Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium Lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne SP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM

LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU

RỄ MELOIDOGYNE SP.

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM

LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU

RỄ MELOIDOGYNE SP.

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 60 42 01 07

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2013

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu,

những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá trình làm luận

văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn vi sinh đã giảng dạy, chỉ dẫn cho em trong suốt

quá trình học tập.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt

Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài.

Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã xin ra con nuôi nấng, dạy dỗ và luôn

động viên con trong những lúc con gặp khó khăn.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khoá vi sinh vật 22 đã cùng em

chia sẽ những khó khăn trong quá trình học tập.

1

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. 1 MỤC LỤC .................................................................................................................... 2

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT ..................................................................................... 5

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 6

1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................................ 6

2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................................... 6

3. Nhiệm vụ ......................................................................................................................... 7

4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................... 7

5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 7

6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7

7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu ...................................................................... 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 8

1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum ............................................... 8

1.1.1 Vị trí phân loại .......................................................................................................... 8

1.1.2. Lịch sử nghiên cứu .................................................................................................. 9

1.1.3. Đặc điểm sinh học ................................................................................................... 9

1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum .................................................................. 10

1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến trùng ở Việt Nam và trên thế giới ............................................................................................. 12

1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. ..................................................................... 13

1.2.1. Đặc trưng sinh học ................................................................................................ 13

1.2.2. Các loài quan trọng ............................................................................................... 15

1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng ................................................................................. 15

1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi ............................ 22

1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi ..................................................................... 22

1.3.2. Môi trường nuôi cấy .............................................................................................. 24

1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon ................................................................... 24

1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen ................................................................. 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 25

2. 1. Vật liệu ...................................................................................................................... 25

2. 2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 25

2. 3. Hóa chất .................................................................................................................... 25

2

2. 4. Môi trường ................................................................................................................ 26

2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA ) .............................................................................................. 26

2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26

2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) . 26

2. 5. Các phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 26

2.5.1. Phương pháp phân lập ........................................................................................... 26

2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ......................................................... 27

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi ......................................... 28

2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử ...................................... 28

2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng .................................................................. 29

2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng ............................................................................. 29

2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái ............................................ 30

2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro .................................................................................. 31

2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ........................................................... 32

2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov ................................................... 33

2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật............................................. 33

2.5.11. Các phương pháp khác ........................................................................................ 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 34

3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng ....................... 34

3.1.1. Phân lập ................................................................................................................. 34

3.1.2. Định danh .............................................................................................................. 34

3.2. Kết quả định danh tuyến trùng .............................................................................. 38

3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều kiện in vitro ....................................................................................................................... 40

3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp. trong điều kiện in vitro.............................................................................................................. 40

3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây chuối ...................................................................................... 42

3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum ......................................................... 45

3.4.1 Ảnh hưởng của pH ................................................................................................. 45

3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon ....................................................... 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 59

3

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 60

PHỤ LỤC ................................................................................................................... 64

4

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT

C: cacbon

N: nitơ

PGA: potato glucose agar

5

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp lâu đời. Hàng năm chúng ta cung ứng rất

nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại trong nước và còn xuất khẩu sang các

nước. Các mặt hàng nông sản xuất khẩu tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay những mặt

hàng nông sản trái cây với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho nền kinh tế đất nước.

Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có khi thất thoát.

Nguyên nhân gây ra thực trạng trên có thể là do ảnh hưởng của khí hậu, thiên tai và đặc biệt

là dịch bệnh.

Dịch bệnh ở cây trồng do các tác nhân sinh học gây ra như: virut, nấm, tuyến

trùng...thì trong số các đối tượng đó vấn đề bệnh do tuyến trùng gây ra chưa được nghiên

cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn.

Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ

ký sinh lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật.

Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5 % sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng

ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính là hàng trăm tỷ USD mỗi năm.

Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển,

hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tiểu

biểu như nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. ký sinh ở rễ một số cây như cà phê,

hồ tiêu, cà chua, cà rốt... gây ra những tổn thất đáng kể đặc biệt là những mặt hàng nông sản

thế mạnh như cà phê, hồ tiêu.

Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ trên các đối tượng cây trồng trên có các biện pháp

như: dùng các tác nhân cơ học, hoá học, sinh học...Trong số các biện pháp trên thì biện pháp

phòng trừ tuyến trùng bằng các tác nhân sinh học như dùng các loại vi khuẩn Pasteuria

penetrans, nấm (Nematoctonus concurrens và N. haptocladus, Purpureocillium lilacinum...)

đang rất được quan tâm.

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân

lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Góp phần nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi các tác nhân sinh học là nấm Purpureocillium lilacinum.

6

3. Nhiệm vụ

- Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh. - Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum. - Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp. - Thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm Purpureocillium lilacinum.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển sinh khối và hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.

4. Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh. - Tuyến trùng Meloidogyne sp. phân lập từ đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng.

5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số 7 đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp

Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương.

Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP. 6, P. Linh Trung, Quận Thủ Đức,

TP.HCM.

Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013

6. Ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu

Góp phần tìm hiểu về đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy và khả năng diệt tuyến

trùng bướu rễ Meloidogyne sp. của Purpureocillium lilacinum.

7. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Trên cơ sở những kết quả thu được trong quá trình khảo sát khả năng phòng trừ tuyến

trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ đó ứng dụng vào sản xuất các chế

phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. cho cây trồng.

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về nấm Purpureocillium lilacinum

1.1.1 Vị trí phân loại

(Kingdom) : Nấm − Giới

− Ngành (Division): Ascomycota

− Lớp (Class): Sordariomycetes

− Bộ (Order): Hypocreales

− Họ (Family): Ophiocordycipitaceae

− Chi (Genus) : Purpureocillium (theo Luangsa-ard, Hywel-Jones, Houbraken & Samson

(2011))

− Loài: Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou- braken, Hywel-Jones &

Samson (2011)

Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium

lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923)

Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974).

Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi đơn loài có

chứa loài duy nhất là Purpureocillium lilacinum, là loài nấm sợi hoại sinh phổ biến. Nó

đựơc phân lập từ một loạt các môi trưòng sống bao gồm đất trồng và đất bỏ hoang, rừng,

đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải và côn trùng. Nó cũng đã đựơc tìm

thấy trong trứng giun tròn, tuyến trùng nang. Ngoài ra nó còn đựơc phát hiện thường xuyên

trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng. Chúng có thể phát triển ở phạm vi nhiệt độ rộng từ 8-38 oC, và nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu trong khoảng 26-30 oC. Nó cũng có khả năng chịu

đựng pH rộng 2-10 và có thể phát triển trên nhiều loại bề mặt khác nhau.

Purpureocillium lilacinum đựơc cho là có tiềm năng sử dụng để kiểm soát sự phát

triển của tuyến trùng rễ [16],[19].

8

1.1.2. Lịch sử nghiên cứu

Các loài đựơc mô tả bởi nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên

gọi Penicillium lilacinum.

Vào năm 1974 Charles Thom chuyển các loài này thành Paecilomyces. Những ấn

phẩm trong thập niên 20 chỉ ra chi Paecilomyces không phải là đơn ngành mà có quan hệ

mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola.

Chi mới Purpureocillium được tạo ra để tổ chức các đơn vị phân loại. Tên gọi chung

này đề cập đến các bào tử tím được tạo ra bởi nấm này.

1.1.3. Đặc điểm sinh học

Purpureocillium lilacinum tạo thành một sợi nấm dầy đặc làm phát sinh cành bào tử phân

sinh. Phần cuối của thể bình mang những bào tử được xếp thành chuỗi. Bào tử nảy mầm khi

có độ ẩm và chất dinh dưỡng thích hợp.

Khuẩn lạc trong môi trường thạch Malt phát triển nhanh, đạt đuờng kính 5-7cm trong vòng 14 ngày ở 15oC, bao gồm những sợi nấm khí sinh ban đầu có màu trắng nhưng khi

hình thành bào tử thì có sự thay đổi sắc thái thành màu đỏ rượu vang.

Sợi dinh dưỡng có thành bao trơn, trong suốt, kích thứơc 2.5-4 mm. Cuống sinh bào tử

phát sinh từ sợi ký sinh hoặc phát sinh từ sợi nấm khí sinh. Cuống sinh bào tử dài khoảng

400-600 μm.

Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu giống như một cái cổ. Bào tử

trong chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn đến hơi nhám.

Không có bào tử chống chịu [19].

9

Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm

Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36]

1.1.4. Vai trò của Purpureocillium lilacinum

a. Tác nhân kiểm soát tuyến trùng

Purpureocillium lilacinum là một loài nấm bông phổ biến với phạm vi phân bố rộng

trên toàn thế giới (Samson, 1974) và đã được thử nghiệm rộng rãi nhất cho sự kiểm soát của

bệnh sần rễ và u nang tuyến trùng.

Purpureocillium lilacinum sử dụng chủ yếu trong điều kiện nhiệt đới, ví dụ như, ở

Philippines (Jatala, 1986) và Cộng hòa Nam Phi (Neethling, 2002). Loài này có hiệu quả

chống lại các loài tuyến trùng khác nhau gây bệnh thực vật, và chủ yếu lây nhiễm trứng và

con cái tuyến trùng (Amancho và Sasser năm 1995; Borisov năm 1998; Pandey và Trivedi,

1990; Silva và cộng sự, 1992;. Sosnowska năm 2001; Zaki, 1994). Wang và cộng sự.

(2001).

Quan sát một số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng ở Đông Trung Quốc có

sự khác biệt lớn trong khả năng gây bệnh giữa các chủng Purpureocillium lilacinum

(Rodriguez- Kabana et al., 1984). Ở Ba Lan, một dòng nội địa của loại nấm này loài được

nghiên cứu như một tác nhân sinh học tiềm năng chống lại

tuyến trùng sần rễ trong nhà kính (Sosnowska, 2003).

Hiện nay, Purpureocillium lilacinum là loài nấm chỉ có mục đích thương mại để

kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh ở châu Âu, và chủng nấm 251 thương mại được đăng ký để

bán ở một số nước (Atkins et al., 2005). Bởi vì nó được phân loại như một

microbiopesticide [23].

Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng:

Trứơc khi xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào

bề mặt trứng và trở nên sát gần với trứng. Purpureocillium lilacinum sản xuất những tế bào

chuyên biệt điển hình để lây nhiễm ở khắp nơi trên bề mặt trứng của tuyến trùng. Những tế

bào chuyên biệt tương tự như những mấu lồi ở phần cuối của một sợi nấm giúp áp sát vỏ

trứng. Sau khi sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên

trong sau đó sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử ra phía ngoài xâm nhiễm các trứng liền kề

[19].

10

Hình 1.2: Cơ chế tấn công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. bởi nấm

Purpureocillium lilacinum [42]

Hình 1.3: Trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm bởi sợi nấm

Purpureocillium lilacinum

b. Sản xuất một số enzym

Nhiều enzym đựơc sản xuất bởi Purpureocillium lilacinum đã đựơc nghiên cứu như: serine

protease một loại enzym chống lại trứng của tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium

lilacinuma: protease và chitinase có thể làm suy yếu vỏ trứng của tuyến trùng [16],[19].

c. Kháng khuẩn

Purpureocillium lilacinum khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách

được hoạt chất sinh học có tên gọi là leucinostatins. Leucinostatins là một peptide trung tính

với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine và theo sau bởi 3 acid amin

bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid và

cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al. 1982).Leucinostatins có 6 loại đã được môt tả là A,

B, C, D, E, F. Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và

nhiều loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này [9].

11

1.1.5. Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum trong phòng trừ tuyến

trùng ở Việt Nam và trên thế giới

a. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thế giới

Một số chế phẩm diệt tuyến trùng được sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị

trường thế giới

Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum trên thị

trường thế giới [40]

b. Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum ở Việt Nam

+ Tuyến trùng: Sử dụng nấm đối kháng Paecilomyces (Palila 500 WP) liều lượng theo

khuyến cáo, hoạt chất Cytokinin (Sincosin + Agrispon) 0,2%; Etobon 0,56 SL, tưới gốc

nồng độ: 0,125 ml/lít nước; 3.000-5.000 lít nước/ha, Vimoca 10G rải quanh gốc (30g/gốc

tưới đẫm nước).

PALILA : ( Purpureocillium lilacinum 500 triệu bào tử/g)

Sản phẩm đặc trị tuyến trùng, ngăn ngừa bênh chết nhanh chết chậm trên tiêu và nhiều loại

cây trồng khác, làm khoẻ lại bộ rễ và hút dinh dưỡng tốt hơn.

Đặc biệt thử nghiệm hiệu quả trên cao su, cà phê, hồ tiêu, đã khảo nghiệm và chất lượng

đuợc khẳng đinh tại Đơn Dương- Đức Trọng, Chư sê, Daksong….

