Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên ếch thái lan "Rana tigerina" nuôi tại khu vực ven đô thành phố Hồ Chí Minh

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

180

PHAÂN LAÄP VAØ ÑÒNH DANH VI KHUAÅN Aeromonas hydrophila TREÂN EÁCH THAÙI LAN “Rana tigerina” NUOÂI TAÏI KHU VÖÏC VEN ÑOÂ THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH CHARACTERIZATION OF BACTERIA ISOLATED FROM FARMED FROG (Rana tigerina) IN PERI – URBAN OF HCM CITY Traàn Hoàng Thuûy Boä moân Sinh hoïc vaø Quaûn lyù Nguoàn lôïi Thuûy saûn, Khoa Thuûy saûn Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

ABSTRACT

lôùn veà kinh teá cho ngöôøi daân. Phong traøo nuoâi eách coù phaàn chöõng laïi. Theo baùo caùo cuûa Vieän Nghieân Cöùu Söùc Khoûe Ñoäng Vaät Thuûy Saûn- Thaùi Lan (AAHRI) naêm 1997, 120 loaøi vi khuaån phaân laäp ñöôïc töø eách bình thöôøng vaø eách beänh ôû caùc traïi thuoäc 8 tænh cuûa Thaùi Lan. Nhöõng vi khuaån xaùc ñònh ñöôïc chuû yeáu laø vi khuaån Gram aâm nhö: Aeromonas hydrophila, A.sobria, Pseudomonas…. Moät soá nghieân cöùu khaùc cuûa Somsiri vaø ctv,1997, cuõng tìm thaáy A.hydrophila treân eách bò beänh lôû loeùt ôû Thaùi Lan trong quaù trình phaân laäp vaø ñònh danh. Döïa treân nhöõng keát quaû ñaõ nghieân cöùu taïi Thaùi Lan, ñoàng thôøi xuaát phaùt töø tình hình thöïc teá veà dòch beänh trong nöôùc, vieäc tìm ra nguyeân nhaân vaø bieän phaùp phoøng trò beänh höõu hieäu laø yeâu caàu caàn thieát. Chuùng toâi tieán haønh “Phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån A.hydrophila treân eách Thaùi Lan Rana tigerina nuoâi taïi khu vöïc ven ñoâ TP.Hoà Chí Minh”.

This study was conducted from September 2006 to September 2007 to identify major pathogens, especially bacteria, of diseased frog (Rana tigerina) farmed in the peri –urban area of Ho Chi Minh City. Challenge of cultured frog with Aeromonas hydrophila. That were isolated from diseased frogs with clinical signs of ulcerative syndrome were carried out. Experimental frogs were injected on the vetral left thigh with a variety of bacterial concentrations. Average 18-25g sized frog (Rana tigerina) were stocked at 10 frogs/tank. There were four treatments with triplicate each: control (injected with 0.85% sterile NaCl), 9x106 cfu/ml, 9x107 cfu/ml, and 9x108 cfu/ml for bacterial infection challenges. The mortalities occurred at bacterial concentration of 9x106 cfu/ml, 9x107 cfu/ ml, and 9x108 cfu/ml were 57%, 90% and 100%, respectively. No bacteria were isolated from frogs in the control at the end of experiment.

Signs of moribund frogs included light-reddish fluid in the body cavity and haemorrhage on the skin of abdomen and thigh. Aeromonas hydrophila were isolated frog diseased frog in bacterial injection challenge treatments. Those results point out the importance of Aeromonas hydrophila as causal agents of ulcerative syndrome in frog. Muïc ñích cuûa nghieân cöùu naøy laø phaân laäp vaø ñònh danh ñöôïc vi khuaån Aeromonas hydrophila treân eách nuoâi bò beänh ñoàng thôøi tieán haønh gaây caûm nhieãm ngöôïc vi khuaån A.hydrophila treân eách nuoâi khoûe maïnh ñeå xaùc ñònh xem A.hydrophila coù ñuùng laø vi khuaån gaây beänh lôû loeùt vaø ñoû chaân treân eách Thaùi Lan nuoâi taïi Khu vöïc ven ñoâ TP.Hoà Chí Minh hay khoâng? Töø ñoù coù höôùng nghieân cöùu tieáp theo veà vaán ñeà phoøng vaø trò beänh cho eách, goùp phaàn duy trì vaø phaùt trieån nuoâi eách coâng nghieäp taïi khu vöïc Thaønh phoá Hoà Chí Minh trong thôøi gian tôùi. GIÔÙI THIEÄU VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP

