Phản ứng Multiplex PCR: Các thông số quyết định và quy trình từng bước

ả ứ ố

c

Ph n ng Multiplex PCR: Các thông s quy t đ nh và quy trình ế ị ướ

t ng b ừ

O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt1

Tr

ạ ọ

ạ ọ

ứ

ng Đ i h c Indiana (Indianapolis, IN, USA) và ườ 1 Tr ng Đ i h c Haeidelberg (Heidelberg, Đ c) ườ T p chí BioTechniques 23: 504-511 (tháng 9/1997) ạ

Ng

i d ch:

ườ ị

L uư Quang Minh

1- Gi i thi u ớ ệ

ả ứ ng, ng PCR thông th ở ườ ồ ừ

ừ ệ ự ấ ấ ặ ạ ng pháp đ nh l ươ ậ ỹ ị c (RT-PCR) [7]. Ph n ng multiplex PCR là m t d ng thay đ i c a ph n ả ổ ủ ộ ạ c nhân đó hai ho c h n hai locus đ ượ ặ ứ ơ đ u tiên lên đ ng th i trong cùng m t ph n ng. T các mô t ộ ả ầ ả ứ ờ ụ c áp d ng v nó năm 1988 [6], ph ng pháp này đã t ng đ ươ ượ ề thành công trong r t nhi u lĩnh v c thí nghi m ADN g m có ồ ề phân tích m t đo n [2,8], đ t bi n [14], đa hình [11] ho c trong ế ộ các ph ng [10] và k thu t PCR sao chép ượ ng ượ

Vai trò c a các thành ph n hoá ch t khác nhau trong ph n ng PCR đã t ng đ ấ ầ ủ ả ứ ượ ả ứ ứ ứ t) có th nh h ụ ồ ấ (ví d : n ng đ m i, chu trình nhi ộ ồ ể ả ệ ố ả ứ ng t ượ ứ ườ ộ ơ ạ ệ ạ ả ứ ứ ứ ả ứ ố ả ế ượ ệ ằ ườ ượ ặ ứ ệ ế ậ ộ ứ c thi ệ ề ặ ả c nhân lên m t cách th t th ấ ộ ế ế ế ượ ễ ớ ng m c. Quy trình này s r t có ích cho nh ng công vi c s d ng công ngh t k (hình 1) v i các gi ữ ả ệ ử ụ ả ứ ề ướ c đ c p ượ ề ậ ừ b i r t nhi u đ n [3, 9, 12, 13], và quy trình ph n ng multiplex PCR cũng đã đ ề c miêu t ả ở ấ ế nhóm nghiên c u khác nhau. Tuy nhiên, r t ít công trình nghiên c u [5, 15] đ a ra th o lu n r ng ậ ộ ả ư ả ủ rãi v m t s nhân t i k t qu c a ớ ế ưở ề ộ ố c nhân lên trong vi c phân tích ph n ng multiplex. Trong nghiên c u này, h n 50 locus đã đ ệ nhi u ph n ng multiplex PCR khác nhau s d ng m t lo i đ m PCR ch a KCl thông th ng. ử ụ ề i vi c khu ch đ i trong ph n ng multiplex PCR M t nghiên c u v các thông s nh h ng t ế ớ ề ộ ưở i quy t m t s v n đ đ c bi t trong ph n ng multiplex PCR bao đã đ c ti n hành nh m gi ả ứ ộ ố ầ ế c nhân lên và nh ng ng ho c không đ g m c vi c các locus đ ữ ượ ả ệ ồ ừ khó khăn trong vi c đ a ra k t lu n. Căn c vào k t qu nghiên c u này, m t quy trình t ng ả ư i pháp th c ti n cho c cho ph n ng multiplex PCR đã đ b ự ướ nhi u v n đ v ệ ẽ ấ ắ ấ ề PCR trên c hai lĩnh v c nghiên c u và đi u tr . ị ự ứ ề ả

