NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007 Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM
180
PHAÂN LAÄP VAØ ÑÒNH DANH VI KHUAÅN
Aeromonas hydrophila
TREÂN EÁCH THAÙI LAN
“Rana tigerina”
NUOÂI
TAÏI KHU VÖÏC VEN ÑOÂ THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH
CHARACTERIZATION OF BACTERIA ISOLATED FROM FARMED FROG (Rana tigerina)
IN PERI – URBAN OF HCM CITY
Traàn Hoàng Thuûy
Boä moân Sinh hoïc vaø Quaûn lyù Nguoàn lôïi Thuûy saûn, Khoa Thuûy saûn
Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM
ABSTRACT
This study was conducted from September 2006
to September 2007 to identify major pathogens,
especially bacteria, of diseased frog (Rana tigerina)
farmed in the peri –urban area of Ho Chi Minh
City. Challenge of cultured frog with Aeromonas
hydrophila. That were isolated from diseased frogs
with clinical signs of ulcerative syndrome were
carried out. Experimental frogs were injected on
the vetral left thigh with a variety of bacterial
concentrations. Average 18-25g sized frog (Rana
tigerina) were stocked at 10 frogs/tank. There were
four treatments with triplicate each: control
(injected with 0.85% sterile NaCl), 9x106 cfu/ml,
9x107 cfu/ml, and 9x108 cfu/ml for bacterial
infection challenges. The mortalities occurred at
bacterial concentration of 9x106 cfu/ml, 9x107 cfu/
ml, and 9x108 cfu/ml were 57%, 90% and 100%,
respectively. No bacteria were isolated from frogs
in the control at the end of experiment.
Signs of moribund frogs included light-reddish
fluid in the body cavity and haemorrhage on the
skin of abdomen and thigh. Aeromonas hydrophila
were isolated frog diseased frog in bacterial
injection challenge treatments. Those results point
out the importance of Aeromonas hydrophila as
causal agents of ulcerative syndrome in frog.
GIÔÙI THIEÄU
Thaønh Phoá Hoà Chí Minh nhöõng naêm gaàn ñaây roä
leân phong traøo nuoâi eách vôùi nhieàu hình thöùc nuoâi
khaùc nhau. Nguoàn eách gioáng ñöôïc nhaäp veà töø Thaùi
Lan. EÁch Thaùi Lan Rana tigerina voøng ñôøi ngaén,
taêng tröôûng nhanh vaø thích hôïp vôùi ñieàu kieän nuoâi
taïi khu vöïc ven ñoâ Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Tuy
nhieân, song song vôùi söï phaùt trieån nuoâi eách coâng
nghieäp ñoù laø söï gia taêng ñaùng keå tình hình dòch
beänh laøm eách cheát haøng loaït maø khoâng roõ nguyeân
nhaân. EÁch beänh coù nhöõng bieåu hieän laâm saøng nhö
meät moûi boû aên, xuaát hieän nhöõng veát lôû loeùt treân da
vaø toån thöông ôû chaân sau, buïng xuaát huyeát, chaân baïi
lieät, queïo coå, muø maét, sình buïng. tyû leä cheát leân tôùi
80-90%. Do thieáu kinh nghieäm trong kyõ thuaät nuoâi
neân dòch beänh thöôøng xuyeân xaûy ra, gaây thieät haïi
lôùn veà kinh teá cho ngöôøi daân. Phong traøo nuoâi eách
coù phaàn chöõng laïi. Theo baùo caùo cuûa Vieän Nghieân
Cöùu Söùc Khoûe Ñoäng Vaät Thuûy Saûn- Thaùi Lan
(AAHRI) naêm 1997, 120 loaøi vi khuaån phaân laäp ñöôïc
töø eách bình thöôøng vaø eách beänh ôû caùc traïi thuoäc 8
tænh cuûa Thaùi Lan. Nhöõng vi khuaån xaùc ñònh ñöôïc
chuû yeáu laø vi khuaån Gram aâm nhö: Aeromonas
hydrophila, A.sobria, Pseudomonas…. Moät soá nghieân
cöùu khaùc cuûa Somsiri vaø ctv,1997, cuõng tìm thaáy
A.hydrophila treân eách bò beänh lôû loeùt ôû Thaùi Lan
trong quaù trình phaân laäp vaø ñònh danh. Döïa treân
nhöõng keát quaû ñaõ nghieân cöùu taïi Thaùi Lan, ñoàng
thôøi xuaát phaùt töø tình hình thöïc teá veà dòch beänh
trong nöôùc, vieäc tìm ra nguyeân nhaân vaø bieän phaùp
phoøng trò beänh höõu hieäu laø yeâu caàu caàn thieát. Chuùng
toâi tieán haønh “Phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån
A.hydrophila treân eách Thaùi Lan Rana tigerina nuoâi
taïi khu vöïc ven ñoâ TP.Hoà Chí Minh”.