12

Trên cây trồng: cải bắp ( sú) , hồ tiêu, cà phê…. [40].

1.2. Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp.

Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan

trọng nhất. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp thế giới và ký sinh ở hầu hết các cây

trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau. Chúng gây nên giảm sản lượng thu hoạch

cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Hiện nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh

thuộc chi này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M.

arenaria, M. javanica và M. hapurpureocillium lilacinuma. Đây là các loài phân bố rộng và

gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra một số loài khác mặc dù cũng

gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1-2 cây trồng và phân bố hẹp [18].

1.2.1. Đặc trưng sinh học

Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọc gelatine (còn

gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng có thể nằm bên

trong nốt sần. Sau quá trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi 1 ngay

bên trong trứng. Lần lột xác thứ nhất xảy ra trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2.

Trứng nở ra ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (infective juvenile = IJ2) không cần có sự kích

thích của rễ thực vật.

Hình 1.5: Tuyến trùng cái Meloidogyne sp. và khối trứng

http://www.tstcantho.com.vn/?mod=article&id=193§ion_id=3

Chuẩn bị xâm nhập vào rễ IJ2 tập trung dọc theo các tế bào non ngay tại phía sau

vùng đỉnh rễ. IJ2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các rễ bên mọc ra tạo

13

nan điểm xâm nhập cho các IJ2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương. Khi IJ2 tiếp xúc

với bề mặt rễ chúng thường dùng kim hút châm chích và xâm nhập ngay vào trong rễ. Sự

xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ. Sau khi xâm nhập vào trong rễ

tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm cho các tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến

trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ và bắt đầu quá trình dinh dưỡng. Khi dinh

dưỡng tuyến trùng cắm phần đầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho

quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng cho tuyến

trùng. Vùng này gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tạo thành trong vùng

nhu mô hoặc vùng mô phloem, nơi đầu tuyến trùng. Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao

của tế bào, chúng được tạo ra và duy trì bằng tuyến trùng ký sinh. Cùng với sự hình thành tế

bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần

rễ (gall hoặc root-knot). Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến

trùng xâm nhập. Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng IJ2 xâm nhập và

loài tuyến trùng ký sinh [5].

Hình 1. 6: Chu kỳ sống của tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg

Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau khi xâm nhập vào rễ cũng bắt đầu một cách

nhanh chóng quá trình thay đổi về hình thái: cơ thể chúng phình ra và các nội quan cũng dần

được phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ IJ2 trải qua 3 lần lột xác và

đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng

cuộn gấp khúc trong IJ4 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi đó con cái có

dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh. Tuyến trùng Meloidogyne spp. sinh sản bằng 2

cách: một vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) và phần lớn các loài

14

sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần con đực. Đối với các loài hữu tính thì con

đực cặp đôi ngay với con cái sau lần lột xác cuối cùng.

Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với các điều kiện môi trường trong đó cây

chủ, nhiệt độ và các yếu tố sinh thái đất như độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm...

Có thể phân biệt 2 nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt độ là nhóm ưa nóng (các loài điển

hình như M. incognita, M. javanica, M. exigua) và nhóm ưa lạnh (các loài điển hình như M.

hapla, M. chitwooodi và có thể cả M. naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid của tuyến

trùng xảy ra ở 10 °C. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với cây trồng thường có liên quan

đến loại đất kiềm, là môi trường tạo ra các sốc bất lợi (stress) cho thực vật.

1.2.2. Các loài quan trọng

M. incognita: là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân

bố trên một vùng địa lý rộng từ 40 vĩ độ bắc đến 33 vĩ độ nam trên phạm vi toàn thế giới.

Đây cũng là loài ký sinh gây hại phổ biến nhất trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng ký

sinh gây hại phổ biến nhất ở: tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ Cà, họ Đậu,

chuối..

M. javanica: là loài phổ biến thứ 2 sau loài trên và có dải phân bố tương tự. Đây là loài có

khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3-6 tháng. Ở Việt Nam, loài này ký

sinh tương đối phổ biến sau loài M. incognita, gây hại chính cho các cây đậu phộng, chuối.

M. arenaria: là loài phổ biến thứ 3 sau, phân bố khắp thế giới như các loài M. incognita và

M. javanica. Đây cũng là loài ký sinh gây hại tương đối phổ biến ở Việt Nam trên các cây

họ đậu.

M. graminicola: ký sinh gây hại chính cho lúa cạn ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Đông

Nam Á, Nam Phi, Mỹ). Ở ta loài này ký sinh tương đối phổ biến trên lúa cạn (giai đoạn lúa

non, khi chưa ngập nước) ở đồng bằng sông Cửu Long [18].

1.2.3. Cơ sở phòng trừ tuyến trùng

Mục tiêu phòng trừ là: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu và giảm số cây

trồng bị nhiễm tuyến trùng.

15

Nội dung phòng trừ tuyến trùng bao gồm: i) Giết tuyến trùng bằng làm mất nguồn

dinh dưỡng để tuyến trùng chết đói; ii) Giết trực tiếp tuyến trùng bằng hóa chất hoặc bất kỳ

một kỹ thuật khác được áp dụng trước khi gieo trồng; iii) Sử dụng các hóa chất một cách

hợp lý để chống lại tuyến trùng trên đồng ruộng có cây trồng [18].

a. Ngăn ngừa

Ngăn ngừa hoặc phòng ngừa là giải pháp đầu tiên quan trọng nhất trong quản lý

tuyến trùng, vì nó là biện pháp đơn giản để giải quyết tuyến trùng trước khi chúng trở thành

vật hại được xác định trên đồng ruộng.

Ngăn ngừa sự phát tán của tuyến trùng có thể cần được xem xét ở các mức độ khác

nhau: trang trại (như một đơn vị sản xuất), quốc gia và quốc tế. Ở quy mô quốc tế, các vấn

đề kiểm dịch thực vật quan trọng được quản lý bằng các công ước kiểm dịch thực vật [18].

b. Luân canh

Luân canh được coi là biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản. Tuyến trùng thực vật

là những ký sinh bắt buộc, chúng cần một vật chủ cho sự phát triển và nhân nuôi số lượng.

Mỗi loài tuyến trùng thực vật có một phổ vật chủ, phổ này dù có thể là rộng nhất nhưng

không bao gồm tất cả các loài cây trồng. Mật độ tuyến trùng tăng ở các cây chủ thích hợp và

suy giảm ở cây chủ không thích hợp. Trong luân canh cây trồng để quản lý các cây trồng

mẫn cảm với một loài tuyến trùng đã được trồng luân canh với các cây kháng hoặc miễn

nhiễm tuyến trùng. Thường các cây trồng kinh tế là các cây mẫn cảm với tuyến trùng và các

cây trồng luân canh là các cây kém kinh tế hơn. Sự luân canh cần phải trồng như thế nào để

mật độ quần thể tuyến trùng ở mức thấp nhất khi trồng cây trồng chính. Các cây luân canh

là cây miễn nhiễm hoặc có khả năng chống chịu cao với một hoặc một vài loại tuyến trùng

nào đó. Khả năng miễn nhiễm của chúng có thể là miễn nhiễm tự nhiên [18].

c. Biện pháp canh tác

Tùy từng loại tuyến trùng ký sinh và loại cây trồng mà có thể lựa chọn, điều chỉnh

một số biện pháp canh tác như: gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, bón chất

hữu cơ... cũng có thể giảm mật độ tuyến trùng và tránh một số tác hại gây ra do tuyến trùng.

16

Làm ngập nước: nồng độ O2 giảm, CO2 tăng do sự giảm vi khuẩn hiếu khí, đồng thời

trong đất ngập nước cũng xảy ra các phản ứng như: phản ứng nitrat, tích luỹ chất amoni,

giảm sắt, mangan và sunfat, tăng các loại acid hữu cơ, methane hydrosulfite.

Bón phân hữu cơ: sự phân huỷ chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho

tuyến trùng ký sinh. Đặc biệt, sự phân giải các chất phế thải thực vật sẽ giải phóng các acid

hữu cơ như: acid acetic, propionic, butyric. Nồng độ các chất này có thể lưu giữ một vài

tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng ký sinh, nhưng không độc đến các

nhóm tuyến trùng sống tự do trong đất. Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải

thành phố, rơm rạ và các phế thải sau khi thu hoạch đều có thể sử dụng làm chất bổ sung

vào đất để tăng hàm lượng chất hữu cơ.

Ở Nigieria, bón vỏ khô của quả ca cao và vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây

bướu rễ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với sử dụng thuốc hoá học hoặc bón 3 loại

phân hoá học NPK ở liều lượng cao. Ở xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị, bón

20 kg phân chuồng ủ hoai mục/ gốc tiêu làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ

Meloidogyne incognita so với đối chứng [5].

Một số cây trồng và cây hoang dại cũng đã và đang được dùng làm thuốc thảo mộc

phòng trừ tuyến trùng như cây xoan Ấn Độ, hạt cây củ đậu, rễ cây ruốc cá, hạt và lá cây sầu

đâu rừng ở Việt Nam do chúng chứa các hợp chất như phenolic, glucid hoặc các alkaloid…

có tác dụng gây độc tuyến trùng và một số sâu hại khác.Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng

40-60g HBJ hoặc LBJ ( chế phẩm dạng bột chế biến từ quả hoặc lá sầu đâu rừng)/m2 diệt

75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh, 1993; Nguyễn Thị

Yến , 1997) [5].

d. Các biện pháp vật lý

Lợi ích lớn của biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng là không để lại dư lượng, độc

tố như thuốc hóa học. Bản chất của các biện pháp vật lý là phòng trừ tuyến trùng bằng xử lý

nhiệt. Tuyến trùng nhìn chung rất mẫn cảm với nhiệt. Hầu hết tuyến trùng chết ở nhiệt độ

cao trên 60 °C. Phương pháp vật lý được áp dụng rộng rãi bằng nhiều biện pháp khác nhau

như: xử lý khói, dùng hơi nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng bằng nhiệt điện, bằng

17

nhiệt vi sóng, đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt,

chiếu xạ... [18].

e. Chọn giống kháng và giống chống chịu bệnh

- Trồng các cây chống chịu tuyến trùng ký sinh có thể đáp ứng cho một phương pháp lý tưởng là duy trì mật độ quần thể tuyến trùng dưới ngưỡng gây hại. Các cây trồng kháng

tuyến trùng có một số ưu điểm vượt trội hơn các phương pháp khác cho mục tiêu quản lý

tuyến trùng hại: (a) có thể hoàn toàn ngăn ngừa sự sinh sản của tuyến trùng, không giống

một vài phương pháp khác như phòng trừ hóa học; (b) sự áp dụng chúng cần ít hoặc không

cần công nghệ và hiệu quả kinh tế; (c) cho phép luân canh trong thời gian ngắn; (d) không

để lại dư lượng độc.

- Ngoài tính kháng (resistance) với tuyến trùng ký sinh, cây kháng cũng cần phải chống chịu (tolerance); những cây không chống chịu sẽ phải chịu thiệt hại nặng nề nếu trồng trên

đất nhiễm tuyến trùng nặng. Các cây chống chịu mà không kháng có xu hướng tăng mật độ

quần thể tuyến trùng đến số lượng tuyến trùng cao có thể dẫn đến gây hại [18].

f. Biện pháp hóa học

Từ những năm 1950 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng

rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật. Tuy nhiên, ngoài những mặt có lợi

không thể chối cãi trong việc phòng trừ sâu bệnh hại tăng sản lượng cây trồng, việc sử dụng

không hợp lý các chất hóa học cũng gây những hậu quả xấu đối với môi trường và sức khỏe

cộng đồng. Đặc biệt, thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng

thuốc. Mặc dù hiện nay đã sản xuất được nhiều loại thuốc có hiệu quả tốt hơn, chuyên hóa

hơn đối với việc phòng trừ tuyến trùng và cũng ít độc hại hơn đối với môi trường. Tuy nhiên

cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong những trường hợp cần thiết được khuyến cáo dưới

đây và đặc biệt phải sử dụng chúng một cách hợp lý [18].

g. Biện pháp sinh học

Tuyến trùng ký sinh thực vật cũng bị tấn công bằng nhiều thiên địch tồn tại trong đất

như virus, vi khuẩn, nấm, Ricketuyến trùngsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria,

Enchytraeid, ve bét, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch

18

của tuyến trùng có tầm quan trọng rất lớn trong việc làm giảm mật độ quần thể để hạn chế

tác hại do tuyến trùng ký sinh gây ra cho cây trồng.

Có 2 dạng phòng trừ sinh học (PTSH): PTSH nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác

nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng và PTSH tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch

sẵn có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng. Hiện tại, biện pháp phòng trừ sinh học

chưa thay thế thuốc hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và

không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, PTSH rất phù hợp trong hệ thống quản

lý tổng hợp tuyến trùng.