2- Nguyên li u và ph ng pháp ệ ươ

2.1- Nh ng dung d ch và hoá ch t c n thi ấ ầ ữ ị ế t cho ph n ng PCR ả ứ

ị ả ỗ ạ ượ ệ 24 ướ ạ ẩ ủ ở c mua t ừ ượ ế

c l y t ồ ượ ấ ừ ặ ế ộ ố ự ấ ắ i tính X c a ng i gây nên b nh teo c ừ ạ ễ muscular ễ ể ớ dystrophy ườ DMD) ắ ệ [4]. ể ố ắ ủ ễ ồ ườ ư ặ ồ ượ b ng 1 và các hình 2b, 3b, 5e. ADN h gen đ ỗ ợ c tách chi Nucleotide (dNTP) (hãng Pharmacia Biotech [Piscataway, NJ, USA] ho c hãng Boehringer ặ i d ng dung d ch g c 100mM (25mM c b o qu n d Mannheim [Indianapolis, IN, USA]) đ ố ả m i lo i dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Đ m PCR 10x chu n c a hãng Perkin-Elmer, Norwalk, CT, 0C) và 15mM MgCl2. Taq ADN USA bao g m: 200mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 8.3 ( ồ hãng Perkin- hãng Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA) ho c t Polymerase đ ặ ừ hãng c mua t Elmer. Dimethyl sulfoxide (DMSO), albumin huy t thanh bò (BSA) và glycerol đ ừ ượ hãng Genosys [The Woodlands, TX, Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). M i đ c s d ng ượ ử ụ t ng h p và đ c t USA] ho c Research Genetics [Huntsville, AL, USA] ho c đ ợ ượ ự ổ ặ ồ trong ph n ng v i n ng đ cu i cùng t 10 đ n 25 pmol/uL m i m i. M t nhóm các c p m i ặ ộ ồ ỗ ớ ồ ả ứ i tính Y [8, 16]. 15 c p m i c s d ng đ ch ra s m t đo n trên nhi m s c th gi (sY) đ ồ ể ượ ử ụ ặ ể ớ ỉ ơ khác đ c s d ng đ i v i gen trên nhi m s c th gi ủ ượ ử ụ ố ớ (Duchenne Duchenne - ở Các c p m i khác ch ra s đa hình c a các locus (microsatellites) trên nhi m s c th s 12 ỉ ả ứ c đ a vào trong các h n h p ph n ng ng multiplex nh đã miêu t t và tinh ượ ư ự ặ i (Research Genetics). Các c p m i trên đ ả ở ả ệ ế

d ng Sodium dodecyl sulfate (SDS)/proteinase K (hãng Boehringer ử ụ s ch theo quy trình s ạ Mannheim).

2.2- Quy trình PCR c b n ơ ả

ồ ấ ệ ể ơ ả m L) bao g m: n m M m i lo i); các m i (0.04-0.6 ồ ỗ ạ ạ ử ỗ Ph n ng PCR c b n (th tích 25 ỗ Taq ADN polymerase (1-2 U/25m L ph n ng) và ADN h gen (150ng/25 ư c vào tr ự ệ c làm nóng ho c n i c gi ướ ữ Đ i v i vi c đánh d u phóng x , 1 ệ ấ ạ ố ớ ậ ứ ệ ượ ư c khi b t đ u ph n ng. K t qu ph n ng PCR đ i v i các th tích 100 ố ớ ả ứ ắ ầ ư ệ ấ ế ớ ả ể t khác nhau đã đ ượ ử ụ ứ ệ ề c kh ion h p kh trùng; đ m PCR ử ướ ả ứ m M m i lo i); DMSO, glycerol ho c ặ (1x); h n h p dNTP (200 ợ m L BSA (5%-n u dùng); ệ ả ứ ế khác nhau nh ng nên đ a ư ph n ng). Các thành ph n ph n ng có th cho vào theo các th t ứ ự ể ầ ả ứ ả ứ ả ứ c th c hi n trên đá l nh, và các tube ph n ng c tiên. Vi c tr n m u ph i đ n ạ ả ượ ộ ệ ẫ ướ c khi đ t chúng vào khuôn kim lo i đã đ ồ ử trên đá tr ph i đ ặ ượ ặ ướ ả ượ ạ m Ci water-bath (940C) c a máy chu trình nhi t (máy PCR). ủ [32P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ngay l p t c đ c đ a vào 100uL h n h p ợ ỗ m L, 25m l chính tr ể ướ ả ứ m L là nh nhau. Tuy nhiên v i th tích nh , vi c l y, hút hoá ch t r t khó khăn, đ c ặ ho c 6.2 ấ ấ ỏ ặ t là đ i v i dNTP. Nhi u chu trình nhi bi c s d ng trong nghiên c u này và ố ớ ệ t c đ u v n hành t t ề ố ậ ấ ả ề t sau khi có các đi u ch nh nh . ỏ ỉ

