PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA

Chia sẻ: G G | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

156
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây rau cải nằm trong họ thập tự đƣợc trồng phổ biến ở khắp châu Âu, Địa Trung Hải, nơi đƣợc coi là nguồn gốc của chúng (Nguyễn Văn Thắng, Trần Khắc Thi, 1996). Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho ngƣời và gia súc, làm nguyên liệu nghành dƣợc. Cây cải chiếm vị trí quan trọng bậc nhất trong ngành rau nhờ chủng loại phong phú, sản lƣợng cao, thích nghi rộng rãi với điều kiện thời tiết, đất đai khác nhau, dễ vận chuyển, cất giữ lâu, dễ ăn, dễ chế biến và nấu nƣớng. Rau...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN VĂN KỲ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí minh -2006-
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN VĂN KỲ KS. HOÀNG XUÂN QUANG Thành phố Hồ Chí Minh -2006-
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATING AND IDENTIFYING AGENT CAUSED Brassica chinensis L. LEAF SPOT DISEASE IN HO CHI MINH CITY USING POLYMERASE CHAIN REACTION AND SEQUENCING 16S – 23S rDNA REGION GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D, LE DINH DON TRAN VAN KY MSc, HOANG XUAN QUANG HCMC, 09/2006
LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  TS. Lê Đình Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí, Trƣởng Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, anh chị đã sinh thành, dạy dỗ và ủng hộ tinh thần cũng nhƣ vật chất cho tôi.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh, trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học Khóa 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. i
TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” đƣợc thực hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. Đề tài do sinh viên Trần Văn Kỳ thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang. Đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt. Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho nông dân trồng rau cải ngọt. Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm trên lá rau. Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết. Bệnh làm giảm năng suất cũng nhƣ chất lƣợng cây rau cải ngọt. Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này. Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu đƣợc từ các vùng trồng rau ở huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1. Phân lập đƣợc 8 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tại các vùng trồng rau thuộc huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, Tp HCM. 2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu giải trình tự và gen hrpF đặc trƣng của vi khuẩn gây bệnh. 3. Do hạn chế phƣơng pháp giải trình tự gen không mang lại kết quả. Tuy nhiên, kết quả PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas campestris pv. campestris. ii
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .....................................................................................................................i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt ..........................................................................................vi Danh sách các bảng................................................................................................... vii Danh sách các hình .................................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ........................................................................................ 2 1.2.1. Mục đích ................................................................................................ 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 4 2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc .................................................................. 4 2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố. ........................................................... 4 2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh ............................................................... 5 2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh. ................................................................... 6 2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. ...................................... 7 2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh................ 8 2.1.6. Phƣơng pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh ........................ 8 2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử………………….......................10 2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc ................................................................ 12 2.3. Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). ............................................... 13 2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). ...................... 13 iii
2.3.2. Ribosome DNA (rDNA). .................................................................... 13 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................... 15 3.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................... 15 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 15 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 15 3.2. Vật liệu ......................................................................................................... 15 3.3. Hóa chất ........................................................................................................ 15 3.3.1. Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn ...................................... 15 3.3.2. Các hóa chất dùng trong điện di .......................................................... 16 3.3.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) .......... 16 3.3.4. Môi trƣờng........................................................................................... 17 3.4. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................ 