Các tác nhân sinh học sử dụng trong phòng trừ sinh học

Hiện nay, kiểm soát sinh học đựơc xem như là một phưong pháp thích hợp nhất cho

việc kiểm soát tuyến trùng rễ. Một số tác nhân kiểm soát sinh học tối ưu như nấm bông

trong đất đựơc cho là hứa hẹn.

Vi khuẩn Pasteuria penetrans: là loại vi khuẩn ký sinh bắt buộc ở một số tuyến trùng ký

sinh thực vật như các loại ấu trùng của Melodogyne spp., Pratylenchus spp. Tuyến trùng dễ

dàng bị nhiễm với vi khuẩn này ở trong đất khi chúng tiếp xúc với nội bào tử. Vi khuẩn

Pasteuria penetrans rất độc và có thể giảm mật độ quần thể tuyến trùng Melodogyne trong

chậu đến 99 % trong vòng 3 tuần. Vi khuẩn Pasteuria penetrans có thể tồn tại một số năm

trong đất được làm khô bằng khí mà không hề suy giảm khả năng sống và bị ảnh hưởng rất

ít bởi các điều kiện đất hoặc thuốc phòng trừ tuyến trùng.

Vi khuẩn Pasteuria penetrans ký sinh bắt buộc với một số nhóm tuyến trùng ký sinh

thực vật. Chúng bám dính trên bề mặt vỏ cutin khi tuyến trùng ở trong đất. Khi tuyến trùng

xâm nhiễm vào cây để dinh dưỡng, bào tử của Pastueria penetrans nảy mầm xâm nhập qua

vỏ cutin giải phóng khuẩn lạc sinh sôi nảy nở khắp cơ thể tuyến trùng. Khi bổ sung đất đã

nhiễm bào tử Pasteuria penetrans vào đất chứa Pratylenchus scribneri làm giảm 53% tuyến

trùng trong đất và 63% tuyến trùng rễ đậu [18].

19

Hình 1.7: A. Nội bào tử của vi khuẩn Pasteuria penetrans, B và C: Cơ chế tiệu diệt

tuyến trùng của vi khuẩn Pasteuria penetrans [43]

Nấm bẫy tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng tạo ra những mạng bẫy dạng lưới

dính để bắt giữ và ăn thịt tuyến trùng. Hầu hết các loại nấm bẫy được xem như không có

khả năng tạo khuẩn lạc nhanh, khả năng cạnh tranh thấp trong môi trường hoại sinh và

không sẵn sàng ổn định khi bổ sung vào trong đất. Tuy nhiên, khi bổ sung một nguồn

carbohydrate vào đất thay cho tuyến trùng sẽ giúp nấm mọc nhanh hơn. Các loài nấm bẫy

khác nhau có khả năng bắt tuyến trùng khác nhau, nhưng hấu hết chúng đều ít chuyên hóa

đối với đối tượng loài tuyến trùng mồi, và thông thường một khi các bẫy được tạo ra hầu hết

các dạng tuyến trùng đều bị bắt bẫy. Do hoạt động bẫy hạn chế và ít chuyên hóa trong tự

nhiên nên những loại nấm này khó khăn để xác lập vai trò của một tác nhân phòng trừ sinh

học.

20

Hình 1.8: Nấm bẫy tuyến trùng

Nấm nội ký sinh tuyến trùng: đây là các loài nấm có khả năng dính và xâm nhập vào cơ

thể tuyến trùng để ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng. Một số loài nấm như Nematoctonus

spp., Meria coniospora đã được thử nghiệm và cho kết quả nhất định. Có thể phân biệt 2

• Nấm nội ký sinh cơ thể tuyến trùng sản xuất ra các bào tử nhỏ các bào tử này cũng chứa

nhóm nấm nội ký sinh là:

các năng lượng nhỏ để bắt đầu quá trình khuẩn lạc trong đất. Từ đây các bào tử duy trì

sự ưu thế cho đến khi chúng dính bám vào tuyến trùng đi qua. Sau đó bào tử nảy mầm

và xâm nhập qua vỏ cutin tạo khuẩn lạc trong cơ thể vật chủ tuyến trùng. Loài

Nematoctonus concurrens và N. haptocladus thuộc nhóm nấm này nhưng có hiệu lực

không lớn đối với tuyến trùng. Loài Hirsutella rhossiliensis cũng có liên quan với tuyến

trùng Criconemella xenopurpureocillium lilacinumax. Tuy nhiên, hiện tại rất ít kết quả

áp dụng thực tế.

21

• Nấm nội ký sinh trứng tuyến trùng có khả năng ký sinh tuyến trùng cái và trứng của một

Hình 1.9: Nấm nội ký sinh tuyến trùng Nematoctonus sp. [34]

số tuyến trùng bào nang và tuyến trùng sần rễ trước khi ấu trùng nở ra. Tuy nhiên, những

nấm này không có khả năng giết ấu trùng dạng hoạt động trong đất. Hầu hết trứng tuyến

trùng đều mẫn cảm hơn với sự xâm nhập của nấm trước khi phát triển ấu trùng tuổi 2.

Nếu con cái bị nấm ký sinh thì khả năng sinh sản của chúng sẽ bị giảm. Vì vậy, những

nấm này rất hiệu quả nếu chúng có khả năng ký sinh con cái và khối trứng sớm sau khi

chúng được nở ra trong rễ. Các nấm ký sinh trứng là ký sinh tạm thời nan chúng có thể

được nhân nuôi in vitro và sự tồn tại của chúng trong đất có thể không phụ thuộc vào sự

hiện diện của truyến trùng [18].

1. 3. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh trưởng của nấm sợi

1.3.1. Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi

− Lên men bề mặt là thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc

môi trường bán rắn.

Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường dịch thể (dùng cho vi sinh vật hiếu khí): môi

trường ở đây có thể là những nguồn dinh dưỡng khác nhau như nước đường hoá, nước bã

rượu, dịch kiềm sunfit được pha loãng theo những tỷ lệ cần thiết, sau đó bổ sung thêm

nguồn nitrogen, nguồn khoáng… khi cho môi trường vào thiết bị lên men phải bảo đảm cột

môi trường có chiều cao tử 3-5cm, bề mặt thoáng, rộng.

Phương pháp lên men này yêu cầu thiết bị đơn giản, nhưng đòi hỏi diện tích sử dụng lớn,

khó tự động hoá quy trình sản xuất.

22

Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường bán rắn hay lên men bán rắn (có thể sử dụng cho vi

sinh vật hiếu khí và kị khí)

Ở phương pháp này nguyên liệu thường dùng là:

• Các loại hạt: thóc, gạo nếp, đậu tương…

• Các loại manh: mảnh sắn, mảnh bắp…

• Các loại phế liệu: bã mía, bã thơm, trấu, cọng rơm, ra…

• Ngoài các nguyên liệu nói trên, để làm môi trường lên men người ta cần trộn các chất

dinh dưỡng khác (các hợp chất có N, khoáng hoà tan trong nước). Nguyên liệu sau

xử lý đảm bảo độ ẩm 60-75% sẽ được tãi ra nia, khay có độ dày 2-3cm (đối với vi

sinh vật hiếu khí hay ủ đống, ủ kín (dùng cho vi sinh vật kị khí).

Đối với các vi sinh vật hiếu khí cần có hệ thống quạt thổi khí vô trùng.

Trong lên men bán rắn, ngoài yêu cầu nguyên liệu môi trường có độ ẩm 60-75%, cần

phải đảm bảo lên men trong điều kiện bầu không khí có độ ẩm 95-100%.

− Lên men chìm

• Lên men chìm (dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí). Khi lên men chìm vi sinh

vật được nuôi cấy ở môi trường dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng của cột

môi trường.

• Trong quá trình lên men này cần liên tục theo dõi và thực hiện một số công việc sau:

• Thực hiên quá trình khuấy đảo và sục khí: nhằm đảm bảo cung cấp O 2 đầy đủ theo

nhu cầu của từng loại vi sinh vật.

• Điều chỉnh pH của môi trường lên men: mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giá trị

pH nhất định của môi trường nuôi cấy.

• Tuy nhiên trong quá trình lên men vi sinh vật lại tạo ra một số chất có tính acid hay

kiềm khiến pH của môi trường không còn thích hợp cho hoạt động sống của vi sinh

vật. Do đó phải điều chỉnh pH bằng các dung dịch như NaOH, HCl, NH4OH, urê

…hay hay bổ sung dung dịch đệm để ổn định pH của môi trường.

• Theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ của môi trường lên men: cũng như độ pH của môi

trường, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh

[7].

vật và hiệu quả lên men

23

1.3.2. Môi trường nuôi cấy

Trong quá trinh nuôi cấy nhân giống vi sinh vật môi trường nuôi cấy cần các nguyên

tố đa lượng (C, H, O, N, S, P, Mg) và một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng (Mn, Bo, Co,

Cu…).

Trong số các nguyên tố đa lượng thì C và N có ảnh hưởng rất lớn đến sinh khối và số lượng

bào tử của nấm sợi [7]

1.3.3. Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon

Cacbon tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào, từ tế bào chất đến thành tế bào,

từ phân tử enzyme đến acid nucleic. Vì vậy hợp chất carbohydrat có ý nghĩa hàng đầu đối

với sự sống của tế bào vi sinh vật.

Nguồn carbohydrat vi sinh vật sử dụng được rất phong phú. Từ dạng tinh khiết

(glucose, saccharose…) đến dạng tạp chất (rĩ đường, dịch kiềm sunfite…). Một số nhóm vi

sinh vật sử dụng được cả khí thiên nhiên, hydrocacbon (methane, alkan…).

1.3.4. Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen

Nitrogen tham gia vào các thành phần cấu trúc nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào

hoàn thiện được mọi chức năng của hoạt động sống. Nguồn nitrogen là nguồn dinh dưỡng

quan trọng không kém gì nguồn cacnon.

Nitrogen được cung cấp cho tế bào dưới nhiều dạng khác nhau:

Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4+, NO3-, pepton các loại,

các amino acid.

Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng nguồn nitrogen dưới dạng sản

phẩm thô gọi là nguồn nitrogen kĩ thuật bao gồm các loại sau: dịch thuỷ phân nấm men, bột

đậu nành, cao ngô, khô lạc hay bánh dầu phông, nước mắm, nước tương [7].

24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1. Vật liệu

- Côn trùng bị nhiễm nấm trên lá cây chanh, bưởi, sung. - Đất và rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng nốt sưng.

2. 2. Thiết bị và dụng cụ

Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp vô trùng Cân phân tích Metuyến trùngler AE 260

Kính hiển vi quang học Leca Tủ sấy

Kính lúp soi nổi Nikon SMZ 800 Bếp gas

Máy chụp hình Máy đo pH Thermo

Lò vi sóng National

Dụng cụ - Ống nghiệm, bình erlen, lam và lamen, đĩa Petri, đũa thủy tinh, bình đựng mức, cốc đong, que trans.

- Que cấy đầu vuông, kim mũi mác. - Pipet, vải muslin 2 lớp, giấy thấm. - Rây lọc có khích thước lỗ khác nhau: 0.5mm, 15 μm. - Que gắp tuyến trùng, các giếng, đĩa đếm tuyến trùng, bình hút ẩm.

2. 3. Hóa chất

Methyl blue − Glycerol

Cao nấm men − Agar

− Glucose NaNO3

Ethanol 96 − KNO3

NaClO − (NH4)2SO4

NaCl − MgSO4.7H2O

− Ampicilline K2HPO4

Huyền phù tinh bột − KH2PO4

Formaldehyt 40% − Saccharose

25

2. 4. Môi trường

2.4.1. Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường

potato glucose agar-PGA )

Khoai tây 200g

Glucose 20g

Agar 20g

Nước cất 1000 ml

2.4.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến

sinh khối và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox

Broth)

Cao nấm men 3 g

Glucose 20 g

0.5 g K2HPO4

0.05 g KH2PO4

0.5 g MgSO4.7H20

NaCl vài mg

Nước cất 1000ml

2.4.3. Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường

YEA)

Glucose Cao nấm men Agar Nước cất 20g 4g 20g 1000ml

2. 5. Các phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp phân lập

a. Phương pháp thu mẫu

Thu thập những xác côn trùng vào buổi sáng. Nếu cơ thể chúng mềm và bẩn, chúng

có thể bị nhiễm vi khuẩn hoặc virus. Nếu cơ thể chúng cứng, điều đó chứng tỏ sự nhiễm

nấm.

Tiến hành thu mẫu ở 3 khu vực khác nhau trên 3 đối tượng cây trồng là: chanh, bưởi,

sung. Mỗi khu vực thu thập 10 mẫu. Vì số lượng côn trùng bị bệnh thu được rất ít nên chúng

26

tôi tiến hành phối trộn chung hết tất cảc các mẫu thu được. Sau đó tiến hành các phương

[6].

pháp phân lập

b. Phương pháp phân lập

Tiến hành khử trùng mẫu xác côn trùng bằng HgCl2 0.1%. Sau đó rửa sạch lại bằng

nước cất vô trùng nhiều lần.

