Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
114
PHÂN LẬP CÁC DẪN CHẤT PHENOL TỪ RỄ CỦ CÂY BẠCH CHỈ NAM
MILLETTIA PULCHRA KURZ THU HÁI TẠI AN GIANG
Đinh Thị Bách*, Trần Thị Tâm Nguyên**, Mã Chí Thành*
TÓM TẮT
Mở đầu: Rễ củ Bạch chỉ nam (Millettia pulchra Kurz Fabaceae) là một vị thuốc nam được thu hái và sử
dụng phổ biến tại An Giang. Bạch chỉ nam được dùng trong y học cổ truyền để chữa nóng sốt, nhức đầu, phong
thấp, viêm da do dị ứng. Hiện nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của dược liệu
này ở Việt Nam còn rất hạn chế. Do đó, việc phân lập các hợp chất từ Bạch chỉ nam góp phần quan trọng
trong việc nghiên cứu về hoá học, thử tác dụng sinh học và kiểm tra chất lượng dược liệu Bạch chỉ nam thu
hái tại An Giang.
Phương pháp nghiên cứu: Rễ củ Bạch chỉ nam được xay nhỏ và chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô quay thu
hồi dung môi thu được cao cồn 96%. Cao cồn toàn phần được tách thành các phân đoạn đơn giản bằng phương
pháp chiết phân bố với các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau. Các hợp chất tinh khiết được phân lập từ
các cao phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột (silica gel, Sephadex LH-20) và kết tinh phân đoạn. Cấu trúc các
hợp chất phân lập được xác định bằng các phương pháp phổ MS, NMR và so sánh với giá trị phổ trong các tài
liêu tham khảo.
Kết quả: Từ 6,0 kg dược liệu Bạch chỉ nam, chiết được 2,7 lít cao cồn 96% đậm đặc. Bằng phương pháp
chiết phân bố với các dung môi khác nhau thu được các phân đoạn cao n-hexan (50,0 g), ethyl acetat (17,6 g) và
n-butanol (147,0 g). Từ phân đoạn ethyl acetat, 4 hợp chất tinh khiết đã được phân lập và xác định là karanjin
(1150 g), fujikinetin (3,0 mg), acid 4-O-methyl-karanjic (5,5 mg) và acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-
6-carboxylic (3,2 mg).
Kết luận: Từ phân đoạn cao ethyl acetat của rễ củ Bạch chỉ nam đã phân lập được 4 hợp chất tinh
khiết. Cấu trúc các hợp chất được xác định là: karanjin, fujikinetin, acid 4-O-methyl-karanjic và acid
5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic. Trong đó, hợp chất karanjin là thành phần chính có hàm
lượng cao nhất trong Bạch chỉ nam. Các hợp chất này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
(chống oxi hoá, kháng viêm, độc tế bào), cũng như tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu Bạch chỉ nam.
Từ khóa: Milletia pulchra, Bạch chỉ nam, flavonoid, karanjin
ABSTRACT
ISOLATION OF PHENOL DERIVATIVES FROM THE RADIX OF MILLETTIA PULCHRA KURZ
COLLECTED IN AN GIANG PROVINCE
Dinh Thi Bach, Tran Thi Tam Nguyen, Ma Chi Thanh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 114 - 119
Introduction: The radix of Millettia pulchra Kurz (Bach chi nam) has been collected and used as a popular
herbal medicine in An Giang province. Bach chi nam was used in traditional medicine for the treatment of fever,
headache, rheumatism, allergire dermatitis. Up to now, the research reported on the chemical constituents of M.
pulchra collected in Vietnam was rare and limited. Hence, the aim of this study is to isolate and identify the
structures of compound from M. pulchra radix for further biological studies and quality control of this herbs.
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
** Viện Kiểm nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Mã Chí Thành ĐT: 0988611055 Email: mcthanh@ump.edu.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
115
Methods: The radix of M. pulchra was ground and extracted with ethanol 96%, the solvent was evaporated
to obtain the total extract. The crude extract was further subjected to liquid-liquid distribution based on the
polarity of compounds. The pure compounds were isolated by the column chromatographic (silica gel, Sephadex
LH-20) and crystallization methods. The structures of isolated compound were deduced by means of spectroscopic
methods (MS, NMR).
Results: From 6.0 kg of dried M. pulchra radix, the concentrated ethanolic extract were obtained (2.7 liters).