2.3- Phân tách gel các s n ph m PCR ả ẩ

ắ ẩ ể ễ ủ ượ ặ ệ

ả ặ nhi ở i đi n th ệ ố ớ ả ẩ ỗ ử ụ ư ả ế ộ

ả ợ ứ ặ ế ấ ộ ệ ạ ủ ệ ạ ẽ ượ ả ứ ả ạ Các s n ph m PCR c a các locus không có đa hình (nhi m s c th X và Y) đã đ c phân ả ng pháp đi n di trên gel agarose 3% c a hãng SeaKem LE ho c hãng NuSieve tách b ng ph ủ ươ ằ (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA) trong đ m TAE 1x [0.04M Tris-acetate; 0.001M EDTA ệ ế (pH 8.0)] ho c đ m TBE 1x [0.09M Tris-borate; 0.002M EDTA (pH 8.0)], s d ng gi ệ t đ phòng. Th tích s n ph m PCR đ a vào m i gi ng là nh nhau đ i v i các 7-10V/cm ể ư ệ ộ lo i gel phân tích trong nghiên c u này. Quan sát k t qu sau khi nhu m các b n gel trong dung ứ ả ế ạ m g/mL ethidium bromide. Gel gi d ch ch a 0.5-1 (6% polyacrylamide [PAA]/7M urea) i trình t ự ả ứ ị ng h p có s đa hình trên các locus c s d ng đ phân tách các s n ph m PCR trong tr đ ườ ự ẩ ể ượ ử ụ m L s n ph m PCR có ng kho ng 0.2 i cao h n. M t l nghiên c u ho c yêu c u đ phân gi ộ ầ ẩ ả ả ộ ượ ơ ả c đ a vào m i gi ng c a gel sau khi đã tr n v i đ m ch y (loading đánh d u phóng x đ ớ ệ ỗ ạ ư ạ ượ c ch y đi n di trên đ m TBE 0.6x v i hi u đi n th 1800-2000V buffer). Nh ng gel này đ ớ ệ ượ ế ệ ữ (60A) trong kho ng 2 gi i sau khi ch y ph n ng qua c ghi l . K t qu b n phóng x s đ ạ ả ả ế ờ đêm.

3- K t qu và th o lu n ế ả ả ậ

ề ả ứ ộ c thi ể ề ườ ễ ặ ế ế t k Qua r t nhi u thí nghi m, m t quy trình cho ph n ng multiplex PCR đã đ ượ ng g p nh t. Đ thu n ậ ự ấ ọ in nghiêng k t h p v i s đ cùng v i nhi u đi m tr ng ệ i pháp th c ti n cho m t vài v n đ th ấ ớ ơ ồ ộ ố ả ử ụ ữ ừ ề ể ớ ấ (hình 1) bao g m m t s gi ồ ti n và d dàng khi s d ng, nh ng t ệ tâm đ ộ ế ợ ng pháp và trong các ti u ph n sau đây. ễ c trình bày trong ph n Nguyên li u và Ph ầ ượ ươ ệ ể ầ

3.1- Nh ng v n đ căn b n trong ph n ng multiplex PCR ả ứ ữ ề ấ ả

c 1 và 2). ồ ọ ồ ướ ệ ự ắ ả ơ ồ ặ ậ ồ ồ ơ ượ ADN m i (b ả ả ự ả ẩ ặ ồ ồ ng đ ể ả ồ ượ ử ụ ể ể ừ ự c đ i chi u v i c s d li u trình t ệ ồ c s d ng. Đ ki m tra các trình t ớ ơ ở ữ ệ website: ftp.bio.indiana.edu) đã đ ế t ự ạ ượ