17 3.5. Phƣơng pháp .................................................................................................. 17 3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh ......................................................... 17 3.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh .................................. 18 3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới ................ 18 3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ .................................................... 18 3.5.3.2. Chủng bệnh ................................................................................. 19 3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn .............................................. 20 3.5.5. Phƣơng pháp PCR ............................................................................... 20 3.5.5.1. Khuếch đại đoạn DNA trong vùng ITS của vi khuẩn ............. 20 3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF .................................... 22 3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết qủa ................................................... 22 3.5.6.1. Điện di trên gel agarose............................................................ 22 3.5.6.2. Đọc kết quả điện di................................................................... 22 3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR. ....................... 23 3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA. .............................................................. 23 3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). ............................ 24 3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại. .............................................. 25 3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer. ........... 25 iv
3.5.7.5. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự. .................................. 26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 27 4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh. ........................... 27 4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới.................... 28 4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn. ....................................... 31 4.4. Kết quả phản ứng PCR. ......................................................................... 32 4.4.1. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS. ............................................... 32 4.4.2. Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR ....................................... 32 4.4.3. Kết quả PCR khuếch đại vùng hrpF. ............................................. 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 36 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 39 v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid ng : nano gram cDNA : complementary DNA nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base SDS : Sodium dodecyl sulphate PDA : Potato Dextrose agar RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction UV : Ultra violet CC : Củ Chi HM : Hóc Môn Q12 : Quận 12 DC : Đối chứng vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn Xanthomonas trên môi trƣờng bán chọn lọc.....................................................................9 Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR………………………………………... 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 322…21 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCR và XCF……….. 21 Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự………………………. 23 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự……………... 24 Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài………………... 26 vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của Youfu Zhao và ctv…………………………………........................10 Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Xanthomonas.…………………………………………..…………..11 Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR………………...25 Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau…………………………… 26 Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính hiển vi soi nổi….…….…………………………………………… 27 Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch………………………….. 27 Hình 4.4Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp dƣới kính hiển vi soi nổi……………………………………………28 Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và bên trái bị nhiễm……………………………………………………29 Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn…………………..….... 30 Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA………………………………….. 30 Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA………………………... 31 Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR…………………………………... 32 Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF…………….…………. 32 viii
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây rau cải nằm trong họ thập tự đƣợc trồng phổ biến ở khắp châu Âu, Địa Trung Hải, nơi đƣợc coi là nguồn gốc của chúng (Nguyễn Văn Thắng, Trần Khắc Thi, 1996). Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho ngƣời và gia súc, làm nguyên liệu nghành dƣợc. Cây cải chiếm vị trí quan trọng bậc nhất trong ngành rau nhờ chủng loại phong phú, sản lƣợng cao, thích nghi rộng rãi với điều kiện thời tiết, đất đai khác nhau, dễ vận chuyển, cất giữ lâu, dễ ăn, dễ chế biến và nấu nƣớng. Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày của con ngƣời, đặc biệt là với các dân tộc Châu Á và nhất là với ngƣời Việt Nam. Dù ở đâu – trong nƣớc hay ngoài nƣớc – bữa ăn của ngƣời Việt Nam luôn có món rau với số lƣợng nhiều hơn so với của các dân tộc khác. Có lẽ vì vậy mà ngƣời Việt trẻ hơn, đẹp hơn so với ngƣời cùng lứa tuổi của các châu lục khác. Theo sự phát triển của đời sống xã hội, nhiều nhà dinh dƣỡng học của Việt Nam cũng nhƣ của thế giới nghiên cứu về khẩu phần thức ăn cho nguời Việt Nam đã tính rằng hàng ngày chúng ta cần khoảng 2300 – 2500 calo năng lƣợng để sống và hoạt động. Để có đƣợc năng lƣợng này, nhu cầu tiêu dùng rau hằng ngày trung bình cho một ngƣời phải vào khoảng 250 – 300 g (tức là khoảng 7,5 – 9 kg/ngƣời mỗi tháng). Còn nghiên cứu của nhà khoa học Pháp, ông Dorolle từ năm 1942 đã tính là khoảng 360 g/ngày (tức là khoảng 10,8 kg/một tháng cho mổi ngƣời). Theo các số liệu thống kê thì hiện nay tính bình quân chung cả nƣớc chúng ta mới sản xuất đƣợc khoảng 4 – 5 kg/ngƣời mỗi tháng (không tính phần sản xuất tự túc trong dân) (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996). Nhƣng tác dụng của rau không phải là bảo đảm số calo chủ yếu trong khẩu phần dinh dƣỡng mà là cung cấp đủ chất xơ (xenlulo) để kích thích hoạt động của nhu mô ruột và các sinh tố (vitamin) cho cơ thể. Ở phía nam nƣớc ta, cải ngọt đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh nhƣ: Tp HCM, Đồng Nai, Lâm Đồng, Long An. Cùng các loại rau khác, cải ngọt đã mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho đời sống con ngƣời nhƣ cung cấp rau tƣơi, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, chất xơ cũng nhƣ các loại vitamin. Trong một vài năm trở lại đây, do tốc độ đô thị hóa diễn
2 ra nhanh, các khu công nghiệp tập trung số lƣợng lớn công nhân, do vậy nhu cầu lƣợng rau xanh hàng ngày rất lớn. Chính vì vậy, cây cải ngọt (Brassica chinensis L.) đƣợc nông dân quan tâm, chọn trồng nhiều do chúng có những đặc tính sinh trƣởng phù hợp cho việc thu hoạch thƣờng xuyên nhƣ: thời gian sinh trƣởng ngắn (30 – 35 ngày), trồng đƣợc quanh năm, có nhiều giống trồng trong cả mùa khô và mùa mƣa, năng suất cao, đáp ứng đƣợc nhu cầu của thị trƣờng. Đối với cây cải ngọt, do hàm lƣợng nƣớc lớn, trên 90% (Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985) nên là ký chủ thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật gây bệnh nhƣ nấm, vi khuẩn. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên cây cải ngọt bao gồm: vi khuẩn gây thối nhũn, cháy lá chữ V, đốm lá. Bệnh đốm lá vi khuẩn không phải là đối tƣợng quan trọng. Nhƣng hiện nay, khi diện tích gieo trồng tăng, trồng nhiều vụ trong năm, có sự tích lũy nguồn bệnh qua các vụ, nó trở thành vấn đề đƣợc nhiều ngƣời quan tâm. Triệu chứng ban đầu của bệnh là các đốm nhỏ xuất hiện ở bề mặt dƣới của lá. Vết bệnh dạng tròn, sũng nƣớc, đƣờng kính từ 1 – 3 mm. Vết bệnh lúc già thì phần mô ở giữa bị hoại tử, nhìn mặt trên lá sẽ thấy các đốm màu nâu. Bệnh cũng xuất hiện ở phần thân và cuống lá làm cho lá bị cong lại và vết bệnh có màu đen. Bệnh làm giảm năng suất, giá trị thƣơng phẩm của rau, giảm thời gian bảo quản nên giá trị kinh tế không cao. Hơn nữa, ngoài cải ngọt, bệnh cũng gây hại trên khá nhiều các loại cây trồng khác cùng họ thập tự nhƣ: cải bắp, súp lơ, cải thảo, cải xanh. Chính vì vậy, xác định đƣợc tác nhân gây bệnh là việc cần thiết nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng trừ sau này. Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt tại Tp. HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA”. Đề tài là một phần trong chƣơng trình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên cây họ thập tự của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn sau này nhằm phòng trừ bệnh có hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho nông dân trồng rau.
3 1.2.2. Yêu cầu - Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các vùng trồng rau Củ Chi, quận 12, Hóc Môn. - Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm. - Chủng bệnh trên cây rau cải trồng trong nhà lƣới. - Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh trong số các dòng thu thập đƣợc dựa vào kết quả chủng bệnh. - Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR định danh tác nhân gây bệnh. - Đọc trình tự vùng 16S – 23S rDNA. Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc 2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố
4 Vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây rau họ thập tự phân bố rộng rãi, chúng đã đƣợc ghi nhận là có mặt ở khoảng 85 quốc gia khắp Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ (Bradbury, 1986). Bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1929 trên cây cải ngựa, năm 1930 phát hiện trên củ cải trắng và củ cải đỏ (Youfu Zhao và ctv, 2005). Bệnh cũng đƣợc tìm thấy ở nhiều vùng thuộc nƣớc Mỹ nhƣ Riverside, Santa Barbara, Santa Clara (Matsumoto, 1975). Bệnh này đƣợc ghi nhận gây hại trên họ thập tự ở Argentina (Gaetan, 1995) và ở Brazil trong năm 1992 (Leit, 1994). Ở miền bắc Ấn Độ trong những năm từ 1989 – 1992 bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên cây cải bông (Shyam, 1994). Vi kuẩn gây bệnh đã đƣợc tìm thấy từ hạt cải bắp ở Nhật Bản năm 1988 (Shiomi, 1992). Ở Hàn Quốc, đốm lá là bệnh quan trọng trên cây cải bắp (Kim, 1986). Schaad và Taveechi (1983) đã báo cáo rằng: bệnh xuất hiện ở vùng phía bắc, tây bắc và miền trung Thái Lan. Theo CPC (Crop protection compendium) (2001) cho đến nay, bệnh đã xuất hiện trên nhiều quốc gia khác nhau. Ở châu Âu bao gồm: Bungary, CH Séc, Đan Mạch, Pháp, Đức, Hy Lạp, Hungary, Iceland, Ireland, Ý Hà Lan, Na Uy, Bồ Đào Nha, Rumani, Nga, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Anh. Ở châu Á bao gồm các quốc gia nhƣ: Brunei, Cam Pu Chia, Trung Quốc, Đài Loan, Tây Tạng, Ấn Độ, Inđônêxia, Iran, Nhật, Hàn Quốc, Malayxia, Nêpan, Philippin, Srilanka, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kỳ, Uzbêkistan và Việt Nam. Châu Phi gồm có: Angola, Ethiopia, Ghana, Kenya, Libya, Malawi, Mauritius, Morocco, Mozambique, Seychelles, Somalia, Tanzania, Togo, Uganda, Zimbabwe. Ở vùng tây bán cầu có các quốc gia nhƣ: Argentina, Barbados, Bermuda, Bolivia, Brazil, Parana, Canada, British Columbia, Costa Rica, Cuba, Dominica, El Salvador, Guatemala, Haiti, Honduras, Jamaica, Mexico, Nicaragua, Panama, Puerto Rico. Ở nƣớc Mỹ, bệnh xuất hiện ở các bang nhƣ: California, Florida, Georgia, Hawaii, Illinois, Michigan, New York, Washington, Wisconsin. Ở châu Đại Dƣơng bệnh xuất hiện ở American Samoa, New South Wales. Ở Úc, bệnh xuất hiện ở các khu vực nhƣ: Queensland, Nam Úc, Tây Úc. Ngoài ra, bệnh cũng đƣợc ghi nhận là đã có mặt Cook Islands, Fiji New Caledonia, New Zealand, Norfolk Island, Papua New Guinea, Tonga.