The crude extract was partitioned with n-hexane, ethyl acetate and n-butanol to afford 50.0, 17.6, and 147.0 g of
extracts, respectively. From ethyl acetate extract, 4 compounds were isolated and determined as karanjin
(1150 mg), fujikinetin (3.0 mg), 4-O-methyl-karanjic acid (5.5 mg) and 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-
6-carboxylic acid (3.2 mg).
Conclusions: From the ethyl acetate fraction of M. pulchra radix, four compounds were isolated and
identified. In there, karanjin is presented as the main component in M. pulchra. These compounds could be used
for further biological assays such as antioxidant, anti-inflammatory, and anti-cancer, as well as quality control of
M. pulchra radix collected in An Giang province.
Keywords: Milletia pulchra, Bạch chỉ nam, flavonoid, karanjin
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch chỉ nam (Millettia pulchra) là một loài
thuộc họ Đậu, hiện nay mọc hoang chủ yếu ở các
tỉnh An Giang, Kiên Giang, Tây Ninh, Đồng Nai,
Bình Phước và một số tỉnh phía Bắc như Bắc
Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Yên Bái(1). Trong y
học cổ truyền, rễ củ Bạch chỉ nam được dùng để
trị cảm mạo, sốt nóng, nhức đầu, phong thấp
đau xương, nhức mắt, chữa mẩn ngứa, viêm da
dị ứng. Thành phần chính của Bạch chỉ nam
được xác định là flavonoid, hợp chất phenol,
sterol và đặc biệt là các isoflavonoid với các tác
dụng kháng viêm(2), kháng ung thư(3), chống oxy
hóa, kháng khuẩn, kháng nấm. Tại An Giang,
Bạch chỉ nam được sử dụng nhiều ở các nhà
thuốc đông y. Tuy nhiên, các nghiên cứu về
thành phần hoá học và tác dụng dược lý của
Bạch chỉ nam còn hạn chế. Do đó, đề tài được
thực hiện với mục đích phân lập các hợp chất
chính góp phần nghiên cứu thành phần hoá học,
thử tác dụng sinh học và kiểm nghiệm dược liệu
Bạch chỉ nam thu hái tại An Giang nhằm nâng
cao hiệu quả sử dụng trong điều trị bệnh.
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Rễ củ Bạch chỉ nam (15,0 kg tươi) thu hái
tại tỉnh An Giang (tháng 11/2018). Nguyên liệu
được định danh bởi Tiến sĩ Võ Văn Chi bằng
cách so sánh về hình thái thực vật với các tài
liệu thực vật học chuyên ngành. Mẫu nghiên
cứu (MP-112018) được lưu giữ tại Bộ môn
Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ
Chí Minh.
Nguyên liệu được thái nhỏ, phơi khô, sau
đó xay thành bột thô (7,5 kg) dùng để chiết
xuất và phân lập các hợp chất.
Dung môi, hoá chất, trang thiết bị
Ethanol 96% công nghiệp dùng cho chiết
xuất (Việt Nam). Các dung môi n-hexan, ethyl
acetat, cloroform, methanol, n-butanol dùng cho
phân tách phân đoạn và sắc ký (pure analysis)
được cung cấp bởi công ty Đoàn Lê (Scharlau,
Tây Ban Nha). Sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel
60 (Merck, 40-63 µm) hoặc Sephadex LH-20 (GE
Healthcare, Thuỵ Điển). Sắc ký lớp mỏng sử
dụng bản mỏng silica gel 60 F254 tráng sẳn
(Art.1.05554.0001, Merck), phát hiện vết bằng UV
254, 365 nm và thuốc thử vanilin – acid
sulfuric/cồn tuyệt đối.
Phổ MS được thực hiện trên máy X500R
QTOF (AB SCIEX, Anh) của Viện hoá học,
TP. Hồ Chí Minh. Phổ NMR được đo trên máy
Ascend 400 FT-NMR (Bruker, Đức) của Viện
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
116
kiểm nghiệm thuốc, TP. Hồ Chí Minh và dung
môi NMR được sử dụng là CDCl3.
Phương pháp chiết xuất và phân lập
Nguyên liệu Bạch chỉ nam được chiết bằng
phương pháp ngấm kiệt với cồn 96%. Dịch chiết
cồn được cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất
giảm thu được cao chiết toàn phần. Cao chiết
toàn phần được chiết phân bố lỏng – lỏng lần
lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần:
n–hexan, ethyl acetat và n-butanol bão hòa nước.
Các dịch chiết phân đoạn này tiếp tục được cô
quay dưới áp suất giảm, thu được các cao phân
đoạn tương ứng, được dùng để phân lập các
hợp chất trong Bạch chỉ nam.
