn với dòng H7 môi

trường tốt nhất cho sự ra rễ in vitro là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-

NAA. Trên các môi trường này chồi in vitro không chỉ ra rễ thuận lợi mà chồi

sinh trưởng phát triển tốt.

Bảng 3.30. Khả năng ra rễ in vitro của các dòng cẩm chướng H6 và H7 (sau 3 tuần nuôi cấy)

Nồng Nồng độ Thời gian Tỷ lệ Chiều Công Số rễ độ α-NAA ra rễ dài rễ ra rễ thức (rễ/cây) THT(g/l) (mg/l) (ngày) (cm) (%)

11 97,57 0,5 0,00 5,27 1,87 CT1

0,5 0,25 100 6,57 3,44 7 CT2

0,5 0,50 100 5,77 2,89 8 CT3

H6 0,5 0,75 100 5,91 2,95 7 CT4

0,5 1,00 98,50 5,61 2,34 8 CT5

CV(%) 3,10 3,30

0,35 0,17 LSD0,05

0,5 0,00 97,53 6,83 2,22 10 CT1

0,5 0,25 98,60 6,91 2,36 9 CT2

0,5 0,50 100,0 7,37 2,55 8 CT3

H7 0,5 0,75 100,0 8,35 3,48 7 CT4

0,5 1,00 100,0 7,57 2,78 8 CT5

CV(%) 3,20 2,30

0,45 0,12 LSD0,05

3.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh

trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm

Trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của

126

một số loại giá thể địa canh đến khả năng sống, sự sinh trưởng phát triển của cây

cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm.

Bảng 3.31. Ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng

của cây in vitro ngoài vườn ươm (sau 3 tuần)

Công Thành phần H6 H7

Thức Tỷ lệ Chiều Số lá Tỷ lệ Chiều Số lá

sống cao sống cao (lá/cây) (lá/cây)

cây cây (%) (%)

(cm) (cm)

Đất phù sa 83,55 7,84 12,30 82,65 7,85 11,96 CT1

Trấu hun 91,62 8,68 12,68 91,56 8,57 12,55 CT2

Đất + trấu hun (1:1) 95,28 9,35 13,55 95,48 9,12 13,19 CT3

CV% 1,70 1,70 2,50 1,10

0,33 0,49 0,48 0,31 LSD0,05

Sự sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro ngoài vườn ươm thể hiện ở sự

tăng trưởng chiều cao, sự ra lá, màu sắc thân lá. Qua kết quả nghiên cứu chúng

tôi thấy công thức cho tỷ lệ sống cao thì đồng thời cây cũng sinh trưởng phát

triển tốt. Trong các loại giá thể được sử dụng trong phương pháp địa canh thì tốt

nhất là giá thể đất + trấu hun (1:1) đạt tỷ lệ sống 95,82%, chiều cao cây trung

bình 9,35 cm đối với dòng H6 và đạt tỷ lệ sống 95,48%, chiều cao cây trung bình

9,12 cm đối với dòng H7.

Như vậy đối với 2 dòng H6 và H7 khi đưa ra ngoài vườn ươm nên trồng

sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) sẽ giúp cây sinh trưởng tốt, tỷ lệ sống cao.

Kết luận:

Do có sự khác nhau về cấu trúc di truyền nên sự cảm ứng với môi trường

nuôi cấy in vitro giữa dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Để nhân giống in vitro

cho 2 dòng đột biến H6 và H7 nên sử dụng môi trường như sau:

127

Đối với dòng H6: môi trường nhân nhanh phù hợp là MS + 0,5mg/l BA +

0,5 mg/l kinetin; môi trường phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,5 g/l than

hoạt tính + 0,25 mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vườn ươm nên trồng sử dụng giá

thể đất + trấu hun (1:1).

Đối với dòng H7: các môi trường nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh thích

hợp lần lượt là: MS + 1,0 mg/l kinetin và MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l

α-NAA. Khi đưa ra ngoài vườn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + Trấu hun

(1:1).

128

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1) Để nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng giống Quận Chúa nên

sử dụng quy trình nuôi cấy như sau: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong thời

gian 7 phút; giai đoạn nhân nhanh dùng môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l

kinetin; giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh dùng môi trường dinh dưỡng MS có bổ

sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l α-NAA; khi thích ứng cây in vitro trong

điều kiện tự nhiên bằng phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun

(1:1) sẽ cho hiệu quả tốt nhất.

2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia

gamma nguồn 60Co làm giảm khả năng sống, khả năng phát sinh chồi, sự sinh

trưởng của đoạn thân mang mắt ngủ cây cẩm chướng giống Quận Chúa (tỷ lệ

sống giảm so với đối chứng từ 8,89 đến 78,89% khi xử lý bằng EMS; từ 6,67 đến

98,0% khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 8,00 đến 70,66% khi xử

lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.

3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và tia

gamma nguồn 60Co làm làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm chướng nuôi cấy in

vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối chứng khi xử lý bằng EMS; từ 2,67 đến

16,67 lần so với đối chứng khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5

đến 9,24 lần so với đối chứng khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma

nguồn 60Co).

4) Để gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa

đạt hiệu quả cao đối với phương pháp xử lý bằng hóa chất EMS, nồng độ và thời

gian xử lý thích hợp là 0,4% trong thời gian 2 giờ; đối với phương pháp xử lý

chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều hấp thu 30 Gγ; đối với phương

pháp xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma nguồn 60Co nên xử lý EMS nồng độ

0,2% trong thời gian 2 giờ kết hợp chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co với liều hấp

129

thu 20 Gγ. Trong các phương pháp gây tạo đột biến in vitro được nghiên cứu,

phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng hóa chất EMS cho hiệu quả tốt

hơn, cho tỷ lệ biến dị cao và xuất hiện nhiều biến dị có tiềm năng.

5) Đề tài đã chọn lọc được 6 dòng đột biến về màu sắc có tiềm năng phát

triển thành giống mới (dòng H1, H2, H3, H4, H6 và H7). Đánh giá sự sai khác di

truyền các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR cho thấy, các dòng đột biến về

màu sắc có sự khác biệt về mặt di truyền so với giống gốc không xử lý đột biến.

Trong đó dòng H3 có sự sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền

H3 - H1: 0,5098) và sự sai khác di truyền thấp nhất là dòng H4 (hệ số tương đồng

di truyền H4 - ĐC: 0,8293).

6) Do có sự khác nhau về cấu trúc di truyền nên sự cảm ứng với môi

trường nuôi cấy in vitro giữa dòng H6 và H7 có sự khác nhau. Để nhân giống in

vitro cho 2 dòng đột biến H6 và H7 nên sử dụng môi trường như sau:

Đối với dòng H6: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong thời gian 7

phút; môi trường nhân nhanh phù hợp là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l kinetin;

môi trường phù hợp để tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25

mg/l α-NAA. Khi đưa ra ngoài vườn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu

hun (1:1).

Đối với dòng H7: Khử trùng mẫu dùng HgCl2(0,1%) trong thời gian 7

phút ; các môi trường nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh thích hợp lần lượt là:

MS + 1,0 mg/l kinetin và MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Khi

đưa ra ngoài vườn ươm nên trồng sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1).

2. Đề nghị

1) Bổ sung kết quả nghiên cứu nuôi cấy in vitro vào quy trình vi nhân

giống cây hoa cẩm chướng.

2) Ứng dụng các dòng đột biến đã gây tạo được vào công tác chọn giống

hoa cẩm chướng.

3) Mở rộng phổ xử lý EMS cho các giống khác nhau để tìm được chế độ

xử lý thích hợp cho từng giống nhằm tạo nguồn vật liệu cho ý nghĩa cho công tác

chọn tạo giống cây cẩm chướng.

130

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý đột biến

in vitro bằng chiếu xạ gamma đối với cây hoa cẩm chướng (Dianthus

caryophyllus L.), Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Công

nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 2: Công nghệ sinh học Vi sinh,

công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ: 817

- 821.

2. Vũ Hoàng Hiệp và Nguyễn Thị Lý Anh (2013). Ảnh hưởng của xử lý đột biến

in vitro bằng Ethyl methane sulphonate (EMS) kết hợp chiếu xạ tia

gamma đến sự biến dị ở cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.),

Tạp chí Khoa học phát triển, 8: 1092 - 1100.

131

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà và Vũ Hoàng Hiệp (2009a). Ảnh hưởng của xử lý ethyl methane sunphonate đối với cây cẩm chướng in vitro, Tạp chí Khoa học phát triển, 2: 130-136.

2. Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà và Vũ Hoàng Hiệp (2009b). Ảnh hưởng của xử lý Ethylmethane sunphonate đối với cây cẩm chướng in vitro, Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009, Công nghệ sinh học phục vụ Nông - Lâm nghiệp, Thủy sản, Công nghiệp, Y - Dược và bảo vệ môi trường, Tháng 11/2009, NXB Đại học Thái Nguyên: 36- 40.

3. Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Hà Hồng Linh và Lê Thị Thuỳ (2009c). Ảnh hưởng của xử lý tia gamma in vitro đối với cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), Tuyển tập Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hạt nhân Toàn Quốc lần thứ VIII, Tháng 8/2009, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 20-22.

4. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hân và Nguyễn Quang Thạch (2010). Nghiên cứu nhân giống hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) bằng kỹ thuật khí canh, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2: 14 – 18.

5. Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Hồ Thị Thu Thanh, Nguyễn Thị Hân, Nguyễn Thị Thanh Phương và Lê Trọng Dân (2011a). Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm sinh học của một số dòng cẩm chướng đột biến phóng xạ, Tuyển tập Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hạt nhân Toàn Quốc lần thứ IX, Tháng 8/2011, NXB Khoa học và Kỹ thuật: 703-708.

6. Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Hồ Thị Thu Thanh và Vũ Hoàng Hiệp (2011b). Hiệu quả xử lý EMS in vitrro đối với cây hoa cẩm chướng (D.caryophyllus L), Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 4: 28-34.

7. Đào Thị Thanh Bằng, Nguyễn Hữu Đống, Mai Ngọc Toàn, Khuất Hữu Trung, Nguyễn Mỹ Giang và Ngô Hữu Tình (1997). Nghiên cứu hiệu quả của việc xử lý Ethylmethanesulphonate (EMS) trên ngô giống thế hệ M1 và M2, Kết quả nghiên cứu khoa học 1997-1998, Viện Di truyền nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 240-245.

8. Đào Thị Thanh Bằng, Phạm Thị Liên, Nguyễn Kim Lý, Lê Thị Liễu, Nguyễn Phương Đoài, Vũ Thị Hằng và Nguyễn Thị Hồng Nhung (2007). Nghiên cứu chọn giống ở một số loài hoa thông qua chiếu xạ in vitro, Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp: 165-174.

9. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007). Chọn giống cây trồng phương pháp

truyền thống và phân tử, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 502 tr.

10. Khuyết danh (2007). Kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành của tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) tăng mạnh, Bản tin thị trường thế giới của Rau hoa quả Việt Nam ngày

A. Tài liệu tiếng Việt

132

từ http://www.rauhoaquavn.vn/

27/01/2007, Truy cập ngày 30/9/2010 default.aspx?tabID=5&ID=5&LangID=1&NewsID=882&PageNum=24.

15/03/2011

ngày

11. Khuyết danh (2010). Xuất khẩu rau hoa quả sang thị trường Nhật Bản ước đạt 11,3 triệu USD, Bản tin thị trường của Rau hoa quả Việt Nam ngày 04/5/2010, Truy cập http://www.rauhoaquavietnam.vn/ từ default.aspx?ID=11&LangID=1&tabID=1&NewsID=5306.

12. Lê Sỹ Dũng, Nguyễn Xuân Linh và Phùng Thanh Thuỷ (2001). Hoàn thiện qui trình nhân giống in vivo và in vitro hoa cẩm chướng, Kết quả nghiên cứu khoa học 2000 – 2001, Viện Di truyền Nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

13. Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc (2005). Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập

cao, NXB Lao động - Xã hội: 3-10.