Dùng đũa thuỷ tinh vô trùng nghiền mẫu với 10ml nước cất vô trùng. Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Dùng pipet vô trùng hút 0.1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi

đĩa trên môi trường PGA [6].

c. Phương pháp làm thuần (Phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng nấm)

Cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm là quá trình cấy truyền đỉnh sinh trưởng của một sợi

nấm để tạo một mẫu nấm thuần

- Đổ môi trường PGA vào đĩa Petri để nghiêng sao cho phần thạch ở một phía của đĩa

nông.

- Cấy truyền một miếng nhỏ nấm từ đĩa phân lập vào một bên đĩa nơi thạch sâu hơn. - Đặt đĩa dưới kính lúp soi nổi và điều chỉnh tiêu điểm sợi nấm ở rìa tản nấm (Các sợi nấm

sẽ mọc rất thưa ở phần nông của thạch)

- Điều chỉnh nguồn sáng (gương) nhằm đạt độ tương phản tốt giữa môi trường và sợi nấm. - Dùng que cấy dẹp đã khử trùng cấy một miếng thạch nhỏ chứa đỉnh sinh trưởng của một

sợi nấm sang một đĩa môi trường thích hợp.

2.5.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

− Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường PGA tiến hành hấp khử trùng. Sau khi hấp

xong để nghiêng một góc 45 ° C các ống thạch này trên giá gỗ.

− Tiến hành cấy truyền giữ giống nấm trên bề mặt thạch nghiêng. Sau đó bảo quản các

ống giống này trong điều kiện lạnh (3-5 ° C)

− Thời gian cấy truyền lại đối với nấm mốc là 3-6 tháng [8].

27

2.5.3. Phương pháp quan sát hình thái và định danh nấm sợi

a. Quan sát đại thể

Cấy nấm sợi vào ống thạch nghiêng, sau 3 ngày cho 5ml nước cất vô trùng vào ống.

Dùng que cấy vô trùng gạt đều bào tử nấm sợi trong ống giống, sau đó lăn nhẹ ngón tay để

tạo thành dịch huyền phù. Dùng que cấy vô trùng nhúng nhẹ vào dịch huyền phù rồi cấy nhẹ

1 điểm vào đĩa Petri có chứa môi trường PGA. Quan sát từng ngày khuẩn lạc về các đặc

điểm sau:

- Tốc độ phát triển của khuẩn lạc. - Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc. - Hình dạng khuẩn lạc, mép khuẩn lạc và sợi nấm. - Giọt tiết. - Sắc tố tiết vào môi trường.

b. Quan sát vi thể (tiêu bản phòng ẩm)

− Chuẩn bị các đĩa Petri vô trùng chứa lam, lamen và một miếng giấy lọc.

− Chuẩn bị một đĩa Petri môi trường PGA với độ dày môi trường thật mỏng.

− Dùng kim mũi mác vô trùng cắt lấy một miếng thạch từ đĩa Petri môi trường PGA

(kích thước miếng thạch 1x1cm) dặt lên lam chứa trong đĩa Petri vô trùng được

chuẩn bị ở trên.

− Dùng que cấy đầu vuông lấy một ít bào tử nấm Purpureocillium lilacinum từ các

ống giống chấm vào 2 điểm đối diện của miếng thạch PGA trên lam. Sau đó đậy

lamen lên và dùng nước cất vô trùng làm ướt miếng giấy lọc trong đĩa Petri.

− Sau 3 ngày nuôi cấy lấy tiêu bản phòng ẩm ra và nhuộm bằng xanh metylen loffer.

Quan sát tiêu bản phòng ẩm dưới kính hiển vi về các đặc điểm: cấu trúc hệ sợi nấm

(có hay không có vách ngăn), cấu trúc cuống sinh bào tử, thể bình, hình dạng và cách

sắp xếp bào tử [3].

2.5.4. Phương pháp định danh nấm sợi bằng sinh học phân tử

− Thu nhận DNA

• Phá màng tế bào và màng nhân bằng proteinase đặc hiệu để giải phóng DNA, đồng

thời phân huỷ các protein liên kết với DNA.

28

• Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và

chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có

chứa DNA.

• Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu các acid

nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản.

− Chạy PCR

• Biến tính: trong một hỗn hợp đầy đủ các thành phần cho sự sao chép, DNA được

biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử (khoảng 94°-95° C), trong 30 giây-1

phút.

• Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động

khoảng từ 40°-70° C và kéo dài trong vòng 30 giây- 1 phút.

• Tổng hợp: nhiệt độ tăng lên đến 72° C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời

gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30

giây- vài phút.

− Giải trình tự DNA [3].

2.5.5. Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng

Rây lọc được xếp một lớp giấy lên trên và đặt vào đĩa Petri, sau đó lấy rễ cho vào rây

lọc, điều chỉnh lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp và đặt yên tĩnh trong 48h ở nhiệt

độ phòng. Tuyến trùng sống chui qua rây lọc, lắng đọng xuống đáy đĩa Petri.

Nhấc rây ra khỏi đĩa Petri thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa Petri [2].

2.5.6. Phương pháp đếm tuyến trùng

Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi.

Nếu mẫu có ít tuyến trùng:

• Đổ dung dịch tuyến trùng vào đĩa đếm. sau đó lắc nhẹ cho dung dịch tuyến

trùng dàn đều.

• Đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hay đếm đại diện một

số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa.

Nếu mẫu quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30ml,

sau đó lấy 1ml để đếm, lặp lại 5 lần như vây, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1ml

rồi nhân với 30 [2].

29

2.5.7. Phương pháp định danh tuyến trùng bằng hình thái

a. Phương pháp xử lý, làm tiêu bản tuyến trùng theo De Grisse (1969)

− Ngày thứ nhất: nhặt tuyến trùng chuyển vào giếng có chứa 0.5ml dung dịch I (99ml

Formalin 40% + 1 ml glycerine). Với mỗi mẫu nhặt khoảng 200 con để định loại, với

mẫu có ít tiến hành định loại toàn bộ mẫu. Đặt giếng có tuyến trùng (có đậy lam kính)

vào bình hút ẩm chứa 1/10 thể tích ethanol 96 %. Để bình hút ẩm trong tủ ấm ở nhiệt độ

40 °C ít nhất 12 giờ.

− Ngày thứ 2: lấy giếng ra khỏi bình hút ẩm, nhỏ vài giọt dung dịch II ( 95ml ethanol 96%

+ 5 ml glycerine) vào giếng, đậy lam kính lên giếng để ethanol bay hơi chậm và đặt

trong tủ ấm. Cứ sau 2 giờ thì nhỏ 2 giọt dung dịch II, thực hiện 4 lần. Quá trình này

nhằm làm mất nước tuyến trùng. Để giếng trongâm1 qua đêm, bổ sung vài giọt dung

dịch III (50ml ethanol 96%+ 50ml glycerine) giúp làm mất nước và làm trong tuyến

− Ngày thứ 3: tuyến trùng đã được sử lý làm mất nước, làm trong nằm trong dung dịch

trùng.

glycerine tinh khiết được sử dụng để lên tiêu bản định loại [1].

b. Phương pháp lên tiêu bản tuyến trùng theo Maeseneer (1963)

− Hơ nóng ống đồng và cắm vào đĩa paraffin. Sau đó chấm ống đồng lên lam để tạo thành

vòng paraffin .

− Nhỏ một giọt glycerine thuần khiết vào giữa vòng paraffin. Dùng que gắp tuyến trùng đã

được xử lý trong các giếng vào giọt glycerine (khỏang 5-10 tuyến trùng, chú ý các con

− Đặt khoảng 3 viên paraffin xung quanh vòng paraffin sau đó đậy lamen lên. Đặt lam và

tuyến trùng phải xếp cùng chiều và không chồng lên nhau).

lamen có tuyến trùng lên thanh sắt nóng cho paraffin chảy ra [1].

c. Phương pháp định danh tuyến trùng

− Quan sát dưới kính hiển vi quan học lần lượt ở các vật kính 10X, 20X, 40X, 100X. Phác

hoạ sơ bộ hình thái tuyến trùng như: kích thước, có kim hút hay không có kim hút, hình

dạng vùng môi, cơ quan sinh dục…

30

− Dựa vào đặc điểm hình thái đặc trưng cho từng nhóm tuyến trùng như: lớp cutin,

amphid, vùng môi, buồng trứng, kim hút để định loại. sử dụng khoá phân loại theo tài

liệu của Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000) [1].

2.5.8. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng bởi nấm

Purpureocillium lilacinum trong điêù kiện in vitro

a. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum

Cách tiến hành:

− Chuẩn bị huyền phù trứng tuyến trùng:

• Dùng kim mũi mác tách lấy khối trứng tuyến trùng cho vào ống nghiệm chứa

nước cất. Cho thêm 4-5 ml NaClO 1,05% vào lắc trong vòng 5 phút. Sau đó để

yên cho các mãnh vở lắng xuống trong 30 giây.

• Dùng pipet hút phần trong ở phía trên của ống nghiệm chuyển lên ray lọc kích

thước 15 μm. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa sạch NaClO.

• Chuyển ray lọc chứa trứng tuyến trùng vào đĩa Petri chứa dung dịch ampicilline

0.1% để khử trùng trong 10 phút. Sau đó dùng nước cất vô trùng rửa lại [14].

Bố trí thí nghiệm: lô thí nghiệm: 1ml huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml) + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng 100 trứng/ 0.5ml) cho vào

ống nghiệm.

− Lô đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 0.5ml huyền phù trứng tuyến trùng (khoảng

100 trứng/ 0.5ml). Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 1 tuần.

− Thu kết quả: quan sát và đếm số lượng trứng không nở, IJ2 chết, IJ2 sống trong các

đĩa đếm tuyến trùng dưới kính lúp sôi nổi. Đối với trứng tuyến trùng bị ký sinh bởi

nấm Purpureocillium lilacinum dùng kim tiêm 500cc thu ngẫu nhiên 100 trứng tuyến

[10], [14].

trùng chuyển lên lam nhuộm bằng xanhmethylen loffer và quan sát bằng kính hiển vi

− Cách đánh giá kết quả:

Tỉ lệ trứng không nở= số trứng không nở/ (trứng + IJ2)X 100

Tỉ lệ IJ2 chết= IJ2 chết/ tổng IJ2x100

31

b. Phương pháp đánh giá khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp.

bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro

− Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (105 bào tử/ml)

trên các đĩa Petri môi trường PGA.

trên môi trường PGA tiến hành − Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum

cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp. (5 tuyến trùng cái/ 1 đĩa PGA) vào mép khuẩn

lạc nấm Purpureocillium lilacinum. Tiến hành thí nghiệm trong thời gian 4 ngày.

− Sau mỗi ngày thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng cho vào các

đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái. Quan sát sự lây nhiễm nấm

Purpureocillium lilacinum trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với

xanh metylen loffer và soi dưới kính hiển vi [10].

2.5.9. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sinh khối

và số lượng bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử

Tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong các bình tam giác 250ml

chứa môi trường Czapek-Dox Broth (100 ml/ bình) với các giá trị pH khác nhau: 6, 6.5, 7,

7.5. Đặt các bình này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.

Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử bằng cách cho dịch nuôi cấy

lọc qua giấy lọc kích thước 15-20 μm thu lấy sinh khối trên giấy lọc và dịch lọc chứa bào

tử. Việc thu sinh khối và dịch bào tử được tiến hành trong tủ cấy vô trùng [17].

b. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn Nitơ và Cacbon đến sinh khối và số lượng

bào tử

Tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường Czapek-Dox Broth nhưng thay thế nguồn

nitơ cao nấm men bằng nguồn nitơ khác nhau như: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3. Đặt các bình

này trong tối, nhiệt độ phòng và tiến hành nuôi cấy tĩnh.

- Sau 14 ngày nuôi cấy trong các bình tam giác tiến hành thu sinh khối và bào tử. Cách thu sinh khối và bào tử tiến hành tương tự như ở mục 2.5.9.1

- Tương tự ảnh hưởng của nguồn cacbon cũng tiến hành nuôi cấy trong môi trường Czapek- Dox Broth nhưng thay thế glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau như: huyền

phù tinh bột, saccharose. Sau 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử.

32

2.5.10. Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov

- Sinh khối nấm sợi được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối. - Lọc dịch lên men qua giấy lọc, rửa sạch sinh khối nấm sợi bằng HCl 1N và nước cất. Sấy khô tờ giấy lọc có sinh khối nấm sợi ở 80- 105 °C đến trọng lượng không đổi. Sinh khối

đựơc tính theo sự chênh lệch trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và tờ giấy lọc khô đã cân

trước đó [3].

