Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN TRỌNG HỘI NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN BỘ KIT PCR 16 GEN GẮN

HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DÂN

TỘC HỌC VÀ GIÁM ĐỊNH GEN

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số : 62420121

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC 1 Hà Nội - 2015

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Trịnh Đình Đạt

2. PGS.TS. Nguyễn Văn Hà

Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . .vào hồi giờ ngày tháng năm 20...

MỞ ĐẦU

Ở mức độ di truyền, người ta đã ước tính được khoảng 99,7% hệ gen người là giống nhau, sự khác biệt giữa hai cá thể được tìm thấy trong 0,3% của toàn bộ ADN còn lại trong cơ

thể của mỗi người [38]. Hệ gen người có rất nhiều các trình tự ADN lặp lại, trong đó có các

trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) hay còn được gọi là trình tự lặp lại đơn giản (SSR) hoặc vi vệ tinh (microsatellite). Các STR này thường có kích thước ngắn khoảng từ 100-400 bp, mang các đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp thường có 2-7 bp và được tìm thấy ở vùng ADN không mã

hóa. Chúng nằm rải rác trên tất cả 22 cặp NST thường, cũng như trên cặp NST giới tính X và Y. Các STR trên NST thường có tính đa hình cao hơn so với các STR trên NST Y (Y-STR) do

thiếu sự tái tổ hợp trên NST này. Chúng có một vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền

quần thể và phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) [67].

Vào những năm 1990, các locus STR đầu tiên được sử dụng trong các PTN phân tích ADN nhận dạng cá thể người. Ngày nay, kỹ thuật phân tích STR là một công cụ không thể

thiếu được trong các PTN phân tích ADN hình sự [50, 66, 123]. Hiện nay, có khoảng hơn

20.000 locus STR lặp bốn nucleotide (có 4bp trong mỗi đơn vị lặp lại) được xác định có trong hệ gen người [44] và bộ CODIS 13 locus STR lõi do FBI (Mỹ) lựa chọn là bộ locus STR trên

NST thường được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [67].

Mặt khác, công nghệ phân tích STR trên thế giới phát triển cũng rất đa dạng, bao gồm:

Điện di gel polyacrlamide biến tính-nhuộm bạc [27, 99]; đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản [35, 85]; điện di mao quản vi mạch sử dụng microchip [74, 76, 101]; phân tích bằng khối

phổ (mass spectrometry) [38, 39] và công nghệ pyrosequencing (giải trình tự bằng tổng hợp)

[53, 56, 100]. Tuy nhiên, kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản là công nghệ đã được nghiên cứu hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong các PTN phân tích ADN hình sự

trên thế giới với những ưu điểm: độ nhạy và chính xác cao; thời gian phân tích mẫu nhanh

(được tính bằng phút); việc phân tích mẫu được thực hiện một cách tự động và có thể phân tích

với quy mô số lượng mẫu lớn (xây dựng tàng thư ADN) [35].

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR trong nhận dạng cá thể

người cũng đã được phát triển mạnh mẽ từ những năm 2000 đến nay với những nghiên cứu về tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho các locus STR (từ 2- 4 locus), xây dựng thang alen cho các locus STR (2-3 locus), chế tạo các bộ kit PCR (3-4 locus STR) và sử dụng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc để phát hiện các alen STR [1-3, 7, 9-12]. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu khảo sát tần suất alen của các locus STR cũng được thực hiện trên dân tộc người Mường (N=107, với ba locus D5S818-D13S317-D7S820) [5] và người Kinh [8, 13]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu thăm dò ban đầu, các dữ liệu

tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người chưa phản ánh đầy đủ cho các quần

thể nghiên cứu. Mặt khác, công nghệ phân tách và phát hiện các alen STR được sử dụng trong

các nghiên cứu này chủ yếu là dùng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc còn có nhiều mặt hạn chế như: Độ nhạy và chính xác chưa cao; thời gian phân tích mẫu lâu

(được tính bằng ngày); việc phân tích mẫu không thực hiện tự động được và kết quả phân tích

mẫu phụ thuộc rất nhiều vào thao tác cũng như kinh nghiệm của người làm thí nghiệm.

Xuất phát từ những lý do trên, việc thực hiện luận án “Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định gen” là

hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết.

 Mục tiêu nghiên cứu 1. Chế tạo bộ kit PCR 16 locus (gen) gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản. 2. Ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định ADN.

 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Nhóm đối tượng nghiên cứu chính là các cá thể người thuộc ba dân tộc của Việt Nam là: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng.

 Nội dung nghiên cứu

1. Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao

quản.

2. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở

ba dân tộc người Việt Nam (người Kinh, người Mường và người Khmer).

3. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận dạng cá thể

người (giám định ADN) tại Việt Nam.

 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

1. Bổ sung dữ liệu tần suất alen 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) của người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng vào CSDL STR của người Việt Nam phục vụ cho công tác nghiên cứu di truyền quần thể và giám định ADN tại Việt Nam.

2. Tạo ra được các bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản, giúp cho chủ động về công nghệ, đáp ứng các nhu cầu về phân tích ADN nhận dạng cá thể người, xác định huyết thống, làm thẻ ADN cá nhân, xây dựng CSDL tàng thư ADN, nghiên cứu di truyền quần thể...ở Việt Nam.

 Điểm mới của luận án

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về việc tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang và chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản. Bộ kit mới này, đã được ứng dụng thành công ở hai lĩnh vực nghiên cứu chính. Đó là: 1. Nghiên cứu di truyền quần thể ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh, thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa

Bình, thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng, thu

được 145 alen/15 locus. Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15 locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu trước

đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103]. Kết quả nghiên cứu cũng đã xây

dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS 13 locus STR lõi (do FBI-Mỹ lựa chọn) của 3 quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo.

Cây phả hệ này, đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với

14 quần thể khác nhau trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và người Mường có quan hệ gần gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST).

2. Phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy nguyên cá thể người từ các dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án

(dấu vết máu và tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm

tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống

mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%; đã xây dựng được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân của 10 đối tượng cần kiểm soát an ninh (KSAN) và đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân

thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Các locus STR sử dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình

sự Ngày nay, người ta đã phát hiện ra trong hệ gen người có chứa rất nhiều trình tự ADN lặp lại. Những trình tự lặp lại này thường nằm giữa các gen, chúng có thể khác nhau về kích thước ở các cá thể khác nhau mà không ảnh hưởng đến sức khỏe di truyền của cá thể đó [38].

Các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) cũng được tìm thấy trong hệ gen người. Các STR này đã trở thành các marker di truyền được sử dụng phổ biến hơn trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình sự vì chúng dễ dàng được nhân bội để phân tích bằng kỹ thuật PCR đa mồi [38].

Các tiêu chí để lựa chọn các locus STR sử dụng trong phân tích ADN hình sự bao gồm

[62, 45]:

- Tính dị hợp tử được cao (≥ 70 %); - Có vị trí riêng biệt trên các NST khác nhau; - Có khả năng kết hợp với các locus khác để tạo thành các bộ phức nhiều locus

(multiplex);

- Có tỷ lệ stutter thấp (<15%); - Tỷ lệ đột biến thấp; - Kích thước của các alen nằm trong khoảng từ 100 bp đến 400 bp. Vào năm 1997, FBI (Mỹ) đã đồng ý lựa chọn bộ CODIS 13 locus STR lõi (CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 và D21S11) làm cơ sở cho việc xây dựng tàng thư ADN quốc gia của Mỹ và phục vụ cho công tác điều tra phá án trong tương lai [32]. Bộ CODIS này cho khả năng trùng lặp là

khoảng 1 trong 1.000 tỷ [48]. Ngoài ra, FBI cũng sử dụng thêm locus Amelogenin để xác định giới tính.

Argon ion LASER (488 nm)

Phân tách theo kích thước

Hiện nay, theo như thông báo của FBI đến ngày 01/01/2017, sẽ bổ sung thêm 7 locus STR trên NST thường mới (D1S1656, D2S441, D2S1338, D10S1248, D12S391, D19S433, và D22S1045) vào bộ CODIS hiện có để nâng cấp thành bộ 20 locus STR sử dụng cho việc thiết lập hồ sơ ADN thuộc Hệ thống tàng thư ADN Quốc gia, Mỹ [69, 70]. 1.2. Công nghệ phân tích STR sử dụng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản Đánh dấu huỳnh quang vào các đoạn ADN có thể được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau. Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất được sử dụng đánh dấu các alen STR là sử dụng các thuốc nhuộm huỳnh quang để đánh dấu ở đầu 5' của một mồi PCR (mồi xuôi hoặc mồi ngược). Quá trình đánh dấu này, được thực hiện ngay từ khi đặt tổng hợp mồi. Sau đó, sử dụng các mồi này để PCR nhân bội các locus STR tương ứng sẽ tạo các sản phẩm PCR được đánh dấu [85]. Các sản phẩm PCR này, được điện di phân tách trên hệ thống điện di mao quản. Hai sợi ADN được phân tách ra trong quá trình điện di và chỉ sợi ADN được đánh dấu sẽ được phát hiện bằng thiết bị phát hiện huỳnh quang chuyên dụng [35] (xem Hình 1.7).

ABI Prism spectrograph

Phân tách các màu

Huỳnh quang

3. Phân tách mẫu

CCD Panel (với các kính lọc)

Mao quản (chứa dung dịch polymer)

4. Phát hiện mẫu

2. Lấy mẫu vào mao quản

Phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID

Hỗn hợp các sản phẩm PCR đã được đánh dấu huỳnh quang từ phản ứng PCR đa mồi

5. Phân tích kết quả

1. Chuẩn bị mẫu

Hình 1.7. Sơ đồ mô tả các bước phân tách và phát hiện các alen STR với hệ thống máy điện di mao quản của hãng Applied Biosystems [35].

1.3. Luận giải các vấn đề nghiên cứu của luận án

Qua các bằng chứng và cơ sở khoa học đã được phân tích ở trên cho thấy, các locus STR trên NST thường ở người có một vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình sự (giám định ADN) trên thế giới. Bên cạnh đó, ở thời điểm hiện nay, công nghệ phân tích STR bằng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản đã được

nghiên cứu hoàn thiện, được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng phân tích ADN hình sự trên thế giới và có nhiều ưu việt hơn so với các công nghệ phân tích khác.

Chính vì vậy, trong luận án này đã lựa chọn 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin xác định giới tính để nghiên cứu. Công nghệ được sử dụng trong luận án để phân tách và phát hiện các alen STR này là đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) đang được sử dụng phổ biến ở các PTN phân tích ADN tại Việt Nam.

Trong luận án này, vấn đề nghiên cứu thứ nhất được đặt ra: Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thông điện di mao quản. Để giải quyết được vấn đề nghiên cứu thứ nhất này, các nội dung công việc đã được thực hiện, bao gồm: Tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang; Xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu và Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản.

Sau khi vấn đề nghiên cứu thứ nhất được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ hai của luận án được đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở ba dân tộc người Việt Nam. Ba dân tộc được lựa chọn trong nghiên cứu này là người Kinh sống ở khu vực Hà Nội (6.370.244 người) [126] và thành phố Hồ Chí Minh (6.699.124 người) [126]; người Mường sống ở tỉnh Hòa Bình (501.956 người) [126] và người Khmer sống ở tỉnh Sóc Trăng (397.014 người) [126]. Lý do để lựa chọn ba dân tộc nghiên cứu là: (1) Xuất phát từ nhiệm vụ của đơn vị; (2) Ba dân tộc nghiên cứu đều là các dân tộc chính và có dân số lớn ở Việt Nam (người Kinh có dân số 73.594.427 người, người Mường có dân số 1.268.963 người và người Khmer có dân số 1.260.640 người [126]); (3) Hiện nay, dựa trên ngôn ngữ sử dụng, 54 dân tộc anh em đang sinh sống trên lãnh thổ Việt Nam được chia thành 8 nhóm dân tộc chính, trong đó người Kinh và người Mường đều thuộc nhóm Việt- Mường (Vietic) còn người Khmer thuộc nhóm Môn-Khmer (Austroasiatic) [127, 128]. Điều này cũng cần phải được kiểm chứng dựa trên các bằng chứng khoa học khác.