14. Lâm Hồng Hải, Nguyễn Văn Kết và Nguyễn Văn Vinh (1997). Nhân giống cẩm chướng mới nhập nội bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tạp chí Nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, 12: 547-548.

15. Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (2008). Quy phạm khảo nghiệm

tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định, ECAP II, 24 tr.

16. Huy Hoàng (2013). Nông dân tiếp cận công nghệ cao trồng hoa xuất khẩu, Bản tin kinh tế của Hội Nông dân Việt Nam ngày 30/9/2013, Truy cập ngày 25/10/2013 http://www.hoinongdan.org.vn/index.php/kinh-te/trong-nuoc/6257-đà-lạt- từ nông-dân-tiếp-cận-công-nghệ-cao-trồng-hoa-xuất-khẩu.html.

17. Phạm Thành Hổ (2010). Di truyền học, NXB Giáo dục, Hà Nội, 616 tr.

18. Lê Văn Tường Huân và Nguyễn Hoàng Trung Hiếu (2013). Tối ưu hóa khả năng tạo cụm chồi cho nhân nhanh in vitro ở cây hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L., Báo cáo khoa học Proceedings, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 2: Công nghệ sinh học Vi sinh, công nghệ sinh học Thực vật, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ: 836- 840.

19. Nguyễn Thị Kim Lý (2009). Giáo trình Hoa, cây cảnh, NXB Nông nghiệp, Hà Nội:

158-163.

20. Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Đức Thảo và Nguyễn Xuân Linh (2012). Kỹ thuật trồng và

chăm sóc cây hoa cẩm chướng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 52 tr.

21. Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé (2006). Phân loại học thực vật, NXB Giáo dục Hà

Nội, 393 tr.

22. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Thị Kim Thanh, Mai Thị Kim Tân, Nguyễn Thị Lý Anh và Hoàng Minh Tấn (1996), Nghiên cứu xây dựng qui trình vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế (chuối, dứa, cẩm chướng, loa kèn, khoai tây), Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật nông nghiệp 1956 – 1996, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 49-57.

23. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Thị Phương Thảo (2005).

Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 164 tr.

24. Lê Đức Thảo, Nguyễn Xuân Linh và Lê Sỹ Dũng (2004). Kết quả đánh giá một số giống Cẩm chướng nhập nội, Tạp chí Khoa học - Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 7: 960-962.

133

25. Lê Đức Thảo, Hoàng Ngọc Thuận, Nguyễn Thị Kim Lý, Hoàng Xuân Lam và Nguyễn Viết Dũng (2008). Kết quả nghiên cứu và tuyển chọn một số giống cẩm chướng đơn (Standard carnation) nhập nội tại Sapa - Lào Cai, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, số 2: 31-36.

26. Lê Đức Thảo, Hoàng Ngọc Thuận, Nguyễn Thị Kim Lý và Nguyễn Tuấn Phong (2009a). Kết quả nghiên cứu và tuyển chọn một số giống cẩm chướng chùm (Spray carnation) nhập nội tại Sapa - Lào Cai, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2: 13-18.

27. Lê Đức Thảo, Hoàng Ngọc Thuận, Nguyễn Thị Kim Lý và Trần Hoài Hương (2009b). Nghiên cứu quy trình nhân giống hoa cẩm chướng SP25 (Dianthus caryophyllus Make up) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2: 76-82.

28. Lê Đức Thảo và Nguyễn Thị Kim Lý (2009). Ứng dụng kỹ thuật chiếu xạ in vitro bằng tia Gamma trong chọn tạo giống hoa cẩm chướng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 9: 9-13.

29. Lê Đức Thảo (2010). Nghiên cứu chọn tạo và một số biện pháp nhân giống cây hoa Cẩm chướng (Dianthus Cariophylus L.), Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 159 tr.

30. Nguyễn Tiến Thịnh và Lê Văn Thức (2007). Sử dụng kỹ thuật nuối cấy in vitro trong phân lập đột biến ở cây trồng nhân giống sinh dưỡng, Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh: 155 - 163.

31. Nguyễn Mai Thơm, Trần Tú Ngà, Vũ Văn Liết và Nguyễn Xuân Cử (2008). Kết quả tạo giống hoa hồng đột biến bằng xử lý tia gamma Co60, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 8: 23-28.

32. Trung tâm Dữ liệu thực vật Việt Nam (2007). Cơ sở dữ liệu thực vật, Bài viết về Caryophyllaceae của Botany Vietnam Group, Truy cập ngày 15/08/2011 từ http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Caryophyllaceae&list=familia.

B. Tài liệu tiếng nước ngoài

33. Aamir Ali, Humera Afrasiab, Shagufta Naz, Mamoona Rauf and Javed Iqbal (2008). An efficient protocol for in vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus), Pakistan Journal of Botany, 40 (1): 111-121.

34. Ahloowalia, B.S. and Maluszynski, M. (2001). Induced mutations - A new

paradigm in plant breeding, Euphytica, 118: 167-173.

35. Aparna Pareek, Archana Kantia and Kothari, S.L. (2004). In vitro cloning

ornamental species of Dianthus, Indian Journal of Biotechnology, 3: 263-266

36. Arani, A. and Majidi, M.M. (2004). Study of induced mutation via ethyl methane sulfonate (EMS) in sainfoin (Onobrychis viciifolia Scop), Agricultral Sciences and Techology, 18 (2): 167-180.

134

37. Archana Kantia and Kothari, S.L. (2002). High efficiency adventitious shoot bud formation and plant regeneration from leaf explants of Dianthus chinensis L., Scientia Horticulturae, 96: 205-212.

38. Barakat, M.N. and Heba El-Sammak (2011). In vitro culture and plant regeneration from shoot tip and lateral bud explants of Gypsophila paniculata L., Australian Journal of Crop Science, 5(2): 214-222.

39. Barakat, M.N., Abdel, F.R.S., Badr, M. and El-Torky, M.G. (2010). In vitro culture and plant regeneration derived from ray florets of Chrysanthemum morifolium, Afr. J. Biotechnol, 9.

40. Behrens, B. and Karber, C. (1935). Wie sind reihenwersuche fur bilogishe auswertungen am zweckmassigsten anzuorden, Arch Exp Path Pharmakol, 177: 379-388.

41. Beneditti, L. de, Burchi, G., Bruna, S., Mercuri, A. and Schiva, T. (2003). Use of molecular markers to improve cut flowers longevity in carnation, Acta Hort, 624: 343-348.

42. Benedetti, L. de, Bruna, S., Mercuri, A., Burchi G., Pecchioni, N., Bianchini, C., and Schiva, T. (2006). Molecular markers to improve flower vase life in carnation (Dianthus caryophyllus), Italus Hortus, 13(5): 141-145.

43. Bora, A., Singh, S., Talukdar, M.C. and Hazarika, B.N. (2007). An efficient method for in vitro plant regeneration in carnation, Indian Journal of Horticulture, 64(4): 439-443.

44. Casanova, E., Moysset, L. and Trillas, M.I. (2008). Effects of agar concentration and vessel closure on the organogenesis and hyperhydricity of adventitious carnation shoots, Biologia Plantarum, 52(1): 1-8.

45. Cassells, A.C., Walsh and Periappuram, C. (1993). Diplontic selection as a positive factor indetermingning the fitness of mutants of Dianthus “Mystère” derived from x-irradiation of nodes in in vitro culture, Euphytica, 70: 167-174.

46. Chahal, G.S. and Gosal, S.S (2002). Principles and Procedures of Plant Breeding,

Alpha Science International, India, 695 p.

47. Chakrabarty, D. and Datta, S. (2010). Application of RAPD markers for characterization of γ-ray-induced rose mutants and assessment of genetic diversity, Plant Biotechnology Reports, 4(3): 237-242.

48. Chopra, V.L. (2005). Mutagenesis: Investigating the process and processing the

outcome for crop improvement, Current Science, 89(2): 353- 359.

49. Cox -RJ. (1987). Carnation production in Kenya, Acta - Horticulturae, 216: 43.

50. Datta, S.K., Misra, P. and Mandal, A.K.A. (2005). In vitro mutagenesis - a quick method for establishment of solid mutant in Chrysanthemum, Current Science, 88 (1): 155-158.

51. Datta, S.K. and Chakrabarty, D. (2009). Management of Chimera and In vitro Mutagenesis for Development of New Flower Color/Shape and Chlorophyll Variegated Mutants in Chrysanthemum, Induced Plant Mutations in the Genomics Era, Food and Agriculture Organization of the United Nations: 303-305.

135

52. Esmaiel, Abdullah Abdlulaziz Al-Doss and Mohamed Najeb Barakat (2013). An assessment of in vitro culture and plant regeneration from leaf base explants in carnation (Dianthus caryophyllus L.), Journal of Food, Agriculture and Environment, 11(1):1113-1117.

53. FAO/IAEA (2008). Database of mutant varieties and genetic stock, Truy cập ngày

15/09/2011 từ http://mvgs.iaea.org.

54. Flickriver (2012). Interesting, Hình ảnh hoa cẩm chương của Flickriver, Truy cập ngày 25/07/2012 từ http://www.flickriver.com/photos/tags/%E7%9F%B3%E7% AB%B9%E7%A7%91/interesting.

55. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2008). Plant

Mutation Reports 2008.

56. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2009). Plant

Mutation Reports 2009.

57. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2010). Plant

Mutation Reports 2010.

58. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2011). Plant

Mutation Reports 2011.

59. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2012). Plant

Mutation Reports 2012.

60. Food and Agricultrural Organic, International Atomic Energy Agency (2013). Plant

Mutation Reports 2013.

61. Galbally, J. and Galbally, E. (1997). Carnations and pinks for garden and

greenhouse, Timber Press, Portland, Oregon, USA: 1-310.

62. Gamborg and Philips (1995). Plant cell, tissue and Organ culture - Fundamental

methods, Springer- Verlag Berlin Heidelberg: 35-37.

63. Gharge Chandrakant Pralhad

(2009), Evaluation of carnation

(Dianthus

caryophyllus) varieties under green house condition, Horticulture, 54p.

64. Gulay Babadogun (2009). Cut flowers preme Ministry Undercecretariat for Foreign

Trade, Export promotion Centre, 21p.

65. Haberlandt, G.

(1902). Kulturversuche mit

isolierten Pflanzenzellen, Sitzungsberichte Akademie der Wissenschaften Wien, Mathematisch Naturwissenschaftliche Classe 111, Abt, 1: 69-92.

66. Ibrahim, R. and Debergh, P.C. (1998). Introduction of in vitro mutagenesis in Roses (Rosa hybrida L.) using X-ray radiation, Proceedings FLTBW 4th Symposium, 7 October, 1998.

67. International Atomic Energy Agency (2008). IAEA Annual Reports 2008.

68. International Atomic Energy Agency (2009). IAEA Annual Reports 2009.

69. International Atomic Energy Agency (2010). IAEA Annual Reports 2010.

70. International Atomic Energy Agency (2011). IAEA Annual Reports 2011.

71. International Atomic Energy Agency (2012). IAEA Annual Reports 2012.

136

72. International Atomic Energy Agency (2013). IAEA Annual Reports 2013.

73. Jawaharlal (2005). A technical guide on carnation National Agricultural Innovation

project, Icar, New Delhi, 62p.

74. Jain, S.M. (2010). In vitro Mutagenesis in Banana (Musa spp.) Improvement, Acta

Hort, 879: 605-618.

75. Joanna Jankowicz-Cieslak, Owen, A. Huynh, Marta Brozynska, Joy Nakitandwe and Bradley J. (2012). Till Induction, rapid fixation and retention of mutations in vegetatively propagated banana, Plant Biotechnology Journal, 10: 1056–1066.

76. Jurgens, A., Witt, T. and Gottsberger, G. (2003). Flower scent composition in Dianthus and Saponaria species, Biochemical Sytematics and Ecology, 31: 345- 357.