Các phân đoạn được tiến hành sắc ký cột
(silica gel, Sephadex LH-20), kết tinh phân đoạn,
lọc rửa tủa nhiều lần với các dung môi khác
nhau thu được các hợp chất tinh khiết.
Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập
Cấu trúc của các chất phân lập được xác
định bằng phương pháp phổ UV, MS, NMR và
kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo.
KẾT QUẢ
Chiết xuất và phân lập các chất
Rễ củ Bạch chỉ nam (6,0 kg) được chiết ngấm
kiệt với cồn 96%, dịch chiết cồn được cô quay
dưới áp suất giảm thu hồi dung môi thu được
2,7 lít cao cồn 96% đậm đặc. Dịch chiết này
được phân tán vào nước và lắc phân bố lần
lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol. Cô
thu hồi dung môi, thu được các cao phân đoạn
n-hexan (H; 50,0 g), ethyl acetat (E; 17,6 g) và
n-butanol (B; 147,0 g) tương ứng. Phân đoạn cao
ethyl acetat xuất hiện tủa, tiến hành lọc thu được
9,2 g tủa Et và 8,4 g cao ethyl acetat còn lại.
Từ 4,4 g tủa Et tiến hành sắc ký cột với silica
gel (40-63 µm), hệ dung môi n-hexan – ethyl
acetat (95:5), tăng dần ethyl acetat đến tỷ lệ (5:5),
thu được 8 phân đoạn (Et1 – Et8). Phân đoạn Et1
xuất hiện tinh thể hình khối, tiến hành rửa bằng
chloroform – methanol (1:1) và petroleum ether
thu được 1 (1150 mg) tinh khiết. Cao ethyl acetat
E (7,0 g) được sắc ký cột Sephadex LH-20 với hệ
dung môi dichloromethan – methanol (9:1), thu
được 10 phân đoạn (E1-E10). Phân đoạn E4 (220
mg) sau khi lọc loại tủa, dịch lọc được tiến hành
sắc ký cột Sephadex LH-20 với dung môi MeOH
100% thu được 3 phân đoạn (E4.1 – E4.3), tủa vô
định hình từ phân đoạn E4.2, E4.3 được lọc, rửa
nhiều lần với dung môi chloroform và methanol
thu được 3 (5,5 mg) và 4 (3,2 mg) tinh khiết. Tủa
từ phân đoạn E4 được kết tinh lại và lọc rửa
nhiều lần với dung môi chloroform, methanol
thu được 2 (3,0 mg).
BÀN LUẬN
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Hợp chất 1
Chất 1 là tinh thể hình khối không màu.
Phổ UV của 1 cho thấy các đỉnh hấp thu cực
đại tại λmax = 303, 260 và 218 nm, có dạng phổ
đặc trưng của hợp chất flavonoid. Phổ ESI-
MS positive cho thấy các ion phân mảnh có
m/z = 315,0646 [M + Na]+ và m/z = 293,0815
[M + H]+. Do đó, công thức phân tử của 1 là
C18H12O4 (tương ứng với C18H12O4Na = 315,0633),
với độ bất bão hòa là 12.
Phổ 13C NMR của chất 1 cho thấy 16 tín hiệu
cộng hưởng gồm 7 carbon bậc III, 7 carbon bậc
IV, một nhóm carbonyl và một nhóm methoxy.
Đây là vùng cộng hưởng đặc trưng cho cấu trc
các nhóm chất thuộc khung C6-C3-C6, với các
carbon methin sp2 của vòng thơm gắn hoặc
không gắn với dị nguyên tố oxy. Tín hiệu của
một carbon bậc I tại vùng trưng cao δC 60,3 ppm
là của nhóm methoxy. Dữ liệu phổ 13C NMR cho
thấy tín hiệu của các carbon đối xứng trên vòng
B ở vị trí δC 128,6 và 128,4 ppm. Các carbon có tín
hiệu cộng hưởng trong vùng trưng thấp tại các
vị trí δC 175,1; 158,2; 154,9; 150,0; 145,8; 141,8 ppm
của các carbon có gắn với dị tố oxi. Tín hiệu cộng
hưởng ở vùng trưng thấp của C-4 (δC 175,1)
chứng tỏ chất 1 có một nhóm thế ở C-3, từ các dữ
liệu trên cho thấy đây là một hợp chất có cấu
trc khung flavonol.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
117
Phổ 1H NMR cũng cho thấy các proton H-5
(δH 8,21; d; J = 8,8 Hz) và H-6 (δH 7,54; d; J = 8,8
Hz) ppm có tương tác COSY của các proton kế
cận (3JHH). Thêm vào đó, tín hiệu tương tác quan
sát được của 2 proton H-2” (δH 7,77; d, J = 2,0 Hz)
và H-3” (δH 7,19; dd; J = 2,0; 0,8 Hz) ppm gắn với
các carbon tương ứng tại vị trí δC 145,8 (C-2”) và
104,3 (C-3”) ppm, đây là tương tác của 2 proton
của khung furan gắn vào vòng A. Trên phổ
proton còn cho thấy 2 proton tại vị trí δH 7,56 và
8,15 ppm có số tích phân tương ứng là 2H ở mi
vị trí, đây là các proton đối xứng (H-3’/H-5’ và
H-2’/H-6’) của vòng B. Phổ HMBC của 1 cho
thấy các tương tác giữa H-5 với C-4/C-7/C-9/C-
10, giữa H-6 với C-8/C-10, giữa H-2” với C-7/C-
8/C-3” và H-3” với C-6/C-7/C-8/C-2”, chứng tỏ
rằng vòng furan gắn vào vị trí C-7 và C-8 của
vòng A.