5 Nhƣ vậy, chúng ta thấy rằng đây là bệnh phân bố khá rộng rãi, hầu nhƣ chúng có mặt ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. 2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh Theo Lowell L. Black (2000), bệnh do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây nên. Bệnh xuất hiện trên tất cả các loại cây trồng thuộc họ thập tự và một số giống cải hoang. Triệu chứng chính của bệnh là đốm trên lá thật, đôi khi bệnh cũng xuất hiện trên lá mầm, bông, cuống lá và bắp của cây cải bắp. Các đốm nhỏ xuất hiện trên bề mặt lá do sự xâm nhiễm qua lỗ khí khổng của vi khuẩn hoặc rìa mép lá do quá trình xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng. Vết bệnh ban đầu là các lỗ nhỏ sũng nƣớc, về sau khi triệu chứng bệnh điển hình, đƣờng kính vết bệnh có thể lên đến 3 mm và có dạng hình tròn. Bao quanh vết bệnh là vành màu nâu sáng, khi bệnh già ở giữa có vùng hoại tử màu trắng. Vết bệnh trên gân, cuống lá thƣờng có dạng sọc đen dài. Youfu Zhao và ctv (2000, 2002) đã phân lập các vi khuẩn gây bệnh đốm lá trên các cây trồng họ thập tự ở Oklahoma (cải bắp, cải rổ, cải củ, cải thìa) là Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris, Pseudomonas syringae pv. maculicola. Trong đó hai loài vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris là những tác nhân quan trọng. những vi khuẩn này cùng tồn tại và phát triển trên đồng ruộng. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris thuờng gây triệu chứng cháy lá chữ V (V – shape), đôi lúc cũng có triệu chứng đốm lá, nếu xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây triệu chứng đốm lá. Đối với bệnh đốm lá do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây triệu chứng đốm lá, vết bệnh thƣờng không định hình, kích thƣớc vết bệnh khoảng 2 mm, khi nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau, đƣờng kính vết bệnh có thể lên tới 1 cm. Màu sắc vết bệnh thƣờng có dạng sũng nƣớc, viền úa vàng bao quanh vết bệnh. Trong nghiên cứu của mình về bệnh đốm lá trên cây canola (Brassica napus), một loại cây trồng thuộc họ thập tự, S. Geatan, N. Lopez (2005) đã xác định rằng, tác nhân của bệnh này là do vi khuẩn Xanthomonas campestris gây nên. Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ khí khổng tạo nên các vết đốm hoại tử. Triệu chứng bệnh đôi lúc có dạng cháy lá chữ V, đó là kết quả của sự xâm nhiễm qua lỗ thủy khổng ở mép lá.