Các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện để giải quyết vấn đề nghiên cứu thứ hai này, bao gồm: Khảo sát tần suất alen cho 15 locus STR nghiên cứu trong ba quần thể người Kinh, người Mường và người Khmer bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang và So sánh mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với một số quần thể tham khảo khác nhau trên thế giới bằng cây phả hệ di truyền.

Sau khi vấn đề thứ hai được giải quyết, vấn đề nghiên cứu thứ ba còn lại của luận án đƣợc đặt ra là: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam. Để giải quyết được vấn đề thứ ba còn lại này, các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện như sau: Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong một số vụ án; Phân tích một số loại dấu vết ADN thu được từ một số đối tượng cần KSAN và Làm thẻ ADN cá nhân phục vụ công tác an ninh và dân sinh.

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Nguồn mẫu sử dụng cho nghiên cứu

 Nguồn mẫu dùng cho tối ưu phản ứng PCR đa mồi: Mẫu ADN chuẩn 9947A (10ng/l) của

hãng Promega (Code: DD1001).

 Nguồn sử dụng cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen: 514 mẫu máu của 514 cá thể khác nhau thuộc ba dân tộc nghiên cứu là: người Kinh (300 mẫu gồm 122 nam và 178 nữ) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (104 mẫu gồm 63 nam và 41 nữ) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (110 gồm 60 nam và 50 nữ) sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam.

 Nguồn mẫu sử dụng cho ứng dụng phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định

ADN)

+ Các mẫu sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án do Phòng Kỹ thuật Hình sự (PC54) - Công an thành phố (CATP) Hải Phòng cung cấp, bao gồm: mẫu dấu vết máu, mẫu tinh trùng và răng của tử thi.

+ Ba mươi mẫu dấu vết ADN (9 mẫu tăm bông thu trên miệng cốc uống nước; 5 mẫu ống hút dùng để uống nước; 3 mẫu bàn chải đánh răng; 9 mẫu đầu mẩu thuốc lá và 4 mẫu dao cạo râu) thu được từ 10 đối tượng cần KSAN do Phòng 4 - Cục Bảo vệ Chính trị VI (A67) - Bộ Công an cung cấp.

+ Một nghìn mẫu máu của 1.000 cá thể thuộc các nhóm đối tượng mà có nghề nghiệp tiềm ẩn nguy cơ rủi do cao như phi công, tiếp viên hàng không và ngư dân (trong đó, đã bao gồm cả 300 mẫu của người Kinh được lựa chọn cho nghiên cứu khảo sát tần suất alen).

Tất cả các mẫu sinh phẩm này đều được lưu giữ ở -20oC, tại PTN Công nghệ gen và Vi

sinh, Viện Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Bộ Công an. 2.1.2. Bộ 16 locus nghiên cứu

Bộ 16 locus nghiên cứu bao gồm 15 locus STR nằm trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) và locus Amelogenin để xác định giới tính. 2.1.3. Bộ 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang Được nêu ở Bảng 2.1 như sau:

Bảng 2.1. Kết quả đặt tổng hợp 16 cặp mồi PCR gắn huỳnh quang [83] (Nguồn: IDT, 2012).

Mồi

Đầu 5’

Trình tự nucleotide (5’>>>>>>>3’)

ACTGCAGTCCAATCTGGGT

ATGAAATCAACAGAGGCTTGC

GTGATTCCCATTGGCCTGTTC

GC (%) 52,6 42,8 52,3 50,0 40.9 38,4 45,0 33.3 34,4 27,2

Tm (oC) 56,4 53,7 56,5 57,8 52,5 54,2 53,4 54,6 54,4 55,8

OD260 Nồng độ (nmol) 40,3 23,5 28,1 31,7 39,2 17,2 19,6 45,3 37,1 17,0

8,2 5,5 5,8 7,6 9,7 4,7 4,2 14,2 11,7 5,9

MW (g/mol) 5.803 7.000 6.916 6.750 6.718 8.497 6.669 8.182 7.980 10.678

OH FL FL OH OH FL FL OH OH FL

Tinh sạch HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC

Bảng 2.1. Tiếp theo...

OD260 Nồng độ

43,5 34,6 42,6 52,6 GC 47,6 (%) 37,5 45,8 41,3 8 45,8 45,5 52,6 29,6

53,5 55,1 59,0 55,8 Tm (oC) 54,6 51,9 55,5 58,2 56,4 56,3 53,3 51,7

7,2 3,4 12,0 3,0 4,8 10,3 10,4 3,3 4,2 7,9 2,5 12,0

31,7 12,6 38,7 13,5 21,3 (nmol) 41,0 35,9 11,1 15,9 35,8 11,4 38,3

7.002 8.570 8.139 6.515 MW 7.158 (g/mol) 7.237 7.505 9.611 8.123 6.667 6.608 8.281

D3_F D3_R TH_F TH_R ATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTC D21_F ATATGTGAGTCAATTCCCCAAG D21_R TGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGAC TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA D18_F D18_R ATTCTACCAGCAACAACACAAATAAAC ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATA PeE_F PeE_R TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACA ATTT GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC D5_F D5_R AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCT D13_F ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA D13_R GGCAGCCCAAAAAGACAGA Trình tự nucleotide Mồi ATGTTGGTCAGGCTGACTATG D7_F (5’>>>>>>>3’) D7_R GATTCCACATTTATCCTCATTGAC GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAG D16_F D16_R GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATC CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGT CSF_F CSF_R ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTT GAAGGTCGAAGCTGAAGTG PeD_F PeD_R ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG

HPLC HPLC HPLC HPLC Đầu 5’ Tinh HPLC sạch HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC HPLC

OH JOE OH JOE JOE OH OH JOE JOE OH JOE OH

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Luận án đã sử dụng 2 nhóm phương pháp nghiên cứu chính như sau:

2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.1. Tách chiết ADN hệ gen người bằng Chelex [118] 2.2.1.2. Tách chiết ADN hệ gen người bằng phương pháp “salting out” 2.2.1.3. Tách chiết ADN hệ gen người từ mẫu xương bằng kit DNA IQ Systems 2.2.1.4. Định lượng ADN bằng máy quang phổ Nanodrop 2.2.1.5. Phương pháp tối ưu phản ứng PCR đa mồi [81, 83, 89] 2.2.1.6. Phương pháp xây dựng thang alen bằng PCR đa mồi 2.2.1.7. Phương pháp chế tạo kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao

quản

2.2.1.8. Phương pháp PCR sử dụng kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang 2.2.1.9. Kỹ thuật điện di mao quản trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer 2.2.2. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm 2.2.2.1. Kiểm tra mồi bằng phần mềm FastPCR, OligoAnalyzer và BLAST 2.2.2.2. Phân tích kiểu gen bằng phần mềm GenMapper® ID 2.2.2.3. Xử lý dữ liệu thống kê bằng phần mềm EasyDNA_PopuData 2.2.2.4. Xây dựng cây phả hệ di truyền bằng phần mềm POPTREE 2

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao

quản 3.1.1. Kết quả tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang 3.1.1.1. Kết quả tối ưu thành phần PCR đa mồi

Từ các kết quả tối ưu thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang, luận án đã lựa chọn được các thành phần tối ưu được nêu trong Bảng 3.1 như sau:

Bảng 3.1. Thành phần tối ưu được lựa chọn cho PCR đa mồi của 16 cặp mồi nghiên cứu

Thành phần Nồng độ tối ƣu (cuối cùng) Thể tích cần lấy (l)

Colorless GoTaq® Flexi Buffer (5X) 1,2X

4,8 0,5 dNTP (10mM) 250M

1,75mM 1,0X

1,4 2,0 0,6 3,0 unit

MgCl2 (25mM) HQ 16 plex 10X Primer Mix GoTaq® Hot Start polymerase (5unit/l) ADN 9947A (0,2 - 2,0 ng) Nước deion-không có nuclease 1,0 9,7 0,2 - 2,0 ng -

20,0 Tổng thể tích (l)

3.1.1.2. Kết quả tối ưu chu trình nhiệt PCR đa mồi

Từ các kết quả tối chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đa mồi cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang, luận án đã lựa chọn được chu trình nhiệt tối ưu là: 96 oC - 2 phút; (94 oC - 1 phút; 60 oC - 1 phút; 72 oC - 1 phút) x 30 chu kỳ; 60 oC - 30 phút và giữ ở 15 oC. 3.1.2. Kết quả xây dựng thang alen cho 16 locus nghiên cứu

Sau khi xây dựng được thang alen cho 16 locus nghiên cứu (thực hiện theo phương pháp

được nêu ở Mục 2.2.1.6), chất lượng thang alen được kiểm tra bằng cách như sau: Lấy 1,5l

Thang alen chưa tinh sạch

Thang alen sau khi tinh sạch

thang alen tinh sạch và 0,5 l ILS-600 trộn với 10,0l Hi-Di Formamide. Hỗn hợp này được biến tính bằng máy GenAmpPCR System 9700 ở 95oC trong 3 phút và giữ ở 4oC trong 5 phút. Sau đó, hỗn hợp này được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer. Kết quả điện di được phân tích bằng phần mềm GenMapper® software v.3.2.1 và được nêu trong Hình 3.1 như sau:

Hình 3.1. Kết quả xây dựng thang alen 16 locus nghiên cứu bằng phương pháp PCR đa mồi, được điện di trên hệ thống máy 3130 Gentic Analyzer và phân tích bằng phần mềm GenMapper® software v.3.2.1. Nhóm 6 locus đánh dấu JOE (D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO và Penta D) 3.1.3. Kết quả chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang

Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang chế tạo thành công được mô tả ở Hình 3.2 như

Hình 3.2. Mô tả thành phần bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang

Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang này, đã được gửi đi thử nghiệm đánh giá tại 02 PTN phân tích ADN của Viện Khoa Học Hình Sự - Bộ Công an và Viện Pháp Y Quân Đội - Bộ Quốc phòng. Kết quả thử nghiệm đánh giá cho thấy: Bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang (có ký hiệu KIT PCR HQ 16 plex) có chất lượng tốt với độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng tốt cho việc giám định ADN theo công nghệ đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản, cụ thể như sau:

- KIT PCR HQ 16 plex có nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các bộ kit thương mại cùng loại đang được sử dụng ở Việt Nam hiện nay (PowerPlex 16 HS System và AmpFlSTR Identifiler PCR amplification) trên cùng mẫu ADN thử nghiệm là 9947A với dải nồng độ: 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 (ng/20l phản ứng).

- Khả năng sử dụng của KIT PCR HQ 16 plex trong phân tích kiểu gen nhận dạng cá thể người được thử nghiệm đối với 5 mẫu ADN có nồng độ từ 0,5 đến 1,0 (ng/l) và 2 mẫu đối chứng (chứng dương sử dụng 9947A và chứng âm sử dụng nước deion diH2O) đều cho kết quả phân tích kiểu gen chính xác.

- Bộ KIT PCR HQ 16 plex hoàn toàn tương thích với hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer và phân tích kiểu gen bằng phần mềm phân tích kết quả GeneMapper ID v3.2.1 của hãng Applied Biosystems.