Kết hợp các dữ liệu phổ HMBC, COSY và so
sánh với tài liệu tham khảo, 1 được xác định là
karanjin(2,4), 1 flavonoid thưng gặp trong các
loài thuộc chi Millettia và là hợp chất chính có
hàm lượng cao nhất trong loài Millettia pulchra.
Karanjin
Acid 4-O-methyl-
karanjic
Các tương tác
COSY
HMBC
Hình 1. Cấu trúc của các hợp chất 1 – 4
Hợp chất 2
Dữ liệu phổ ESI-MS positive cho thấy ion
phân mảnh có m/z = 313,0722 [M + H]+ (100%).
Do đó, công thức phân tử của chất 2 là C17H12O6
(tương ứng với C17H13O6 = 313,0712), với độ bất
bão hòa của cấu trc là 12.
Phổ 13C NMR của chất 2 cho thấy có 17 tín
hiệu cộng hưởng của carbon, trong đó có 6 carbon
bậc III, 9 carbon bậc IV (trong đó có một nhóm
carbonyl), 1 carbon bậc II và 1 carbon bậc I. Trong
đó, 15 tín hiệu của carbon xuất hiện trong vùng
trưng thấp từ δC 102 – 175 ppm, đặc trưng cho
các nhóm chất thuộc khung C6-C3-C6. Tín hiệu
của carbon tại δC 55,7 ppm là của nhóm methoxy
và tại δC 101,2 ppm là của nhóm methylendioxy.
Phổ 13C NMR của chất 2 không cho thấy tín hiệu
của carbon đối xứng trên vòng B.
Phổ 1H NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng
của một đỉnh đơn (s) tại vị trí δH 7,94 ppm gắn với
carbon có δC 152,2 ppm, đây là proton methin của
carbon C-2 gắn với oxy của vòng pyran. Do vậy,
chất 2 là một isoflavonoid aglycon. Phổ proton
cũng cho thấy có các đỉnh đơn của 2 proton
methin trên vòng A tại vị trí δH 7,67 (H-5) và 7,01
ppm (H-8). Phổ 1H NMR của chất 2 cũng không
cho thấy tín hiệu đối xứng trên vòng B. Phổ
COSY cho thấy tín hiệu tương tác giữa proton H-
5’ (δH 6,90; d; J = 8,0 Hz) và H-6’ (δH 6,99; dd; J =
8,0; 1,6 Hz), ở vị trí ortho và tương tác giữa
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
118
proton H-6’ với H-2’ (J = 1,6 Hz) ở vị trí meta trên
vòng B.
Phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương tác của
proton H-5 với C-4/C-6/C-7/C-9, giữa proton H-2
với C-3/C-4/C-9/C-1’, giữa proton H-8 với C-6/C-
7/C-9. Nhóm methoxy được gắn vào vị trí C-6 và
nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-7 dựa vào các
tương tác quan sát được trên phổ HMBC. Kết
hợp với dữ liệu phổ từ tài liệu tham khảo(5) thì
chất 2 được xác định là 6-methoxy-7-hydroxy-
3',4'-methylenedioxy isoflavon hay fujikinetin.