Noäi dung

Phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån A.hydrophila treân maãu eách beänh thu taïi khu vöïc Quaän 9, Q. Thuû Ñöùc, huyeän Cuû Chi, Hoùc Moân.

Gaây caûm nhieãm ngöôïc vi khuaån A.hydrophila treân eách gioáng khoûe maïnh.

Phöông phaùp

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

Thaønh Phoá Hoà Chí Minh nhöõng naêm gaàn ñaây roä leân phong traøo nuoâi eách vôùi nhieàu hình thöùc nuoâi khaùc nhau. Nguoàn eách gioáng ñöôïc nhaäp veà töø Thaùi Lan. EÁch Thaùi Lan Rana tigerina voøng ñôøi ngaén, taêng tröôûng nhanh vaø thích hôïp vôùi ñieàu kieän nuoâi taïi khu vöïc ven ñoâ Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Tuy nhieân, song song vôùi söï phaùt trieån nuoâi eách coâng nghieäp ñoù laø söï gia taêng ñaùng keå tình hình dòch beänh laøm eách cheát haøng loaït maø khoâng roõ nguyeân nhaân. EÁch beänh coù nhöõng bieåu hieän laâm saøng nhö meät moûi boû aên, xuaát hieän nhöõng veát lôû loeùt treân da vaø toån thöông ôû chaân sau, buïng xuaát huyeát, chaân baïi lieät, queïo coå, muø maét, sình buïng. tyû leä cheát leân tôùi 80-90%. Do thieáu kinh nghieäm trong kyõ thuaät nuoâi neân dòch beänh thöôøng xuyeân xaûy ra, gaây thieät haïi Phöông phaùp phaân laäp vaø ñònh danh vi khuaån töø eách nuoâi bò beänh theo phöông phaùp truyeàn thoáng cuûa Bergey

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

181

ngoaøi hieän tröôøng leân eách gioáng khoûe maïnh coù troïng löôïng töø 18-25g/con. trong thôøi gian 14 ngaøy.

- Thu maãu eách beänh töø moät soá traïi nuoâi taïi khu vöïc nghieân cöùu. Thu maãu vaøo caùc thôøi ñieåm xaûy ra dòch beänh vaø thu maãu ñònh kyø moãi thaùng moät laàn, töø thaùng 9/2006 ñeán thaùng 9/2007.

Thí nghieäm goàm: nghieäm thöùc ñoái chöùng, nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml, 9x107cfu/ml vaø 9x108cfu/ml. moãi nghieäm thöùc ñöôïc laäp laïi 3 laàn.

Maät ñoä EÁch thí nghieäm 10con/beå (kích thöôùc beå 30cm x 40cm x 35cm).

Lieàu gaây beänh: Tieâm vaøo cô ñuøi moãi eách 0,1ml huyeàn dòch vi khuaån. Loâ ñoái chöùng moãi eách ñöôïc tieâm 0,1 ml nöôùc muoái sinh lyù.

- Tieán haønh giaûi phaãu eách beänh thu maãu maùu, gan, laùch, thaän. tuïy nuoâi caáy treân moâi tröôøng NA (Nutrien Agar). UÛ ôû 37oC trong thôøi gian töø 18-24 giôø. Choïn khuaån laïc rieâng leû phaân laäp, caáy truyeàn, laøm thuaàn taêng sinh sau ñoù nhuoäm gram, thöû caùc phaûn öùng sinh hoùa, ñònh danh baèng boä kit API- 20E (BioMerieus, Phaùp). Sau khi phaân laäp ñöôïc vi khuaån Aeromonas hydrophila chuùng toâi tieán haønh gaây caûm nhieãm leân eách gioáng khoûe maïnh. Neáu vi khuaån thu ñöôïc töø eách bò beänh nhaân taïo (vôùi daáu hieäu beänh lyù töông töï) laø vi khuaån phaân laäp ñöôïc töø maãu eách beänh ngoaøi hieän tröôøng thì keát luaän vi khuaån ñoù chính laø taùc nhaân gaây beänh.