77. Koji Tanase, Chikako Nishitani, Hideki Hirakawa, Sachiko

Isobe, Satoshi Tabata, Akemi Ohmiya and Takashi Onozaki (2012). Transcriptome analysis of carnation (Dianthus caryophyllus L.) based on next - generation sequencing technology, BMC Genomics, 5: 2-11.

78. Kuzin, A.M. and S.S. Yurov (1968). Mutagenic effects of radiotoxins,

Radiobiologya, 456p.

79. Lee, S.Y., Yae, B.W. and Kim, K.S. (2005). Segregation patterns of several morphological characters and RAPD markers in interspecific hybrids between Dianthus giganteus and D. carthusianorum, Scientia Horticulturae, 105: 53-64.

80. Le Quang Luan, Nguyen Huynh Phuong Uyen and Vo Thi Thu Ha (2012). In vitro radiation, Scientia

ionization

mutation breeding of Paphiopedilum by Horticulturae, 144: 1- 9.

81. Luan, Yu-Shi, Zhang, Juan, Gao, Xiao-Rong, An and Li-Jia (2007). Mutation induced by ethylmethanesulphonate (EMS), in vitro screening for salt tolerance and plant regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas L.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 88 (1): 77-81.

82. Mahdiyeh Kharrazi, Hossein Nemati, Ali Tehranifar, Abdolreza Bagheri and Ahmad Sharifi (2011). In vitro Culture of Carnation (Dianthus caryophyllus L.) Focusing on the Problem of Vitrification, Journal of Biological and Environmental Sciences, 5(13): 1-6.

83. Maluszynski, K.N., Zanten, L.V. and Ahlowalia, B.S. (2000). Officially released mutant varieties, The FAO/IAEA Database, Mut. Breed. Rev, 12: 1-12.

84. Manreet Sooch, Arora, J.S., Kushal Singh and Gosal, S.S. (2002). Effect of Gamma ray irradiation on in vitro multiple shoot formation and establishment of carnation plants, Journal of Ornamental Horticulture (New Series), 3( 2): 118- 119, 3 ref.

85. Mehta Rupali, Sharma Sarita and Nath Amarjit, K. (2007). In vitro selection and Biochemical characterization of Carnation (Diathus caryophyllus L.) callus culture tolerant to alternaria dianthi, Indian Journal of Plant Physiology, 12(2): 120-126.

86. Meena Wankhade, Shanti Patil, Nitin Solao, Renuka Naik and Pinki Kumari (2006).

137

In vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus L.), Annals of Plant Physiology, 20(1): 29-34, 7 ref.

87. Mohan Jain, S. (2010). Mutagenesis in crop improvement under the climate change,

Romanian Biotechnological Letters, 15(2) : 88-106.

88. Mosquera, T., Rodriguez, L.E., Parra, A. and Rodriguez, M. (2009). In vitro adventive regeneration from carnation (Dianthus caryophyllus) anthers, Acta Horticulturae, 482: 156-162.

89. Muhamad Fahmi Yunus, Maheran Abd Aziz, Mihdzar Abdul kadir, Siti Khalijah Daud and Azmi Abdul Rashid (2013). In vitro Mutagenesis of Etlingera Elatior (Jack) and Early Detection of Mutation using Rapd Markers, Turk J Biol, 37: 716-725.

90. Murashige and Skoog, F. (1962). Arevised medium for rapid growth and bioassays

with tobaco tissue culture, Physiol plant, 15: 473 – 497.

91. Nakayama, M., Tanikawa, N., Morita, Y. and Ban, Y. (2012). Comprehensive analyses of anthocyanin and related compounds to understand flower color change in ion-beam mutants of cyclamen (Cyclamen spp.) and carnation ( Dianthus caryophyllus), Plant Biotechnology, 29:215–221.

92. Nakagawa, H. (2008). Mutation breeding, status quo and future, Techno Innovation,

Japanese, 68: 6-12.

93. Nei, M. (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations, Proc Natl

Acad Sci, 70: 3321-3323.

94. Novak, F.J. and Brunner, H. (1992). Plant breeding: Induced mutation technology

for crop improvement, IAEA Bulletin, 4: 25-33.

95. Obara Okeyo, P. and Kako (1998). Genetic diversity and identification of cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers, Euphytica, 99 (2): 95-101.

96. Office of the Gene Technology Regulator (2005). The Biology and Ecology of Dianthus caryophyllus L. (Canation), Office of the Gene Technology Regulator, Australia, 18p.

(2006). Advances of mutagenesis

flowers and

97. Okamura, M., Tanaka, A., Momose, M., Umemoto, N., Teixeira da Silva, JA. and their Toguri, T. industrialization, In: Da Silva JAT (Ed) Floriculture, ornamental and plant biotechnology, Global Science Books, Isleworth, Middlesex, UK, 1: 619-628.

98. Omid Karami (2011). Induction of Embryogenic Callus and Plant Regeneration in Carnation (Dianthus caryophyllus L.), Journal of Biological Sciences, 8 (4): 68- 72.

99. Orkun Yaycili and Sema Alikamanoglu (2011). Induction of salt - tolerant potato (Solanum tuberosum L.) mutants with gamma irradiation and characterization of genetic variations via RAPD-PCR analysis, Turk J Biol, 36: 405-412.

100. Predieri, S. and Di virgilio, N. (2007). In vitro mutagenesis and mutant multiplication, In: Protocols for micropropagation of woody trees and fruits, Jain, S.M., Haggman, H. (eds), Springer: 323 – 333.

138

101. Reed, L.J. and Muench, H. (1938). A simple method of estimating fifty per cent

endpoints. Amer J. Hygienne, 27: 493–497.

102. Roychowdhury, R. and Jagatpati Tah, (2011a). Chemical mutagenic action on seed germination and related agro- metrical traits in M1 Dianthus generation, Current Botany, 2(8): 19-23.

103. Roychowdhury, R. and Jagatpati Tah (2011b). Mutation breeding in Dianthus caryophyllus for economic traits, Electronic Journal of Plant Breeding, 2(2):282- 286.

104. Roychowdhury, R., Jagatpati Tah, Tinkari Dalal and Abhijit Bandyopadhyay, (2011a). Selection response and correlation studies for metrical traits in mutant carnation (Dianthus caryophyllus L.) genotypes, Continental J. Agricultural Science, 5 (3): 6-14.

105. Roychowdhury, R., Sultana, P. and Tah, J. (2011b). Morphological architecture of foliar stomata in M2 carnation (Dianthus caryophyllus L.) genotypes using scanning electron microscopy (SEM), Electronic J Plant Breed, 2(4):583–588.

106. Sayeed Hassan, A.K.M., Munshi, J.L., Sultana, R., Jahan, M.A.A. and Khatun, R. (2011). High Frequency In vitro Regeneration of Dianthus caryophyllus L., A Herbaceous Perennial Ornamental Plant, Bangladesh J. Sci. Ind. Res, 46(4): 495- 498.

107. Sato, S., Katoh, N., Yoshida, H., Iwai, S. and Hagimori, M. (2000). Production of (Dianthus caryophyllus L.) by

doubled haploid plants of carnation pseudofertilized ovule culture, Scientia Horticulturae, 83: 301-310.

108. Shin Watanabe, Tsuyohi Mizoguchi, Koh Aoki, Yasutaka Kubo, Hitoshi Mori, Shunsuke Imanishi, Yamazaki, Daisuke Shibata and Hiroshi Ezura (2007). Ethylmethanesunlfonate (EMS) mutagenesis of Solanum lycopersicum cv. Micro - Tom for large-scale mutant screens, Plant Biotechnology, 24: 33- 38.

109. Shu, Q.Y (2009). Induced Plant Mutations in the Genomics Era, Food and

Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 460 p.

110. Scovel, G., Ben-Meir, H., Ovadis, M., Itzhaki, H. and Vainstein, A. (1998). RAPD and RFLP markers tightly linked to the locus controlling carnation (Dianthus caryophyllus) flower type, Theor Appl Genet, 96: 117-122.

111. Seetohul, S., Maunkee, V. and Gungadurdoss, M. (2009). Induced Plant Mutations in the Genomics Era, Food and Agriculture Organization of the United Nations: 296-299.

112. Seo JinWook, Kim Suk Weon, Min Sung Ran and Liu, J.R. (2007). High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration in root explant cultures of carnation, Plant Biotechnology Reports, 1(2): 67-70.

113. Si Yong Kang (2009). Research Division for Food Irradiation and Radiation Breeding, 13th International Conference on Accelerator and Beam Utilization, Gyeongju, Korea, 38p.

114. Singh, K.R., Singh, B., Raghava, S.P.S. and Kalia, C.S. (2000). Induced flower colour mutation in carnation through in vitro application of chemical mutagen, Indian Journal of Genetics and Plant Breeding, 60: 535-539.

139

115. Smulders, M.J.M., Noordijk, Y., Rus-Kortekaas, W., Bredemeijer, B. and Vosman (2003). Microsatellite genotyping of carnation varieties, Theor Appl Genet, 106: 1191-1195.

116. Suprasanna, P., Patade, V.Y., Vaidya1, E.R. and Patil, V.D. (2009). Radiation Induced In vitro Mutagenesis, Selection for Salt Tolerance and Characterization in Sugarcane, Induced Plant Mutations in the Genomics Era, Food and Agriculture Organization of the United Nations: 145-147.

117. Takashi Onozaki, Natsu Tanikawa, Mitsuyasu Taneya, Kiyofumi Kudo, Takuya Funayama, Hiroshi Ikeda and Michio Shibata (2004). A RAPD-derived STS marker is linked to a bacterial wilt (Burkholderia caryophylli) resistance genein carnation, Euphytica, 138: 255-262.

118. Takashi Onozaki, Tsutomu Yoshinari, Tadahisa Yoshimura, Masafumi Yagi, Satoshi Yoshioka, Mitsuyasu Taneya and Michio Shibata (2006). DNA Markers Linked to a Recessive Gene Controlling Single Flower Type Derived from a Wild Species Dianthus capitatus sp., Hort. Res. (Japan), 5 (4): 363-367.

119. Tejaswini, Sona Chowdury, Paramesh, H. and Neeraj Tripathi (2006). In vitro approaches for chemical mutagenesis in carnation (Dianthus caryophyllus), Indian J. Genet, 66(1): 71 – 72.

120. Tetsuya Kimura, Masafumi Yagi, Chikako Nishitani, Takashi Onozaki, Yoshiyuki Ban and Toshiya Yamamoto (2009). Development of SSR Markers in Carnation (Dianthus caryophyllus), J. Japan. Soc. Hort. Sci, 78: 115–123.

121. Thiranjan Gowda, B. (2005). Study on cultivation and marketing pattern of Selected in Belghum District, University of Agricultural Sciences Dharwad, 162 p.

(Dendranthema

grandiflora

Tzvelev)

122. Tulmann Neto, A., Latado, R.R. and Adames, A.H. (2004). In vitro mutation of chrysanthemum with ethylmethanesulphonate (EMS) in immature floral pedicels, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 77 (1): 103-106.

123. Yagi, M., Onozaki, T., Taneya, M., Watanabe, H., Yoshimura, T., Yoshinari, T., Ochiai, Y. and Shibata, M. (2006). Construction of a genetic linkage map for the carnation by using RAPD and SSR markers and mapping quantitative trait loci (QTL) for resistance to bacterial wilt caused by Burkholderia caryophylli, J. Japan, Society of Horticultural Science, 75: 166–172.

124. Yagi. M., Kimura, T., Yamamoto, T., Isobe, S., Tabata, S. and Onozaki, T. (2012). QTL analysis for resistance to bacterial wilt (Burkholderia caryophilli) in carnation (Dianthus caryophyllus) using an SSR-based genetic linkage map, Mol Breeding, 30: 495-509.

125. Yang Xiaohan, Liu Guangshu and Zhu Lu (1998). Cut flower production in China,

FAO, Bangkok, Thailand.

126. Youbo Su (2004). RAPD Identification of Different Carnation Cultivars, Acta

Horticulturae Sinica, 31: 109-111.