Vi c l a ch n m i tuân theo các quy t c đ n gi n sau: chi u ề dài m i kho ng 18 - 24bp ho c h n và ph n trăm GC chi m 35%-60%, do v y, nhi ệ ộ ắ t đ g n ầ ế ơ 0C ho c cao h n. Nh ng m i dài h n (m i DMD, 28-30bp) cho phép ph n ả m i vào kho ng 55-58 ơ ữ ặ c th c hi n ơ t đ g n m i cao h n và thu đ c ít s n ph m không đ c hi u h n. nhi ượ ệ ộ ắ ứ ơ ệ ở Đ tính toán đi m nóng ch y và ki m tra kh năng b t c p c a 2 m i (primer-primer), "m i 1.2" ể ắ ặ ủ ể ả i xu ng t có (có th t ố ể ả i, các m i s d ng đã đ kh năng l p l i Trung tâm ồ ử ụ ặ ạ ả ố qu c gia v thông tin công ngh sinh h c (National Center for Biotechnology Information - NCBI) ọ ệ ề ố s d ng các công c tìm ki m (Basic Local Alignment Search Tool - BLAST). ử ụ ụ ế

ệ t đã đ ừ c thi ệ PCR t ng locus riêng bi ế ế t (b ướ ả ứ ả ứ ệ ượ ồ ỗ ả ượ ợ ể bi Taq ADN polymerase trong th tích ph n ng 25 sánh liên t c trên cùng chu trình nhi c 3). M t ph n ng PCR đ nhân lên t ng locus riêng ộ ể ừ m M m i, 5% DMSO và 1U t k . H n h p ph n ng bao g m đ m PCR 1x, 0.4 ồ m L. Khi ph n ng k t thúc, các k t qu đ c so ế ả ứ ế t ho c trong cùng đi u ki n, trên các lo i máy có cùng ạ ệ ả ứ ề ụ ệ ặ

ấ ả ặ ế ế ố ặ ự ỉ ớ ệ ỉ ề ệ ố ơ ố ớ ấ ả ạ ố ượ ể t đ kéo dài trong chu trình nhi ộ ố ả t xu ng. Đ i v i các locus đ ố ớ ủ ố ệ ả ờ ồ ệ ớ ế ủ ả ệ ả ẩ ặ ả t h n đ i v i t c ki m tra (dài 100-300bp), s l ệ ộ ắ ư ổ ặ ệ ộ ắ ư ự ế ồ ạ model và trên các máy khác model ho c khác hãng s n xu t. K t qu r t gi ng nhau n u ch y ả ấ t rõ r t khi s d ng các máy trên cùng m t máy ho c các máy cùng model nh ng có s khác bi ộ ử ụ ệ ư t, k t t c a các hãng khác nhau. Tuy nhiên, ch v i các đi u ch nh trong chu trình nhi luân nhi ế ệ ủ ố qu đã tr nên t t c các lo i máy s d ng. Chúng tôi quan sát th y r ng, đ i ấ ằ ử ụ ở ả ng b n copy c a m t s s n ph m PCR đã v i các locus đ ẩ ả ớ ượ ượ c tăng lên đáng k khi gi m nhi ể t, th i gian g n m i (30-120 giây) và th i gian kéo dài (30-150 giây) không nh nhân lên riêng bi ả ờ ụ h ưở ả thu c r t nhi u vào s thay đ i nhi t ố ệ i k t qu , nh ng tính đ c hi u c a s n ph m PCR tăng lên ho c gi m đi ph t đ g n m i. Quy trình ph n ng PCR A đã đ a ra k t qu ả ứ i tính Y (hình 2a). ớ ặ ng rõ r t t ề ộ ấ t nh t (b ng 2) đ nhân lên locus đ c hi u s 22 trên NST gi ấ ệ ố ể ả