Phöông phaùp gaây beänh thöïc nghieäm Trong quaù trình boá trí thí nghieäm eách ôû taát caû caùc loâ thí nghieäm ñöôïc chaêm soùc nhö nhau. Theo doõi caùc bieåu hieän baát thöôøng cuûa eách, thu maãu eách cheát hoaëc coù bieåu hieän beänh, yeáu. Tieán haønh moå, phaân laäp ñònh danh nhöõng eách beänh vaø nhöõng eách coøn soáng soùt sau thôøi gian keát thuùc thí nghieäm.

Chuùng toâi tieán haønh gaây caûm nhieãm ngöôïc vi khuaån A.hydrophila phaân laäp ñöôïc töø eách beänh

Sô ñoà khaùi quaùt quaù trình thöïc hieän

EÁch beänh

Giaûi phaãu

Thu maãu (Maùu, Gan, Tuïy, thaän, dòch buïng)

Nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch NA (Nutrient Agar)

UÛ ôû 37 oC thôøi gian 18-24 giôø

Phaân laäp vi khuaån (choïn khuaån laïc rieâng leû)

Laøm thuaàn

Giöõ gioáng

Nhuoäm gram

Thöû caùc phaûn öùng sinh hoùa (Oxidease, catalase, di ñoäng)

Quan saùt hình thaùi vi khuaån

Ñònh danh vi khuaån

Gaây beänh thöïc nghieäm

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

182

KEÁT QUAÛ THAÛO LUAÄN A.hydrophila tieán haønh gaây caûm nhieãm ngöôïc leân eách khoûe maïnh.

Keát quaû phaân laäp vi khuaån töø eách beänh thu ngoaøi hieän tröôøng Keát quaû gaây caûm nhieãm ngöôïc

Sau khi tieán haønh gaây beänh thöïc nghieäm vi khuaån A.hydrophila treân eách gioáng khoûe maïnh coù troïng löôïng töø 18-25g, trong thôøi gian 14 ngaøy. Keát quaû cho thaáy:

Sau 8 giôø keå töø khi baét ñaàu tieâm vi khuaån, ôû nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån laø 9x108cfu/ml: eách coù bieåu hieän meät moûi baát ñoäng khoâng aên vaø baét ñaàu coù eách bò cheát Sau khi thu maãu eách beänh töø caùc traïi thuoäc khu vöïc nghieân cöùu, chuùng toâi tieán haønh phaân laäp 145 maãu vi khuaån töø caùc cô quan nhö: Maùu tim, Gan, Laùch, tuïy, Thaän, dòch buïng. Keát quaû ñònh danh nhö sau: 45 maãu A.hydrophila, 68 maãu (bao goàm 14 gioáng vi khuaån) nhö: Chryseobacterium indologenes, Salmonella choleraesuis ssp/arizonal, Vibrio, Pasteurella pneumotropica, Pseudomonas flurescens/putida, Enterobacteria, Citrobacter freundii ….32 maãu chöa ñònh danh ñöôïc.(Bieåu ñoà 1).

Aeromonas hydrophila 31%

Chöa ñònh danh ñöôïc 22%

Caùc loaøi VK khaùc 47%

Töø keát quaû ñònh danh vi khuaån thu ñöôïc treân eách beänh ngoaøi hieän tröôøng, keát hôïp vôùi caùc keát quaû nghieân cöùu tröôùc ñaây cuûa Vieän Nghieân Cöùu Söùc Khoûe Ñoäng Vaät Thuûy Saûn-Thaùi Lan (AAHRI) naêm 1997; Somsiri vaø ctv,1996. Chuùng toâi choïn Sau 10 giôø keå töø khi baét ñaàu tieâm vi khuaån, eách ôû nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml cuõng baét ñaàu cheát raûi raùc vaø sau 12 giôø thì eách ôû nghieäm thöùc coù maät ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml baét ñaàu cheát. EÁch cheát cô theå bò tích nöôùc, xuaát huyeát döôùi da, tuoät nhôùt, taïi veát tieâm ôû ñuøi sau cô bò hoaïi töû.

