Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN

TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hà Nội, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và

kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình

nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.

Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh

học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn,

tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn

thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận

tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những

người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi

học tập và hoàn thành luận văn của mình.

Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Hiền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3

1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis ......................................................... 3

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis ..................................... 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt........................................................................... 6

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá ....................................................................................... 8

1.1.4. Đặc điểm phân loại ..................................................................................... 8

1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ........................ 9

1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis ............................................... 11

1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể ..................................................... 13

1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng ................................. 14

1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam ................................................... 15

1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc .......... 16

1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ............. 18

1.2. Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy ..................................................... 19

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy .............................................................................. 19

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm ............................................................................... 19

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24

2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 24

2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................. 24

2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 24

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 26

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh ................................ 26

2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt ........................................................................ 27

2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm .................................................. 27

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid ............................................................................ 28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR ...................................... 29

2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 30

2.2.7 Xác định trình tự nucleotide ...................................................................... 32

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33

3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C

có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ ................................................... 33

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu ..................... 33

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh .................................................................. 35

3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu ............. 36

Nồng độ bào tử .................................................................................................... 36

Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ .................................. 37

3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C ........................................... 39

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR............................. 39

3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C ..................................................................... 40

3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C ........................................................... 44

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 47

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

STT Viết tắt Viết đầy đủ

Amp Ampicillin 1

Bp Base pair 2

Bt Bacillus thuringiensis 3

Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai 4

Nước khử ion 5 dH2O

DNA Deoxyribonucleotide acid 6

E. coli Escherichia coli 7

EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 8

OD Optical density 9

PCR Polymerase chain reaction 10

SDS Sodium dodecyl sulphate 11

Sol Solution 12

TE Tris EDTA 13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

X-gal 5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside 14

Trang

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt………………………………………… .............. 10

Bảng 3.1. Sự đa dạ ng hình thá i tinh thể của các chủng Bt…........ ................................. 34

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm . 37

Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm. ................... 38

DANH MỤC BẢNG

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis ……………………..…. ................... 7

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis ....................................... .................... 8

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac ................14

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis …… ………….. .................. 15

Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….……... ........... 21

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại …………… ……………………………... ............... 21

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng …………… ………...……………. ........... 23

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC...........33

Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần . ............................ 34

Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển

vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………….... ................... 36

Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu.. ........................... 37

Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu………………... .......... 38

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… .................... 39

Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua

đêm………………………………………………………………………………. ....... 41

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… ........... 42

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên

agarose 1%.......................................................................................................... .......... 43

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều

kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng

bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên

180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt

hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà.

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa

học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình

mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn

lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm,

gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay

vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử

dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn

90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với

con người, động vật và môi trường [24].

Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu

nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis

subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng

bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh

(Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn

trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong

quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh.

Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng

cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy

vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’.

2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.1. Mục tiêu

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) có hoạt

tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.

- Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc

có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.

1.2. Nội dung

- Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái

Nguyên.

- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương

pháp huyết thanh học.

- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được.

- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn

trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR.

- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy.

- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tự gene trên Gene Bank.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cƣơng về Bacillus thuringiensis

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis

 Trên thế giới

B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học

Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu,

đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi

Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8].

Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây

bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã

đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8].

Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục

thân ở Châu Âu.

Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa

mì tại Pháp.

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể

có bản chất là protein [8].

Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với

khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã

chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33].

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết

thanh.

Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var.

israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã chứng

tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà

còn với cả bộ hai cánh (Diptera) [14].

Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng

gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp. kurstaki HD-1 gọi là gene cry1

và cho biểu hiện gene này ở E. coli. Từ đó một số lượng lớn các gene đã được

tách dòng và nghiên cứu đặc tính.

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự

phát hiện ra dưới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera).

Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar. Sau đó, công ty

Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt

subsp. Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng [14].

Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm

1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng.

Từ năm 1987 -1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt

giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ

Hymenoptera. Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương

mại cao [10, 13, 25].

Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản

xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –

cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2].

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả

năng diệt tế bào ung thư.

Năm 2005, Ohba và N.D. Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt

phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ở người [10,13].

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng

 Ở Việt Nam

để sản xuất có tính thương mại cao.

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam

được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác

giả như Nguyễ n Công Bì nh , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu

tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam [10].

Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn rất

ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis

bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng

các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var.

thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã

được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả

tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã

bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lượng

không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10].

Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)

Ở thời kỳ này, các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất theo phương pháp

dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá

thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các

trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phương

pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [10].

Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay)

Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất

lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bước vào thời

kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa

học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm

các chủng B. thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục

hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ

chuyển gene B. thuringiensis phục vụ sản xuất [10].

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B.

thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [6]. Năm

2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen e

của Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22

dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [7, 11].

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng B.

thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu

hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli

thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng

[5,12].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng

vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt

đầu từ cuối thế kỷ 20. Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu

vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các

giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. [9,13].

Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua

phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gene kháng sâu trên được

chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14].

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt

Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh

vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que,

kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí

không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trên bề mặt tế bào [26,27,28].

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn

lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn

lạc dạng trơn nhẵn.

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc

bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc

hình trứng, kích thước 1,6-2m. Bào tử được hình thành trong điều kiện môi

trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp

điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27].

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng

hợp. Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là

hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có thể chiếm tới 30%

trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và

quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

bào tử thì bắt màu hồng nhạt [27].

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá

Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose,

manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose. Có khả năng thủy phân tinh

bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001%

lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Bt không có

khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối

sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn).

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15-450C.

Nhiệt độ tối ưu là 28- 32οC.

Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH= 7. Bt

có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo chu

trình Embden- Meyerhoff- Panas [6, 7, 8].

1.1.4. Đặc điểm phân loại

Có rất nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau: Phân loại

Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus,

1958).Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên - H. Phân loại bằng thực

khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác

nhau.Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể.Phân loại theo loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hình enzym lipase.Phân loại theo nguồn bệnh.

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn

chế.

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có

hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh

động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H

được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương pháp phân

loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi

khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type huyết thanh và các

chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập

được. Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao

gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B. thuringiensis. Theo hệ thống phân loại

thì B. thuringiensis subsp. aizawai thuộc type huyết thanh số 7 (Theo Bonnefoi

& de Barjac 1963) [5].

Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B.

thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các

phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H.

1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gene của B. thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp. Thể

nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình

dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen

có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có một NST duy nhất dạng

vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt.

Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài

nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không

đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên

cho một số chủng B. thuringiensis.

Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ

chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene cry,

cyt, vip mã hóa [21,25].

1.1.5.1. Gene cry

Gene cry mã hóa cho các độc tố Cry khác nhau. Đây là gene độc tố quan

trọng nhất của Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng là do các protein độc do gene cry

mã hóa. Các gene cry thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp. Những

nghiên cứu của Carlton và Gonzalez trên 21 loài phụ Bt đã cho thấy số lượng

plasmid dao động từ 2- 12 trong các chủng nghiên cứu [11,20].

Theo công bố mới nhất trên website

http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html: đã

phát hiện tới hơn 600 gene thuộc 70 họ gene cry của Bt.