ợ ả ứ Ph n ng Multiplex PCR: H n h p m i cùng n ng đ (b ỗ ộ ướ ệ ợ ồ ỗ c 4). ề ồ ồ ờ ầ ng l ả ứ ượ ầ ươ ươ ồ ớ ữ ầ ấ ồ ượ ệ ả ầ ế ụ ề ụ ổ ữ ế ả ề Vi c k t h p nhi u ế ợ ồ m i trong các h n h p ph n ng khác nhau và nhân lên đ ng th i nhi u locus (b ng 1 và hình ả ả ứ i u các thông s c a ph n ng. L n đ u khi th c hi n ph n ng 2b) đòi h i s thay đ i/t ả ứ ố ủ ệ ự ổ ố ư ỏ ự ng nhau (cùng n ng ng đ multiplex PCR, nên s d ng các m i v i m t đ ồ ng gram t ộ ươ ử ụ ổ đ ). K t qu này s cho ta th y nh ng n ng đ m i nào hay các thông s nào c n ph i thay đ i. ả ả ố ộ ồ ẽ ộ ph n sau; tuy nhiên, các Ví d v nh ng thay đ i h u hi u đã đ c ch ng minh và th o lu n ậ ở ứ ữ ví d này không nh t thi t kê trong quy trình này c li ệ ộ ậ ự ượ ấ c thay đ i nhi u l n. t đ kéo dài) đ (hình 1) khi mà các thông s (ví du: nhi ề ầ t ph i tuân theo m t tr t t ố xác đ nh đã đ ị ổ ệ ộ ượ

3.2- T i u các đi u ki n chu trình nhi t c a ph n ng multiplex PCR ố ư ề ệ ệ ủ ả ứ

t đ kéo dài (b ả ế ệ ộ ả ố ng m i t ỉ ng đ ướ ứ Hình 2c ch ra các k t qu thu đ ươ ế

ắ ơ ư ờ ở ủ ỗ ả ợ ộ ố ả ờ ả ứ ẩ ệ ấ ở ơ ợ ả ở ế ẩ ấ t và đã cho th y r ng nhi ả ấ ằ ơ ố ố ắ ả ằ ộ ỗ c sau khi c b n h n c 5, A-C). Nhi ượ ng nhau khu ch đ i các locus trên NST h p ph n ng khác nhau ch a m t l ồ ươ ộ ượ ạ ợ ả ứ m M m i m i) đ ả c đ a vào ph n ng multiplex PCR theo quy trình A và B (b ng i tính Y (0.4 gi ả ứ ượ ư ồ ỗ ớ 0C) và có th i gian g n m i cũng nh th i gian kéo t đ kéo dài cao h n (72 2); quy trình B có nhi ồ ệ ộ quy trình A dài cao h n. Nhìn chung, s n ph m PCR c a h n h p ph n ng Y-1, Y-3* và Y-4 ẩ ơ ố ớ quy trình B, m t s s n ph m chính không xu t hi n (đ i v i cao h n rõ r t. Thêm vào đó, ệ quy h n h p Y-1 và Y-2) và xu t hi n các s n ph m ph ( h n h p Y-1 và Y-3*). K t qu ợ ụ ở ỗ ệ ỗ t đ kéo dài cao h n trong quy trình này đã trình B hoàn toàn không t ệ ộ làm gi m s nhân lên c a m t vài locus, cho dù chúng tôi đã c g ng bù đ p b ng vi c s d ng ệ ử ụ ủ ự ắ th i gian g n m i cao h n và th i gian kéo dài cao h n m t chút so v i quy trình A. ơ ắ ờ ồ ờ ơ ộ ớ