Bieåu ñoà 1. Tyû leä % vi khuaån ñònh danh ñöôïc töø eách beänh ngoaøi hieän tröôøng

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

183

Hình 1. EÁch bò beänh sau khi tieâm vi khuaån Aeromonas hydrophila

90%

80%

70%

á

)

60% 50%

87%

%

ø

(

40% 30%

á

43%

ä

20%

û

10%

10%

0%

N T u a s g n o s n o c h c e e l y T

0%

Ñoái chöùng

9x106cfu/ml 9x107cfu/ml 9x108cfu/ml

Noàng ñoä vi khuaån (cfu/ml)

Bieåu ñoà 3. Tyû leä soáng cuûa eách Sau thôøi gian gaây caûm nhieãm ngöôïc

Sau 14 ngaøy theo doõi thí nghieäm, chuùng toâi ghi nhaän keát quaû: sau 24 giôø eách ôû nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x108cfu/ml eách cheát 100%. ôû nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml sau 14 ngaøy eách cheát 90%. ÔÛ nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml eách cheát 57%. Nghieäm thöùc ñoái chöùng 13%. Chuùng toâi tieán haønh moå, phaân laäp, ñònh danh 85 maãu vi khuaån taïi moät soá cô quan nhö: Dòch öù trong khoang buïng, gan, laùch, thaän, cô vaø maùu tim. Keát quaû ghi nhaän ñöôïc nhö sau: 52 maãu laø A.hydrophila chieám 61,17%, 21 maãu laø caùc vi khuaån khaùc (Seratia liquefaciens, Chyseomonas luteola, Enterobacter, Salmonella arizonae, Escherichia coli Pasteurella…). (Bieåu ñoà 2).

Bieåu ñoà 3 cho thaáy tyû leä eách coøn soáng soùt sau thôøi gian boá trí thí nghieäm. Chuùng toâi tieán haønh moå taát caû nhöõng eách coøn soáng sau 14 ngaøy, phaân laäp, ñònh danh keát quaû cho thaáy:

Nghieäm thöùc ñoái chöùng moå 26 eách (87%), khoâng coù söï hieän dieän cuûa vi khuaån A.hydrophila.

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

Tieáp tuïc theo doõi thí nghieäm, sau 2 ngaøy EÁch ôû nghieäm thöùc tieâm noàng ñoä vi khuaån 9x108 cfu/ml cheát 100%. Sau 5 ngaøy taát caû nhöõng eách coøn soáng quan saùt thaáy taïi veát tieâm coù hieän töôïng lôû loeùt, hoaïi töû. Moät soá eách coù hieän töôïng lôû loeùt treân da vaø töù chi. Moå quan saùt noäi taïng eách cheát, yeáu thaáy gan, laùch, thaän coù hieän töôïng muû traéng. Tuy nhieân 10 ngaøy sau khi tieâm, nhöõng eách coøn soáng soùt taïi veát tieâm coù hieän töôïng kheùp mieäng, vaø keát thuùc thí nghieäm nhöõng eách coøn soáng veát thöông ñaõ laønh, eách aên bình thöôøng. Nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x106cfu/ml soá eách soáng soùt 13 eách (43%) quan saùt ngoaøi thaáy bình thöôøng. Moå quan saùt noäi taïng taát caû caùc eách gan, laùch, thaän ñeàu bò muû. Tuy nhieân, khoâng laøm eách cheát.

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

184

Hình 2. Hình daïng khuaån laïc vi khuaån A.hydrophila phaân laäp töø eách beänh

Hình 3. A.hydrophila gaây hoaïi töû cô ñuøi eách

KEÁT LUAÄN

A.hydro phila laø vi khuaån chieám öu theá trong quaù trình phaân laäp ñöôïc töø eách beänh lôû loeùt ngoaøi hieän tröôøng.