Sau đây là các họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn

trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam:

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt

Gen

Hình dạng tinh thể

Khối lƣợng phân tử protein (kDa)

Hoạt tính diệt côn trùng

cry1A- cry1L

Lưỡng tháp

130 – 138

Cánh vảy

cry2A- cry2C

Cầu

Cánh vảy, hai cánh

69 – 71

73 – 74

Cánh cứng

cry3A- cry3C

Lập phương

73 – 74

Hai cánh

cry4A- cry4D

Cầu

Tuyến trùng

Lưỡng tháp

cry5

130

Cánh cứng

Lập phương

cry8

Các gene cry còn lại

Đa dạng

35 – 129

Đa dạng

Gene cyt

Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình

thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

không đáng kể [34].

Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc 3 lớp cyt1, cyt2 và cyt3 mã hóa protein

gây độc với côn trùng và động vật không xương sống. Nhóm gene cyt mã hóa

protein 27 kDa và chiếm khoảng 40-50% tinh thể, protein này có tác dụng gây

độc với côn trùng bộ hai cánh và giun tròn.

Gene vip

Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein). Độc

tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao gồm

Vip3A và Vip3B [8].

Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do

khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát

hiện được côn trùng kháng độc tố này. Các nhà khoa học đã phát hiện được 85

gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã hóa

protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon,

Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua. Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A

là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa.

1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố:

Ngoại độc tố  ( - exotoxin), ngoại độc tố  (-exotoxin), ngoại độc tố  ( -

exotoxin), nội độc tố  (-endotoxin). Trong đó nội độc tố  có tác dụng diệt côn

trùng mạnh nhất.

Ngoại độc tố 

Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước,

tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi trường

khi tế bào tan rã. Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là phospholipase

hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá đặc biệt là ong

Tenthre dineda. Tác dụng độc của ngoại độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ

phospholipid ở mô của côn trùng (nghiên cứu này được phát hiện bởi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Toumanoff - năm 1953) [8, 11].

Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella. Ngoài ra còn có

hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng.

Ngoại độc tố 

Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi

nhà bằng thức ăn có chứa B. thuringiensis. Độc tố  có khối lượng phân tử cao

707- 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm

nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA. Ngoại độc tố

 có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ

cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh [8,12].

Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng

mẫn cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu

trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết.

Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử

dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ

sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%.

Ngoại độc tố 

Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không

khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có tác

dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 600C trở lên trong vòng từ 10- 15 phút đã bị vô hoạt.

Nội độc tố 

Có bản chất là một protein gồm 1180 gốc amino acid, các amino acid chủ

yếu là glutamic và aspartic acid, chiếm trên 20% tổng số amino acid trong phân

tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp. Lượng

cysteine nhỏ hơn 20% tổng axit amin quy định sự không hoà tan của tinh thể,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ngoài ra còn có các amino acid: arginine, threonine, leucine, isoleucine [14].

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: carbohydrate,

tuy nhiên cũng có thể carbohydrate chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong

quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố  chứa chủ

yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng

nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Nguyên tố P hầu như không có.

Nội độc tố : có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ

tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun ở 650C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 1000C trong 30-40

phút thì tinh thể bị mất tính độc. Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm,

nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp. Qua nghiên cứu các nhà khoa

học nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng tới độc tính

của tinh thể. Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hòa tan trong pH

rất kiềm. Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như đồng thời trong

khoảng 3 giờ sau pha cân bằng [8, 11, 16].

1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể

Năm 1991, Li và cs đã công bố cấu trúc của nội độc tố  của protein tinh

thể diệt sâu Cry3A, từ đó đã mở rộng ra cho các độc tố khác. Các protein tinh

thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:

Vùng 1: là một chuỗi polypeptide gồm 290 amino acid, đây là vùng đầu

N. Vùng này gồm 7 chuỗi xoắn , 6 trong 7 chuỗi này được sắp xếp thành hình

6 cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ 5 kị nước. Mặt bên của chuỗi xoắn

thứ nhất và thứ 7 là các amino acid kị nước và nó nằm liền kề với vùng 2.

Vùng 2: bắt đầu từ amino acid 291 đến amino acid 500. Vùng này gồm 3

tấm  có cấu trúc tương đồng, song song và xếp ngược chiều nhau, trong đó tấm

1 và tấm 2 có tính tương đồng cao hơn. Mỗi tấm bao gồm 4 mảnh  không song

song, có cấu trúc chung. Hai mảnh  ở phía trong tạo thành một dải  kéo dài ra

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tận phía 2 mảnh  ở phía ngoài. Tấm 3 có 3 mảnh  và 1 chuỗi xoắn  có chức

năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2. Vùng 2 là vùng không bền vững của

độc tố [20].

Vùng 3: chứa những tấm  dạng bánh kẹp Sandwich. Vùng này chứa đầu

nhóm carboxyl và có cấu trúc bền vững [8].

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac

1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng

Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B. thuringiensis liên quan tới

sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng. Khi sâu ăn phải protein tinh

thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm

(pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối

lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa. Độc tố đã hoạt hóa bám

vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu.

Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò

(kênh ion). Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết [8, 26].

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam

Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện

Bảo vệ Thực vật năm 1971. Nguyễn Văn Cảm và CS đã khảo nghiệm 5 loại

thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô vàTrung Quốc đã cho kết quả rất

khả quan. Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên được

Nguyễn Công Bình và CS thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật

nay là Viện Công nghệ sinh học. Cho đến nay Bt đã được nghiên cứu rộng rãi ở

nhiều cơ sở tại Việt Nam như Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực

vật, Viện Công nghệ sinh học [13].

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng

Bt phân lập tại Việt Nam. Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng gene và biểu hiện

gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C, Cry1D diệt sâu khoang từ các chủng Bt

subsp. aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh. Protein tái tổ

hợp có hoạt tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [12].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng

vào cây trồng để tạo ra cây có khả năng kháng sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ

thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các

giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như cây đậu xanh, cây bông. Năm

2003, Phan Đình Pháp và CS đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua

phương pháp sử dụng súng bắn gene, đến năm 2005, gene kháng sâu trên được

chuyển vào cây cà tím thông qua Agrobacterium [12].

Những nghiên cứu trên đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong

việc ứng dụng các gene quý của Bt để tạo ra các cây trồng mới kháng được sâu

bệnh cũng như sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt.

1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể độc,

đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả của quá

trình lên men sản xuất chế phẩm Bt. Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng

các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều ảnh hưởng

tới quá trình sinh tổng hợp độc tố.

Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20- 400C. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28- 320C. Nếu nhiệt độ dưới 200C và trên 320C đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào tử. Nếu nuôi cấy ở 200C thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy ở 350C thì

thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ và số bào tử tăng lên. Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 400C thì Bt vẫn có khả

năng phát triển nhưng bào tử lại không được hình thành. Thêm vào đó nhiệt độ

cũng có ảnh hưởng lớn tới quá trình hình thành tinh thể độc, ở nhiệt độ dưới 140C sau 360 giờ nuôi cấy không quá 10% tinh thể được hình thành, nhưng ở nhiệt độ 160C sau 168 giờ nuôi cấy lượng tinh thể tăng lên đạt tới 15% [8].

pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào

và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh

dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại. Do đó pH quá cao

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hoặc quá thấp đều có hại tới Bt. Với pH dao động trong khoảng 5,8- 8,5 không

gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc. Tuy nhiên sự thay đổi lớn yếu tố

pH lại làm thay đổi số lượng bào tử. Thường thì Bt phát triển tối ưu ở pH=7 [9].

Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể thiếu

trong quá trình sinh trưởng Bt. Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm lượng

oxy cần cung cấp khác nhau. Ở các giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng, Bt

cần nhiều không khí, do vậy không khí được cấp càng nhiều thì lượng sinh khối

càng tăng và số lượng bào tử sẽ tăng. Tuy nhiên, ở các giai đoạn sau (giai đoạn

logarit cho đến trở về sau) nếu cứ tiếp tục tăng hàm lượng không khí thì nó sẽ

tác động lên quá trình sống của tế bào làm tế bào sớm tự phân giải, dẫn tới số

lượng tinh thể độc giảm [8].

Các nguồn dinh dưỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và

nhận thấy rằng các hợp chất amonium vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu quả

trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt. Trong khi đó các nguồn nitơ

hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình sinh

trưởng. Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau. Các nghiên cứu

cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt và các protein

tinh thể độc. Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng được coi là nguồn

dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt.

Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức

chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho

thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi. Ngoài ra, nếu bổ sung riêng rẽ

threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự hình

thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì sự ức

chế bị mất. Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu như có

mặt axit amin methionine. Acid  – picoline và acid flucoacetate cũng ức chế

việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc. Chất kháng sinh erythromycine

ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

độc [8].

1.1.11. Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai

Gene cry1C

Gene cry1C có kích thước khoảng 3 kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc

tố có kích thước 288bp. Gene cry1C mã hóa protein tinh thể độc tố có khối

lượng phân tử khoảng 130kDa. Nhóm dưới loài B.thuringiensis subsp. aizawai

có khả năng sinh tinh thể hình thoi chứa gene cry1C. Cho đến thời điểm hiện

nay đã có trên 16 gene thuộc phân nhóm cy1C được tách dòng và công bố trên

cơ sở dữ liệu của Crichmore, trong đó mới nhất là gene cry1CAa14.

Trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn

trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1C có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối

lượng phân tử khác nhau.

Dưới loài Bta

Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis, thuộc typ

huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de. Barjac, 1963. Trong số

các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15% số chủng là Bta

[5,10].

Bta hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì phát triển ở pha ổn định. Tinh

thể có dạng hình thoi là chủ yếu. Dưới loài Bta mang gene mã hóa nhiều loại

protein tinh thể của nhóm Cry 1 như Cry 1C, Cry 1D, Cry 1Aa, Cry 1Ab. Vì thế

Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế

phẩm từ Bt. Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ

(Plutella Xylustella), CL, ICW, sâu xanh da láng, sâu quả cà chua, sâu khoang.

Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng đã có biểu hiện kháng độc tố Btk

[38].

Trên thị trường hiện nay, chế phẩm XenTari sản xuất từ Bta được sử dụng

rộng rãi và có hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng mà đã kháng lại thuốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trừ sâu hóa học như: sâu khoang, sâu xanh [10].

1.2. Đại cƣơng về côn trùng bộ cánh vảy

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy

Bộ cánh vảy(Lepidoptera) là một bộ lớn trong côn trùng học, bao gồm

bướm và bướm đêm. Bộ cánh vảy gồm hơn 180.000 loài trong 128 ngành và 47

họ. Trong số hơn 180.000 loài được mô tả cho đến nay có thể tìm thấy hầu như

ở khắp mọi nơi. Khoảng 11.300 loài được tìm thấy từ Bắc Mỹ và 10.000 loài tìm

thấy ở Úc. Bộ cánh vảy được tìm thấy phần lớn ở hầu hết các môi trường sống,

nhưng hầu như chúng luôn luôn sống ở các vùng thực vật bậc cao, đặc biệt là

thực vật hạt kín [3].

Cũng như tất cả các côn trùng, loài cánh vảy có một bộ xương ngoài và

tách ra thành ba phần : phần đầu, phần ngực, phần bụng. Chúng có 3 cặp chân ở

ngực, hai mắt kép lớn và một thuôn dài trên miệng được gọi là vòi. Còn ấu trùng

thì cơ thể mềm, phần đầu phát triển và có đến 11 cặp chân (thông thường là 8

cặp). Chúng thường đẻ trứng trên các loài cây chủ, số lượng trứng là khác nhau

từ một vài cho đến một vài nghìn. Trứng sau khi nở thành ấu trùng, các ấu trùng

ăn tất cả các phần của cây. Ấu trùng phát triển nhanh với nhiều thế hệ trong một

năm, tuy nhiên một số loài thời kỳ phát triển mất đến 3 năm. Bộ cánh vảy gây

hại nghiêm trọng cho nông nghiệp, chủ yếu là khi tuổi ấu trùng, chúng đục thân,

ăn lá làm tổn hại đến cây dẫn đến cây chết: sâu hại bắp ngô, sâu tơ hại rau, sâu

đục quả đậu rau.

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm

Sâu tơ

Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau

(Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù.

Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương. Chúng

được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong

nhiều nghiên cứu. Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này. Sâu tơ sinh sản cao,

vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh. Thiệt hại hàng năm do sâu tơ gây ra

khoảng 30- 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20-40% tổng chi phí đầu tư

nhất là trên bắp cải [3].

Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ

Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt độ 20 -300C thì vòng đời của chúng là 20 -30 ngày, ở nhiệt độ 15–200C thì vòng đời

là 40 ngày. Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non – nhộng – trưởng

thành (Hình 1.5).

Thời trứng 2-3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4- 5mm, đường

kính 0,3-0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng

3–4 ngày.Thời kỳ sâu non 8-10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8- 10mm,

đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ. Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi

1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ

1,2-1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang

màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5-3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển

trong thời gian từ 1-3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm

và phát triển từ 1- 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể

từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày. Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình

ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ. Đầu màu nâu vàng có các

phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt. Trên mảnh cứng của lưng ngực

có những chấm xếp thành hình chữ U.

Thời kỳ nhộng 3- 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6-7mm

được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá.

Thời kỳ trưởng thành 5-7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài 6-

10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có ba dấu

hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát

thân. Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50-400 trứng. Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề

mặt của lá. Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt

dưới của lá [3].

Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ [3]

Đặc điểm gây hại

Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải. Sâu non ăn lá,

khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả

năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết. Sâu tơ phá hoại toàn

bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu

non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng

lỗ chỗ. Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân.

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại [3]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả

năng kháng thuốc cao. Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc

thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme system). Khi cơ

thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích thích hoạt động tăng

100- 200 lần [3].

Sâu xanh da láng

Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)có tên khoa học là Spodoptera

exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh Vảy).

Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu

là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa

màu ngắn ngày khác.Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai

đoạn:

Giai đoạn trưởng thành: Bướm là loại bướm đêm, màu trắng xám,

chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm. Đầu màu xám, mang

nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm. Ngực

màu nâu đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim. Cánh

trước màu xám hơi ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh hơi bầu, có nhiều

vân. Thời gian sống của bướm từ 5-10 ngày và một bướm cái có thể đẻ từ 300-

400 trứng trong vòng từ 3-5 ngày.

Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5mm, mới đẻ màu xanh đến vàng

nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, sắp nở có một chấm đen trên vỏ trứng, đó

là mắt của sâu. Trứng được đẻ thành từng ổ, trên phủ lớp lông màu trắng ngà.