Muïc ñích cuûa nghieân cöùu naøy laø phaân laäp vaø
ñònh danh ñöôïc vi khuaån Aeromonas hydrophila
treân eách nuoâi bò beänh ñoàng thôøi tieán haønh gaây caûm
nhieãm ngöôïc vi khuaån A.hydrophila treân eách nuoâi
khoûe maïnh ñeå xaùc ñònh xem A.hydrophila coù ñuùng
laø vi khuaån gaây beänh lôû loeùt vaø ñoû chaân treân eách
Thaùi Lan nuoâi taïi Khu vöïc ven ñoâ TP.Hoà Chí Minh
hay khoâng? Töø ñoù coù höôùng nghieân cöùu tieáp theo
veà vaán ñeà phoøng vaø trò beänh cho eách, goùp phaàn
duy trì vaø phaùt trieån nuoâi eách coâng nghieäp taïi khu
vöïc Thaønh phoá Hoà Chí Minh trong thôøi gian tôùi.
VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP
Noäi dung
Phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån A.hydrophila
treân maãu eách beänh thu taïi khu vöïc Quaän 9, Q. Thuû
Ñöùc, huyeän Cuû Chi, Hoùc Moân.
Gaây caûm nhieãm ngöôïc vi khuaån A.hydrophila
treân eách gioáng khoûe maïnh.
Phöông phaùp
Phöông phaùp phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån töø
eách nuoâi bò beänh theo phöông phaùp truyeàn thoáng
cuûa Bergey
NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007
181
- Thu maãu eách beänh töø moät soá traïi nuoâi taïi
khu vöïc nghieân cöùu. Thu maãu vaøo caùc thôøi ñieåm
xaûy ra dòch beänh vaø thu maãu ñònh kyø moãi thaùng
moät laàn, töø thaùng 9/2006 ñeán thaùng 9/2007.
- Tieán haønh giaûi phaãu eách beänh thu maãu maùu,
gan, laùch, thaän. tuïy nuoâi caáy treân moâi tröôøng NA
(Nutrien Agar). UÛ ôû 37oC trong thôøi gian töø 18-24
giôø. Choïn khuaån laïc rieâng leû phaân laäp, caáy truyeàn,
laøm thuaàn taêng sinh sau ñoù nhuoäm gram, thöû caùc
phaûn öùng sinh hoùa, ñònh danh baèng boä kit API-
20E (BioMerieus, Phaùp). Sau khi phaân laäp ñöôïc vi
khuaån Aeromonas hydrophila chuùng toâi tieán haønh
gaây caûm nhieãm leân eách gioáng khoûe maïnh. Neáu vi
khuaån thu ñöôïc töø eách bò beänh nhaân taïo (vôùi daáu
hieäu beänh lyù töông töï) laø vi khuaån phaân laäp ñöôïc
töø maãu eách beänh ngoaøi hieän tröôøng thì keát luaän vi
khuaån ñoù chính laø taùc nhaân gaây beänh.
Phöông phaùp gaây beänh thöïc nghieäm
Chuùng toâi tieán haønh gaây caûm nhieãm ngöôïc vi
khuaån A.hydrophila phaân laäp ñöôïc töø eách beänh
ngoaøi hieän tröôøng leân eách gioáng khoûe maïnh coù
troïng löôïng töø 18-25g/con. trong thôøi gian 14 ngaøy.
Thí nghieäm goàm: nghieäm thöùc ñoái chöùng,
nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml,
9x107cfu/ml vaø 9x108cfu/ml. moãi nghieäm thöùc ñöôïc
laäp laïi 3 laàn.
Maät ñoä EÁch thí nghieäm 10con/beå (kích thöôùc beå
30cm x 40cm x 35cm).
Lieàu gaây beänh: Tieâm vaøo cô ñuøi moãi eách 0,1ml
huyeàn dòch vi khuaån. Loâ ñoái chöùng moãi eách ñöôïc
tieâm 0,1 ml nöôùc muoái sinh lyù.
Trong quaù trình boá trí thí nghieäm eách ôû taát caû
caùc loâ thí nghieäm ñöôïc chaêm soùc nhö nhau. Theo
doõi caùc bieåu hieän baát thöôøng cuûa eách, thu maãu eách
cheát hoaëc coù bieåu hieän beänh, yeáu. Tieán haønh moå,
phaân laäp ñònh danh nhöõng eách beänh vaø nhöõng eách
coøn soáng soùt sau thôøi gian keát thuùc thí nghieäm.