ả ứ ầ ở ộ ờ ồ ả ử ể ợ ề ẩ ả ủ ượ ư ồ ủ ỗ ứ ấ ặ ế ệ ả ờ ố ượ ẽ ồ ủ ấ ằ ng multiplex PCR (quy trình A và D) s làm tăng s l ố ả ồ ủ ứ ệ ỗ ợ ả ứ ả ượ ờ t c h n h p ph n ng trên đ u tăng lên rõ r t. c t ề c 5, A, B và D). Trong ph n ng multiplex PCR, khi mà nhi u Th i gian kéo dài (b ờ ướ c nhân lên đ ng th i, ph n đóng góp c a enzyme và các nucleotide tr thành m t nhân locus đ ủ ượ ờ đ hoàn thành quá trình i h n và c n ph i có nhi u th i gian cho s trùng h p các phân t t gi ự ầ ố ớ ạ t c các s n ph m. Hai thí nghi m sau đây đã cho th y vai trò c a th i gian kéo t ng h p c a t ờ ệ ấ ợ ủ ấ ả ổ c đ a vào h n h p dài. Trong thí nghi m th nh t, c p m i c a NST Y (Y6BaH34pr, 910bp) đ ợ ệ m i c a NST X (X-3). K t qu (hình 3b) đã cho th y r ng vi c tăng th i gian kéo dài trong ph n ả ướ ớ ng các s n ph m có kích th c l n. ẩ ứ c nhân Trong thí nghi m th hai, b n h n h p ph n ng multiplex cho m i c a NST Y đã đ ượ c tăng lên, s lên s d ng quy trình PCR C và A (hình 3a và b ng 2). Và khi th i gian kéo dài đ ố l ệ ượ ở ấ ả ỗ ượ ử ụ ng các s n ph m PCR thu đ ẩ ả ứ ề ả ợ

t đ g n m i (b Th i gian và nhi ổ ệ ệ ộ ắ ắ ổ ớ ả ế c 5, A-D; hình 1). ạ ọ ố ề ấ ặ ủ ộ c nhân lên đ c hi u ệ ở ặ t đ g n m i t ồ ừ ệ ộ ắ ế ố ớ ồ ư 0C là c n thi ầ ượ 56-60 4-6 ề ứ ồ ả ứ ệ ộ ắ 54ở ố ớ ế ả ẩ ạ ặ ộ ố ượ ụ ồ ờ ệ ẽ ặ ng t ồ Vi c thay đ i th i gian g n m i ồ ướ ờ ờ 20 giây t t t ệ i 2 phút không làm thay đ i hi u qu khuy ch đ i (không minh h a), nh ng nhi ư ệ ừ ọ đ g n m i là m t trong các thông s quan tr ng nh t. M c dù r t nhi u locus riêng bi ể t có th ệ ồ ộ ắ ấ 0C, nh ng thí nghi m c a chúng tôi đã cho th y r ng vi c h đ ạ ượ ấ ằ ệ ệ th p nhi c nhân lên đ ng th i trong h n t đ i v i các locus đ ỗ ấ ờ ượ h p ph n ng multiplex. Đi u này đã đ c ch ng minh trong hình 3, d-f. Hình này đã cho th y ấ ợ 0C đ i v i các m i có nhi t đ g n m i t nhi ợ t đ thích h p ồ ố ư ệ ộ là 600C. 0C, m c dù có th xu t hi n các s n ph m khuy ch đ i không đ c hi u (ví d : hình ể ặ ụ ệ ng tăng 3c), nh ng đi u này có th đ ệ ằ ể ượ ề ư d n các locus đ c hi u trong ph n ng multiplex và nh v y s không quan sát th y các s n ả ầ ồ ph m không đ c hi u này. T c nhân lên đ ng ặ ẩ i u trong ph n ng multiplex là 54 ả ứ ệ ấ c kh c ph c b ng vi c nhân lên đ ng th i m t s l ắ ư ậ ả ứ ấ nh v y, khi r t nhi u locus đ c hi u đ ề ự ư ậ ươ ượ ệ ệ ấ ặ

ờ ưở ả ẩ ộ ự ệ ề ả ấ Đi u này xu t phát t ấ ả ế ạ ạ ủ i s n l th i thì các locus nhân lên hi u qu h n s không nh h ng t ng các s n ph m c a ớ ả ượ ả ơ ẽ ả ệ th c t các locus có hi u qu th p. r ng ph n ng PCR có m t s cung ả ứ ừ ự ế ằ ấ c p h n ch các nucleotide và enzyme, và t ộ t c các s n ph m c nh tranh nhau trong cùng m t ẩ ả ấ ngu n cung c p này. ấ ồ