Thời gian ủ trứng từ 2-4 ngày.

Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển trong thời gian từ 10-19

ngày. Mặt lưng của sâu màu xanh và trơn láng nên còn có tên là "Sâu xanh da

láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera). Chi tiết trong từng tuổi

sâu như sau:

Tuổi 1: thân sâu có màu xanh lá cây hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang

nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, cơ thể có chiều dài từ 1,2-1,5mm, thường phần

đầu có chiều ngang lớn hơn chiều ngang thân mình và các sọc trên cơ thể chưa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

rõ ràng. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-5 ngày.

Từ tuổi 2, màu sắc trên mình sâu bắt dầu thể hiện rõ dần. Bụng màu vàng

xanh, các đốt trên thân phân biệt rõ dần. Mình sâu có 3 sọc màu trắng mờ, một

sọc giữa lưng và 2 sọc ở hai bên thân, cả 3 sọc trên chạy từ đốt thứ nhất đến đốt

cuối của bụng. Ở tuổi này sâu có kích thước cơ thể trung bình là 0,45x3,7mm.

Thời gian phát triển của sâu tuổi 2 từ 2-4 ngày.

Sang tuổi 3, lúc mới lột xác sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu

xanh lá cây. Đầu màu vàng nhạt, bóng; vẫn còn mang nhiều lông. Các chấm trên

mình sâu nhỏ dần, lông ngắn hơn. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-3

ngày.

Sau khi nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục của lá

thành những lổ nhỏ, chừa lại lớp biểu bì trắng. Cuối tuổi 1 sâu bắt đầu phân tán

sang các lá lân cận. Ấu trùng tuổi 2 ăn lủng lá thành những lổ nhỏ và có tập

quán nhả tơ buông mình xuống đất khi bị động. Ở tuổi 3 sâu ăn phá mạnh nhất,

cắn lá thành những lổ to; sâu còn đeo trên các chùm hoa của cây đậu nành và ăn

các cánh hoa vừa mới nhú. Ở những ruộng có mật số cao sâu ăn lá còn trơ gân

chính và cuống và cả trái non [3].

Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7–10 ngày, sâu thường hóa nhộng trong đất

hoặc lùm cỏ khô.

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng [3]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Sinh phẩm

150 chủng Bt phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên, chưa qua phân loại và

xác định hình dạng tinh thể, do Phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.

E. coli DH5α được nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ

Sinh học.

Sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) tuổi 2

do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp.

Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene cry1C do phòng Di truyền

- Cặp mồi đặc hiệu gene cry1C

vi sinh vật cung cấp.

TYIC 5’ – CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC 3’

TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’

- Cặp mồi M13

Reverse M13: 5’- CAGGAAACAGCTATG – 3’

Forward M13: 3’- GTAAAACGACGGCCA – 5 ’

Vector tách dòng plasmid: pGEM-T Easy

Taq polymerase, enzyme giới hạn (EcoRI), ligase…của hãng Invitrogen,

Fermentas.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất:

- Hóa chất sử dụng trong phân lập và nuôi cấy Bt: agar, cao thịt, cao nấm men,

peptone, NaCl….

- Hóa chất sử dụng nhuộm bào tử và tinh thể: fuchsin base

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris-base, TAE.

- Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Taq polymease, đệm, nước

khử ion…

Thiết bị:

Các thiết bị nghiên cứu gồm: Máy li tâm (Fresco, Đức), máy PCR (PTC-

100, Mỹ), máy vortex (IKA, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), máy soi gel (Vilber

Lourmat, Đức), máy chụp gel (Gen Doc), kính hiển vi (Olympus, Nhật), tủ lạnh

sâu (Frigo, Đan Mạch)

Ngoài ra chúng tôi cũng sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá

trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet

Môi trƣờng:

Các loại môi trường đã sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm:

 Môi trƣờng MPA- MT1 (g/l)

Agar: 20g Pepton: 10g Nước cất: 1l

NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7

 Môi trƣờng MPB- MT2 (g/l)

Pepton: 10g Nước cất: 1l pH: 7

NaCl: 5g Cao thịt: 4g

 Môi trƣờng Craige- MT3 (g/l)

Bacto agar: 8g Pepton: 10g Nước cất: 1l

NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7

 Môi trƣờng LB- MT4 (g/l)

Trypton: 10g Nước cất: 1l pH: 7

NaCl: 5g Cao men: 4g

 Môi trƣờng LBA- MT5 (g/l)

Agar: 20g Trypton: 10g Nước: 1l

NaCl: 5g Cao men: 4g pH: 7

Các loại dung dịch:

 Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 Dung dịch Sol 1: Tris HCl, pH = 8.0: 20mM.

EDTA, pH = 8.0: 10mM

Glucose: 50mM

 Dung dịch Sol II: NaOH: 20mM.

SDS: 1%

 Dung dịch Sol III: CH3COOK: 60ml

CH3COOH: 11,5ml

H2O: 28,5ml

 Các dung dịch dung trong điện di trên gel agarose

 Dung dịch TE: Tris HCl 10mM, pH= 8.0

EDTA 1mM, pH= 8.0

 Dung dịch đệm điện di TAE 50X:

Tris base 121g

Acid acetic 5M: 28.6 ml

EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml

Nước khử ion đủ 500ml

 Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X:

Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml

EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml

Glycerol: 2ml

Bromphenol blue 1%: 2ml

 Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X: 100ml

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh

Phương pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh dựa trên đặc tính

huyết thanh học của chủng Bt, nghĩa là dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và

được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với kháng huyết

thanh tương ứng. Phương pháp này cho phép xác định dưới loài Bt, tạo điều kiện

thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng Bt có hoạt tính cao với các bộ côn trùng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Các chủng Bt tham gia vào phản ứng ngưng kết huyết thanh phải là các chủng

có khả năng chuyển động. Do vậy, trước khi tiến hành phương pháp này, chúng

tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động của các chủng nghiên cứu trên môi

trường MT3 [30].

Cách tiến hành: các chủng Bt được cấy vào trong ống Craige (là ống thủy

tinh nhỏ, được cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm

to), nuôi ở 37ºC trong 24-28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động

sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường, giữa ống Craige và ống nghiệm.

Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi

trường MT2, lắc ở 70–75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12-15 giờ [30].

Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên

kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng

chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng)

và quan sát dưới kính hiển vi.

2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt

Cấy các chủng Bt ra từng đĩa môi trường MPA riêng rẽ, nuôi ở 28ºC sau 3

ngày để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được xử lý ở 70ºC trong 10 phút, sau đó pha loãng đến nồng độ 10-8 lấy 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng 10-7 và 10-8 cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 28ºC trong 24h, đếm

số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất. Số lượng bào tử được

tính theo công thức:

CFU = n . a . 10

CFU: số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy.

n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng

a: nồng độ pha loãng.

2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm

Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng

nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng

(Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp của Thiery và Frachon ở nồng độ 107 và 109 bào tử/ml đối với sâu xanh da láng và nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ 105. Mỗi nồng độ thử nghiệm với 3 đĩa petri

và mỗi đĩa 10 con sâu tơ và 3 con sâu đối với sâu xanh da láng [34].

Chuẩn bị: Các chủng Bt được cấy thảm trên môi trường MPA, nuôi ở 280C trong 72

giờ. Sau đó, sinh khối được thu vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng. Pha loãng mật độ bào tử ở nồng độ 105 đến 107 bào tử/ml để thử hoạt tính.