Sô ñoà khaùi quaùt quaù trình thöïc hieän
EÁch be
ä
nh
Giaûi
p
haãu
Thu maãu (Maùu, Gan, Tuïy, thaän, dòch buïng)
Nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch NA (Nutrient Agar)
UÛ ôû 37
o
C thôøi gian 18-24 giôø
Phaân laäp vi khuaån (choïn khuaån laïc rieâng leû)
Giöõ gioáng
Thöû caùc phaûn öùng sinh hoùa
(Oxidease, catalase, di ñoäng)
Nhuoäm gram
Q
uan saùt hình thaùi vi khuaån
Ñònh danh vi khuaån
Gaây beänh thöïc nghieä
m
Laøm thuaàn
NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007 Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM
182
KEÁT QUAÛ THAÛO LUAÄN
Keát quaû phaân laäp vi khuaån töø eách beänh thu
ngoaøi hieän tröôøng
Sau khi thu maãu eách beänh töø caùc traïi thuoäc khu
vöïc nghieân cöùu, chuùng toâi tieán haønh phaân laäp 145
maãu vi khuaån töø caùc cô quan nhö: Maùu tim, Gan,
Laùch, tuïy, Thaän, dòch buïng. Keát quaû ñònh danh nhö
sau: 45 maãu A.hydrophila, 68 maãu (bao goàm 14 gioáng
vi khuaån) nhö: Chryseobacterium indologenes,
Salmonella choleraesuis ssp/arizonal, Vibrio,
Pasteurella pneumotropica, Pseudomonas
flurescens/putida, Enterobacteria, Citrobacter
freundii ….32 maãu chöa ñònh danh ñöôïc.(Bieåu ñoà 1).
Töø keát quaû ñònh danh vi khuaån thu ñöôïc treân
eách beänh ngoaøi hieän tröôøng, keát hôïp vôùi caùc keát
quaû nghieân cöùu tröôùc ñaây cuûa Vieän Nghieân Cöùu Söùc
Khoûe Ñoäng Vaät Thuûy Saûn-Thaùi Lan (AAHRI) naêm
1997; Somsiri vaø ctv,1996. Chuùng toâi choïn
A.hydrophila tieán haønh gaây caûm nhieãm ngöôïc leân
eách khoûe maïnh.
Keát quaû gaây caûm nhieãm ngöôïc
Sau khi tieán haønh gaây beänh thöïc nghieäm vi
khuaån A.hydrophila treân eách gioáng khoûe maïnh coù
troïng löôïng töø 18-25g, trong thôøi gian 14 ngaøy.
Keát quaû cho thaáy:
Sau 8 giôø keå töø khi baét ñaàu tieâm vi khuaån, ôû
nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån laø 9x108cfu/ml:
eách coù bieåu hieän meät moûi baát ñoäng khoâng aên vaø
baét ñaàu coù eách bò cheát
Sau 10 giôø keå töø khi baét ñaàu tieâm vi khuaån, eách
ôû nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml cuõng
baét ñaàu cheát raûi raùc vaø sau 12 giôø thì eách ôû nghieäm
thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml baét ñaàu cheát.
EÁch cheát cô theå bò tích nöôùc, xuaát huyeát döôùi da,
tuoät nhôùt, taïi veát tieâm ôû ñuøi sau cô bò hoaïi töû.
Bieåu ñoà 1. Tyû leä % vi khuaån ñònh danh ñöôïc töø eách beänh ngoaøi hieän tröôøng
Chöa ñònh danh ñöôïc
22%
Caùc loaøi VK khaùc
47%
A
eromonas hydrophil
a
31%
NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007
183
Hình 1. EÁch bò beänh sau khi tieâm vi khuaån Aeromonas hydrophila
Bieåu ñoà 3. Tyû leä soáng cuûa eách Sau thôøi gian gaây caûm nhieãm ngöôïc
87%
43%
10% 0%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
9x106cfu/ml 9x107cfu/ml 9x108cfu/ml
Noàng ñoä vi khuaån (cfu/ml)
Ñoái chöùn
g
Tyû leä eách coøn soáng sau TN
(%)
Chuùng toâi tieán haønh moå, phaân laäp, ñònh danh
85 maãu vi khuaån taïi moät soá cô quan nhö: Dòch öù
trong khoang buïng, gan, laùch, thaän, cô vaø maùu tim.
Keát quaû ghi nhaän ñöôïc nhö sau: 52 maãu laø
A.hydrophila chieám 61,17%, 21 maãu laø caùc vi khuaån
khaùc (Seratia liquefaciens, Chyseomonas luteola,
Enterobacter, Salmonella arizonae, Escherichia coli
Pasteurella…). (Bieåu ñoà 2).