3.2. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở ba dân tộc ngƣời Việt Nam 3.2.1. Kết quả khảo sát tần suất alen của 15 locus STR trên NST thường ở ba quần thể người Kinh, người Mường và người Khmer

Sau khi chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang, đã được ứng dụng để khảo sát tần suất alen ở ba quần thể nghiên cứu là người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam. Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm EasyDNA_PopuData [60] cho 15 locus STR nghiên cứu được nêu trong Bảng 3.4, Bảng 3.5 và Bảng 3.6 như sau:

Bảng 3.4. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Kinh (N=300)

Alen

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta_E

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1P0

Penta_D

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

5 6 7 8 9 9.1 9.3 10 11 12 13 13.2 14 15 16 17 18 19 20 21 21.2 22 22.2 23 23.2 24 24.2 25 25.2 26 27 27.2 28 28.2 29 30 30.2 31 31.2 32 32.2 33 33.2 34.2

--- --- --- --- 0,002 --- --- 0,002 0,005 0,055 0,137 0,017 0,204 0,202 0,166 0,077 0,037 0,037 0,025 0,017 --- 0,005 --- 0,007 --- 0,002 --- 0,003 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---

OH

EH

EH_SE

PD

PE

CHI

--- 0,002 --- 0,135 --- 0,31 --- 0,073 --- 0,397 --- --- --- 0,04 --- 0,04 --- 0,003 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002 --- 0,002 --- --- --- 0,055 --- 0,005 --- 0,268 --- 0,231 --- 0,02 --- 0,077 --- 0,065 --- 0,012 --- 0,193 --- 0,007 --- 0,055 --- 0,008 --- 0,803 0,823 0,74 0,72 0,857 0,82 0,02 0,026 0,022 0,877 0,945 0,964 0,719 0,65 0,474 6,43 3,48 3,36 7,81 12,59 7,81 0,936 0,199 0,099

--- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002 0,002 --- 0,295 0,025 0,128 0,257 0,173 0,095 0,02 0,003 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,803 0,791 0,023 0,925 0,594 12,69 18,31 0,195

--- --- 0,01 0,138 0,05 0,005 --- 0,165 0,393 0,207 0,028 --- 0,002 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,75 0,753 0,025 0,905 0,532 6,6 12,59 0,167

--- --- --- 0,002 0,225 --- --- 0,132 0,288 0,222 0,098 --- 0,03 0,003 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,797 0,789 0,024 0,923 0,591 5,44 18,31 0,939

--- --- 0,01 0,002 0,04 --- --- 0,202 0,302 0,352 0,08 --- 0,007 0,003 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,763 0,734 0,026 0,885 0,494 1,4 7,81 0,818

--- --- --- 0,002 0,003 --- --- 0,17 0,145 0,11 0,137 --- 0,157 0,178 0,082 0,015 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,847 0,856 0,02 0,962 0,716 14,41 32,67 0,541

0,057 --- 0,002 0,002 0,015 --- --- 0,037 0,252 0,123 0,063 --- 0,078 0,095 0,057 0,067 0,048 0,04 0,02 0,015 --- 0,012 --- 0,008 --- 0,007 --- 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,897 0,885 0,018 0,978 0,774 11,35 12,59 0,171

--- --- 0,037 0,002 0,048 --- --- 0,241 0,305 0,217 0,135 --- 0,013 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,77 0,78 0,024 0,917 0,574 2,42 12,59 0,200

--- --- 0,003 0,315 0,127 --- --- 0,147 0,211 0,157 0,03 --- 0,01 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,797 0,793 0,023 0,927 0,599 5,84 18,31 0,269

0,002 0,002 0,03 0,087 0,307 --- --- 0,155 0,158 0,142 0,075 --- 0,027 0,005 0,008 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,813 0,821 0,022 0,947 0,653 12,32 18,31 0,343

--- --- 0,003 0,55 0,115 --- --- 0,032 0,278 0,02 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,593 0,605 0,028 0,786 0,308 1,46 7,81 0,691

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,002 --- --- --- 0,002 0,003 0,017 0,092 0,053 0,122 0,012 0,17 0,012 0,131 0,022 0,151 0,017 0,085 0,007 0,075 0,022 0,002 0,002 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,867 0,889 0,018 0,978 0,78 18,49 25 CHI(c) Bảng 3.5. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Mường (N=104) 0,376 p1

--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,003 --- 0,018 0,352 0,345 0,210 0,060 0,012 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,670 0,709 0,026 0,862 0,450 5,18 7,81 0,498

Alen

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta_E

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1P0

Penta_D

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

5 6 7 8 9

--- --- --- --- ---

--- 0,106 0,365 0,029 0,385

--- --- --- --- ---

0,029 --- --- --- ---

--- --- 0,014 --- 0,043

--- --- --- 0,403 0,082

--- --- 0,019 0,154 0,043

--- --- --- --- 0,188

--- --- 0,029 --- 0,010

--- --- 0,024 0,072 0,289

--- --- --- --- ---

--- --- 0,005 0,602 0,072

--- --- --- --- ---

Bảng 3.6. Tần suất alen và các chỉ số thống kê của 15 locus STR trên NST thường ở quần thể người Khmer (N=110)

Alen

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta_E

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1P0

Penta_D

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

5 6 7 8 9 9.1 9.3 10 10.1

--- --- --- --- --- --- --- --- ---

--- 0,105 0,286 0,055 0,359 --- 0,109 0,086 ---

--- --- --- --- --- --- --- --- ---

0,027 --- 0,018 --- 0,009 --- --- 0,032 ---

--- --- 0,023 0,005 0,036 --- --- 0,286 ---

--- --- --- 0,382 0,077 --- --- 0,118 ---

--- --- 0,005 0,141 0,05 0,005 --- 0,217 0,005

--- --- --- 0,014 0,186 --- --- 0,132 ---

--- --- 0,005 --- 0,014 --- --- 0,281 ---

--- --- 0,018 0,082 0,332 --- --- 0,132 ---

--- --- --- --- --- --- --- --- ---

--- --- --- --- --- --- --- 0,095 ---

0,005 --- --- 0,564 0,114 --- --- 0,068 ---

--- --- --- --- --- --- --- --- ---

Tóm lại: Bằng việc sử dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh, luận án đã tiến hành khảo sát thành công sự phân bố tần suất alen cho 15 locus STR (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) ở ba quần thể nghiên cứu: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh, khảo sát thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình, khảo sát thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng, khảo sát thu được 145 alen/15 locus. Kết quả nghiên cứu này, đã bổ sung vào CSDL tần suất alen 15

locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với nghiên cứu trước đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103]. Các giá trị tần suất alen và các chỉ số thống kê cho thấy 15 locus STR sử dụng trong nghiên cứu này đều là các locus STR có tính đa hình cao, có thể sử dụng tốt trong phân tích ADN nhận dạng cá thể, xác định huyết thống và trong nghiên cứu di truyền quần thể. Sự phân bố tần suất alen của 15 locus STR nghiên cứu thu được từ thực nghiệm hoàn toàn phù hợp với định luật Hardy-Weinberg ở trạng thái cân bằng theo tiêu chuẩn 2 với độ tin cậy 95%. Điều này được thể hiện ở các giá trị CHI tính toán từ thực nghiệm của 15 locus STR này ở mỗi quần thể nghiên cứu đều nhỏ hơn các giá trị CHI(c) tương ứng. Ngoài ra, giá trị xác suất trong kiểm định theo định luật Hardy-Weinberg của mỗi locus (p1) cũng được xác định (xem Bảng 3.4; 3.5 và 3.6). 3.2.2. Mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với một số quần thể khác trên thế giới

Từ dữ liệu tần suất alen 13 locus STR thuộc bộ CODIS (do FBI-Mỹ lựa chọn) của ba quần thể nghiên cứu (người Kinh; người Mường và người Khmer) và 14 quần thể tham khảo [26, 52, 71, 72, 84, 98, 103, 119, 121, 122], đã xây dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm POPTREE2 [109]. Cây phả hệ di truyền này, đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với 14 quần thể tham khảo dựa trên các giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST) giữa các quần thể với nhau (xem Hình 3.19). Kết quả nghiên cứu này đã đáp ứng được mục đích mong đợi và cho thấy rằng từ dữ liệu tần suất alen của các locus STR nằm trên NST thường có thể sử dụng tốt cho các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền giữa các quần thể người khác nhau trên trên thế giới (mặc dù các quần thể này hoàn toàn cách ly về địa lý) hoặc các quần thể phân nhỏ (các quần thể người dân tộc) cùng sống trên lãnh thổ của một quốc gia.

Hình 3.19. Cây phả hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với 14 quần thể

3.3. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận dạng cá thể ngƣời 3.3.1. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong một số vụ án

Việc ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để truy nguyên cá thể và truy tìm tung tích nạn nhân từ các mẫu dấu vết sinh phẩm thu được từ hiện trường của một số vụ án tiêu biểu do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp như sau:  Trường hợp 01 (vụ án mạng):

Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) Dấu vết máu

dính trên dao bàu (DV_MÁU_DAO) và (2) mẫu máu của nạn nhân (MÁU_NN).

Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.8 như sau:

Bảng 3.8. Kết quả phân tích ADN từ mẫu DV_MÁU_DAO và mẫu MÁU_NN trong một vụ án mạng xảy ra tại quận Lê Chân, Tp. Hải Phòng bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang.

LOCUS MÁU_NN DV_MÁU_DAO

16 7 30 13 11 11 11 11 11 10 9 X 16 12 8 24.2 17 9 32.2 21 16 13 13 12 13 12 10 Y 16 15 11 24.2 TẦN SUẤT KIỂU GEN (2pq hoặc p2 hoặc q2) (Tính theo dữ liệu tần suất alen của người Kinh, N=300) 0,1449 0,2461 0,0892 0,0047 0,0287 0,0824 0,0127 0,1627 0,0564 0,1422 0,0952 1,0000 0,0164 0,0392 0,3058 0,0003 16 7 30 13 11 11 11 11 11 10 9 X 16 12 8 24.2 17 9 32.2 21 16 13 13 12 13 12 10 Y 16 15 11 24.2 D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D Amelogenin vWA D8S1179 TPOX FGA

TẦN SUẤT KIỂU GEN KẾT HỢP 16 LOCUS: 0,0000000000000000000031

ĐỘ TIN CẬY (CI): 99,99999999999999999969%

Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.8 cho thấy: Mẫu DV_MÁU_DAO và MÁU_NN là của cùng một người với độ tin cậy là 99,99999999999999999969%. Điều này có nghĩa là dao bàu chính là hung khí mà đối tượng đã sử dụng để gây án. Từ kết quả này, qua công tác nghiệp vụ điều tra, cơ quan Cảnh sát Điều tra của quận Lê Chân đã bắt được đối tượng gây án chịu tội trước pháp luật.  Trường hợp 02 (vụ án hiếp dâm trẻ em):

Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) Dấu vết tinh dịch thu được trên quần lót của nạn nhân (DV_Q. LÓT_NN); (2) mẫu máu của đối tượng nghi vấn 01 (MÁU_ĐT_01); (3) mẫu máu của đối tượng nghi vấn 02 (MÁU_ĐT_02) và (4) mẫu máu của nạn nhân (MÁU_NN).

Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.9 như sau:

Bảng 3.9. Kết quả phân tích ADN từ mẫu DV_Q. LÓT_NN và mẫu MÁU_ĐT_01 trong một vụ án hiếp dâm xảy ra tại quận Dương Kinh, Tp. Hải Phòng bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang.