2.5.11. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

Nguyên tắc:

- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trong đĩa Petri.

- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.

Cách lấy mẫu - Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5 để cấy mẫu. - Ghi vào nắp hộp Petri có mội trường thạch các thông tin: - Nồng độ pha loãng. - Ngày cấy. - Dùng pipet đã vô trùng lấy 0.1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch. - Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. - Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp. Mỗi nồng độ cấy 3 đĩa Petri và lấy kết quả trung bình. - Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp [8]. - Cách đếm

Số tế bào/g mẫu = M.a.10 n .N

M: số khuẩn lạc trung bình trong một đĩa.

A: số giọt trong 1ml dịch mãu.

n: hệ số pha loãng.

2.5.11. Các phương pháp khác

Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic plus 5 [5].

Phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm Excel [4].

33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Phân lập và định danh chủng nấm có khả năng diệt tuyến trùng

3.1.1. Phân lập

Chúng tôi tiến hành phân lập chủng nấm từ các mẫu xác côn trùng bị nhiễm nấm theo

mục 2.5.1. Tiến hành định danh sơ bộ bằng các phương pháp ở mục 2.5.3 và căn cứ vào đặc

điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc chúng tôi phân lập được 1 chủng nấm.

Hình 3.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum

3.1.2. Định danh

Sau khi phân lập và làm thuần, tiến hành định danh sơ bộ nấm bằng cách nuôi chủng

nấm này trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong vòng 7 ngày. Tiến hành quan sát hình

dạng, màu sắc của khuẩn lạc. Làm tiêu bản phòng ẩm quan sát cấu trúc hệ sợi (sự phân

nhánh, vách ngăn của sợi nấm), màu sắc sợi nấm, hình dạng và cấu trúc cơ quan sinh sản

(cuống sinh bào tử, thể bình, bào tử).

Kết quả định danh sơ bộ

Quan sát đại thể

34

Hình 3.2: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum ( PGA, 7 ngày, 28 °C)

Quan sát vi thể

35

Hình 3. 3: Cấu trúc hệ sợi nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN TRÁI) và cơ

quan sinh sản của nấm Purpureocillium lilacinum (1000) (BÊN PHẢI)

Hình 3.4: Cấu trúc thể bình và cách sắp xếp bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum (

400)

So sánh giữa kết quả quan sát được với khoá phân loại của R.A. Samson (1974)

Đặc điểm phân loại chủng nấm

Đặc điểm chủng nấm A Đặc điểm phân loại chi Paecilomyces

− Bề mặt khuẩn lạc nhẵn, mịn như − Khuẩn lạc của Paecilomyces mọc

nhung. Khuẩn lạc ban đầu có màu nhanh và trưởng thành trong vòng 3

ngày. Màu sắc khuẩn lạc thì bắt đầu trắng sau chuyển thành màu tím.

từ màu trắng trở nên vàng, vàng − Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh

xanh, vàng nâu, nâu olive, cuối cùng và trong suốt không màu.

có màu hồng hoặc tím phụ thuộc tuỳ − Cuống sinh bào tử phân nhánh thẳng

loài. đứng.

36

− Thể bình phình ở phần gốc dần dần − Thể bình có cấu trúc phình ở phần

thuôn nhọn kéo dài thành một cái gốc và dần dần hẹp kéo dài thành cái

cổ. cổ. Thể bình phân chia thành thể

bình cấp 1 hoặc cấp 2… − Bào tử được sắp xếp trong chuỗi từ

đầu mút của thể bình, chuỗi bào tử − Bào tử hình elip đến hình trụ, không

không phân nhánh. Bào tử không màu. Bào tử xếp thành chuỗi dài và

màu hoặc sáng màu. không phân nhánh.

So sánh kết quả quan sát được và đặc điểm mô tả trong khoá phân loại của R.A. Samson

(1974) chúng tôi kết luận chủng nấm A thuộc chi Paecilomyces.

Sau đó chúng tôi gửi chủng nấm Paecilomyces A đến công ty xét nghiệm Nam Khoa để

định danh bằng cách giải trình tự ribosome 28S và so sánh với ngân hàng gen NCBI.

Kết quả giải trình tự gen 28S

• TTTAAGTCCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATG

GCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAG

GGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAAC

AAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTC

CCAAACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCC

GCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAA

ACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAG

CAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATC

GATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGT

GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCA

TGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGT

TGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCA

GCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGC

So sánh kết quả với ngân hàng gen cho thấy chủng Paecilomyces A có độ tương đồng với loài

nấm Purpureocillium lilacinum là 99%.

37

3.2. Kết quả định danh tuyến trùng

Sử dụng phương pháp định danh bằng hình thái và đối chiếu với khoá phân loại tuyến

trùng ký sinh thực vật của tác giả Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000).

Hình 3.5: Hình thái toàn bộ cơ thể tuyến trùng (bên trái 400), đầu tuyến trùng (bên phải

1000)

Hình 3.6: Hình thái phần thân tuyến trùng (1000)

38

Hình 3.7: Hình thái cơ quan sinh sản của tuyến trùng (1000)

Hình 3.8: Hình thái phần đuôi tuyến trùng (1000)

So sánh với khoá phân loại của hai tác giả trên chúng tôi thu được loài tuyến trùng thuộc giống

Meloidogyne sp. với các đặc điểm sau:

Thuộc bộ Tylenchida:

− Có phasmid. Vỏ cutin luôn luôn phân đốt.

− Không có tơ cứng trên bề mặt cutin.

− Có stylet (kim hút). Thực quản có diều giữa dạng cơ và diều sau dạng tuyến.

− Vùng môi thường kitin hoá mạnh. Kim hút rất phát triển. Lỗ đổ của tuyến thực quản lưng

không đổ vào diều giữa mà đổ sau stylet một khoảng cách.

Thuộc họ Heteroderidae:

− Cutin phân đốt nhỏ đến trung bình. Vùng đầu phát triển và kitin hoá ở mức độ khác nhau.

Diều giữa tách biệt con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng, nếu một thì có túi sau vulva. Con đực

có cánh đuôi hoặc không.

− Stylet khoẻ. Diều giữa của con cái phát triển dạng tròn hoặc ovan, phần diều tuyến dạng quả

lê hoặc dạng thuỳ kéo dài. Con cái có 2 hoặc 1 buồng trứng. Đuôi từ tròn, tù, hình trụ đến

hình chóp.

− Thực quản tuyến ở dạng thuỳ, không tạo thành hành thực quản, bao phủ phần đầu của ruột

về phía lưng hoặc phía bụng. Stylet trung bình nhưng khoẻ.

− Con cái hình tròn hoặc hình quả lê. Con đực với đuôi ngắn, tròn, không có cánh đuôi.

Giống Meloidogyne:

− Dị hình sinh dục. con cái trưởng thành hình quả lê hoặc hình cầu, nằm sâu trong mô rễ.

Đường kính cơ thể 0.5-0.7mm với cổ cân đối. Vulva ở phía sau gần hậu môn. Vỏ cutin màu

trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Stylet ngắn, kitin hoá trung bình.Vùng đầu kitin hoá không

mạnh. Lỗ bài tiết nằm ở phía trước đến van diều giữa và thường gần gốc stylet. Hai nhánh

sinh dục được cuộn gấp lại. Trứng được đẻ bên ngoài cơ thể vào khối gelatin.

− Con đực hình giun sống tự do trong đất; dài 1-2mm. Vùng đầu kitin hoá mạnh. Đuôi ngắn,

hình cầu. Gai giao cấu phát triển mạnh, không có cánh đuôi.

39

− Ấu trùng (IJ2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0.4-0.5mm. Stylet và vùng đầu kitin

hoá yếu. Đuôi hình chóp, phần cuối của đuôi thừơng là khoảng trong với chiều dài khác

nhau [1].

3.3. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. trong diều kiện in

vitro

3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái loài Meloidogyne sp.

trong điều kiện in vitro

Tiến hành khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. ký sinh trên rễ

cây chuối theo phương pháp nêu ở mục 2.5.8.2 trong thời gian 4 ngày trong môi trừơng thạch

đĩa PGA với nấm Purpureocillium lilacinum 5 ngày tuổi. Tiến hành thu kết quả sau từng ngày

lây nhiễm.

Hình 3.9: Tiêu bản tuyến trúng cái Meloidogyne sp. trên cây chuối bị nhiễm nấm

Purpureocillium lilacinum (400)

Hình 3.10: Tiêu bản nhuộm xanh metylen loffer tuyến trùng cái Meloidogyne sp. trên cây

chuối bị nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum (400)

Qua kết quả quan sát sự lây nhiễm của tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bởi nấm

Purpureocillium lilacinum cho thấy sợi nấm Purpureocillium lilacinum ký sinh bao phủ các

khắp các phần cơ thể tuyến trùng cái. Sự xâm nhập của nấm Purpureocillium lilacinum đã được

40

ghi nhận trong bài báo của tác giả Morgan-Jone et.al (1984), nấm Purpureocillium lilacinum

tấn công tuyến trùng cái qua các phần bị trầy xướt, qua hậu môn hoặc âm đạo của tuyến trùng cái. Tuy nhiên một số tác giả khác như Jatala (1986) lại giải thích rằng nấm Purpureocillium

lilacinum tấn công cơ thể tuyến trùng cái Meloidogyne javanica chỉ qua những chổ mở của cơ

thể.

Kết quả thu được như sau:

Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị lây nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum

Tỷ lệ trung bình sau 3 lần thí nghiệm

Thời gian lây nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum

Lần thí nghiệm thứ 1

Lần thí nghiệm thứ 3

1 ngày

40%

0%

0%

0%

0%

11%

2 ngày

40% 20% 60%

24%

20 % 20 %

3 ngày

60% 40% 40%

0%

36%

4 ngày

20% 60% 40%

31%

Lần thí nghiệm thứ 2 20 % 20 % 40 % 20 %

20 %

20 % 20 % 60 % 40 %

20 % 20 % 40 %

0 % 0 % 20 % 20 %

Bảng 3.1: Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. của nấm Purpureocillium lilacinum

20 % 40 % 20 %

36%

31%

)

24%

%

( ệ l ỉ

11%

Tỷ lệ trung bình sau 3 lần thí nghiệm

T

40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

2 ngày 3 ngày 4 ngày

1 ngày

Thời gian lây nhiễm (ngày)

41

Hình 3.11: Đồ thị khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng cái Meloidogyne sp. của nấm

Purpureocillium lilacinum

Kết quả bảng số liệu 3.1 và đồ thị 3.1cho ta thấy tỉ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị

lây nhiễm bởi nấm Purpureocillium lilacinum thấp. Kết quả này khá tương đồng với kết quả

nghiên cứu trong bài báo của tác giả Chan Guan Pau (với tỉ lệ lây nhiễm sau 1 ngày là 10% của

nấm Purpureocillium lilacinum B) và thấp hơn so với các chủng nấm khác như

Purpureocillium lilacinum A, Purpureocillium lilacinum M (với tỉ lệ lây nhiễm sau 1 ngày

>50%). Điều này cho thấy rằng chủng nấm Purpureocillium lilacinum của chúng tôi có khả

năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. thấp nguyên nhân có thể là do chủng thu được

từ tự nhiên với tốc độ mọc chậm.

3.3.2 Kết quả thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến

trùng Meloidogyne sp. trên cây chuối

Tiến hành thí nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trên trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp. theo phương pháp nêu trong mục 2.5.8.2 . Sau 7 ngày lây nhiễm trứng tuyến

trùng Meloidogyne sp. với bào tử nấm Purpureocillium lilacinum kết quả thu được:

Hình 3.12: Tiêu bản nhuộm xanhmetylen loffer trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. bị nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum ( bên trái 400), (bên phải 1000) Kết quả quan sát dưới kính hiển vi sự lây nhiễm nấm Purpureocillium lilacinum của

trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. cho thấy mạng lưới sợi nấm phân nhánh đến nhiều trứng.

42

Phần cuối của hệ sợi có 1 cấu trúc sợi sắt nhọn được xem như là giác bám giúp bám vào vỏ

trứng tuyến trùng.

Những trứng bị nấm Purpureocillium lilacinum tấn công có biểu hiện bất thường là bị

teo lại (do bị áp lực của mạng lưới sợi nấm). Đây là phương pháp xâm nhập vật chủ bằng cơ

học ( theo giải thích của tác giả Holland et. al, 1999).

Theo Lopez-Llorea et. al, 2002 cũng lý giải về cơ chế tấn công trứng tuyến trùng bởi

nấm Purpureocillium lilacinum tương tự. Khi sợi nấm chạm vào bề mặt trứng nó phản ứng tiếp

xúc bằng cách hình thành những giác bám. Sau đó dùng chất dính kết giúp cho việc kết nối

nấm và vật chủ (trứng tuyến trùng).