Hợp chất 3
Phổ ESI-MS positive có các phân mảnh ion
với m/z = 193,0520 [M + H]+ và m/z = 175,0398
[M - OH]+. Do đó, công thức phân tử của chất 3
là C10H8O4 (tương ứng với C10H9O4 = 193,0501),
với độ bất bão hòa của cấu trc là 7. Phổ 13C
NMR của chất 3 cho thấy 9 tín hiệu cộng hưởng
của carbon trong vùng từ 105 – 166 ppm của các
carbon thơm và 1 tín hiệu của carbon tại vùng
trưng cao δC 61,5 ppm của nhóm methoxy. Tín
hiệu của carbon tại δC 165,8 ppm là của nhóm
carbonyl. Phổ 1H NMR của chất 3 cho thấy các
tín hiệu của 2 proton thơm H-6 (8,15; d, J = 8,8
Hz) và H-7 (δH 7,37; dd, J = 8,8; 1,2 Hz) có tương
tác COSY của các proton kế cận ở vị trí ortho. Tín
hiệu tương tác của 2 proton H-2 (δH 7,70; d; J = 2,0
Hz) và H-3 (δH 7,0; d; J = 2,0; 1,2 Hz) gắn với các
carbon tại δC 145,5 và 105,1 ppm với hằng số ghép
J = 2,0 Hz, đặc trưng của vòng furan(6). Phổ
HMBC của chất 3 cho thấy tương tác quan sát
được giữa proton H-3 với C-2/C-8/C-9, giữa
proton H-6 với C-4/C-7/C-8/C-9/COOH và
giữa H-7 với C-4/C-5/C-8/C-9. Kết hợp dữ liệu
phổ từ tài liệu tham khảo(7) xác định chất 3 là
acid 4-methoxy-5-benzofuran carboxylic hay
acid 4-O-methyl karanjic.
Hợp chất 4
Phổ ESI-MS positive của chất 4 có các phân
mảnh ion với m/z = 235,0970 [M+H]+ và m/z =
217,0855 [M - OH]+. Do đó, công thức phân tử
của chất 4 là C13H14O4 (tương ứng với C13H15O4 =
235,0970), độ bất bão hòa của cấu trc là 7. Phổ
13C NMR của chất 4 có 9 tín hiệu cộng hưởng của
carbon trong vùng từ 113 – 166 ppm của các
carbon thơm và 4 tín hiệu của các carbon nhóm
carbonyl (δC 165,5), nhóm methoxy (δC 63,8) và 2
nhóm methyl (cùng ở δC 28,1 ppm). Phổ 1H NMR
của chất 4 cho thấy các tín hiệu tương tác của các
proton H-3 (δH 5,76; d) và H-4 (δH 6,56; d) với
hằng số ghép J = 10 Hz, đặc trưng của vòng
pyran(6). Phổ COSY cho thấy tín hiệu tương
tác của 2 proton H-7 (δH 7,92; d; J = 8,8 Hz) và
H-8 (δH 6,72; d; J = 8,8 Hz). Phổ HMBC của hợp
chất chất 4 cho thấy tương tác quan sát được
giữa proton H-3 với C-2/C-9/2-CH3, giữa proton
H-4 với C-2/C-5/C-8/C-9/C-10, giữa H-7 với C-
5/C-6/C-10/COOH, và giữa H-8 với C-6/C-9/C-
10. Kết hợp dữ liệu phổ từ tài liệu tham khảo(8,9)
xác định chất 4 là acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-
2H-chromen-6-carboxylic.
Bảng 1. Dữ liệu phổ 1H (400 MHz) và 13C NMR
(100 MHz) của các hợp chất 1 – 2 (CDCl3)
C
1
2
δC
δH (mult, J, Hz)
δC
δH (mult, J, Hz)
2
154,9
-
152,2
7,94 (s)
3
141,9
-
124,3
-
4
175,1
-
175,6
-
5
121,9
8,21 (d; 8,8)
104,7
7,67 (s)
6
110,1
7,54 (d; 8,8)
145,4
-
7
158,2
-
151,3
-
8
117,0
-
102,7
7,01 (s)
9
150,0
-
152,5
-
10
119,7
-
117,9
-
1’
131,0
-
125,9
-
2’
128,4
8,14 (dd; 8,5; 2,0)
109,8
7,12 (d; 1,6)
3’
128,6
7,56 (m)
147,7
-
4’
130,7
7,52 (m)
147,6
-
5’
128,4
7,56 (m)
108,4
6,90 (d; 8,0)
6’
128,6
8,14 (dd; 8,5; 2,0)
122,4
6,99 (dd; 8,0;
1,6)
2’’
104,3
7,19 (dd; 2,0; 0,8)
3’’
145,8
7,77 (d; 2,0)
3-OCH3
60,3
3,93 (s)
6-OCH3
56,5
4,04 (s)
OCH2O
101,2
6,02 (s)
7-OH
6,33 (s)