ng chu kỳ ph n ng PCR. H n h p ỗ ố ượ S l ệ ợ m i Y-3* đ ồ ố ượ t h n, kh năng là do ch t l ộ ẫ ả ấ ượ ầ ở ả ầ ỉ ề ả ả ứ ộ ố ượ ả ả ả ứ ươ ủ ố ẫ c s d ng đ nhân lên hai m u ả ứ ể ượ ử ụ ADN h gen khác nhau, d ng ph n ng sau khi tăng s l ng các chu kỳ ph n ng (hình 4a). ả ứ ừ ả ứ M t trong hai m u ADN này là khuôn t ng ng cao h n và/ho c l ặ ượ ố ơ ơ c hai m u này đã ch ra s gia tăng d n d n v s n l ADN nhi u h n. Tuy nhiên t ủ ấ ng c a t ề ả ượ ẫ ơ ự ủ ng c a ng các chu kỳ ph n ng. S dao đ ng rõ ràng nh t v s l c các s n ph m theo s l ấ ề ố ượ ự ẩ ả ng hai các s n ph m vào kho ng 25 chu kỳ (đ i v i gel nhu m ethidium bromide). Thông th ườ ộ ố ớ m i tám đ n ba m i chu kỳ là đ cho m t ph n ng; và khi tăng s chu kỳ lên 60, s n ph m ẩ ả ộ ươ thu đ ẩ ế c ít đi. ượ

3.3- T i u các thành ph n trong ph n ng multiplex ả ứ ố ư ầ

ầ ự Lúc đ u, có m t vài s thay đ i trong các thí nghi m đ ki m tra khi nào các quy trình ể ể i quy t các v n đ có th sinh ra ế ố ệ ể ả ổ ụ ề ể ấ PCR gi ng nhau đ này đòi h i ph i có s đi u ch nh các thành ph n ph n ng PCR. ỏ ộ c s d ng (ví d : hình 2c và 3a). Đ gi ượ ử ụ ự ề ả ứ ả ầ ỉ

S l ng m i (b ồ ướ ươ ừ ồ c 5, B và C) ả ứ ộ ươ ư ả ậ ể ệ ỏ ng m i đ i v i các locus “y u” và gi m l ể ắ ượ ế ng t 0.2-0.4uM m i ỗ . Ban đ u,ầ các n ng đ t ố ượ ề c đ a vào trong ph n ng multiplex PCR (hình 3c), nh ng có s khu ch đ i không đ u, ế ạ ề i u các đi u c t ượ ố ư các lo i m i khác nhau ồ ạ ng m i đ i v i các ồ ố ớ ượ m M) thay đ i đáng k gi a các locus và ể ữ ng đ ự ả ứ ấ t. Đ kh c ph c v n đ này đòi h i thay đ i t l ề ổ ỉ ệ ệ ả ồ ố ớ ộ ớ ồ ồ ổ ủ c tính toán tuỳ theo kinh nghi m. m i đ ồ ượ ư v i m t vài s n ph m khó có th quan sát th y th m chí sau khi ph n ng đ ộ ớ ẩ ki n v chu trình nhi ụ ấ ề ệ trong ph n ng, v i vi c tăng l ả ứ locus “m nh”. N ng đ cu i cùng c a các m i (0.04-0.6 ố ạ đ ượ ệ

N ng đ dNTP và MgCl c 5D)

2 (b

ồ ộ ướ

2) đ ượ ạ ơ ả ứ

ộ ể ượ c gi ồ ủ ồ ả ố ế ạ ứ ế ộ ộ ớ ượ ỗ ơ ư ấ ạ m M) cho phép khu ch đ i ph n ng PCR nh ng v i l ố ấ ế ớ ạ ng không làm vi c t ạ ả ở m ơ ư ậ ư ề ấ ấ ể ể ượ ả ỗ ệ ố m t l c chia ra và b o qu n ả ở ườ ộ ượ –20 ợ ộ ề ủ ế ạ ớ c ki m tra trong ph n ng multiplex PCR v i dNTP. Vai trò c a n ng đ dNTP đã đ ả ứ ồ nguyên (3mM), trong khi ợ m i Y-4. N ng đ Magnesium chloride (MgCl h n h p ữ ỗ ộ m M m i lo i (hình 4b). Các k t qu t t nh t 50-1200 c tăng lên t ng b c t n ng đ dNTP đ ấ ở ỗ ậ ừ ừ ượ ộ ồ m M m i dNTP, còn ờ ị ứ các n ng đ cao h n vi c khu ch đ i t c th i b c n ng đ 200 và 400 ệ ồ ở ộ ồ ả ch . N ng đ dNTP th p h n (50 ng s n ế ồ ph m ít h n. Dung d ch dNTP g c r t nh y c m v i chu trình làm nóng/làm l nh. Sau 3-5 chu ị ả ẩ t; các s n ph m tr nên trình nh v y, các ph n ng multiplex PCR th ườ ả ứ ẩ l, 10-20 h u nh hoàn toàn không quan sát th y. Đ tránh v n đ này, ng nh (2-4 ầ ỏ 0C và li tâm tr ph n ng) dNTP (25mM m i lo i) có th đ c khi ướ ạ ả ứ s d ng. ng h p khu ch đ i các locus ử ụ “Đ b n y u” này c a dNTP không quá rõ ràng trong tr ế đ n.ơ