140

PHỤ LỤC Phụ lục 1 Một số hình ảnh minh họa của luận án

Cây cẩm chướng trồng trên giá thể đất + trấu hun

Cây cẩm chướng trồng trên hệ thống khí canh

Cây cẩm chướng trồng tại nhà lưới

141

Phụ lục 2

Số liệu xử lý thống kê ở một số chỉ tiêu chính

1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu BALANCED ANOVA FOR VARIATE MAUNHIEM FILE KHUTRUNG 1/ 10/13 16:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 MAUNHIEM NHIE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 595.778 119.156 178.73 0.000 2 * RESIDUAL 12 8.00000 .666666 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 603.778 35.5163 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE MAUSONG FILE KHUTRUNG 1/ 10/13 16:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 MAUSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 392.000 78.4000 19.60 0.000 2 * RESIDUAL 12 48.0000 4.00000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 440.000 25.8824 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TGPSC FILE KHUTRUNG 1/ 10/13 16:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 TGPSC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 56.7200 11.3440 51.56 0.000 2 * RESIDUAL 12 2.64000 .220000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 59.3600 3.49176 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KHUTRUNG 1/ 10/13 16:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS MAUNHIEM MAUSONG TGPSC CT1 3 22.0000 71.3333 8.93333 CT2 3 11.3333 74.6667 9.73333 CT3 3 8.00000 68.6667 11.6667 CT4 3 24.0000 61.3333 8.46667 CT5 3 17.3333 69.3333 11.1333 CT6 3 12.6667 62.6667 13.6667

142

SE(N= 3) 0.471404 1.15470 0.270801 5%LSD 12DF 1.45256 3.55803 0.834431 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KHUTRUNG 1/ 10/13 16:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | MAUNHIEM 18 15.889 5.9596 0.81650 4.1 0.0000 MAUSONG 18 68.000 5.0875 2.0000 2.9 0.0000 TGPSC 18 10.600 1.8686 0.46904 4.4 0.0000 2. Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCC FILE INVITRO1 7/12/13 0:43 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

VARIATE V003 CHIEUCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 8.19160 1.02395 125.08 0.000 3 2 NLAI 2 .842222E-02 .421111E-02 0.51 0.612 3 * RESIDUAL 16 .130978 .818612E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 8.33100 .320423 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITRO1 7/12/13 0:43 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

VARIATE V004 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 3.71336 .464170 69.79 0.000 3 2 NLAI 2 .471853E-02 .235927E-02 0.35 0.711 3 * RESIDUAL 16 .106415 .665093E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 3.82450 .147096 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE INVITRO1 7/12/13 0:43 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

VARIATE V005 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 2.66556 .333195 79.08 0.000 3 2 NLAI 2 .165185E-02 .825925E-03 0.20 0.825 3 * RESIDUAL 16 .674147E-01 .421342E-02 -----------------------------------------------------------------------------

143

* TOTAL (CORRECTED) 26 2.73463 .105178 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO1 7/12/13 0:43 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------ CT$ NOS CHIEUCC SOLA HSN DC 3 5.06000 7.63333 1.96667 CT1 3 4.11667 7.42000 2.53333 CT2 3 3.95667 7.51333 2.74000 CT3 3 3.80667 6.91333 2.19000 CT4 3 3.46000 6.80000 2.03333 CT5 3 4.95000 6.74333 2.30333 CT6 3 4.83333 7.50000 3.00333 CT7 3 4.26333 6.95333 2.43333 CT8 3 3.68333 6.60000 2.27333 SE(N= 3) 0.522370E-01 0.470848E-01 0.374763E-01 5%LSD 16DF 0.156607 0.141161 0.112355 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS CHIEUCC SOLA HSN 1 9 4.22889 7.11778 2.39667 2 9 4.22000 7.10444 2.38444 3 9 4.26111 7.13667 2.37778 SE(N= 9) 0.301591E-01 0.271844E-01 0.216369E-01 5%LSD 16DF 0.904174E-01 0.814993E-01 0.648679E-01 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO1 7/12/13 0:43 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CHIEUCC 27 4.2367 0.56606 0.90477E-01 2.1 0.0000 0.6122 SOLA 27 7.1196 0.38353 0.81553E-01 1.1 0.0000 0.7109 HSN 27 2.3863 0.32431 0.64911E-01 2.7 0.0000 0.8253 3. Ảnh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa. BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCC FILE INVITRO2 7/12/13 0:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

144

----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITRO2 7/12/13 0:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

VARIATE V004 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 11.3561 1.41952 30.07 0.000 3 2 NLAI 2 .687629E-01 .343814E-01 0.73 0.502 3 * RESIDUAL 16 .755371 .472107E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 12.1803 .468472 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE INVITRO2 7/12/13 0:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

VARIATE V005 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 8 1.96972 .246215 83.99 0.000 3 2 NLAI 2 .302964E-02 .151482E-02 0.52 0.611 3 * RESIDUAL 16 .469038E-01 .293149E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 26 2.01965 .776789E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO2 7/12/13 0:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHIEUCC SOLA HSNC DC 3 4.82667 7.84667 2.99333 CT1 3 4.84333 7.38000 2.64333 CT2 3 4.25000 6.78000 2.35667 CT3 3 4.15667 6.12333 2.29333 CT4 3 4.01333 5.89000 2.10667 CT5 3 4.71667 7.56667 2.72000 CT6 3 4.40333 7.10000 2.41000 CT7 3 4.02667 6.85333 2.33000 CT8 3 3.77667 6.15667 2.16000 SE(N= 3) 0.493179E-01 0.125447 0.312596E-01 5%LSD 16DF 0.147856 0.376092 0.937168E-01 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS CHIEUCC SOLA HSNC 1 9 4.34000 6.79111 2.43444 2 9 4.34111 6.86000 2.44333 3 9 4.32333 6.91444 2.46000 SE(N= 9) 0.284737E-01 0.724267E-01 0.180477E-01 5%LSD 16DF 0.853647E-01 0.217137 0.541074E-01 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO2 7/12/13 0:49 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

145

F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 27) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CHIEUCC 27 4.3348 0.37815 0.85421E-01 2.0 0.0000 0.8855 SOLA 27 6.8552 0.68445 0.21728 3.2 0.0000 0.5019 HSNC 27 2.4459 0.27871 0.54143E-01 2.2 0.0000 0.6109 4. Ảnh hưởng của α-NAA và than hoạt tính trong môi trường MS tới khả năng ra rễ của chồi in vitro cây cẩm chướng giống Quận Chúa BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCAY FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 CCCAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .224777E-01 .112389E-01 1.31 0.313 5 2 THT$ 2 1.25254 .626272 73.06 0.000 5 3 NAA$ 1 .108889E-02 .108889E-02 0.13 0.728 5 4 THT$NAA$ 2 .525278 .262639 30.64 0.000 5 RESIDUAL 10 .857225E-01 .857225E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1.88711 .111007 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SCLA FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 SCLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .460444E-01 .230222E-01 1.59 0.252 5 2 THT$ 2 2.23391 1.11696 76.95 0.000 5 3 NAA$ 1 .826890E-01 .826890E-01 5.70 0.037 5 4 THT$NAA$ 2 .267511 .133755 9.21 0.006 5 RESIDUAL 10 .145156 .145156E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 2.77531 .163254 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SORE FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V006 SORE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .964449E-02 .482225E-02 0.13 0.881 5 2 THT$ 2 1.38768 .693839 18.36 0.001 5 3 NAA$ 1 27.0358 27.0358 715.32 0.000 5 4 THT$NAA$ 2 12.5870 6.29350 166.51 0.000 5 RESIDUAL 10 .377956 .377956E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 41.3980 2.43518

146

----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDAIRE FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V007 CDAIRE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 NLAI 2 .807778E-02 .403889E-02 0.39 0.691 5 2 THT$ 2 .305744 .152872 14.76 0.001 5 3 NAA$ 1 2.64500 2.64500 255.34 0.000 5 4 THT$*NAA$ 2 .178033 .890167E-01 8.59 0.007 5 * RESIDUAL 10 .103589 .103589E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 3.24044 .190614 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS CCCAY SCLA SORE CDAIRE 1 6 4.63833 7.89000 8.91667 2.33000 2 6 4.69500 7.97667 8.88667 2.38167 3 6 4.61000 7.85667 8.94333 2.35167 SE(N= 6) 0.377983E-01 0.491860E-01 0.793679E-01 0.415510E-01 5%LSD 10DF 0.119104 0.154987 0.250091 0.130929 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT THT$ ----------------------------------------------------------------------------- THT$ NOS CCCAY SCLA SORE CDAIRE a0 6 4.94667 8.01333 8.54500 2.18833 a1 6 4.69167 8.27667 8.98833 2.50667 a2 6 4.30500 7.43333 9.21333 2.36833 SE(N= 6) 0.377983E-01 0.491860E-01 0.793679E-01 0.415510E-01 5%LSD 10DF 0.119104 0.154987 0.250091 0.130929 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NAA$ ----------------------------------------------------------------------------- NAA$ NOS CCCAY SCLA SORE CDAIRE b0 9 4.64000 7.97556 7.69000 1.97111 b1 9 4.65556 7.84000 10.1411 2.73778 SE(N= 9) 0.308621E-01 0.401602E-01 0.648036E-01 0.339263E-01 5%LSD 10DF 0.972477E-01 0.126546 0.204198 0.106903 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT THT$*NAA$ ----------------------------------------------------------------------------- THT$ NAA$ NOS CCCAY SCLA SORE a0 b0 3 5.11667 8.04000 6.62000 a0 b1 3 4.77667 7.98667 10.4700 a1 b0 3 4.45333 8.22000 7.28667 a1 b1 3 4.93000 8.33333 10.6900 a2 b0 3 4.35000 7.66667 9.16333 a2 b1 3 4.26000 7.20000 9.26333 SE(N= 3) 0.534548E-01 0.695595E-01 0.112243 5%LSD 10DF 0.168438 0.219185 0.353682

147

THT$ NAA$ NOS CDAIRE a0 b0 3 1.86333 a0 b1 3 2.51333 a1 b0 3 1.98333 a1 b1 3 3.03000 a2 b0 3 2.06667 a2 b1 3 2.67000 SE(N= 3) 0.587620E-01 5%LSD 10DF 0.185161 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RARE1 12/ 8/14 9: 2 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI |THT$ |NAA$ |THT$*NAA| N= 18) -------------------- SD/MEAN | | | |$ | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CCCAY 18 4.6478 0.33318 0.92586E-01 2.0 0.3126 0.0000 0.7277 0.0001 SCLA 18 7.9078 0.40405 0.12048 1.5 0.2518 0.0000 0.0368 0.0055 SORE 18 8.9156 1.5605 0.19441 2.2 0.8814 0.0005 0.0000 0.0000 CDAIRE 18 2.3544 0.43659 0.10178 4.3 0.6908 0.0011 0.0000 0.0069 5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE INVITRO4 7/12/13 10:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 278.244 139.122 203.14 0.001 3 2 NLAI 2 2.03535 1.01768 1.49 0.330 3 * RESIDUAL 4 2.73949 .684873 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 283.019 35.3773 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCC FILE INVITRO4 7/12/13 10:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 CHIEUCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 2.76242 1.38121 32.61 0.005 3 2 NLAI 2 .202224E-02 .101112E-02 0.02 0.978 3 * RESIDUAL 4 .169445 .423612E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 2.93389 .366736 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITRO4 7/12/13 10:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien

148

VARIATE V005 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 3.59815 1.79908 75.98 0.002 3 2 NLAI 2 .373555E-01 .186778E-01 0.79 0.516 3 * RESIDUAL 4 .947106E-01 .236777E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 3.73022 .466278 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO4 7/12/13 10:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLSONG CHIEUCC SOLA CT1 3 83.3300 8.11000 12.1700 CT2 3 92.0067 8.76000 12.7267 CT3 3 96.7600 9.46667 13.7000 SE(N= 3) 0.477798 0.118829 0.888400E-01 5%LSD 4DF 1.87286 0.465785 0.348234 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLSONG CHIEUCC SOLA 1 3 90.7333 8.78000 12.9567 2 3 90.1000 8.79667 12.8200 3 3 91.2633 8.76000 12.8200 SE(N= 3) 0.477798 0.118829 0.888400E-01 5%LSD 4DF 1.87286 0.465785 0.348234 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO4 7/12/13 10:39 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLSONG 9 90.699 5.9479 0.82757 0.9 0.0005 0.3296 CHIEUCC 9 8.7789 0.60559 0.20582 2.3 0.0049 0.9778 SOLA 9 12.866 0.68285 0.15388 1.2 0.0016 0.5163 6. Ảnh hưởng của EMS đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây cẩm chướng BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCHET FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 TLCHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 THOIGIAN$ 2 874.087 437.044 117.17 0.000 4 2 EMS$ 5 34847.3 6969.46 ****** 0.000 4

149

3 THOIGIAN$*EMS$ 10 268.255 26.8255 7.19 0.000 4 * RESIDUAL 36 134.277 3.72991 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 53 36123.9 681.583 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 THOIGIAN$ 2 874.088 437.044 117.17 0.000 4 2 EMS$ 5 34847.3 6969.46 ****** 0.000 4 3 THOIGIAN$*EMS$ 10 268.255 26.8255 7.19 0.000 4 * RESIDUAL 36 134.274 3.72984 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 53 36123.9 681.583 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLPSCHOI FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V006 TLPSCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 THOIGIAN$ 2 359.114 179.557 167.95 0.000 4 2 EMS$ 5 4024.14 804.828 752.82 0.000 4 3 THOIGIAN$*EMS$ 10 83.8930 8.38930 7.85 0.000 4 * RESIDUAL 36 38.4869 1.06908 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 53 4505.63 85.0120 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCHOI FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V007 CCCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 THOIGIAN$ 2 2.27218 1.13609 272.53 0.000 4 2 EMS$ 5 27.1793 5.43585 ****** 0.000 4 3 THOIGIAN$*EMS$ 10 .161844 .161844E-01 3.88 0.001 4 * RESIDUAL 36 .150071 .416864E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 53 29.7634 .561573 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V008 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 THOIGIAN$ 2 3.83880 1.91940 385.46 0.000 4 2 EMS$ 5 52.8742 10.5748 ****** 0.000 4 3 THOIGIAN$*EMS$ 10 2.32378 .232378 46.67 0.000 4

150

* RESIDUAL 36 .179261 .497948E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 53 59.2161 1.11728 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT THOIGIAN$ ----------------------------------------------------------------------------- THOIGIAN$ NOS TLCHET TLSONG TLPSCHOI CCCHOI a1 18 26.5817 73.4183 88.1206 3.22722 a2 18 31.3056 68.6944 85.6156 2.96278 a3 18 36.4339 63.5661 81.8461 2.72500 SE(N= 18) 0.455211 0.455207 0.243708 0.152181E-01 5%LSD 36DF 1.30554 1.30553 0.698952 0.436455E-01 THOIGIAN$ NOS SOLA a1 18 6.40056 a2 18 6.13056 a3 18 5.75056 SE(N= 18) 0.166324E-01 5%LSD 36DF 0.477017E-01 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT EMS$ ----------------------------------------------------------------------------- EMS$ NOS TLCHET TLSONG TLPSCHOI CCCHOI b0 9 1.12889 98.8711 98.7489 4.03444 b1 9 12.2233 87.7767 88.0222 3.48667 b2 9 17.4067 82.5933 89.2400 3.22111 b3 9 28.6467 71.3533 85.8611 2.88556 b4 9 55.1967 44.8033 77.4800 2.24222 b5 9 74.0400 25.9600 71.8122 1.96000 SE(N= 9) 0.643766 0.643760 0.344655 0.215217E-01 5%LSD 36DF 1.84632 1.84630 0.988468 0.617241E-01 EMS$ NOS SOLA b0 9 7.66222 b1 9 6.83778 b2 9 6.27444 b3 9 5.94333 b4 9 5.10111 b5 9 4.74444 SE(N= 9) 0.235218E-01 5%LSD 36DF 0.674605E-01 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT THOIGIAN$*EMS$ ----------------------------------------------------------------------------- THOIGIAN$ EMS$ NOS TLCHET TLSONG TLPSCHOI a1 b0 3 0.000000 100.000 100.000 a1 b1 3 8.89000 91.1100 91.6600 a1 b2 3 13.3333 86.6667 93.9267 a1 b3 3 18.3767 81.6233 88.9000 a1 b4 3 51.1133 48.8867 80.4033 a1 b5 3 67.7767 32.2233 73.8333 a2 b0 3 1.16667 98.8333 98.5767

151

a2 b1 3 11.1100 88.8900 88.2600 a2 b2 3 17.7800 82.2200 91.1133 a2 b3 3 30.0000 70.0000 86.5033 a2 b4 3 54.4467 45.5533 77.3800 a2 b5 3 73.3300 26.6700 71.8600 a3 b0 3 2.22000 97.7800 97.6700 a3 b1 3 16.6700 83.3300 84.1467 a3 b2 3 21.1067 78.8933 82.6800 a3 b3 3 37.5633 62.4367 82.1800 a3 b4 3 60.0300 39.9700 74.6567 a3 b5 3 81.0133 18.9867 69.7433 SE(N= 3) 1.11503 1.11502 0.596959 5%LSD 36DF 3.19792 3.19789 1.71208 THOIGIAN$ EMS$ NOS CCCHOI SOLA a1 b0 3 4.17333 7.68333 a1 b1 3 3.78000 7.27667 a1 b2 3 3.55667 6.80333 a1 b3 3 3.17667 6.26333 a1 b4 3 2.49000 5.66000 a1 b5 3 2.18667 4.71667 a2 b0 3 4.04333 7.68333 a2 b1 3 3.49667 6.77667 a2 b2 3 3.22000 6.26000 a2 b3 3 2.88667 5.92667 a2 b4 3 2.21667 5.32000 a2 b5 3 1.91333 4.81667 a3 b0 3 3.88667 7.62000 a3 b1 3 3.18333 6.46000 a3 b2 3 2.88667 5.76000 a3 b3 3 2.59333 5.64000 a3 b4 3 2.02000 4.32333 a3 b5 3 1.78000 4.70000 SE(N= 3) 0.372766E-01 0.407410E-01 5%LSD 36DF 0.106909 0.116845 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE EMS 17/ 8/14 21:11 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |THOIGIAN|EMS$ |THOIGIAN| (N= 54) -------------------- SD/MEAN |$ | |$*EMS$ | NO. BASED ON BASED ON % | | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | | TLCHET 54 31.440 26.107 1.9313 6.1 0.0000 0.0000 0.0000 TLSONG 54 68.560 26.107 1.9313 2.8 0.0000 0.0000 0.0000 TLPSCHOI 54 85.194 9.2202 1.0340 1.2 0.0000 0.0000 0.0000 CCCHOI 54 2.9717 0.74938 0.64565E-01 2.2 0.0000 0.0000 0.0013 SOLA 54 6.0939 1.0570 0.70565E-01 1.2 0.0000 0.0000 0.0000 7. Ảnh hưởng của gamma đến khả năng sống, phát sinh chồi in vitro cây cẩm chướng BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

152

SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 30621.3 4374.48 ****** 0.000 3 2 NL 2 8.33333 4.16667 1.47 0.263 3 * RESIDUAL 14 39.6673 2.83338 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 30669.3 1333.45 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLPSC FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 TLPSC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 25112.2 3587.45 448.04 0.000 3 2 NL 2 47.9168 23.9584 2.99 0.082 3 * RESIDUAL 14 112.097 8.00691 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 25272.2 1098.79 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCAY FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 CCCAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 42.2011 6.02872 ****** 0.000 3 2 NL 2 .140834E-02 .704170E-03 0.17 0.850 3 * RESIDUAL 14 .597280E-01 .426629E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 42.2622 1.83749 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCAPLA FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 VARIATE V006 SOCAPLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 86.2923 12.3275 ****** 0.000 3 2 NL 2 .173333E-02 .866663E-03 0.12 0.886 3 * RESIDUAL 14 .997300E-01 .712357E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 86.3937 3.75625 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLSONG TLPSC CCCAY SOLA DC 3 98.0000 100.000 4.16333 5.52333 CT1 3 91.3333 91.9900 3.87667 5.34000 CT2 3 82.6667 63.6667 3.44667 5.67000 CT3 3 75.3333 86.7467 4.00000 5.76333

153

CT4 3 49.3333 70.2233 3.04333 4.83000 CT5 3 29.3333 52.2200 2.14000 4.61667 CT6 3 8.66667 24.4433 1.87333 2.48333 CT7 3 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 SE(N= 3) 0.971833 1.63370 0.377107E-01 0.487291E-01 5%LSD 14DF 2.94778 4.95537 0.114385 0.147806 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NL ----------------------------------------------------------------------------- NL NOS TLSONG TLPSC CCCAY SOCAPLA 1 8 54.7500 59.8750 2.81750 4.27500 2 8 53.5000 63.1288 2.82750 4.27000 3 8 54.7500 60.4800 2.80875 4.29000 SE(N= 8) 0.595124 1.00043 0.230930E-01 0.298403E-01 5%LSD 14DF 1.80514 3.03453 0.700461E-01 0.905124E-01 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GAMMA1 15/ 4/13 9: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NL | (N= 24) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLSONG 24 54.333 36.516 1.6833 3.1 0.0000 0.2629 TLPSC 24 61.161 33.148 2.8296 4.6 0.0000 0.0816 CCCAY 24 2.8179 1.3555 0.65317E-01 2.3 0.0000 0.8501 SOCAPLA 24 4.2783 1.9381 0.84401E-01 2.0 0.0000 0.8862 BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG A FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V003 DANG A A LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 28841.7 4120.25 856.67 0.000 3 2 NL 2 2.02466 1.01233 0.21 0.814 3 * RESIDUAL 14 67.3345 4.80961 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 28911.1 1257.00 ----------------------------------------------------------------------------- 8. Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ gamma đến chồi biến dị BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG B FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V004 DANG B B LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 1616.33 230.905 238.69 0.000 3 2 NL 2 2.78176 1.39088 1.44 0.270 3 * RESIDUAL 14 13.5436 .967399 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 1632.66 70.9851 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG C FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14

154

------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V005 DANG C C LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 622.815 88.9735 187.62 0.000 3 2 NL 2 .224408 .112204 0.24 0.795 3 * RESIDUAL 14 6.63903 .474217 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 629.678 27.3773 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG D FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V006 DANG D D LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 327.919 46.8456 181.79 0.000 3 2 NL 2 .496534 .248267 0.96 0.408 3 * RESIDUAL 14 3.60762 .257687 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 332.023 14.4358 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG E FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V007 DANG E E LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 885.849 126.550 1.16 0.384 3 2 NL 2 174.122 87.0610 0.80 0.473 3 * RESIDUAL 14 1528.65 109.189 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 2588.62 112.549 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE DANG F FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V008 DANG F F LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 16594.4 2370.63 23.13 0.000 3 2 NL 2 263.376 131.688 1.28 0.308 3 * RESIDUAL 14 1434.75 102.482 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 18292.5 795.328 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBIENDI FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V009 TLBIENDI