6 Từ tháng 12 năm 2001, K. Pernezn, E. Dickstein phát hiện dịch bệnh đốm lá cải bắp ở trang trại vùng Everglades thuộc phía nam bang Florida. Triệu chứng là các đốm nhỏ, kích thƣớc khoảng 1 – 2 mm và thƣờng xuất hiện ở phần mặt lá. Tác nhân là do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae gây nên. Xanthomonas campestris pv. campestris và các chủng khác thuộc loại này nhƣ X. campestris pv. abbrans, raphani, armmoraciae, và incanae đƣợc biết đến nhƣ là những chủng gây bệnh đốm lá hoặc cháy lá chữ V trên các cây trồng họ thập tự (J.G. Vicente, 2001). Cũng theo J.G. Vicente và ctv (2006) phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây củ cải trắng và cây cải ngựa (horseradish), kết quả cho thấy, tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Xanthomonas campesrtis pv. armoraciae hoặc Xanthomonas campesrtis pv. raphani. Ở Queensland, Australia, tác nhân gây bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây nên. Vi khuẩn thƣờng gây hại mạnh trên các giống cải (Moffett, M.L và ctv, 1976). Nhƣ vậy, tác nhân gây bệnh đốm lá họ tập tự cho đến nay bao gồm hai giống chính, giống Xanthomonas bao gồm: Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas campesrtis pv. raphani. Và giống Pseudomonas gồm có: Pseudomonas syringae pv. maculicola. 2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh Bệnh đốm lá vi khuẩn họ thập tự phân bố rộng rãi, gây hại nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Ở Oklahoma, hàng năm có khoảng 600 ha rau bị bệnh tấn công. Bệnh làm giảm năng suất và chất lƣợng của một số loại rau ăn lá họ thập tự. Từ 1994 đến 1996 bệnh làm thiệt hại hoàn toàn những cánh đồng trồng cải rổ, cải xanh, củ cải ở bang này (Youfu Zhao và ctv, 2000). Theo CPC (2001), bệnh đốm lá họ thập tự là bệnh quan trọng gây tổn thất đáng kể về năng suất cũng nhƣ chất lƣợng. Bệnh là đối tƣợng nguy hiểm cho cây trồng họ thập tự ở các bang phía bắc nƣớc Mỹ. Trong những năm 1960 và 1970, bệnh gây hại rất nặng rên cánh đồng trồng cải bắp của bang Texas. Năm 1972 và 1973, bệnh đã gây thành dịch cho các khu vực Đông – Bắc, và các bang phía tây nƣớc Mỹ, khoảng 70% cây con lấy từ típ ƣơm cây đều bị nhiễm bệnh, sự thiệt hại này ƣớc tính là khoảng
7 1 triệu USD. Ở Canada, trong vụ Đông 1979 – 1980, bệnh gây tổn thất khoảng 60% sản lƣợng cải bắp. Ở miền nam tỉnh Buenos Aires – Argentina, tỷ lệ bệnh đốm lá cây canola (Brassica napus) trung bình koảng 59%, những năm bệnh nặng, tỷ lệ bệnh khoảng 90% và làm thất thoát khoảng 20% năng suất (S. Geatan, N. Lopez, 2005). Các loài gây bệnh thuộc giống Xanthomonas spp. Là vi khuẩn gây tổn thất kinh tế nặng nề nhất trên các cây trồng họ thập tự nhƣ cải bông, cải bắp, cải xanh (J.G. Vicente và ctv, 2006). 2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae tồn tại trong tàn dƣ cây trồng ở trong đất, nhƣng không sống trong đất sau khi tàn dƣ cây trồng bị phân hủy. Vi khuẩn cũng có thể tồn tại trên cây cỏ, hạt giống. Bệnh phát triển mạnh khi có ẩm độ lá cao (trên 85%), khoảng nhiệt độ thích hợp để bệnh phát triển tƣơng đối rộng 20 – 30oC. Trong điều kiện thời tiết có sƣơng hoặc mƣa liên tục kết hợp với nhiệt độ cao là điều kiện rất thuận lợi để bệnh phát triển mạnh mẽ. Vi khuẩn có thể lan từ cây này qua cây khác do mƣa, tƣới và các dụng cụ lao động (Lowell L. Black, 2000). Theo Youfu Zhao (2002), vi khuẩn gây bệnh lan truyền qua hạt giống là chủ yếu. nếu bệnh do Xanthomonas campestris pv. campestris gây nên thì vi khuẩn có thể tồn tại cả ở hạt giống, tàn dƣ thực vật và cỏ dại. Chƣa phát hiện đƣợc sự tồn tại và lan truyền qua đất và tồn dƣ cây trồng của vi khuẩn gây bệnh là Xanthomonas campestris pv. armoraciae. Vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae và Pseudomonas syringae pv. maculicola gây bệnh đốm lá cây rau ăn lá họ thập tự gần nhƣ không tồn tại trong tàn dƣ cây trồng đƣợc chôn vùi sâu, nhƣng chúng tồn tại lâu hơn trong tàn dƣ cây trồng trên mặt đất. Điều này cũng tƣơng tự nhƣ vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Chúng có thể tồn tại lâu hơn trong tồn dƣ thực vật trên mặt đất. Vi khuẩn gây bệnh cũng tồn tại trong tồn dƣ thực vật đã bị hoai mục. Cũng nhƣ các vi khuẩn gây bệnh khác, vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae có quan hệ chặt chẽ với sự xâm nhiễm vào mô lá qua lỗ hở tự nhiên (khí khổng, thủy khổng) và các vết thƣơng tạo nên hiện tƣợng đốm lá (Veronique Hugouvieux, 1998).