Và từ những giác bám này tiết ra enzym và chất hoá học làm phương tiện xâm nhập vật

chủ (theo giải thích của tác giả Morgan-Jones et. al, 1984; Huang et. al, 2004; Gortari và

Houra, 2008; Lopez-Llorea et. al, 2008).

Bảng 3.2: Bảng số liệu khảo sát khả năng kiểm soát trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.

Tỉ lệ trứng không nở Tỉ lệ IJ2 chết Tỉ lệ trứng bị ký sinh Lần thí nghiệm

lô thí nghiệm lô đối chứng lô thí nghiệm lô đối chứng lô thí nghiệm lô đối chứng

83% 54% 28% 0% 71% 41%

61% 55% 14% 0% 88% 78%

66% 51% 34% 0% 84% 81%

70% 53% 25% 0% 81% 67% Lần thí nghiệm 1 Lần thí nghiệm 2 Lần thí nghiệm 3 Tỉ lệ trung bình

43

Đồ thị khảo sát khả năng kiểm soát trứng tuyến trùng ở điều kiện invitro

90%

81%

80%

70%

67%

70%

60%

53%

50%

lô thí nghiệm

lô đối chứng

40%

25%

30%

20%

10%

0%

0%

tỉ lệ IJ2 chết

tỉ lệ trứng không nở

tỉ lệ trứng bị kí sinh

Hình 3.13: Đồ thị khảo sát khả năng kiểm soát trứng tuyến trùng

Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện in vitro

44

Kết quả trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.13 cho thấy nấm Purpureocillium lilacinum có

khả năng kiểm soát sự nở của trứng tuyến trùng là 70% cao hơn so với lô đối chứng. Tuy nhiên

tỉ lệ trứng bị ký sinh bởi nấm Purpureocillium lilacinum là rất thấp 25% so với chủng nấm

Purpureocillium lilacinum A (78.5%), Purpureocillium lilacinum B (66%), Purpureocillium

lilacinum M (73.4%) trong bài báo của tác giả Chen Guan Pau. Tỉ lệ ký sinh của chủng nấm

Purpureocillium lilacinum của chúng tôi khá thấp có thể là do chủng này có hoạt tính thấp, thời

gian sinh trưởng chậm.

Tỉ lệ trứng không nở trong lô đối chứng cũng khá cao 53% nguyên nhân có thể là do điều

nhiệt độ thí nghiệm không thích hợp vì thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng

có khi lên đến 30-32º C không thuận lợi cho sự nở của trứng tuyến trùng (27-28 ºC).

3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sinh khối và số lượng

bào tử của nấm Purpureocillium lilacinum

3.4.1 Ảnh hưởng của pH

Nấm Purpureocillium lilacinum được tiến hành nuôi cấy tĩnh trên môi trường lỏng

Czapek-Dox Broth trong các bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) với các giá trị pH

môi trường lần lượt là: 6, 6.5, 7, 7.5, đặt trong điều kiện tối, nhiệt độ phòng. Sau thời gian 14

ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối và bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.

Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sinh khối và số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

45

Hình 3.15: Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của pH lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum ở pH 6 (g) 0.9622 1.1441 1.1130 1.2776 0.8679 1.2953 0.7486 0.8679 0.8023

Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum ở pH 6.5 (g) 1.2615 1.3374 1.4560 1.2045 0.7842 0.8034 0.6690 0.6891 0.7351

Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum ở pH 7.5 (g) 1.6044 1.4516 0.7594 1.3082 1.3335 0.8635 0.8202 0.7156 0.5895

Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum ở pH 7 (g) 1.0789 0.9070 1.2245 0.6969 0.9338 0.8353 0.7545 0.5573 0.5422 Sự khác biệt

Bình

Sai số

pH7 pH 6.5 pH6 pH7.5 Số mẫu 9 9 9 9 0.227628 0.37276 Trung bình 0.836711 0.204854 0.993356 0.31488 1.00877 1.04954 X X X X

46

1.009

0.993

1.050

0.837

) g ( i ố h k

h n i S

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

pH 6

pH 6.5

pH 7

pH 7.5

pH

Hình 3.16: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của pH lên sinh khối nấm Purpureocillium

lilacinum

đạt cao nhất tại pH 7.5 là (1.050 g/100ml) và đạt giá trị thấp nhất tại pH 7 là (0.837g/100ml).

Bảng số liệu 3.3 và hình 3.16 cho thấy giá trị sinh khối của nấm Purpureocillium lilacinum

Tuy nhiên sự thay đổi giá trị pH này không có ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium

lilacinum vì qua phân tích bằng phần mềm sử lý Stargraphic cho thấy sinh khối nấm

Purpureocillium lilacinum không có khác biệt giữa các nhóm giá trị pH.

Sự thay đổi pH của môi trường không có ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium

lilacinum có thể là do nấm Purpureocillium lilacinum có khả năng phát triển trong khoảng pH

rộng (cả trong điều kiện pH kiềm lẫn axit ) đều có thể phát triển. Và sự thay đổi giá trị pH này

cũng không tỷ lệ thuận với sự phát triển sinh khối của nấm Purpureocillium lilacinum ( theo đồ

thị 3.3 ) cho ta thấy ở pH 6 sinh khối là 1.009 g/100ml đến pH 6.5 sinh khối giảm xuống còn

0.993g/100ml rồi pH 7 sinh khối đạt 0.837g/100ml và tại pH 7.5 sinh khối lại tăng lên

1.050g/100ml.

47

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH lên sự hình thành số lượng bào tử nấm Purpureocillium

lilacinum

Đĩa

Số lượng bào tử (pH 6) (bào tử/ ml)

Số lượng bào tử (pH 6.5) (bào tử/ ml)

Số lượng bào tử (pH 7) (bào tử/ ml)

Số lượng bào tử (pH 7.5) (bào tử/ ml)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

51600000 50000000 49800000 14400000 14000000 14400000 25400000 25000000 29000000 9400000 9800000 10000000 5000000 5400000 3200000 3200000 6600000 3200000 3200000 6800000 6000000 5600000 5200000 6000000 2000000 2600000 2000000

46000000 34000000 34000000 22000000 32000000 24000000 11000000 7400000 13200000 10000000 17400000 7600000 6600000 7800000 10200000 9800000 6000000 4000000 5800000 1000000 800000 1200000 800000 4600000 2800000 6400000 1600000

30800000 33200000 30600000 25200000 27000000 14000000 30000000 40000000 38000000 3800000 6600000 5400000 5200000 2800000 3200000 4600000 5200000 2800000 3600000 2800000 1800000 2800000 5200000 3000000 3800000 3200000 1000000

23400000 26600000 26400000 23000000 24600000 25600000 13600000 17400000 11200000 10400000 6400000 4800000 7000000 7400000 5400000 5000000 3800000 4400000 2800000 6200000 5400000 6600000 4000000 4200000 2600000 4000000 6000000

Số mẫu Trung bình (bào tử) Sự khác biệt 27

1.06741E7

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum

X

27

1.21481E7

X

27

1.24296E7

X

pH Số lượng bào tử pH 6.5 Số lượng bào tử pH 7 Số lượng bào tử pH 7.5

48

27

1.36593E7

X

Số lượng bào tử pH 6

nấm PL

13659259

12148148 12429630

10674074

ử t o à B

16000000 14000000 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0

pH6

pH6.5

pH7

pH7.5

pH

Hình 3.18: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium

lilacinum

Đối với sự hình thành bào tử thì chúng tôi nhận thấy ở giá trị pH 6 cho số lượng bào tử

cao nhất là 13659259 bào tử/ ml và đạt số lượng bào tử thấp nhất tại giá trị pH 6.5 ( 10674074

bào tử/ ml). Tuy nhiên qua phân tích bằng phần mềm Stargraphic cho thấy không có sự khác

biệt về số lượng bào tử thu được giữa các nhóm giá trị pH.

Từ kết quả phân tích trong bảng 3.4 và hình 3.18 cho chúng tôi kết luận rằng sự thay đổi

giá trị pH không có ý nghĩa trong sự hình thành sinh khối và số lượng bào tử của nấm

Purpureocillium lilacinum.

3.4.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ và nguồn Cacbon

a. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong môi trường lỏng Czapek-

Dox trong các bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) nhưng lần lượt thay thế cao nấm

men bằng các nguồn Nitơ khác nhau như: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4.

49

Hình 3. 19: Ảnh hưởng của nguồn N lên sinh khối và số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

KNO3 NaNO3

(NH4)2SO4

Hình 3. 20: Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum trên các nguồn N khác nhau

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh khối nấm

Purpureocillium lilacinum

Bình Cao nấm men

KNO3 (g) 0.1694 0.2587 0.1710 0.1040 0.1464 0.1353 NaNO3 (g) 0.1396 0.1817 0.1356 0.1759 0.0959 0.0812 (NH4)2SO4 (g) 0.1905 0.1848 0.1841 0.1591 0.2261 0.1444 (g) 0.7039 0.7655 0.6775 0.7109 0.5246 0.7911 1 2 3 4 5 6

50

Sai số

0.8193 0.6452 0.7882 0.1317 0.2005 0.3298 0.1038 0.1744 0.2445 0.1984 0.1640 0.1489 7 8 9

Sự khác biệt

NaNO3 (NH4)2SO4 KNO3 Cao nấm men Số mẫu 9 9 9 9 Trung bình (g) 0.148067 0.177811 0.182978 0.714022

0.0916788 X 0.0262158 X 0.0710664 X 0.0515726 X

Hình 3. 21: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nguồn N đến sinh khối nấm Purpureocillium

lilacinum

− Kết quả trình bày trong bảng 3.5 và hình 3.21 cho thâý nấm Purpureocillium lilacinum có

thể sinh trưỏng trên tất cả nguồn N từ N vô cơ như: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 đến nguồn N

hũư cơ như: cao nấm men. Trong đó, sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị

cao nhất khi được nuôi cấy trong môi trường có nguồn N là cao nấm men (0.714022g/ ml)

và đạt giá trị thấp nhất trong môi trường có (NH4)2SO4.

− Qua kết quả phân tích số liệu bằng phần mềm Stargraphic cho thấy sự thay đổi nguồn N có

ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum. sinh khối giữa các

nhóm N khác nhau có sự khác biệt rất rõ ràng: giữa nguồn N hữu cơ là cao nấm men khác

biệt hẳn so với nguồn N vô cơ là: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4. Còn giữa các nguồn N vô cơ

với nhau không có sự khác biệt về sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum. Nguyên nhân

của sự khác biệt giữa 2 nhóm nguồn N có thể do ngoài việc cung cấp protein cao nấm men

51

cón chứa thêm các thành phần khác như: vitamin, chitin (là một trong những thành phần

tham gia cấu trúc vách tế bào nấm sợi) có vai trò trong việc chuyển hoá các chất, tham gia

hình thành sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum.

Hình 3. 22: Ảnh hưởng của nguồn N lên số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn N lên số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

Đĩa (NH4)2SO4 (bào tử/ ml)

1 2 3 4 5 6 Cao nấm men (bào tử/ ml) 3800000 1800000 5000000 4800000 5400000 3600000 KNO3 (bào tử/ ml) 5800000 5200000 1600000 6600000 4600000 6000000 NaNO3 (bào tử/ ml) 1800000 1200000 2000000 1400000 2000000 1200000 3200000 200000 800000 200000 200000 400000

52

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 5800000 4600000 3200000 3600000 1000000 1400000 3400000 1200000 4000000 4600000 5400000 2600000 3000000 2400000 1200000 2800000 1600000 1800000 3600000 2600000 2800000 1600000 400000 200000 3800000 400000 200000 200000 3600000 1800000 400000 400000 200000 200000 400000 600000 400000 200000 800000 400000 200000 600000

Số mẫu 5400000 4600000 4800000 5000000 2200000 3200000 5200000 1400000 3000000 3200000 2800000 2800000 2400000 4400000 2800000 5200000 5000000 2800000 3000000 8000000 5200000 Sự khác biệt

27 27 27 27 6400000 5600000 5400000 2600000 1000000 3600000 4000000 7800000 1800000 3000000 1800000 2600000 1000000 800000 1400000 2400000 1000000 2600000 4400000 2600000 3600000 Trung bình (bào tử/ ml) 814815. 3.22222E6 3.40741E6 3.52593E6 X X X X (NH4)2SO 4 Cao nấm men NaNO3 KNO3

53

4000000

3525926

3407407

3222222

3500000

3000000

2500000

ử t

2000000

o à B

1500000

814815

1000000

500000

0

KNO3

NaNO3

(NH4)2SO4

Cao nấm men

Nguồn N

Hình 3. 23: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nguồn N lên số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

− Kết quả từ bảng 3.6 và hình 3.23 cho số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum đạt

giá trị cao nhất khi sử dụng nguồn N là KNO3 (3525926 bào tử/ ml) và đạt giá trị thấp nhất

khi sử dụng nguồn N là (NH4)2SO4 (814815bào tử/ml). Sự thay đổi nguồn N cũng ảnh

hưởng rõ ràng đến sự hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum điều đó thể hiện

qua sự khác biệt về số lượng bào tử giữa nguồn N là (NH4)2SO4 với các nguồn N khác: cao

nấm men, KNO3, NaNO3.