LOCUS MÁU_ĐT_01 DV_Q. LÓT_NN

TẦN SUẤT KIỂU GEN (2pq hoặc p2 hoặc q2) (Tính theo dữ liệu tần suất alen của người Kinh, N=300) 0,1190 0,2461 0,0534 0,0559 0,0061 0,1046 0,0445 0,0571 0,0435 0,1422 0,0449 1,0000 0,0755 0,0375 0,3058 0,0045 16 7 30 13 14 10 11 8 12 10 11.2 X 14 13 8 18 16 9 30 14 14 12 11 12 13 12 12 Y 16 13 11 23 16 7 30 13 14 10 11 8 12 10 11.2 X 14 13 8 18 16 9 30 14 14 12 11 12 13 12 12 Y 16 13 11 23 D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D Amelogenin vWA D8S1179 TPOX FGA

TẦN SUẤT KIỂU GEN KẾT HỢP 16 LOCUS: 0,00000000000000000015 ĐỘ TIN CẬY (CI): 99,999999999999999985%

Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.9 cho thấy: Kiểu gen 16 locus thu được từ mẫu DV_Q. LÓT_NN hoàn toàn trùng khớp với kiểu gen 16 locus của mẫu MÁU_ĐT_01. Điều này có nghĩa là: Mẫu DV_Q. LÓT_NN và mẫu MÁU_ĐT_01 là của cùng một người với độ tin

cậy là 99,999999999999999985%. Từ kết quả này, qua công tác nghiệp vụ điều tra đối tượng tình nghi 01 đã khai nhận với cơ quan Cảnh sát điều tra và chịu tội trước pháp luật.  Trường hợp 03 (vụ án truy tìm tung tích nạn nhân):

Mẫu phân tích do Phòng PC54 - CATP Hải Phòng cung cấp bao gồm: (1) 02 răng cửa của một xác chết chưa rõ tung tích (RĂNG_NN) và (2) mẫu máu của bà Đặng Thị L (MÁU_ĐTL).

Kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.10 như sau:

Bảng 3.10. Kết quả phân tích ADN từ mẫu RĂNG_NN và mẫu MÁU_ĐTL trong một vụ án truy tìm tung tích nạn nhân xảy ra tại phường Anh Dũng, quận Dương Kinh, Tp. Hải Phòng bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang.

MÁU_ĐTL RĂNG_NN LOCUS

MI (Tính theo dữ liệu tần suất alen của người Kinh, N=300) 0,7175 1,4410 3,8226 2,1716 4,3398 3,1342 3,1466 1,4326 1,9334 1,2065 3,5818 1,0000 4,7223 1,7078 0,9171 4,0867 14 7 31.2 13 13 10 8 8 9 10 9 X 19 13 9 19 15 9 32.2 15 17 12 8 10 11 11 12 X 19 15 11 21 D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D Amelogenin vWA D8S1179 TPOX FGA

15 17 7 9 31 31.2 15 17 11 13 10 12 8 8 10 11 9 11 10 14 9 12 X X 14 19 13 14 8 11 25.2 19 CMI: 106.376 XÁC SUẤT QUAN HỆ HUYẾT THỐNG MẸ-CON: 99,999%

Từ kết quả được nêu trong Bảng 3.10 cho thấy: Kiểu gen 16 locus thu được từ mẫu so sánh MÁU_ĐTL và RĂNG_NN đều thấy có sự cho-nhận các alen ở cả 16 locus tương ứng. Điều này có nghĩa là: Bà Đặng Thị L là mẹ đẻ của tử thi nạn nhân với xác suất quan hệ mẹ-con là 99,999%. Từ kết quả này, cơ quan Cảnh sát Điều tra - Công an quận Dương Kinh đã làm thủ tục cho gia đình bà Đặng Thị L nhận tử thi nạn nhân về để làm các thủ tục cho người đã chết. 3.3.2. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang phân tích một số loại dấu vết ADN thu được từ 10 đối tượng cần KSAN

Việc xác lập hồ sơ ADN cá nhân từ 30 mẫu dấu vết ADN thử nghiệm thu được từ 10 đối tượng cần KSAN bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang, cho tỷ lệ thành công khác nhau đối với từng loại mẫu dấu vết: Mẫu đầu mẩu thuốc lá và ống hút cho tỷ lệ thành công cao nhất tương ứng là 8/9 và 4/5 mẫu phân tích; mẫu tăm bông thu từ miệng cốc-chén cho tỷ lệ thành

công là 5/9; mẫu dao cạo râu cho tỷ lệ thành công là 2/4 mẫu phân tích và mẫu bàn chải đánh răng cho tỷ lệ thành công thấp nhất là 1/3. Hồ sơ ADN cá nhân gồm 16 locus nghiên cứu của 9/10 đối tượng cần KSAN đã được xác lập và được nêu ở Bảng 3.12 như sau:

Bảng 3.12. Kết quả phân tích kiểu gen 16 locus của 10 đối tượng cần KSAN bằng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang

A W

A G F

v

l e m A

1 0 H T

X O P T

Mẫu

1 1 S 1 2 D

1 5 S 8 1 D

8 1 8 S 5 D

0 2 8 S 7 D

E a t n e P

D a t n e P

7 1 3 S 3 1 D

9 3 5 S 6 1 D

O P 1 F S C

9 7 1 1 S 8 D

8 5 3 1 S 3 D

ĐT_01_DCR ĐT_02_TB

ĐT_03_DCR

18 18 16 17 15 15 14 17 16 17 16 17

9 10 7 8 6 6 6 7 7 9 7 9

28 29 31 32.2 32.2 33.2 32.2 32.2 30 31.2 30 30

14 16 13 16 17 17 12 15 20 21 15 16

11 14 10 11 11 18 10 10 12 19 10 12

8 12 9 12 9 11 8 13 8 12 10 12

11 12 11 12 11 13 8 11 12 12 11 12

11 12 12 12 9 11 9 12 9 12 9 11

10 11 11 13 12 14 11 11 10 10 11 12

X Y X Y X Y X Y X Y X Y

14 16 14 17 14 14 17 18 14 17 14 16

10 13 10 10 11 14 12 15 10 15 11 13

8 11 9 11 8 8 8 8 8 8 8 9

21 23 22 23 22 26 22 22 22 22 26 26

9 11 12 12 11 7 12 12 10 10 11 12 10 11 11 12 8 11 10 12 8 10 11 9 Nhiễm mẫu trong quá trình thu mẫu