Lá cải xanh hoặc lá bắp cải sạch (không phun thuốc trừ sâu, không sâu

bệnh) rửa sạch và tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên, cắt lá với diện tích

đều nhau sao cho vừa đĩa petri. Nhúng lá vừa cắt vào dịch Bt đã pha loãng và để

10 phút cho hai mặt lá được ngấm hết dịch Bt, lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng.

Sau đó cho lá đã khô dịch vào các đĩa petri, mỗi đĩa thử 10 con hoặc 3 con sâu

xanh da láng. Nuôi ở nhiệt độ phòng và nơi thoáng mát và theo dõi tỉ lệ sâu chết

trong 3 ngày.

Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott:

A = (C – T)/C. 100

A: % sâu chết

C: số sâu sống ở mẫu đối chứng

T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm.

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid

- Nuôi vi khuẩn trong môi trường MPB ở 28°C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm.

- Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn.

- Bổ sung 150µl dung dịch sol I, vortex.

- Bổ sung 150µl dung dich sol II, đảo nhẹ bằng tay.

- Bổ sung 150µl dung dịch sol III, lắc mạnh cho tủa hòa tan.

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi.

- Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối

- Tủa ở - 20°C trong 4 giờ.

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.

- Làm khô tự nhiên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Hòa tủa trong 35µl RNase, ủ ở 37°C trong 1h.

- Đẩy nước lên tới 500µl.

- Bổ sung chloroform: isoamylalcohol (24:1); tỷ lệ 1: 1, đảo bằng tay.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi

- Bổ sung NaOAC/KOAC, tỷ lệ 1: 10.

- Bổ sung cồn tuyệt đối, tỷ lệ 2,5: 1.

- Ủ ở -20ºC trong ít nhất 4h.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

- Rửa tủa bằng 200µl cồn 70º.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

- Làm khô, hòa tủa trong 35µl dH2O.

- Bảo quản ở - 20ºC .

2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR

Phương pháp PCR do Karl Mulis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ

enzym DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các

mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn

cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn

DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’-OH tự do. Các

nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH tự do tạo thành mạch đơn mới.

Thành phần 1 phản ứng PCR:

dNTPs 2µl

Đệm (có Mg2+) 2µl

Mồi 1C F 1µl

Mồi 1R 1µl

Taq polymease 0,2µl

DNA Temp 2µl

11,8µl dH2O

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Thể tích/phản ứng: 20µl

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.

2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C

Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy

Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối

T4- DNA ligase.

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng:

Đệm 5µl

Vector 1µl

T4-DNA ligase 1µl

Sản phẩm PCR 3µl

Phản ứng ghép nối được tiến hành 14 - 16h ở 4ºC.

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α

 Nguyên tắc: Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng

trở nên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi

sốc nhiệt.

 Quy trình gồm 2 bước

+ Chuẩn bị tế bào khả biến:

- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm.

- Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB.

- Lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 37ºC. Đo OD600 đạt 0,5-0,6 thì hút lấy mẫu

vào ống eppendorf đặt trên đá 1h. Sau bước này mọi thao tác luôn phải được

thực hiện ở 4ºC.

- Mẫu sau đặt đá 1h được ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch

nổi. Hòa tế bào thu được trong 1-1,5ml CaCl2 100mM vô trùng, vortex và ly tâm

thu tủa ở 6000 vòng/phút trong 10 phút.

- Hòa tan lại tủa trong 1,5ml CaCl2 100mM, vortex, ủ mẫu trên đá trong 2h,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cứ 15 phút đảo 1 lần.

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, hòa tế bào trong 60µl CaCl2

100 mM, bổ sung 15% glycerol.

- Bảo quản tế bào ở - 80ºC

+ Biến nạp:

- Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút.

- Hút 5µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả

biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất

định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).

- Sốc nhiệt ở 42ºC trong 60-90 giây sau đó giữ trong đá 2 phút.

- Bổ sung 200-300µl môi trường LB và lắc ở 37ºC, 200 vòng/phút trong 1-

1,5 giờ.

- Trải 150µl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường LBA bổ sung ampicilin

+ X- gal, nuôi ở 37ºC từ 14-16h.

Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR colony

Các thành phần PCR colony tương tự như phản ứng khuếch đại gene cry1C

với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ khuôn DNA được thay thế bằng một lượng nhỏ

sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.

Tách DNA plasmid từ E. coli DH5α

Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng)

cấy vào 2ml môi trường LB chứa ampicillin, lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 37ºC.

Qui trình tách tương tự như quy trình tách DNA plasmid của Bt

Xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI

Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn

hay không, cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng EcoRI.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Trình tự cắt của EcoRI:

Thành phần của phản ứng cắt:

Thành phần Thể tích (µl)

DNA plasmid 6µl

Buffer 1µl

EcoRI 0,5µl

2.5µl dH2O

Tổng thể tích 10µl

Phản ứng cắt được tiến hành ở 37ºC trong 4h.

2.2.7 Xác định trình tự nucleotide

Tiến hành theo phương pháp tổng hợp của Sanger và CS. Thực hiện phản

ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung 4 loại

dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, dd TTP) và được đánh dấu bằng

thuốc nhuộm huỳnh quang [23].

Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide bổ sung urea để tăng độ

phân giải của gel. Sử dụng tia lase quét phát hiện dideoxynucleotide đã đánh

dấu.

Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó so sánh trình tự gene đã

tách dòng với các trình tự đã công bố trong GenBank.

2.3 Địa điểm thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại phòng Di truyền vi sinh vật, Phòng thí nghiệm

trọng điểm Công nghệ Gen, Viện CNSH, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nam

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C

có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu

Từ 150 chủng vi sinh vật thu nhận được sau 3 ngày nuôi cấy ở 280C, trên

đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên nhiều loại khuẩn lạc B. thurigiensis

hình tròn, có màu trắng sữa và mép nhăn hoặc không (Hình 3.1).

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trƣờng MPA

sau khi nuôi ở 28ºC sau 72h (1: Khuẩn lạc Bt)

Từ mỗi đĩa nuôi cấy chúng tôi tách lấy một khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu

bản với thuốc nhuộm fuchsin base sau đó quan sát trên kính hiển vi quang học ở

độ phóng đại 1000X (vật kính dầu). Kết quả cho thấy trong 150 chủng vi khuẩn

thuộc nhóm Bacillus cereus đã thu thập, có 54 chủng sinh tinh thể. Kết quả này

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

được thể hiện trong Hình 3.2, Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Sự đa dạ ng hình thái tinh thể của các chủng Bt

STT

Hình dạng tinh thể

Số chủng

Tỷ lệ %

Lưỡng tháp

Cầu

Lưỡng tháp và cầu

Lập phương

Cầu và lập phương

Không xác định

Tổng số

54

100 Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần

dƣới kính hiển vi quang học (1: tinh thể, 2: bào tử)

54 chủng B. thuringiensis sinh tổng hợp các lọai protein tinh thể rất đa

dạng. Trong đó, protein tinh thể hình lưỡng tháp và hình cầu chiếm tỷ lệ cao

nhất 48%, sau đó là protein tinh thể lưỡng thấp chiếm 39%. Các chủng sinh tinh

thể hình cầu, lập phương và đồng thời 2 loại tinh thể này chiếm tỷ lệ tương đối

thấp, từ 2% đến 7%. Điều này thể hiện tính đa dạng về hình dạng tinh thể của

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các chủng B. thuringiensis đã phân lập. Sự khác nhau về cấu trúc cũng như hình

dạng tinh thể là do thành phần protein cấu tạo tinh thể tạo nên. Sự phong phú về

hình dạng tinh thể là cơ sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng từ cánh vảy, bộ hai

cánh đến bộ cánh cứng tới giun tròn thực vật.