− Khác với sự hình thành sinh khối, sự hình thành bào tử thường xảy ra trong điều kiện môi

trường khắc nghiệt, thiếu thốn do đó có thể thấy rằng khi nuôi cấy trong môi trường sử

dụng nguồn N là KNO3 lại cho kết quả cao hơn khi sử dụng nấm men. Tuy nhiên qua phân

tích số liệu không cho thấy sự khác biệt giữa KNO3 và cao nấm men đến số lượng bào tử

nấm Purpureocillium lilacinum. Do đó, chúng tôi chọn cao nấm men là nguồn N cho thí

nghiệm tiếp theo.

b. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum trong môi trường lỏng

Czapek-Dox Broth trong các bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) nhưng lần lượt

thay thế nguồn C glucose bằng: saccharose, tinh bột.

Kết quả thu được

54

Glucose Saccharose

Tinh bột

Hình 3. 24: Ảnh hưởng của nguồn C lên sinh khối nấm

Purpureocillium lilacinum

Bảng 3.7: Ảnh hưởng nguồn C lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Bình Glucose (g) Saccharos(g) Tinh bột(g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.7618 0.8579 0.6601 0.9686 0.8125 0.7071 0.7555 0.6320 0.6627 0.9068 0.7700 0.8591 1.4147 0.9698 1.0474 0.9947 0.6926 0.7064 0.7186 0.7260 0.7068 0.6882 0.4943 0.5248 0.7597 0.4827 0.5180

Sự khác biệt Nguồn C Số mẫu Sai số

tinh bột glucose saccharose 9 9 9 Trung bình (g) 0.624344 0.757578 0.929056 0.108659 X 0.221359 X 0.115439 X

55

1

0.929055556

0.9

0.8

0.757577778

0.7

0.624344444

0.6

0.5

) g ( i ố h k h n

i

0.4

S

0.3

0.2

Sinh khối trung bình

0.1

0

glucose

saccarose

tinh bột

Nguồn C

Hình 3.25: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng nguồn C lên sinh khối nấm Purpureocillium

lilacinum

- Kết quả phân tích trong bảng 3.7 và hình 3.25 cho thấy chủng nấm Purpureocillium lilacinum có khả năng sử dụng cả 3 loại đường: đường đơn glucose, đường đôi saccharose và

cả đường đa tinh bột. Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nhất khi sử

dụng nguồn C là saccharose (0.929056g/ 100ml) và sinh khối đạt giá trị thấp nhất khi sử

dụng nguồn C là tinh bột (0.624344g/100ml).

- Qua phân tích số liệu bằng phần mềm Stargraphic cho thấy sự khác nhau về sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum thu được giữa các nhóm nguồn C khác nhau: giữa

saccharose với tinh bột, giữa saccharose với glucose. Điều đó cho thấy rằng việc thay đổi

nguồn C có ảnh hưởng rõ ràng đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum.

Tinh bột Saccharose

Hình 3. 26: Ảnh hưởng của nguồn C lên số lượng bào tử nấm

56

Purpureocillium lilacinum

Đĩa

Bảng 3.8: Bảng số liệu khảo sát ảnh hưởng của nguồn C đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Glucose (bào tử/ ml) 3800000 1800000 5000000 4800000 5400000 3600000 5800000 4600000 3200000 3600000 1000000 1400000 3400000 1200000 4000000 4600000 5400000 2600000 3000000 2400000 1200000 2800000 1600000 1800000 3600000 2600000 2800000 Saccharose (bào tử/ ml) 36600000 31000000 24200000 15000000 11600000 37000000 25000000 19400000 20200000 33400000 23600000 21200000 20600000 33000000 21400000 22600000 14400000 23000000 11400000 25400000 25200000 28200000 18000000 31200000 25800000 37000000 18000000 Tinh bột (bào tử/ ml) 14000000 4800000 7400000 17600000 15600000 16200000 15000000 17400000 14600000 21200000 16200000 20600000 5000000 11200000 9800000 20000000 18200000 8200000 12400000 8000000 10000000 12000000 6000000 5000000 14000000 9000000 16000000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Sự khác biệt Nguồn C

glucose tinh bột saccharose Số mẫu 27 27 27 Trung bình (bào tử/ ml) 3.22222E6 X 1.27926E7 X X 2.42E7

57

30000000

24200000

25000000

20000000

12792593

15000000

ử t o à b g n ợ ư l ố S

10000000

Số lượng bào t

5000000

3222222

0

glucose

saccharose

tinh bột

Nguồn C

Hình 3. 27: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của nguồn C đến số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum

- Kết quả trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.27 cho thấy số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nhất khi sử dụng nguồn C là saccharose (24200000

bào tử/ ml) và đạt giá trị thấp nhất khi sử dụng nguồn C là glucose (3222222 bào tử/ ml). và

qua kết quả phân tích bằng phần mềm Stargraphic cho thấy sự khác biệt rõ rệt về số lượng bào

tử thu được từ 3 nhóm nguồn C khác nhau. Điều này chứng tỏ sự thay đổi nguồn C có ảnh

hưởng rõ rệt đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.

58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

- Từ 30 mẫu côn trùng bị nhiễm nấm bệnh thu được 1 chủng nấm A. Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài chủng A, kết luận chủng này thuộc loài Purpureocillium

lilacinum.

- Từ chủng tuyến trùng thu được trên rễ cây chuối bị bệnh tuyến trùng đã tách và định loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp.

- Đã tiến hành thử nghiệm in vitro khả năng kiểm soát tuyến trùng cái Meloidogyne sp. của chủng nấm Purpureocillium lilacinum với tỉ lệ lây nhiễm 10 5 bào tử/ 5 cá thể cái thấy tỉ lệ lây

nhiệm sau 1 ngày rất thấp khoảng 11% và sau 4 ngày lây nhiễm chỉ đạt được 31%.

- Đã tiến hành thử nghiệm in vitro trên trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. bởi chủng nấm Purpureocillium lilacinum với tỉ lệ lây nhiễm 105 bào tử/ 100 trứng tuyến trùng với tỉ lệ trứng

không nở là 70% trong số đó tỉ lệ trứng không nở bởi sự ký sinh của nấm Purpureocillium

lilacinum là 25%.

- Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh khối và số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum:

- Với sự thay đổi giá trị ph từ 6, 6.5, 7, 7.5 không có ảnh hưởng nhiều đến sinh khối cũng như số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum.

- Với sự thay đổi nguồn Nitơ: sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nhất khi nuôi cấy trên nguồn Nitơ là cao nấm men (0.714022g/ 100ml). Số lượng bào tử nấm

Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nhất khi sử dụng nguồn Nitơ là KNO3 (3525926 bào

tử/ ml).

- Với sự thay đổi nguồn Cacbon: sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nhất khi nuôi cấy trên nguồn cacbon là saccharose (0.929056 g/ 100ml) và đạt số lượng bào tử

cao nhất là (24200000 bào tử/ ml).

4.2. Kiến nghị

- Tiếp tục khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp. bởi nấm Purpureocillium lilacinum trong điều kiện nhà lưới để làm cơ sở ứng dụng.

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000), Động vật chí Việt Nam - Tuyến trùng ký

sinh thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 7, tr. 36-37, tr. 210-211.

2. Nguyễn Ngọc Châu (2003), Tuyến trùng thực vật và cơ sở phòng trừ, Nhà xuất bản Khoa

học và Kỹ thuật, tr. 10-15.

3. Trần Thị Minh Định (2011), Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng Aspergillus sp.

phân lập từ rừng ngặp mặn Cần Gìơ, Luận văn Thạc sĩ Sinh Học, Trường ĐH Sư Phạm TP.

HCM, tr. 35-37.

4. Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS-EXCEL, Nhà xuất

bản Giáo Dục.

5. Dương Đức Hiếu (2008), Khảo sát khả năng kiểm soát tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu từ

bánh dầu neem phối trộn với compost và nấm T. harzianum, Báo cáo nghiệm thu, tr. 4-10.

6. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, tr.

7. Trần Thị Thanh (2007), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr. 45-60.

8. Trần Thanh Thuỷ (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr.

54-56, tr. 70-71.

Tiếng Anh

9. Alamgir KHAN, Keith L. WILLIAMS and Helena Nevalainen (2003), “Testing the

nematophagous biological control strain Purpureocillium lilacinum 251 for paecilotoxin

production”, Elsevier, pp. 107-111.

10. Alamgir KHAN, Keith L. WILLIAMS and Helena K.M. NEVALAINEN (2006), “Control of purpureocillium lilacinumant-parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum in pot trials”, Biocontrol 51, pp. 643-658. 11. Chen Guan Pau, Chan Teck Stephen Leong, Sing King Wong, Lily Eng, Make Jiwan,

Franklin Ragai Kundat, Zakry Fitri Bin AB. Aziz, Osumanu Haruna Ahmed and Nik

Muhamamad Majid (2012), “Isolation of indigenous strains of Purpureocillium lilacinum

with antogonistic activity aganinst Meloidogyne incognita”, International jounal of

Agriculture & Biology, 14: pp. 197-203.

60

12. Christos I. Rumbos and Sebastian Kiewnk (2006), “Effect of purpureocillium

lilacinumantspecies on persistence of Purpureocillium lilacinum strain 251 in soil and on

root colonization by the fungus”, Purpureocillium lilacinumant and Soil 283, pp. 25-31.

13. CMPT Mycology Purpureocillium lilacinumus Program (2011), “Sinus aspirate-

Paecilomyces species (lilacinus)”, Challenge 1109-3.

14. F.A. Zaki and D.S. Bhatuyến trùngi (1990), “In vivo parasitism of Meloidogyne javanica

by an oviparasitic fungus, Purpureocillium lilacinum”, Departermant of Nematology,

Haryana Agricultural University – Hisar 125004, India, 18: pp. 141-143.

15. Hajer Regaieg, Aurelio Ciancio, Najet Horrrigue Raouani, Gaetano Grrasso, Laura Rosso

(2010), “Effects of culture filtrates from the nematophagous fungus, Verticillium

leptobactrum on viability of the root-knot nematode Meloidogyne incognita”, Springer

Science and Business Media B.V.

16. Imran A. Siddiqui, Shanmin A. Qureshi, V. Sultana, S. Ehteshamul-Haque and Abdul

Ghaffar (2000), “Biological control of rot-root knot disease compurpureocillium

lilacinumex of tomato”, Kluwer Academic Publishers, Purpureocillium lilacinumant and

Soil 227, pp. 163-169.

17. Jian Xin Deng, Narayan Chandra Paul, Huyn Kyu Sang, Ji Hye Lee, Young Soo Hwang

and Seung Hun Yu (2012), “Frist report on isolation of Penicillium adametzioides and

Purpureocillium lilacinum from decayed fruit of Cheongsoo grapes in Korea”, The Korean

Society of Mycology 40(1), pp. 66-70.

18. Li Gao and Xing Zhong Liu (2010), “Sporulation of several biocontrol fungi as affected by

carbon and nitrogen sources in a two-stage cultivation system”, The Journal of

Microbiology, Vol. 48, No. 6, pp. 767-770.

19. M. Nasr Esfahari and B. Ansari Pour (2006), “The effects of Purpureocillium lilacinum on

the pathogenesis of Meloidogyne javanica and tomato purpureocillium lilacinumant growth

parameters, Iran Agricultural Research”, Vol. 24, No. 2 and Vol. 25, No. 1.

20. Nic Smol (2007), Lectura book of the Postgraduate Unternational Nematology Course-

General techniques, Ghent University.

21. Poornima Sharma and Rakesh Pandey (2009), “Bological control of root-knot nematode;

Meloidogyne incognita in the medicinal purpureocillium lilacinumant; Withania sominifera

61

and the effect of biocontrol agents on purpureocillium lilacinumant growth”, African

Journal of Agricultural Research, Vol. 4(6), pp. 564-567.

22. Xiaoli Liu, Xizhuo Wang, Laifa Wang, Qinglong Shu, Zhihua Cao (2013), “Generatiom of

green fluorenscent protein vector transfomed Purpureocillium lilacinum strains”, Academic

journals, Vol. 7(13), pp. 1114-1120.

23. Yuzuru Mikami, Katsukiyo Yazawa, Kazutaka Fukushima, Tadashi Arai, Shunichi

Udagawa and Robert A. Samson (1989), “Paecilotoxin production in clinical or terrestrial

isolates of Purpureocillium lilacinum strains”, Kluwer Academic Publishers,

Mycopathologia 108, pp. 195-199.