10 10

22 22

9 12

8 10

8 12

12 19

20 21

30 30

16 17

8 12

11 12

14 17

X Y

7 9

8 8

10 12 15 14 16 10 10

29 29 32.2 32.2

8 9 8 11

10 11 11 12

10 11 9 11

10 13 9 11

9 14 11 12

15 17 15 17

13 17 14 16

14 16 9 18

10 11 11 12

14 18 16 17

X Y X X

ĐT_04_TB

ĐT_05_BC ĐT_06_TB ĐT_07_OH ĐT_08_TL 6 22 12 ĐT_09_TL 7 22 12 19 8 7 3.3.3. Kết quả ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để làm thẻ ADN cá nhân ĐT_10_OH 21 9 7 phục vụ công tác an ninh và dân sinh

Bằng việc sử dụng bộ kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang, luận án đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân thử nghiệm có kích thước, chất liệu giống với mẫu thẻ nhựa CMND hiện đang lưu hành phục vụ cho công tác an ninh và dân sinh (xem Hình 3.20). Thẻ ADN này được thiết kế họa tiết vân nền bảo an chống làm giả cao, có kích thước quy chuẩn với hình ảnh và các thông tin trên bề mặt thẻ được bố trí hợp lý đảm bảo yếu tố thẩm mỹ cao.

I

II

Hình 3.20. Mô tả mặt trước và mặt sau của mẫu thẻ ADN cá nhân thử nghiệm. I: Mặt trước của thẻ ADN cá nhân với các thông tin: Tên thẻ, mã số thẻ, ảnh chủ thẻ và các thông tin cá nhân (tên chủ thẻ, ngày sinh, dân tộc, quê quán và nơi trường trú). II: Mặt sau của thẻ ADN cá nhân với thông tin về mã vạch và đặc điểm nhận dạng ADN gồm 16 locus (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN:

1. Đã chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ thống điện di mao quản. Bộ kit này đã được thử nghiệm đánh giá tại 02 PTN phân tích ADN của Viện Khoa học Hình sự - Bộ Công an và Viện Pháp Y Quân đội - Bộ Quốc phòng, cho kết quả về độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với các bộ kit thương mại cùng loại (PowerPlex 16 HS System và AmpFlSTR Identifiler PCR amplification) trên cùng một mẫu ADN thử nghiệm là 9947A.

2. Đã xây dựng được bảng tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người cho 15 locus (D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX và FGA) ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống ở tỉnh Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15 locus STR nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu trước đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103].

3. Đã xây dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS (do FBI-Mỹ lựa chọn) của ba quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo. Cây phả hệ này đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa ba quần thể nghiên cứu với 14 quần thể khác nhau trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và người Mường có quan hệ gần gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST).

4. Đã ứng dụng thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang để phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy nguyên cá thể người từ các dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án (dấu vết máu và tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%; đã thiết lập được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân của 10 đối tượng cần KSAN và đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh.

KIẾN NGHỊ:

Tiếp tục ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang này trong nghiên cứu di truyền quần thể ở các quần thể người dân tộc khác nhau; phân tích các loại mẫu dấu vết sinh phẩm khác nhau thường gặp ở hiện trường của các vụ án và xây dựng CSDL nhận dạng ADN (tàng thư) cho các đối tượng khác nhau như: tội phạm, các đối tượng làm việc trong các ngành nghề

đặc thù có nguy cơ rủi do cao (phi công, tiếp viên hàng không, ngư dân, thợ mỏ…), người mất tích, chết vô tung tích… để phục vụ công tác quản lý và công tác giám định.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH

1. Lương Thị Yến, Lê Thị Bích Trâm, Trần Trọng Hội, Bùi Nguyên Hải, Nguyễn Thị Thu

ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

Hoài (2012), “Nghiên cứu tối ưu thành phần PCR sử dụng 16 cặp mồi gắn huỳnh quang trên

hệ thống điện di soi gel huỳnh quang Pharos® FX”, Tạp chí Khoa học Công nghệ & Môi

2. Lê Thị Bích Trâm, Trần Trọng Hội, Bùi Nguyên Hải, Nguyễn Thị Thu Hoài (2012),

trường Công an, Số 29 tháng 10/2012, tr. 51-55 (ISSN: 1859-4514).

“Nghiên cứu phân tích mẫu dấu vết ADN thử nghiệm trên một số vật mang trong điều kiện

phòng thí nghiệm”, Tạp chí Khoa học Công nghệ & Môi trường Công an, Số 30 tháng

3. Trần Trọng Hội, Lê Thị Bích Trâm, Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Hà (2013), “Nghiên

11/2012, Tr. 42-45 (ISSN: 1859-4514).

cứu tối ưu thành phần mutiplex PCR cho 16 cặp mồi gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di

mao quản”, Tạp chí Phân tích Hóa-Lý và Sinh học, T-18 - Số 3/2013, tr. 29-34 (ISSN:

4. Trần Trọng Hội, Lê Thị Bích Trâm, Phạm Đăng Khoa, Hồ Quang Huy, Trịnh Đình Đạt,

0868-3224).

Nguyễn Văn Hà (2015), “Khảo sát tần suất alen của 15 locus STR trên nhiễm sắc thể

thường trong quần thể người Mường sống ở tỉnh Hòa Bình, Việt Nam”, Tạp chí Phân tích

5. Trần Trọng Hội, Trần Thị Hạnh, Phạm Đăng Khoa, Hồ Quang Huy, Trịnh Đình Đạt,

Hóa-Lý và Sinh học, T-20 - Số 3/2015, tr. 208-214 (ISSN: 0868-3224).

Nguyễn Văn Hà (2015), “Sự đa dạng di truyền của 15 locus STR trên nhiễm sắc thể thường

trong quần thể người Khmer sống ở tỉnh Sóc Trăng, Việt Nam”, Tạp chí Phân tích Hóa-Lý

và Sinh học, T-20 - Số 4/2015, tr. 152-160 (ISSN: 0868-3224).