8 Theo CPC (2001), Xanthomonas campestris pv. campestris sống sót qua mùa đông trong đất, đặc biệt là các cây kí chủ nhiễm bệnh và các loài cỏ dại mọc gần ruộng trồng cây họ thập tự, vi khuẩn có thể tồn tại tới 3 năm. Vi khuẩn xâm nhập vào hạt, lỗ khí khổng và thủy khổng của cây. Vi khuẩn từ lá mầm ở cây con có thể lan truyền trực tiếp lên các lá thật. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua sự hình thành giọt nƣớc tiết ra từ lỗ thủy khổng trong giai đoạn buổi sáng (Ruisen và Gielink, 1993). Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng của vi khuẩn là 25 – 30oC. Trong những điều kiện nhƣ vậy, triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7 – 14 ngày. Nhiệt độ thấp, triệu chứng bệnh xuất hiện chậm. Triệu chứng bệnh không thể hiện rõ khi nhiệt độ dƣới 18 – 20oC. Vi khuẩn có thể sống sót trên bề mặt lá đến 73 ngày sau khi lá đƣợc chủng bệnh bằng phƣơng pháp phun (Schultz và Gabrielson, 1986). Vi khuẩn có thể lây lan từ cây này qua cây khác nhờ gió, mƣa và công cụ lao động. 2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh Các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas thƣờng có phản ứng Gram âm, háo khí, tế bào hình gậy (0,4 – 0,7 x 0,7 – 1,8 μm), tiêm mao đơn cực, không sản sinh nitrates, phản ứng catalase dƣơng tính, tạo axít yếu từ các nguồn carbonhydrate. Khuẩn lạc có màu vàng, nhầy, lồi và bóng trên môi trƣờng NGA và YDC agar. Đối với các loài Xanthomonas, khuẩn lạc có thể mọc và phát triển ở nhiệt độ 35oC, hóa lỏng gelatin, không tạo urease, sản sinh axit từ arabinose, glucose và manose (N.W. Schaad, 1998). 2.1.6. Phƣơng pháp phân lập tác nhân gây bệnh Theo Youfu Zhao (2000), đối với bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas, việc ly trích vi khuẩn tốt nhất từ các đốm lá mới bị nhiễm bệnh. Sát trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite 0,25% trong 30 giây, đốm bệnh đƣợc cắt nhỏ trong giọt nƣớc tiệt trùng và cấy zích zắc dịch khuẩn lên môi trƣờng nutrient agar (NA). Đĩa cấy ủ trong 28oC, sau 3 – 5 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Chọn các khuẩn lạc màu vàng, mọc tách rời để nghiên cứu. Theo CPC (2001), vi khuẩn gây bệnh thực vật giống Xanthomonas có thể đƣợc phân lập từ rìa vết bệnh (phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe ). Vi khuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng Yeast dextrose calcium carbonate (YDC), Beef peptone agar + 5% water soluble starch.
9 Theo Shaad, N.W. (1988), vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có thể đƣợc phát hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng bán chọn lọc (semiselective media). Các loại môi trƣờng bán chọn lọc chuyên biệt đƣợc sử dụng là SX agar, SM agar, NSCAA, BSCAA. Các môi trƣờng này thƣờng dùng phân lập vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. Campestris trong đất và hạt giống. malvacearum Translucens Môi trƣờng pelamgonii vesicatoria campestris Manihotis Begoniae phaseoli fragaria carotae oryzae pruni SX V– V– + + + – – – – – – – SM V V V + + + – – – – – – BSCAA MXP V– V– V– V– V + + + + + + – Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn Xanthomonas trên môi trƣờng bán chon lọc (+) (+) V+ V+ V+ V– V V + + – – XPSa V– V V V V + – – – – – – XCS (+) V + + + + + + + + + – MD – 5 ND (+) V– V V V V V + + + Tween ND (+) V V + + + + + + + + 2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử Để đánh giá sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn Xanthomonas campestris gây bệnh đốm lá trên cây họ thập tự, Youfu Zhao và ctv (2000) đã sử dụng kỹ thuật rep-PCR với BOX primer BOXAIR [5’ –