155

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 7 27582.2 3940.32 819.28 0.000 3 2 NL 2 2.02466 1.01233 0.21 0.814 3 * RESIDUAL 14 67.3331 4.80950 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 23 27651.6 1202.24 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS DANG A DANG B DANG C DANG D DC 3 96.2000 3.80000 0.000000 0.000000 CT1 3 89.6800 6.52667 0.000000 3.79333 CT2 3 64.0433 9.53333 7.39333 7.39333 CT3 3 52.9900 10.7167 13.6867 8.93000 CT4 3 41.5400 18.0000 8.92333 6.77000 CT5 3 22.3400 25.1167 8.37000 8.37000 CT6 3 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 CT7 3 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 SE(N= 3) 1.26618 0.567861 0.397583 0.293080 5%LSD 14DF 3.84059 1.72245 1.20596 0.888975 CT$ NOS DANG E DANG F TLBIENDI DC 3 0.000000 0.000000 3.80000 CT1 3 0.000000 0.000000 10.3200 CT2 3 6.35333 5.28667 35.9567 CT3 3 6.53667 7.14333 47.0100 CT4 3 10.1567 14.6133 58.4600 CT5 3 13.7133 22.0867 77.6600 CT6 3 16.6667 83.3333 100.000 CT7 3 0.000000 0.000000 0.000000 SE(N= 3) 6.03294 5.84472 1.26616 5%LSD 14DF 18.2992 17.7283 3.84055 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NL ----------------------------------------------------------------------------- NL NOS DANG A DANG B DANG C DANG D 1 8 46.1775 9.69125 4.66875 4.59375 2 8 45.4713 8.93500 4.81875 4.38375 3 8 45.8988 9.00875 4.90250 4.24375 SE(N= 8) 0.775371 0.347743 0.243469 0.179474 5%LSD 14DF 2.35187 1.05478 0.738495 0.544384 NL NOS DANG E DANG F TLBIENDI 1 8 10.4875 11.8813 41.3225 2 8 4.75625 19.1362 42.0287 3 8 4.79125 18.6562 41.6012 SE(N= 8) 3.69440 3.57914 0.775363 5%LSD 14DF 11.2059 10.8563 2.35185 ---------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE GAMMA2 15/ 4/13 10:14 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9

156

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NL | (N= 24) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | DANG A 24 45.849 35.454 2.1931 4.8 0.0000 0.8143 DANG B 24 9.2117 8.4253 0.98356 10.7 0.0000 0.2702 DANG C 24 4.7967 5.2323 0.68863 14.4 0.0000 0.7945 DANG D 24 4.4071 3.7994 0.50763 11.5 0.0000 0.4077 DANG E 24 6.6783 10.609 10.449 156.5 0.3840 0.4733 DANG F 24 16.558 28.202 10.123 61.1 0.0000 0.3077 TLBIENDI 24 41.651 34.673 2.1931 5.3 0.0000 0.8143 9. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ gamma.

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 6365.67 2121.89 578.70 0.000 4 2 GAMMA$ 2 6286.89 3143.44 857.31 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 935.333 155.889 42.52 0.000 4 * RESIDUAL 24 87.9992 3.66663 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 13675.9 390.740 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLPSCHOI FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 TLPSCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 1389.33 463.111 96.93 0.000 4 2 GAMMA$ 2 1597.56 798.778 167.19 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 107.333 17.8889 3.74 0.009 4 * RESIDUAL 24 114.666 4.77776 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 3208.89 91.6825 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCHOI FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V006 CCCHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 8.56690 2.85563 422.88 0.000 4 2 GAMMA$ 2 .864939 .432470 64.04 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 .789328 .131555 19.48 0.000 4 * RESIDUAL 24 .162067 .675280E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 10.3832 .296664

157

----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V007 SOLA A A A A A A A LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 2.07521 .691736 138.35 0.000 4 2 GAMMA$ 2 3.10160 1.55080 310.16 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 .266668E-03 .444447E-04 0.01 1.000 4 * RESIDUAL 24 .120000 .500001E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 5.29707 .151345 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI A FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V008 CHOI A LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 12483.3 4161.11 ****** 0.000 4 2 GAMMA$ 2 2332.29 1166.14 827.86 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 540.213 90.0355 63.92 0.000 4 * RESIDUAL 24 33.8069 1.40862 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 15389.6 439.704 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIF FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V009 CHOIF LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 1255.21 418.403 896.52 0.000 4 2 GAMMA$ 2 436.813 218.406 467.98 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 121.601 20.2668 43.43 0.000 4 * RESIDUAL 24 11.2008 .466699 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 1824.82 52.1378 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIG FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V010 CHOIG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 300.567 100.189 561.98 0.000 4 2 GAMMA$ 2 5.83511 2.91755 16.37 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 89.4600 14.9100 83.63 0.000 4 * RESIDUAL 24 4.27869 .178279 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 400.141 11.4326 -----------------------------------------------------------------------------

158

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIL FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V011 CHOIL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 397.226 132.409 ****** 0.000 4 2 GAMMA$ 2 25.3431 12.6716 127.04 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 47.2726 7.87876 78.99 0.000 4 * RESIDUAL 24 2.39382 .997425E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 472.235 13.4924 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIM FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V012 CHOIM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 150.840 50.2801 144.02 0.000 4 2 GAMMA$ 2 80.5472 40.2736 115.36 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 27.4131 4.56884 13.09 0.000 4 * RESIDUAL 24 8.37887 .349120 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 267.179 7.63370 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIN FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 10 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V013 CHOIN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 299.901 99.9671 315.73 0.000 4 2 GAMMA$ 2 11.2165 5.60823 17.71 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 255.055 42.5091 134.26 0.000 4 * RESIDUAL 24 7.59884 .316618 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 573.771 16.3935 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIO FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 11 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V014 CHOIO LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 130.396 43.4653 532.24 0.000 4 2 GAMMA$ 2 137.886 68.9429 844.22 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 96.0179 16.0030 195.96 0.000 4 * RESIDUAL 24 1.95995 .816647E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 366.259 10.4646 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOIP FILE EG 12/ 8/14 14:46

159

------------------------------------------------------------------ :PAGE 12 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V015 CHOIP LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 565.511 188.504 968.06 0.000 4 2 GAMMA$ 2 25.1590 12.5795 64.60 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 59.6206 9.93676 51.03 0.000 4 * RESIDUAL 24 4.67337 .194724 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 654.964 18.7133 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBIENDI FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 13 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V016 TLBIENDI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 EMS$ 3 12483.3 4161.11 ****** 0.000 4 2 GAMMA$ 2 2332.29 1166.14 827.87 0.000 4 3 EMS$*GAMMA$ 6 540.213 90.0355 63.92 0.000 4 * RESIDUAL 24 33.8068 1.40862 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 15389.6 439.704 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 14 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT EMS$ ----------------------------------------------------------------------------- EMS$ NOS TLSONG TLPSCHOI CCCHOI SOLA a1 9 80.0000 84.6667 3.63333 4.48444 a2 9 68.4444 81.3333 3.57111 4.35444 a3 9 54.0000 76.0000 3.37889 4.18000 a4 9 45.3333 68.2222 2.42222 3.84444 SE(N= 9) 0.638282 0.728603 0.273918E-01 0.235702E-01 5%LSD 24DF 1.86297 2.12659 0.799490E-01 0.687949E-01 EMS$ NOS CHOI A CHOIF CHOIG CHOIL a1 9 79.2322 7.22000 0.000000 0.000000 a2 9 56.0155 11.6189 6.42889 0.000000 a3 9 36.5956 15.7467 6.39889 3.77222 a4 9 32.0967 23.2533 1.45444 8.05444 SE(N= 9) 0.395618 0.227718 0.140744 0.105273 5%LSD 24DF 1.15470 0.664645 0.410791 0.307264 EMS$ NOS CHOIM CHOIN CHOIO CHOIP a1 9 9.87667 3.66889 0.000000 0.000000 a2 9 11.1522 8.39556 2.30111 4.09111 a3 9 11.4500 11.5544 4.92333 9.55444 a4 9 15.3522 6.31444 4.17889 9.29222 SE(N= 9) 0.196954 0.187563 0.952568E-01 0.147092 5%LSD 24DF 0.574855 0.547443 0.278028 0.429320

160

EMS$ NOS TLBIENDI a1 9 20.7678 a2 9 43.9844 a3 9 63.4044 a4 9 67.9033 SE(N= 9) 0.395617 5%LSD 24DF 1.15470 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT GAMMA$ ----------------------------------------------------------------------------- GAMMA$ NOS TLSONG TLPSCHOI CCCHOI SOLA b1 12 77.6667 84.3333 3.44667 4.61917 b2 12 62.8333 79.8333 3.24000 4.09917 b3 12 45.3333 68.5000 3.06750 3.92917 SE(N= 12) 0.552768 0.630988 0.237220E-01 0.204124E-01 5%LSD 24DF 1.61338 1.84168 0.692379E-01 0.595782E-01 GAMMA$ NOS CHOI A CHOIF CHOIG CHOIL b1 12 61.2567 10.7025 3.55583 1.84583 b2 12 50.0975 13.5792 4.07083 3.15083 b3 12 41.6008 19.0975 3.08500 3.87333 SE(N= 12) 0.342615 0.197210 0.121887 0.911695E-01 5%LSD 24DF 0.999997 0.575599 0.355755 0.266098 GAMMA$ NOS CHOIM CHOIN CHOIO CHOIP b1 12 10.0742 7.38917 0.622500 4.55333 b2 12 12.0658 8.20917 2.54333 6.28000 b3 12 13.7333 6.85167 5.38667 6.37000 SE(N= 12) 0.170568 0.162434 0.824948E-01 0.127385 5%LSD 24DF 0.497839 0.474100 0.240779 0.371802 GAMMA$ NOS TLBIENDI b1 12 38.7433 b2 12 49.9025 b3 12 58.3992 SE(N= 12) 0.342614 5%LSD 24DF 0.999996 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT EMS$*GAMMA$ ----------------------------------------------------------------------------- EMS$ GAMMA$ NOS TLSONG TLPSCHOI CCCHOI a1 b1 3 87.3333 89.3333 3.74667 a1 b2 3 80.6667 86.6667 3.61667 a1 b3 3 72.0000 78.0000 3.53667 a2 b1 3 80.0000 88.0000 3.60000 a2 b2 3 73.3333 86.6667 3.51000 a2 b3 3 52.0000 69.3333 3.60333 a3 b1 3 74.6667 84.0000 3.52667 a3 b2 3 54.6667 77.3333 3.51667 a3 b3 3 32.6667 66.6667 3.09333 a4 b1 3 68.6667 76.0000 2.91333 a4 b2 3 42.6667 68.6667 2.31667 a4 b3 3 24.6667 60.0000 2.03667 SE(N= 3) 1.10554 1.26198 0.474440E-01 5%LSD 24DF 3.22675 3.68336 0.138476 EMS$ GAMMA$ NOS SOLA CHOI A CHOIF a1 b1 3 4.88667 86.7933 4.70333

161

a1 b2 3 4.37000 79.6467 5.33000 a1 b3 3 4.19667 71.2567 11.6267 a2 b1 3 4.75667 72.6567 8.47667 a2 b2 3 4.24000 57.5033 7.98000 a2 b3 3 4.06667 37.8867 18.4000 a3 b1 3 4.58667 45.9600 13.2667 a3 b2 3 4.05667 34.3367 15.4833 a3 b3 3 3.89667 29.4900 18.4900 a4 b1 3 4.24667 39.6167 16.3633 a4 b2 3 3.73000 28.9033 25.5233 a4 b3 3 3.55667 27.7700 27.8733 SE(N= 3) 0.408249E-01 0.685230 0.394419 5%LSD 24DF 0.119156 1.99999 1.15120 EMS$ GAMMA$ NOS CHOIG CHOIL CHOIM a1 b1 3 0.000000 0.000000 8.50333 a1 b2 3 0.000000 0.000000 10.1800 a1 b3 3 0.000000 0.000000 10.9467 a2 b1 3 3.26000 0.000000 8.35667 a2 b2 3 9.12333 0.000000 11.2967 a2 b3 3 6.90333 0.000000 13.8033 a3 b1 3 6.60000 0.000000 11.1800 a3 b2 3 7.16000 4.78000 11.1333 a3 b3 3 5.43667 6.53667 12.0367 a4 b1 3 4.36333 7.38333 12.2567 a4 b2 3 0.000000 7.82333 15.6533 a4 b3 3 0.000000 8.95667 18.1467 SE(N= 3) 0.243775 0.182339 0.341135 5%LSD 24DF 0.711511 0.532196 0.995678 EMS$ GAMMA$ NOS CHOIN CHOIO CHOIP a1 b1 3 0.000000 0.000000 0.000000 a1 b2 3 4.84000 0.000000 0.000000 a1 b3 3 6.16667 0.000000 0.000000 a2 b1 3 7.25667 0.000000 0.000000 a2 b2 3 8.72667 0.000000 5.37000 a2 b3 3 9.20333 6.90333 6.90333 a3 b1 3 11.1800 2.49000 9.31667 a3 b2 3 11.4467 6.26000 9.39333 a3 b3 3 12.0367 6.02000 9.95333 a4 b1 3 11.1200 0.000000 8.89667 a4 b2 3 7.82333 3.91333 10.3567 a4 b3 3 0.000000 8.62333 8.62333 SE(N= 3) 0.324868 0.164990 0.254770 5%LSD 24DF 0.948200 0.481558 0.743603 EMS$ GAMMA$ NOS TLBIENDI a1 b1 3 13.2067 a1 b2 3 20.3533 a1 b3 3 28.7433 a2 b1 3 27.3433 a2 b2 3 42.4967 a2 b3 3 62.1133 a3 b1 3 54.0400 a3 b2 3 65.6633 a3 b3 3 70.5100 a4 b1 3 60.3833 a4 b2 3 71.0967 a4 b3 3 72.2300 SE(N= 3) 0.685229 5%LSD 24DF 1.99999 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE EG 12/ 8/14 14:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 15