Nghieäm thöùc coù noàng ñoä vi khuaån 9x107cfu/ml soá eách soáng soùt 03 eách(10%). Quan saùt beân ngoaøi moät soá eách veát thöông ñaõ kheùp mieäng nhöng chöa hoaøn toaøn laønh (hình 3), moå noäi taïng caùc cô quan ñeàu bò muû. Vi khuaån ñònh danh vaãn coù söï hieän dieän cuûa A.hydrophila nhöng ít hôn keát quaû ñònh danh ban ñaàu.

Sau khi gaây beänh thöïc nghieäm, vi khuaån thu ñöôïc töø eách bò beänh thöïc nghieäm cuõng chính laø vi khuaån khi tieâm vaøo eách khoûe. EÁch coù caùc bieåu hieän töông töï eách beänh ngoaøi hieän tröôøng.

A.hydrophila chính laø moät trong soá vi khuaån gaây beänh lôû loeùt treân eách Thaùi Lan nuoâi taïi khu vöïc ven ñoâ Thaønh phoá Hoà Chí Minh.

Keát quaû thu ñöôïc töông töï keát quaû nghieân cöùu beänh treân eách Thaùi Lan cuûa Somsiri vaø ctv naêm 1997 ôû Thaùi Lan.

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

Töø keát quaû ghi nhaän ñöôïc sau thôøi gian thí nghieäm, chuùng toâi ñöa ra keát luaän A.hydrophila chính laø moät trong soá nhöõng vi khuaån gaây beänh lôû loeùt treân eâch nuoâi taïi khu vöïc ven ñoâ thaønh phoá Hoà Chí Minh. Keát quaû naøy cuõng gioáng vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Somsiri vaø ctv (1997), khi gaây caûm nhieãm ngöôïc treân eách Thaùi Lan vôùi A.hydrophila vaø A.sobria thì trieäu chöùng laâm saøng treân eách phuø hôïp vôùi bieåu hieän ban ñaàu khi phaân laäp 2 loaøi vi khuaån naøy. Gibbs,(1973) cuõng cho raèng A.hydrophila ñöôïc xem laø nguyeân nhaân gaây neân trieäu chöùng lôû loeùt vaø tyû leä cheát cao ñoái vôùi eách trong ñieàu kieän phoøng thí nghieäm.

NGHIEÂN CÖÙU KHOA HOÏC KYÕ THUAÄT

185

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

Temdoung Somsiri., Supranee Chinabut and Suriyan Soontornvit, 1996. Challenge of cultured frogs (Rana tigerina) with Aeromonas spp. In Proceedings of World Aquaculture,1996. The 1996 Annual Meeting of the World Aquaculture Society. Kantimanee Panwichien and Supranee Chinabut, 1997. Somsiri T., S. Chinabut, and S. Soontornvit, 1997. Challenge of cultured frogs (Rana tigerina) with Aeromonas Species. In: T.W Flegel and I.H. MacRae (eds.), Diseases in Asian Aquaculture III. Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila.

Vieän nghieân cöùu nuoâi troàng Thuûy Saûn II, 1992. Baøi giaûng veà beänh caù toâm. Boä Thuûy Saûn.

Kanchanakhan. S., 1998. An ulcerative disease of the cultured Tiger Frog, Rana tigerina, in Thailand: Virological Exammination. AAHRI Newsletter Article Vol. 7(2).

Vieän nghieân cöùu nuoâi troàng Thuûy Saûn II, 1992. Caùc baøi thöïc haønh nghieân cöùu vaø chuaån ñoaùn beänh Caù- Toâm. Boä Thuûy Saûn.

Temdoung Somsiri. Diseases of cultured frogs in Thailan. Aquatic Animal Health Research Institute Department of Fisheries Jatujak Bangkok 10900.

Ñaïi hoïc Noâng Laâm Tp. HCM

Taïp chí KHKT Noâng Laâm nghieäp, soá 1&2/2007

Leâ Thanh Huøng, 2000. Kyõ thuaät nuoâi coâng nghieäp eách Thaùi Lan (Rana rugulosa). Tröôøng Ñaïi hoïc Noâng Laâm Thaønh phoá Hoà Chí Minh.