24. Zaneta Fiedler and Danuta Sasnowska (2007), “Nematophagous fungus Purpureocillium

lilacinum (Thom) Samson is also a biological agent for control of greenhouse insects and

mite pests”, Biocontrol 52, pp. 547-558.

Web

25.htuyếntrùngp://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Tuy%E1%BA%BFn_tr%C3%B9ng_h%E1 %BA%A1i_th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt

26.htuyến trùngp://hydrology1.nmsu.edu/teaching/soil698/Student_Reports/light- microscope/light_microscope/microscopic-microorganisms.html\

27.htuyến trùngp://agronovida.blogspot.com/2011/04/el-cultivo-de-las- mandarinas_1178.htmlhtuyến trùngp://www.agirpourlabiodiversite.fr/spip.php?article24

28.htuyếntrùngp://zipcodezoo.com/Photographers/Agroscope%20FAL%20Reckenholz%20Arc hives.asp

29.htuyến trùngp://www.vipesco.com.vn/tintucchitiet.php?Idtin=6338

30.htuyến trùngp://www.khuyennongtphcm.com/?mnu=4&s=600012&id=2785

31.htuyếntrùngp://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNemat ode.aspx

32.htuyến trùngp://www.nature.com/nbt/journal/v26/n8/fig_tab/nbt.1482_F1.html

33.http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg

62

34.htuyến trùngp://tapchitre.com/kham-pha/ngam-cac-loai-nam-ky-quai-tu-kinh-hien-vi- 20120926031033229.tct

35.htuyến trùngp://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012/06/paecilomyces-lilacinus.html

36.htuyến trùngp://agriviet.com/home/threads/5705-Cong-Ty-Tnhh-Nong-Sinh

37.htuyến trùngp://www.gaanvn.com/news.php5?NewsID=111

38.htuyến trùngp://www.greenmaxagrotech.com/paecilomyces-lilacinus.html

39.htuyến trùngp://trade.indiamart.com/search.mp?search=paecilomyces+lilacinus

40.htuyến trùngp://agriviet.com/home/threads/5705-Cong-Ty-Tnhh-Nong-Sinh

41.htuyến trùngp://www.doctor-obregon.com/siteimages/paecilomyces1.jpg

42.htuyếntrùngp://origin-ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0 S0038071710001422-gr1.jpg

63

PHỤ LỤC

Kết quả xử lý số liệu bằng phần mềm Stargraphic

Minimum Maximu

Range Stnd.

1. Ảnh hưởng pH đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum

Coeff. of variation 20.3074% 31.6986%

0.7486 0.669

m 1.2953 1.456

skewness 0.5467 0.331128 0.787 0.459758

pH6 9 pH6.5 9

27.2051%

0.5422

1.2245

0.6823 0.386119

0.227628

9

pH7

35.5164% 29.5609%

0.5895 0.5422

1.6044 1.6044

1.0149 0.374244 1.0622 1.15181

pH7.5 9 Total 36

Count Average Standard deviation 1.00877 0.204854 0.31488 0.99335 6 0.83671 1 1.04954 0.37276 0.28736 0.97209 4

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Summary Statistics

Stnd. kurtosis pH6 -0.973109 pH6.5 -1.22625 -0.342502 pH7 pH7.5 -1.09884 Total -1.12136 ANOVA Table Source

Square 0.0783721 0.94

3

0.4307

Sum of Squares 0.235116

32 0.0829699 35

Between groups Within groups 2.65504 Total (Corr.) 2.89015 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneou

Limits

pH7

9

s Groups X

ph6 - ph6_5 ph6 - ph7 ph6 - ph7_5

pH6.5

9

X

9 9

0.83671 1 0.99335 6 1.00877 X 1.04954 X

0.0154111 0.276587 0.172056 0.276587 0.276587 - 0.0407778 0.156644 0.276587 0.276587 - 0.0561889 -0.212833 0.276587

ph6_5 - ph7 ph6_5 - ph7_5 ph7 - ph7_5

pH6 pH7.5 Contrast

Sig. Difference +/-

64

* denotes a statistically significant difference. 2. Ảnh hưởng pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum

Minimum Maximu

Range

Summary Statistics

Count Average Standard deviation 1.51168E7

27

Coeff. of variation 110.67%

2.E6

m 5.16E7

4.96E7

8.44387E6

79.1063%

2.6E6

2.66E7

2.4E7

27

1.20962E7

99.5726%

800000. 4.6E7

4.52E7

27

1.33039E7

107.034%

1.E6

4.E7

3.9E7

27

1.23512E7

101.009%

800000. 5.16E7

5.08E7

Số lượng bào tử _pH 6 Số lượng bào tử _pH 6.5 Số lượng bào tử _pH 7 Số lượng bào tử _pH 7.5 Total

108

1.36593E 7 1.06741E 7 1.21481E 7 1.24296E 7 1.22278E 7

Stnd. skewness 3.65545

Stnd. kurtosis 2.06987

2.14632

-0.679829

3.01232

1.34052

2.11917

-0.794559

6.30008

3.04224

Số lượng bào tử _pH 6 Số lượng bào tử _pH 6.5 Số lượng bào tử _pH 7 Số lượng bào tử _pH 7.5 Total ANOVA Table Source

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares 1.21776E14 3

Square 4.0592E13 0.26

0.8536

Between groups Within groups 1.62013E16 104 1.55782E1

4 Total (Corr.) 1.63231E16 107 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD

Count Mean

Homogeneous Groups

Số lượng bào tử _pH 6.5

27

1.06741E7 X

Số lượng bào tử _pH 7

27

1.21481E7 X

Số lượng bào tử _pH 7.5_

27

1.24296E7 X

Số lượng bào tử _pH 6

27

1.36593E7 X

65

Contrast Số lượng bào tử _pH 6_- Số lượng bào tử _pH 6.5 Số lượng bào tử _pH 6- Số lượng bào tử _pH 7 Số lượng bào tử _pH 6- Số lượng bào tử _pH 7.5 Số lượng bào tử? _pH 6.5- Số lượng bào tử bào t? _pH 7

Sig. Difference +/- Limits 6.73633E 6 6.73633E 6 6.73633E 6 6.73633E 6

Số lượng bào tử _pH 6.5 - Số lượng bào tử _pH 7.5

6.73633E 6

2.98519E 6 1.51111E 6 1.22963E 6 - 1.47407E 6 - 1.75556E 6 -281481. 6.73633E

6

Số lượng bào tử _pH 7 - Số lượng bào tử _pH 7.5 * denotes a statistically significant difference.

3. Ảnh hưởng của nguồn N đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics

Minimum Maximum Range Stnd.

Count Average Standard deviation 0.0916788

9

Coeff. of variation 12.8398%

0.5246

0.8193

0.2947

skewness -1.27799

0.0262158

14.7436%

0.1444

0.2261

0.0817 0.582444

cao nấm men (NH4)2SO4 9

0.0710664

38.8388%

0.104

0.3298

0.2258 1.5441

9

KNO 3

0.0515726

34.8307%

0.0812

0.2445

0.1633 0.637726

9

NaNO3

Total

36

0.247348

80.907%

0.0812

0.8193

0.7381 2.91598

0.71402 2 0.17781 1 0.18297 8 0.14806 7 0.30571 9

Stnd. kurtosis 0.699889

cao nấm men (NH4)2SO4 -0.107829 0.740693 KNO3 -0.0145503 NaNO3 Total -0.381397

66

Df Mean

F-Ratio

P-Value

ANOVA Table Source

Sum of Squares 2.00692

Square 0.668975

3

159.26

0.0000

32 0.00420061 35

Homogeneous Groups X

Between groups Within groups 0.13442 Total (Corr.) 2.14134 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean 9 NaNO3

X

(NH4)2SO4 9

9

X

KNO3

9

X

0.14806 7 0.17781 1 0.18297 8 0.71402 2

cao nấm men Contrast

Sig. Difference +/-

*

0.536211

Limits 0.062234

*

0.531044

0.062234

*

0.565956

0.062234

0.062234

cao nấm men - (NH4)2SO4 cao nấm men - KNO3 cao nấm men - NaNO3 (NH4)2SO4- KNO3

- 0.0051666 7 0.0297444 0.062234 0.0349111 0.062234

(NH4)2SO4- NaNO3 KNO3 - NaNO3 * denotes a statistically significant difference. 4. Ảnh hưởng của nguồn N đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics

Minimum Maximum Range Stnd.

Count Average Standard deviation 1.41349E6

27

Coeff. of variation 43.8669% 1.E6

5.8E6

4.8E6

skewness 0.268604

2.01697E6

57.2038% 800000.

7.8E6

7.E6

0.854775

27

cao nấm men KNO3

1.67376E6

49.1213% 1.2E6

8.E6

6.8E6

1.58345

27

NaNO3

3.22222E 6 3.52593E 6 3.40741E 6

67

(NH4)2SO4 27 108 Total

130.047% 200000. 70.0386% 200000.

3.8E6 8.E6

3.6E6 7.8E6

4.4659 2.0689

814815. 1.05965E6 1.92087E6 2.74259E 6

Stnd. kurtosis -1.0372

Df Mean

F-Ratio

P-Value

cao nấm men -1.00715 KNO3 NaNO3 0.406629 (NH4)2SO4 3.54731 Total -1.10586 ANOVA Table Source

18.02

0.0000

Sum of Squares 1.35053E14 3

Square 4.50177E1 3

Between groups Within groups 2.59751E14 104 2.49761E1

2 Total (Corr.) 3.94804E14 107 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean

Homogeneous Groups

X

27

(NH4)2SO4 27 27 cao nấm men NaNO3

X

27

KNO3

814815. X X 3.22222E 6 3.40741E 6 3.52593E 6

Contrast

Sig. Difference +/-

-303704.

Limits 852957.

-185185.

852957.

*

2.40741E6 852957.

852957. 118519. 2.71111E6 852957. 2.59259E6 852957.

cao nấm men - KNO3 cao nấm men - NaNO3 cao nấm men - (NH4)2SO4 KNO3 - NaNO3 KNO3 - (NH4)2SO4 * * NaNO3 -

68

(NH4)2SO4 * denotes a statistically significant difference. 5. Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics

Minimum Maximum Range Stnd.

-0.261205

Count Average Standard deviation 0.757578 0.108659 0.929056 0.221359 0.624344 0.115439 0.770326 0.197394

Coeff. of variation 14.343% 23.8263% 18.4896% 25.6248%

0.632 0.6926 0.4827 0.4827

0.9686 1.4147 0.7597 1.4147

skewness 0.3366 1.02536 0.7221 1.59533 0.277 0.932 2.71398

9 Glucose saccharose 9 9 tinh bột 27 Total

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Stnd. kurtosis 0.16557 Glucose saccharose 1.44244 -1.41498 tinh bột 3.37441 Total ANOVA Table Source

Sum of Squares 0.420014

Square 0.210007

2

8.50

0.0016

24 0.024711 26

Between groups Within groups 0.593063 Total (Corr.) 1.01308 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD

Count Mean

Homogeneous Groups

tinh bột

9

0.624344 X

0.757578 X X 0.929056

9 glucose saccharose 9 Contrast

Sig. Difference +/-

Limits

*

-0.171478 0.152942

0.133233 0.152942

0.304711 0.152942

*

glucose - saccharose glucose - tinh bột saccharose - tinh bột * denotes a statistically significant difference.

69

6. Ảnh hưởng của nguồn C đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics

Range

Count Average Standard deviation 1.41349E6

27

Coeff. of variation 43.8669%

Minimu m 1.E6

Maximu m 5.8E6

4.8E6

glucose

Stnd. skewness 0.268604

saccharose tinh bột

27 27

30.4709% 39.0454%

1.14E7 4.8E6

3.7E7 2.12E7

2.56E7 1.64E7

0.377893 -0.195049

Total

81

1.0044E7

74.9273%

1.E6

3.7E7

3.6E7

2.31962

3.22222 E6 2.42E7 7.37397E6 4.99491E6 1.27926 E7 1.34049 E7

ANOVA Table Source

Df Mean

F-Ratio

P-Value

Sum of Squares 5.95609E15 2

109.86

0.0000

Square 2.97805E1 5

Between groups Within groups 2.11439E15 78 2.71075E1

3

Total (Corr.) 8.07048E15 80 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean

Homogeneo us Groups

glucose

27

3.22222E6 X

tinh bột 27 saccharose 27

1.27926E7 2.42E7

X X

Sig. Difference +/- Limits -2.09778E7 2.82109E *

6

Contrast glucose - saccharose glucose - tinh bột *

-9.57037E6 2.82109E

6

*

1.14074E7 2.82109E

6

saccharose - tinh bột * denotes a statistically significant difference.

70

7. Kết quả định danh nấm Purpureocillium lilacinum

71

72

73