162

Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |EMS$ |GAMMA$ |EMS$*GAM| N= 36) -------------------- SD/MEAN | | |MA$ | NO. BASED ON BASED ON % | | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | | TLSONG 36 61.944 19.767 1.9148 3.1 0.0000 0.0000 0.0000 TLPSCHOI 36 77.556 9.5751 2.1858 2.8 0.0000 0.0000 0.0091 CCCHOI 36 3.2514 0.54467 0.82175E-01 2.5 0.0000 0.0000 0.0000 SOLA 36 4.2158 0.38903 0.70711E-01 1.7 0.0000 0.0000 1.0000 CHOI A 36 50.985 20.969 1.1869 2.3 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIF 36 14.460 7.2207 0.68315 4.7 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIG 36 3.5706 3.3812 0.42223 11.8 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIL 36 2.9567 3.6732 0.31582 10.7 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIM 36 11.958 2.7629 0.59086 4.9 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIN 36 7.4833 4.0489 0.56269 7.5 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIO 36 2.8508 3.2349 0.28577 10.0 0.0000 0.0000 0.0000 CHOIP 36 5.7344 4.3259 0.44128 7.7 0.0000 0.0000 0.0000 TLBIENDI 36 49.015 20.969 1.1869 2.4 0.0000 0.0000 0.0000

SINGLE EFFECT -------------------- ANOVA FOR SINGLE -------------------- VARIATE TLCRRE SORE CDRE TGRARE CCCAY SOCAPLA TABLE OF MEANS -------------------- MEANS FOR EFFECT DANGCHOI$ -------------------- DANGCHOI$ Dang A Dang B Dang C Dang D Dang E Dang F Dang G Gang G Dang H Dang K Dang L Dang N Dang O Dang P SE(N= 3) 5%LSD 25DF ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE RARE 19/12/13 23:46 ---------------------------------------------- :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien EFFECT - DANGCHOI$ ------------------------------------------ TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB 963.39 13 3.9952 25 241.13 0.000 6.5141 13 0.19181E-01 25 339.61 0.000 1.5286 13 0.39465E-02 25 387.33 0.000 13.757 13 0.97015E-01 25 141.80 0.000 3.3166 13 0.16629E-01 25 199.44 0.000 5.7076 13 0.11867E-01 25 480.95 0.000 FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RARE 19/12/13 23:46 ---------------------------------------------- :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien --------------------------------------------------------- NOS TLCRRE SORE CDRE TGRARE 3 98.8900 6.93333 3.01000 8.04000 3 88.8900 6.44333 1.84667 9.00000 3 37.7800 1.84667 0.580000 15.0000 3 88.8900 6.21000 1.42000 11.0033 3 84.4433 5.76000 1.36000 11.9967 3 85.5567 5.01667 2.17000 10.9500 2 100.000 7.27000 3.20000 7.27000 1 100.000 7.27000 3.26000 7.29000 3 88.8900 6.44000 2.74333 9.27333 3 46.6667 3.76333 1.23333 12.3633 3 87.7800 5.53000 2.34000 8.71000 3 82.2200 4.16333 1.95000 11.2367 3 69.2233 3.82667 1.79000 9.07000 3 72.2200 4.84667 1.88667 13.1900 1.15401 0.799609E-01 0.362700E-01 0.179829 3.36111 0.232890 0.105638 0.523760

10. Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi

163

DANGCHOI$ NOS CCCAY SOCAPLA Dang A 3 4.81667 5.12000 Dang B 3 4.72000 3.88333 Dang C 3 1.52333 2.21000 Dang D 3 3.76333 3.59333 Dang E 3 3.45333 3.37000 Dang F 3 3.46000 4.76333 Dang G 2 5.17000 6.17000 Gang G 1 5.08000 6.01000 Dang H 3 4.72333 5.71667 Dang K 3 2.45333 3.45333 Dang L 3 2.99333 2.32667 Dang N 3 3.67000 5.67000 Dang O 3 2.66000 6.32667 Dang P 3 2.54667 5.89000 SE(N= 3) 0.744524E-01 0.628951E-01 5%LSD 25DF 0.216846 0.183185 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RARE 19/12/13 23:46 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |DANGCHOI| (N= 39) -------------------- SD/MEAN |$ | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLCRRE 39 79.342 18.227 1.9988 2.5 0.0000 SORE 39 5.2346 1.4970 0.13850 2.6 0.0000 CDRE 39 1.9654 0.72494 0.62821E-01 3.2 0.0000 TGRARE 39 10.547 2.1841 0.31147 3.0 0.0000 CCCAY 39 3.5326 1.0703 0.12896 3.7 0.0000 SOCAPLA 39 4.4954 1.4001 0.10894 2.4 0.0000

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE KHICANH 20/12/13 11:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 DANGCHOI$ 11 32937.0 2994.28 421.66 0.000 2 * RESIDUAL 24 170.429 7.10122 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 33107.5 945.927 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCCAY FILE KHICANH 20/12/13 11:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 CCCAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 DANGCHOI$ 11 39.8294 3.62085 72.00 0.000 2 * RESIDUAL 24 1.20693 .502889E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 41.0363 1.17247

11. Thí nghiệm thích ứng các dạng chồi trong điều kiện vườn ươm

164

----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCAPLA FILE KHICANH 20/12/13 11:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 SOCAPLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 DANGCHOI$ 11 54.8047 4.98225 313.51 0.000 2 * RESIDUAL 24 .381400 .158917E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 35 55.1861 1.57675 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KHICANH 20/12/13 11:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT DANGCHOI$ ----------------------------------------------------------------------------- DANGCHOI$ NOS TLSONG CCCAY SOCAPLA Dang A 3 98.8900 5.60667 6.83667 Dang B 3 93.3333 4.55333 5.78333 Dang C 3 3.33000 3.79667 3.27000 Dang D 3 82.2200 4.32000 4.62333 Dang E 3 76.6667 4.02667 4.01333 Dang F 3 62.2200 4.14333 5.67333 Dang G 3 100.000 6.42333 7.37000 Dang H 3 83.3333 4.55000 4.32333 Dang K 3 13.3333 2.03000 3.26000 Dang L 3 80.0000 3.67000 4.90000 Dang N 3 65.5533 4.18667 4.22000 Dang P 3 45.5567 3.24667 5.16000 SE(N= 3) 1.53853 0.129472 0.727820E-01 5%LSD 24DF 4.49054 0.377892 0.212430 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KHICANH 20/12/13 11:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |DANGCHOI| (N= 36) -------------------- SD/MEAN |$ | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLSONG 36 67.036 30.756 2.6648 4.0 0.0000 CCCAY 36 4.2128 1.0828 0.22425 5.3 0.0000 SOCAPLA 36 4.9528 1.2557 0.12606 2.5 0.0000

BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNHIEM FILE INVITRO5 7/12/13 22:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TLNHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER

12. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ phát sinh chồi in vitro của dòng H6

165

SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 7769.28 1942.32 ****** 0.000 3 2 NLAI 2 .456695 .228347 0.26 0.780 3 * RESIDUAL 8 7.05556 .881945 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 7776.79 555.485 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE INVITRO5 7/12/13 22:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 1273.97 318.494 81.09 0.000 3 2 NLAI 2 3.44813 1.72407 0.44 0.663 3 * RESIDUAL 8 31.4200 3.92750 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1308.84 93.4888 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TGPSC FILE INVITRO5 7/12/13 22:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 TGPSC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 70.4543 17.6136 184.20 0.000 3 2 NLAI 2 .249213 .124607 1.30 0.324 3 * RESIDUAL 8 .764983 .956229E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 71.4685 5.10489 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO5 7/12/13 22:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLNHIEM TLSONG TGPSC CT1 3 64.6700 60.3300 8.33000 CT2 3 29.3267 77.6667 9.33333 CT3 3 7.67333 76.3300 9.67333 CT4 3 6.67333 67.7767 13.2067 CT5 3 5.33000 53.6267 13.6600 SE(N= 3) 0.542201 1.14419 0.178534 5%LSD 8DF 1.76806 3.73108 0.582181 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLNHIEM TLSONG TGPSC 1 5 22.8520 66.4840 10.9520 2 5 22.8640 67.6040 10.6600 3 5 22.4880 67.3500 10.9100 SE(N= 5) 0.419987 0.886284 0.138292 5%LSD 8DF 1.36953 2.89008 0.450955 -----------------------------------------------------------------------------

166

ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO5 7/12/13 22:25 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghiem bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNHIEM 15 22.735 23.569 0.93912 4.1 0.0000 0.7800 TLSONG 15 67.146 9.6690 1.9818 3.0 0.0000 0.6630 TGPSC 15 10.841 2.2594 0.30923 2.9 0.0000 0.3243 13. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ phát sinh chồi in vitro của dòng H7 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLNHIEM FILE INVITRO6 7/12/13 22:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 TLNHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 9228.92 2307.23 ****** 0.000 3 2 NLAI 2 .243480 .121740 0.27 0.773 3 * RESIDUAL 8 3.61898 .452373 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 9232.79 659.485 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE INVITRO6 7/12/13 22:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 1108.96 277.240 81.62 0.000 3 2 NLAI 2 3.80243 1.90122 0.56 0.596 3 * RESIDUAL 8 27.1742 3.39678 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 1139.94 81.4239 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE TGPSC FILE INVITRO6 7/12/13 22:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 TGPSC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 83.5095 20.8774 144.49 0.000 3 2 NLAI 2 .425973 .212986 1.47 0.285 3 * RESIDUAL 8 1.15590 .144488 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 85.0914 6.07796 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO6 7/12/13 22:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4

167

Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLNHIEM TLSONG TGPSC CT1 3 71.3267 56.3300 8.56000 CT2 3 29.2867 71.0333 9.35000 CT3 3 8.54667 75.4667 9.82000 CT4 3 7.55667 67.1100 13.9267 CT5 3 6.63333 52.9600 14.0500 SE(N= 3) 0.388318 1.06408 0.219460 5%LSD 8DF 1.26627 3.46985 0.715637 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLNHIEM TLSONG TGPSC 1 5 24.6740 64.9420 11.1560 2 5 24.5120 63.8680 11.3400 3 5 24.8240 64.9300 10.9280 SE(N= 5) 0.300790 0.824230 0.169993 5%LSD 8DF 0.980846 2.68773 0.554330 ----------------------------------------------------------------------------- 14. Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro dòng H6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCC FILE INVITRO8 7/12/13 23:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 CHIEUCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.86870 .956233 170.50 0.000 3 2 NLAI 2 .192167E-01 .960833E-02 1.71 0.258 3 * RESIDUAL 6 .336501E-01 .560834E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.92157 .265597 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITRO8 7/12/13 23:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 VARIATE V004 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 .648300 .216100 75.17 0.000 3 2 NLAI 2 .591500E-01 .295750E-01 10.29 0.012 3 * RESIDUAL 6 .172500E-01 .287500E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 .724700 .658818E-01 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE INVITRO8 7/12/13 23:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 VARIATE V005 HSNC