Theo nhiều tài liệu đã công bố, dưới loài Bta mang nhiều gene trong họ

gene cry1 trong đó có gene cry1C có khả năng mã hóa protein tinh thể hình

lưỡng tháp và hình cầu có khả năng diệt côn trùng bộ cánh vảy với hoạt lực cao.

Vì vậy, các chủng Bt phân lập được phân loại bằng huyết thanh để xác định dưới

loài của chúng nhằm tìm ra các chủng Bta và thử hoạt tính diệt côn trùng bộ

cánh vảy với sâu tơ.

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh

Phân loại dưới loài theo phương pháp phân loại huyết thanh của de Barjac

và Bonefoi đối với các chủng nghiên cứu. Bt được chia làm rất nhiều dưới loài

khác nhau, mỗi dưới loài mang các đặc điểm riêng biệt. Dưới loài Bta có khả

năng diệt côn trùng bộ cánh vảy thuộc type huyết thanh H7. Để tìm được các

chủng Bta chúng tôi tiến hành sàng lọc các chủng Bt phân lập bằng cách sử dụng

typ huyết thanh H7 để phân loại.

Với 26 chủng nghiên cứu mang tinh thể hình lưỡng tháp và hình cầu,

chúng tôi đã xác định được 10 chủng có phản ứng dương tính với typ huyết

thanh H7 chiếm 38% số chủng được phân loại (Hình 3.3).

Như vậy có thể bước đầu kết luận rằng có 10 chủng nghiên cứu có khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

năng thuộc dưới loài Bta.

A B

Hình 3.3. Sản phẩm ngƣng kết huyết thanh của chủng TN 6.12 phân lập với typ huyết

thanh dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần

A: Trước khi nhỏ huyết thanh miễn dịch

B: Sau khi nhỏ huyết thanh miễn dịch

3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu tơ

Nồng độ bào tử

Bt trong giai đoạn tạo bào tử đồng thời sinh tổng hợp các tinh thể độc.

Thông qua nồng độ bào tử có thể gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể của

các chủng nghiên cứu. Do đó chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bào tử

của 7 chủng Bta nghiên cứu cùng với chủng Bta chuẩn 4J4 làm đối chứng

dương. Nồng độ bào tử của các chủng Bta dao động từ 2,5109 đến 5109 bào tử/ml.

Chúng tôi đã chọn ra 7 chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12,

TN 28.6 và TN 36.3 có nồng độ bào tử cao để xác định hoạt tính diệt côn

trùng thử nghiệm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Sinh khối của 7 chủng Bta được pha loãng nhiều lần, chúng tôi sử dụng nồng độ 105 và 107 bào tử/ml để thử hoạt tính diệt sâu tơ và nồng độ 107 và 109 bào tử/ml diệt sâu xanh da láng.

Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ

 Hoạt tính diệt sâu da láng

Bảy chủng Bta đươc pha loãng tới nồng độ 107 và 109 bào tử/ml bằng

nước cất vô trùng. Tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng theo

công thức của Abbott. Tỷ lệ sâu chết được tính sau 3 ngày thử nghiệm. Kết quả

thử nghiệm được trình bày ở Hình 3.4 và Bảng 3.2.

Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta

sau 3 ngày thử nghiệm

Tỷ lệ sâu chết (%)

STT

Tên chủng

ở nồng độ 107 bào tử/ml

ở nồng độ 109 bào tử/ml

1 ĐC âm

2 ĐC dương (4J4)

TN 1.12

TN 3.4

TN 4.4

TN 5.3

TN 6.12

TN 28.6

TN 36.3

Bảng 3.2 cho thấy 7 chủng Bta đều có hoạt tính diệt sâu xanh da láng. Sau 3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ngày thử nghiệm, 4 chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 và TN 36.3 có hoạt tính

diệt sâu xanh da láng trên 50% ở nồng độ 109 bào tử/ml. Các kết quả thử hoạt

tính diệt sâu này là cơ sở để chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

 Hoạt tính diệt sâu tơ

Với 7 chủng Bta đã lựa chọn được, chúng tôi thử nghiệm diệt sâu tơ, tỷ lệ

sâu chết được theo dõi trong 3 ngày và tính toán theo công thức Abbott. Kết quả

thử nghiệm được trình bày trong Hình 3.5 và Bảng 3.3.

Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu

Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm

Tỷ lệ sâu chết (%)

STT

Tên chủng

Ở nồng độ 105 bào tử/ml 0

Ở nồng độ 107 bào tử/ml 0

1 ĐC âm

2 ĐC dương (4J4)

TN 1.12

TN 3.4

TN 4.4

TN 5.3

TN 6.12

TN 28.6

TN 36.3

Bảng 3.3 cho thấy tất cả các chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3,

TN 6.12, TN 28.6 và TN 36.3 đã lựa chọn đều có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối

cao. Sau 3 ngày thử hoạt tính đa số các chủng đều cho tỷ lệ sâu chết lớn hơn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

50%, ở cả hai nồng độ pha loãng. Đặc biệt tất cả các chủng trừ TN 4.4 khi thử ở nồng độ 107 bào tử/ml đều có tỷ lệ sâu chết lên tới hơn 80%.

Qua kết quả thử hoạt tính của các chủng Bta diệt 2 loại côn trùng thử

nghiệm có thể kết luận như sau:

- 7 chủng Bta nghiên cứu đều có hoạt tính diệt cả 2 loại côn trùng thử

nghiệm.

- Các chủng TN28.6,TN1.12, TN6.12, và TN36.3 đều có hoạt tính diệt cao

đối với cả 2 loại côn trùng thử nghiệm.

Các kết quả thử hoạt tính diệt sâu nói trên là cơ sở để chúng tôi tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo về gene mã hóa độc tố tinh thể.

3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR

Nhóm gene cry1C mã hóa protein tinh thể có khả năng diệt côn trùng bộ

cánh vảy. Để phát hiện gene độc tố này chúng tôi sử dụng phương pháp PCR

nhằm khuếch đại một đoạn của gene cry1C của 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu

với cặp mồi đặc hiệu. Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm đoạn gene cry1C với

cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 bp.

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.6).

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu

Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN 5.3,

TN 6.12, TN 28.6, TN 36.3, ĐC dương

M: DNA Marker

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.6 cho thấy sản phẩm PCR có duy nhất một băng với kích thước

khoảng 300 bp. Như vậy các chủng thuộc dưới loài Bta nghiên cứu đều có thể

mang gene cry1C.

Để khẳng định các chủng này chắc chắn mang gene cry1C hay không,

chúng tôi chọn 2 chủng TN 6.12 và TN 28.6 để tách dòng đoạn gene cry1C và

xác định trình tự của chúng.