Tieáp tuïc theo doõi thí nghieäm, sau 2 ngaøy EÁch ôû
nghieäm thöùc tieâm noàng ñoä vi khuaån 9x108 cfu/ml
cheát 100%. Sau 5 ngaøy taát caû nhöõng eách coøn soáng
quan saùt thaáy taïi veát tieâm coù hieän töôïng lôû loeùt,
hoaïi töû. Moät soá eách coù hieän töôïng lôû loeùt treân da
vaø töù chi. Moå quan saùt noäi taïng eách cheát, yeáu thaáy
gan, laùch, thaän coù hieän töôïng muû traéng. Tuy nhieân
10 ngaøy sau khi tieâm, nhöõng eách coøn soáng soùt taïi
veát tieâm coù hieän töôïng kheùp mieäng, vaø keát thuùc
thí nghieäm nhöõng eách coøn soáng veát thöông ñaõ laønh,
eách aên bình thöôøng.
Sau 14 ngaøy theo doõi thí nghieäm, chuùng toâi ghi
nhaän keát quaû: sau 24 giôø eách ôû nghieäm thöùc coù
noàng ñoä vi khuaån 9x108cfu/ml eách cheát 100%. ôû
nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml sau
14 ngaøy eách cheát 90%. ÔÛ nghieäm thöùc coù noàng ñoä
vi khuaån 9x106cfu/ml eách cheát 57%. Nghieäm thöùc
ñoái chöùng 13%.
Bieåu ñoà 3 cho thaáy tyû leä eách coøn soáng soùt sau
thôøi gian boá trí thí nghieäm. Chuùng toâi tieán haønh
moå taát caû nhöõng eách coøn soáng sau 14 ngaøy, phaân
laäp, ñònh danh keát quaû cho thaáy:
Nghieäm thöùc ñoái chöùng moå 26 eách (87%), khoâng
coù söï hieän dieän cuûa vi khuaån A.hydrophila.
Nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml
soá eách soáng soùt 13 eách (43%) quan saùt ngoaøi thaáy
bình thöôøng. Moå quan saùt noäi taïng taát caû caùc eách
gan, laùch, thaän ñeàu bò muû. Tuy nhieân, khoâng laøm
eách cheát.
NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT
Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007 Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM
184
Nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml
soá eách soáng soùt 03 eách(10%). Quan saùt beân ngoaøi
moät soá eách veát thöông ñaõ kheùp mieäng nhöng chöa
hoaøn toaøn laønh (hình 3), moå noäi taïng caùc cô quan
ñeàu bò muû. Vi khuaån ñònh danh vaãn coù söï hieän
dieän cuûa A.hydrophila nhöng ít hôn keát quaû ñònh
danh ban ñaàu.
Töø keát quaû ghi nhaän ñöôïc sau thôøi gian thí
nghieäm, chuùng toâi ñöa ra keát luaän A.hydrophila
chính laø moät trong soá nhöõng vi khuaån gaây beänh lôû
loeùt treân eâch nuoâi taïi khu vöïc ven ñoâ thaønh phoá
Hoà Chí Minh. Keát quaû naøy cuõng gioáng vôùi keát quaû
nghieân cöùu cuûa Somsiri vaø ctv (1997), khi gaây caûm
nhieãm ngöôïc treân eách Thaùi Lan vôùi A.hydrophila
vaø A.sobria thì trieäu chöùng laâm saøng treân eách phuø
hôïp vôùi bieåu hieän ban ñaàu khi phaân laäp 2 loaøi vi
khuaån naøy. Gibbs,(1973) cuõng cho raèng
A.hydrophila ñöôïc xem laø nguyeân nhaân gaây neân
trieäu chöùng lôû loeùt vaø tyû leä cheát cao ñoái vôùi eách
trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm.
KEÁT LUAÄN
A.hydro phila laø vi khuaån chieám öu theá trong
quaù trình phaân laäp ñöôïc töø eách beänh lôû loeùt ngoaøi
hieän tröôøng.
Sau khi gaây beänh thöïc nghieäm, vi khuaån thu
ñöôïc töø eách bò beänh thöïc nghieäm cuõng chính laø vi
khuaån khi tieâm vaøo eách khoûe. EÁch coù caùc bieåu hieän
töông töï eách beänh ngoaøi hieän tröôøng.
A.hydrophila chính laø moät trong soá vi khuaån
gaây beänh lôû loeùt treân eách Thaùi Lan nuoâi taïi khu
vöïc ven ñoâ Thaønh phoá Hoà Chí Minh.
Keát quaû thu ñöôïc töông töï keát quaû nghieân cöùu
beänh treân eách Thaùi Lan cuûa Somsiri vaø ctv naêm
1997 ôû Thaùi Lan.
Hình 2. Hình daïng khuaån laïc vi khuaån A.hydrophila phaân laäp töø eách beänh
Hình 3. A.hydrophila gaây hoaïi töû cô ñuøi eách