168

LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 .602767 .200922 59.14 0.000 3 2 NLAI 2 .249500E-01 .124750E-01 3.67 0.091 3 * RESIDUAL 6 .203833E-01 .339722E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 .648100 .589182E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO8 7/12/13 23:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHIEUCC SOLA HSNC CT1 3 3.63333 5.09000 1.83333 CT2 3 3.47000 4.93000 1.94000 CT3 3 2.52000 4.54000 2.10000 CT4 3 2.65000 4.58000 2.42667 SE(N= 3) 0.432371E-01 0.309570E-01 0.336512E-01 5%LSD 6DF 0.149564 0.107085 0.116405 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS CHIEUCC SOLA HSNC 1 4 3.12000 4.77000 2.12000 2 4 3.06250 4.87750 2.09250 3 4 3.02250 4.70750 2.01250 SE(N= 4) 0.374444E-01 0.268095E-01 0.291428E-01 5%LSD 6DF 0.129526 0.927384E-01 0.100810 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO8 7/12/13 23:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CHIEUCC 12 3.0683 0.51536 0.74889E-01 2.4 0.0000 0.2578 SOLA 12 4.7850 0.25667 0.53619E-01 1.1 0.0001 0.0121 HSNC 12 2.0750 0.24273 0.58286E-01 2.8 0.0002 0.0906 15. Ảnh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số nhân, sinh trưởng của chồi in vitro dòng H7 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO6 7/12/13 22:29 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLNHIEM 15 24.670 25.680 0.67259 2.7 0.0000 0.7728 TLSONG 15 64.580 9.0235 1.8430 2.9 0.0000 0.5961 TGPSC 15 11.141 2.4654 0.38012 3.4 0.0000 0.2852

169

BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHIEUCC FILE INVITRO7 7/12/13 23:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V003 CHIEUCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 1.69582 .565275 43.68 0.000 3 2 NLAI 2 .189500E-01 .947500E-02 0.73 0.522 3 * RESIDUAL 6 .776501E-01 .129417E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 1.79242 .162948 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITRO7 7/12/13 23:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V004 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.33220 .777400 164.53 0.000 3 2 NLAI 2 .244500E-01 .122250E-01 2.59 0.154 3 * RESIDUAL 6 .283497E-01 .472495E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.38500 .216818 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE INVITRO7 7/12/13 23:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien VARIATE V005 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.34896 .782986 65.05 0.000 3 2 NLAI 2 .221167E-01 .110583E-01 0.92 0.451 3 * RESIDUAL 6 .722168E-01 .120361E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.44329 .222117 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO7 7/12/13 23:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHIEUCC SOLA HSNC CT1 3 3.85000 4.35000 1.59333 CT2 3 3.54000 4.86000 2.08333 CT3 3 3.25000 5.54000 2.83000 CT4 3 2.83000 5.21000 2.07000 SE(N= 3) 0.656802E-01 0.396861E-01 0.633407E-01 5%LSD 6DF 0.227198 0.137280 0.219106 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI -----------------------------------------------------------------------------

170

NLAI NOS CHIEUCC SOLA HSNC 1 4 3.40500 5.01000 2.19500 2 4 3.38500 5.03250 2.09000 3 4 3.31250 4.92750 2.14750 SE(N= 4) 0.568807E-01 0.343691E-01 0.548547E-01 5%LSD 6DF 0.196760 0.118888 0.189751 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO7 7/12/13 23:15 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thi nghien bo tri hoan toan ngau nhien F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | CHIEUCC 12 3.3675 0.40367 0.11376 3.4 0.0004 0.5223 SOLA 12 4.9900 0.46564 0.68738E-01 1.4 0.0000 0.1543 HSNC 12 2.1442 0.47129 0.10971 5.1 0.0002 0.4508 16. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin và thanh hoạt tính trong môi trường MS đến khả năng ra rễ dòng H6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCRARE FILE INVITR10 8/12/13 9:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V003 TLCRARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 15.1506 3.78766 10.23 0.003 3 2 NLAI 2 .205654 .102827 0.28 0.767 3 * RESIDUAL 8 2.96329 .370411 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 18.3196 1.30854 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SORE FILE INVITR10 8/12/13 9:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V004 SORE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.73984 .684960 20.35 0.000 3 2 NLAI 2 .280934E-01 .140467E-01 0.42 0.676 3 * RESIDUAL 8 .269240 .336550E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3.03717 .216941 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDAIRE FILE INVITR10 8/12/13 9:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V005 CDAIRE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN =============================================================================

171

1 CT$ 4 4.39363 1.09841 138.31 0.000 3 2 NLAI 2 .443333E-01 .221667E-01 2.79 0.120 3 * RESIDUAL 8 .635334E-01 .794168E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4.50149 .321535 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITR10 8/12/13 9:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLCRARE SORE CDAIRE CT1 3 97.5733 5.27333 1.87333 CT2 3 100.000 6.56667 3.44333 CT3 3 100.000 5.76667 2.88667 CT4 3 100.000 5.91333 2.95333 CT5 3 98.5033 5.60667 2.34000 SE(N= 3) 0.351384 0.105917 0.514512E-01 5%LSD 8DF 1.14583 0.345384 0.167777 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLCRARE SORE CDAIRE 1 5 99.0500 5.86800 2.71600 2 5 99.3060 5.84200 2.75600 3 5 99.2900 5.76600 2.62600 SE(N= 5) 0.272181 0.820427E-01 0.398539E-01 5%LSD 8DF 0.887553 0.267533 0.129960 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITR10 8/12/13 9:32 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLCRARE 15 99.215 1.1439 0.60861 0.6 0.0035 0.7668 SORE 15 5.8253 0.46577 0.18345 3.1 0.0004 0.6759 CDAIRE 15 2.6993 0.56704 0.89116E-01 3.3 0.0000 0.1195 17. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin và thanh hoạt tính trong môi trường MS đến khả năng ra rễ dòng H7 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLCRARE FILE INVITRO9 8/12/13 9:24 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V003 TLCRARE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 15.1627 3.79067 7.12 0.010 3 2 NLAI 2 .449332 .224666 0.42 0.673 3 * RESIDUAL 8 4.25732 .532165 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 19.8693 1.41924

172

----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SORE FILE INVITRO9 8/12/13 9:24 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V004 SORE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4.49136 1.12284 19.75 0.000 3 2 NLAI 2 .120280 .601400E-01 1.06 0.393 3 * RESIDUAL 8 .454720 .568400E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 5.06636 .361883 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDAIRE FILE INVITRO9 8/12/13 9:24 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V005 CDAIRE LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2.92871 .732177 194.64 0.000 3 2 NLAI 2 .764400E-01 .382200E-01 10.16 0.007 3 * RESIDUAL 8 .300936E-01 .376170E-02 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 3.03524 .216803 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITRO9 8/12/13 9:24 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLCRARE SORE CDAIRE CT1 3 97.5333 6.83000 2.22000 CT2 3 98.6000 6.91000 2.36000 CT3 3 100.000 7.37000 2.55000 CT4 3 100.000 8.35000 3.47667 CT5 3 100.000 7.57000 2.78333 SE(N= 3) 0.421175 0.137647 0.354104E-01 5%LSD 8DF 1.37341 0.448853 0.115470 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLCRARE SORE CDAIRE 1 5 99.4200 7.30400 2.77800 2 5 99.2600 7.52200 2.64000 3 5 99.0000 7.39200 2.61600 SE(N= 5) 0.326241 0.106621 0.274288E-01 5%LSD 8DF 1.06384 0.347680 0.894426E-01 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITRO9 8/12/13 9:24 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI |

173

(N= 15) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLCRARE 15 99.227 1.1913 0.72950 0.7 0.0100 0.6730 SORE 15 7.4060 0.60157 0.23841 3.2 0.0005 0.3928 CDAIRE 15 2.6780 0.46562 0.61333E-01 2.3 0.0000 0.0066 18. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây cẩm chướng in vitro dòng H6 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE INVITR11 8/12/13 10:16 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V003 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 216.143 108.071 22.79 0.008 3 2 NLAI 2 1.70535 .852675 0.18 0.842 3 * RESIDUAL 4 18.9661 4.74153 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 236.814 29.6018 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE INVITR11 8/12/13 10:16 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V004 CCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 3.43460 1.71730 79.94 0.001 3 2 NLAI 2 .234867 .117433 5.47 0.073 3 * RESIDUAL 4 .859336E-01 .214834E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 3.75540 .469425 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITR11 8/12/13 10:16 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V005 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 2.47469 1.23734 26.40 0.007 3 2 NLAI 2 .494422 .247211 5.27 0.077 3 * RESIDUAL 4 .187511 .468778E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 3.15662 .394578 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITR11 8/12/13 10:16 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLSONG CCC SOLA CT1 3 83.5500 7.84000 12.3000

174

CT2 3 91.6233 8.68000 12.6833 CT3 3 95.2800 9.35000 13.5533 SE(N= 3) 1.25718 0.846235E-01 0.125004 5%LSD 4DF 4.92789 0.331706 0.489987 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLSONG CCC SOLA 1 3 90.1967 8.46000 12.6933 2 3 90.6600 8.84333 13.1767 3 3 89.5967 8.56667 12.6667 SE(N= 3) 1.25718 0.846235E-01 0.125004 5%LSD 4DF 4.92789 0.331706 0.489987 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITR11 8/12/13 10:16 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLSONG 9 90.151 5.4407 2.1775 2.4 0.0083 0.8416 CCC 9 8.6233 0.68515 0.14657 1.7 0.0015 0.0728 SOLA 9 12.846 0.62815 0.21651 1.7 0.0067 0.0766

19. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống của cây cẩm chướng in vitro dòng H7 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLSONG FILE INVITR12 8/12/13 10:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V003 TLSONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 259.185 129.593 60.12 0.002 3 2 NLAI 2 16.2525 8.12623 3.77 0.121 3 * RESIDUAL 4 8.62287 2.15572 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 284.061 35.5076 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE INVITR12 8/12/13 10:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V004 CCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 2.42169 1.21084 27.06 0.006 3 2 NLAI 2 .143289 .716444E-01 1.60 0.309 3 * RESIDUAL 4 .178978 .447445E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 2.74396 .342995 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOLA FILE INVITR12 8/12/13 10:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3

175

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên VARIATE V005 SOLA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 2.25849 1.12924 61.90 0.002 3 2 NLAI 2 .501556E-01 .250778E-01 1.37 0.352 3 * RESIDUAL 4 .729779E-01 .182445E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 2.38162 .297703 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE INVITR12 8/12/13 10:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên MEANS FOR EFFECT CT$ ----------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLSONG CCC SOLA CT1 3 82.6533 7.85000 11.9600 CT2 3 91.5567 8.57000 12.5467 CT3 3 95.4800 9.11667 13.1867 SE(N= 3) 0.847687 0.122126 0.779839E-01 5%LSD 4DF 3.32275 0.478709 0.305680 ----------------------------------------------------------------------------- MEANS FOR EFFECT NLAI ----------------------------------------------------------------------------- NLAI NOS TLSONG CCC SOLA 1 3 90.3000 8.37000 12.4600 2 3 88.0867 8.67667 12.6033 3 3 91.3033 8.49000 12.6300 SE(N= 3) 0.847687 0.122126 0.779839E-01 5%LSD 4DF 3.32275 0.478709 0.305680 ----------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE INVITR12 8/12/13 10:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 5 Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION – 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ |NLAI | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | | NO. BASED ON BASED ON % | | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | | TLSONG 9 89.897 5.9588 1.4682 1.6 0.0021 0.1206 CCC 9 8.5122 0.58566 0.21153 2.5 0.0064 0.3088 SOLA 9 12.564 0.54562 0.13507 1.1 0.0020 0.3519

176