3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C

Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy

Vector pGEM-T Easy tồn tại ở dạng mạch thẳng với 2 đầu tự do đều thừa

ra 1 nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A

của sản phẩm PCR (Taq polymerase có hoạt tính gắn thêm 1 adenine vào đầu 3’

khi kết thúc PCR) vì thế chúng tôi chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách

dòng.

Đoạn gene tính toán theo lý thuyết 288 bp thu được từ sản phẩm PCR của

2 chủng TN 6.12 và chủng TN 28.6 được gắn trực tiếp vào vector pGEM-T

Easy. Sản phẩm là vector tái tổ hợp pGEM-T Easy- cry1C-TN 6.12 và pGEM-

T Easy-cry1C-TN 28.6.

Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α

Tiến hành biến nạp 2 vector tái tổ hợp trên vào tế bào khả biến E.coli

DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt như đã trình bày trong phần phương pháp.

Sau khi biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM-T Easy-

cry1C được nuôi cấy trên môi trường LB + ampicillin + X-gal ở 37ºC qua đêm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thấy xuất hiện những khuẩn lạc màu xanh và trắng trên mặ t thạ ch (Hình 3.7).

Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA

sau khi nuôi cấy qua đêm. (1: Khuẩn lạc trắng, 2: khuẩn lạc xanh)

Các dòng vi khuẩn mọc được trên môi trường chứa ampicillin là các dòng

đã được biến nạp vector pGEM-T Easy có gene kháng kháng sinh.

Khuẩn lạc xanh xuất hiện là do promoter của lac - operon trên vectơ

pGEM-T Easy vẫn hoạt động bình thường nên β- galactosidase vẫn được tổng

hợp và có khả năng chuyển hóa X-gal từ không màu sang màu xanh chàm.

Khuẩn lạc trắng xuất hiện là do hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ

nhất có thể là do tế bào vi khuẩn nhận được vector tái tổ hợp mang đoạn DNA

chèn vào giữa gene cấu trúc lacZ làm hỏng promoter của gene lac-operon trong

vector pGEM–T Easy nên trong quá trình sống nó không tạo ra β- galactosidase,

không có khả năng chuyển hoá được cơ chất X- gal có trong môi trường nuôi

cấy vi khuẩn vì vậy mà không có màu xanh. Nguyên nhân thứ hai có thể là do

promoter điều khiển hoạt động của gene mã hoá cho β - galactosidase bị hỏng,

dẫn đến không tổng hợp được β- galactosidase do đó mà vi khuẩn E. coli không

chuyển hoá được X-gal có trong môi trường nên tạo thành các khuẩn lạc màu

trắng.

Để biết các khuẩn lạc trắng có mang gene mong muốn hay không, kiểm

tra bằng cách cắt DNA plasmid và tinh sạch. Các dòng khuẩn lạc trắng được cấy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vào môi trường LB bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid.

Do có tới hai khả năng dẫn đến việc khuẩn lạc có màu trắng mà chúng tôi

phải tiến hành PCR colony với mồi đặc hiệu vector M13 để chọn ra các dòng

khuẩn lạc mang vector có đoạn gene cry1C được chèn vào.

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13

1, 3: Sản phẩm PCR các dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 –p3, TN 6.12 –p7

2: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 –p5

M: Thang DNA chuẩn

Điện di đồ sản phẩm PCR cho thấy DNA của các khuẩn lạc trắng TN 28.6

–p3, TN 6.12–p7 có kích thước khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết

(là kích thước của đoạn gene cry1C cộng với kích thước của sản phẩm PCR của

vector bằng mồi M13). Trong khi đó ở khuẩn lạc trắng TN 6.12–p5 chỉ tổng hợp

được đoạn gene có kích thước khoảng 300 bp (là kích thước của sản phẩm PCR

của vector bằng mồi M13). Điều đó chứng tỏ các khuẩn lạc trắng TN 28.6–p3 và

TN 6.12–p7 đã được biến nạp vector mang gene cry1C.

Chúng tôi lấy các khuẩn lạc trắng đã sàng lọc bằng PCR colony và 1

khuẩn lạc xanh của từng chủng lần lượt cấy vào các lọ penicillin chứa 2ml môi trường LB bổ sung Amp (nồng độ 50 µg/ml) nuôi lắc ở 370C qua đêm để tách

plasmid. DNA plasmid được kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Do trong vùng

MCS (multi cloning site) của vector pGEM–T Easy có chứa vị trí cắt của EcoRI

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nằm ở 2 đầu đoạn DNA insert nên chúng tôi cắt DNA plasmid bằng enzyme này

để kiểm tra sự có mặt của gene cry1C. Sản phẩm cắt được điện di trên gel

agarose (Hình 3.9).

Hình 3.9. Điện di đồ phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc

Giếng 1,3. Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng của các plasmid tái tổ

hợp pGEM-T Easy– cry1C – TN28.6- p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7

Giếng 2. DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC)

M:Thanh DNA chuẩn

Kết quả cho thấy DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi

cắt bằng EcoRI tạo ra hai băng, băng lớn là vectơ tách dòng pGEM-T Easy

có kích thước 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với

sản phẩm PCR của đoạn gene cry1C. Trong khi đó, plasmid của khuẩn lạc

xanh sau phản ứng cắt chỉ cho 1 băng có kích thước khoảng 3000 bp (tương

ứng với kích thước của vector tách dòng).

Để xác định chắc chắn sự có mặt của gene cry1C trong các khuẩn lạc

trắng chúng tôi khuếch đại đoạn gene cry1C từ khuôn là plasmid thu được với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

cặp mồi đặc hiệu TYIC và TYIUNI (Hình 3.10).

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp

pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, và pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7

Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi có thể bước đầu kết luận là

đã tách dòng thành công gene cry1C trong vector pGEM–T Easy. Tuy nhiên để

có thể kết luận chính xác đoạn gene đã tách dòng có phải là đoạn gene cry1C

hay không chúng tôi tiến hành đọc trình tự 2 đoạn gene này và so sánh với các

trình tự gene trong Gene Bank.

3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C

Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy–cry1 –TN28.6 - p3 và pGEM-T Easy-

cry1C–TN 6.12–p7 được chọn để đọc trình tự và được so sánh với trình tự có

mã số AF362020 trên Gene Bank. Đoạn gene 288 bp của chủng TN6.12 có

độ tương đồng 100% so với trình tự gene cry1C của chủng Bta C002

(AF362020) đã công bố trên Gene Bank. Trong khi đó , trình tự đoạn gen e

cry1C của chủng TN 28.6 có độ tương đồng 99% so với chủng Bta C002

(AF362020) do bị mấ t 1 nucleotide ở vị trí 282.

Trình tự AF362020 là trình tự của gene cry1Ca mã hóa protein

Cry1Ca. Như vậy có thể kết luận, trình tự gene cry1C của 2 chủng đã tách

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

dòng thuộc phân nhóm gene cry1Ca.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

1. Từ 150 chủng Bacillus cereus chưa qua phân loại, đã xác định được 54

chủng B. thuringiensis sinh tinh thể, trong đó 26/54 chủng sinh 2 loại tinh thể

dạng lưỡng tháp và cầu và được nhận dạng bằng type huyết thanh chuẩn.

Trong đó có 10 chủng thuộc dưới loài B. thuringiensis subsp. aizawai chiếm

tỷ lệ 38%

2. 7 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ và sâu xanh da láng, trong đó 4 chủng

TN28.6, TN 1.12, TN6.12, và TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao nhất.

3. Khuếch đại gene cry1C từ 7 chủng Bta đều cho sản phẩm có hoạt tính

diệt sâu với cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 kb.

4. Đoạn gene cry1C từ 2 chủng TN 6.12 và TN 28.6 được tách dòng, đọc

và so sánh với trình tự gene cry1C của chủng Bta có mã số AF362020 có độ

tương đồng lần lượt là 100% và 99%. Các gene đã tách dòng thuộc phân

nhóm gene cry1Ca

4.2. KIẾN NGHỊ

Gene cry1C được tách dòng từ 2 chủng TN6.12 và TN28.6 có hoạt tính

diệt sâu cao, được xác định là đoạn gene cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca.

Trên cơ sở đó, thiết kế vector biểu hiện protein Cry1Ca nhằm nghiên cứu: sản

xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt diệt côn trùng bộ cánh vảy và làm nguyên liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chuyển gene cry1C vào cây trồng tạo khả năng kháng lại côn trùng cánh vảy.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật,

trang 153.

2. Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý

(1999), Thiết kế lại cấu trúc gene Bt để chuyển vào cây hai lá mầm, Báo cáo Hội

nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376.

3. Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp đại cương tập 2,

Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167.

4. Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, Nhà xuất

bản khoa học và kỹ thuật, trang 109-147.

5. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận

huyết thanh miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu Viện Công

nghệ Sinh học 200-2001, trang 296-303.

6. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh

Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn

Hoài Trâm (2000), Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus

thuringiensis phân lập từ một số tỉnh ở Việt Nam. “Những vấn đề nghiên cứu cơ

bản trong sinh học”. Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, trang 484-

488.

7. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt,

Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), Sự phân bố của Bacillus thuringiensis trong các

mẫu đất của Việt Nam, Tài nguyên sinh vật đất và sự phát triển bền vững của hệ

sinh thái đất, trang 1-7.

8. Ngô Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.

9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

học, Nxb Giáo dục.

10. Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy,

Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến

(2010), “35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus

thuringiensis tại Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, tr. 288 – 300.

11. Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh,

Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính

(2005), Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gene của vi khuẩn Bacillus

thuringiensis phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền và

ứng dụng, số 4, tr. 29 – 34.

12. Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn

Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003),

“Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus

thuringiensis subsp. aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa

học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr. 830 – 832.

13. Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn

Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của vi

khuẩn Bacillus thuringiensis ở Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu cơ

bản trong Khoa học sự sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái

Nguyên 2004, NXB KHKT, tr. 59 – 62.

Tiếng Anh

14. Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002)

Genes encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans.

15. Wu, Cao XL, Bai YY, and Aronson AI (1991), “Sequensing of an operon

containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis’’. FEMS

Microbi. Lett, page 31- 35.

16. Klier A (1985), “Biopesticide opportunities and challegene for anegement

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

insect Parteun International Symposia”, page 16.

17. Tang W, Chen H, Xu C, Li, X., Lin, Y., Zhang X. (2007), “Development of insect – resistant transgenic indica rice with a synthetis Cry1C * gene” Mol.

Breed, 18, pp. 1- 10

18. Asano S., Yamashita C., Iizuka T., Takeuchi K.,Yamanaka S., Cerf D., and

Yamamoto S.(2003), “A strain of Bacillus thurigiensis subsp. galleriae

contaning a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea”. Biological

Control 28, page 191-196.

19. Lyon WaF. Confused and red flour beetles-HYG-2087-97, page 38.Ohio

State University Extention Fact Sheet.

20. Crichmore N(2011), Bacillus thurigiensis Toxin Gene Nomenclature

http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt,27/07/2012.

21. Deacon J. "The microbial world: Bacillus thuringiensis",

www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 20/06/2012

22. Promega (2010), Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector

Systems, Instructions for use of products A1360, A1380, A3600, A3610, USA

23. Sambrook J and Russell D.W.(2001), Molecular Cloning - A laboratory

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

24. Schnepf E, Crickmore N., Van Rie N., Lereclus D., Baum F., Feitelson J.,

Zeigler D.R., and Dean D.H.,(1998) “Bacillus thuringiensis and its pesticidal

crystal protein”. Microbiol Mol Biol Rev 62: page 775-806.

25. Burges H D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide

Outlook, pp. 90-98

26. Nester E.W, Thomashow L. S, Metz M. and Gordon M. (2002), 100 years

of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment, American Academy

of Microbiology,Washington, USA.

27. Theiry and E. Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and

preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

insect Pathology, Edited by Lawrence A. Lacey, Academic Press, pp. 55 – 57.

28. Wijnands L.M., Dufrene J.B., Van Leusden F.M. (2002), Characterization of

Bacillus Cereus. RIVM report 250912002/2002, The National Institue for Public

Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands.

29. Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus

thuringiensis”, page. 36–42

30 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification

biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. Bacillus

thuringiensis.” Entomophaga 7, pp. 5 – 31.

31 Li, Caroll J. J., and Ellar D. J (1991), "Crystal structure of insecticidal δ

endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution", Nature 353, pp. 815-821.

32. Höfte H and Whiteley H R (1989) “Insecticidal crystal proteins of Bacillus

thuringiensis”, Microbio Rev, 53 (2), page 242-25.

33. Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio- Safety Evaluation of Cry1C

Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on

Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi

110003 event MLS9124 34. Proceedings of the 2nd Canberra B. thuringiensis meeting September, Lanberra,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1993.

Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------------------

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN

TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt

Gen

Hình dạng tinh thể

Khối lƣợng phân tử protein (kDa)

Hoạt tính diệt côn trùng

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ [3]

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại [3]

Sâu xanh da láng

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng [3]

Môi trƣờng:

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trƣờng MPA

sau khi nuôi ở 28ºC sau 72h (1: Khuẩn lạc Bt)

Bảng 3.1. Sự đa dạ ng hình thái tinh thể của các chủng Bt

STT

Hình dạng tinh thể

Số chủng

Tỷ lệ %

Tổng số

54

100

Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần

dƣới kính hiển vi quang học (1: tinh thể, 2: bào tử)

Hình 3.3. Sản phẩm ngƣng kết huyết thanh của chủng TN 6.12 phân lập với typ huyết

thanh dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần

Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta

sau 3 ngày thử nghiệm

Tỷ lệ sâu chết (%)

STT

Tên chủng

ở nồng độ 107 bào tử/ml

ở nồng độ 109 bào tử/ml

Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu

Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu

Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trƣờng LBA

sau khi nuôi cấy qua đêm. (1: Khuẩn lạc trắng, 2: khuẩn lạc xanh)

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13

Hình 3.9. Điện di đồ phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp

Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chọn chủng Bacillus Thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu

Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium Lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne SP

Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

Luận văn Thạc sỹ Sinh học: Nghiên cứu khả năng nẩy mầm và sinh trưởng của cây hoàng lan (Cananga odorata(Lamk.) Hook.F.& Thomson) ở giai đoạn vườn ươm

Luận văn Thạc sỹ: Nghiên cứu vai trò của một số Polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro

Báo cáo khoa học: Tuyển chọn các chủng Bacillus thuringiensis có khả năng diệt sâu tơ và sâu xanh

BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM"

BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"

BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM"

Luận văn cao học “Thiết kế vector mang gen HA1 mã hóa protein bề mặt của virus H5N1"

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được