2. Đ làm vi c m t cách có hi u qu ,

ộ ộ m M m i lo i. Đ ki m tra s nh h ả MgCl2. N ng đ Magnesium chloride yêu c u cho m t ph n ng PCR chu n là 1.5mM ầ ể ộ ả ứ ự ả ưở ỗ ẩ ủ ồ ạ ợ ế ỗ ả ứ ầ ộ ộ ầ ặ ế ấ ượ ế ớ ở ồ ng c a magnesium n ng đ dNTP vào kho ng 200 ể ồ ở chloride, m t ph n ng multiplex PCR (h n h p Y-3) đ c ti n hành, duy trì n ng đ dNTP ộ ượ 200m M và d n d n tăng n ng đ magnesium chloride t ế 1.8 đ n 10.8mM (hình 4c). Vi c khu ch ệ ừ ồ c có đ i tr nên đ c hi u h n (các băng không đ c hi u đã bi n m t), và các s n ph m thu đ ẩ ệ ả ặ ơ ạ ở đ t p trung cao (t ẩ 2, các s n ph m ộ ậ ả ạ ồ tr nên khó có th quan sát th y, nh th ph n ng đã b c ch (không minh h a). ể ở ệ i n ng đ 10.8mM). Trong ph n ng PCR v i 20mM MgCl ả ứ ọ ư ể ả ứ ộ ấ ị ứ ế

2 khác nhau cho th y n ng đ 200

ằ ể ệ ệ ự S cân b ng dNTP/MgCl ự ả ệ ồ ờ ườ ộ ồ ng dNTP và MgCl ng cho ph n ng 1.5-2mM, và 800 h i ph i có magnesium t ỏ lý do vi c gia tăng n ng đ dNTP (hình 4b) có th c ch t c th i ph n ng PCR, ng vi c tăng n ng đ magnesium th ệ l ượ MgCl2 t ạ 2. Ng i thi u 6-7mM MgCl ả Taq ADN polymerase đòi do (ngoài magnesium b k t h p v i dNTP và ADN) [9]. Đây có th là ể ớ ượ ạ i c l ế ứ ộ ả ứ i hi u qu rõ r t (hình 4c). B ng vi c k t h p các ệ ả ằ ệ ế ợ m M m i lo i dNTP phù h p v i n ng đ ộ ớ ồ ỗ ợ ả ứ ướ c ng mang l ạ ồ ấ m M dNTP đòi h i t ỏ ố ộ ị ế ợ ể ứ ệ ộ ể ưỡ ừ

2 khi 200m M dNTP đ

2 này.

c s d ng, cùng v i vi c khuy ch đ i PCR ả ượ ử ụ ệ ế ạ ớ ch ng kho ng 1mM MgCl i n ng đ MgCl gi m xu ng d ộ ướ ồ ừ ả ố

N ng đ đ m PCR (KCl). So sánh các lo i đ m PCR (b c 5, B-D). ạ ệ ộ ệ ồ ướ

N ng đ KCl ho c đ m PCR ớ ộ ồ ệ ộ ệ i 2x (ho c n ng đ KCl t ồ . Vi c tăng n ng đ đ m t ồ ặ ộ ặ ệ ệ ả ơ ọ ở ể ấ ặ ụ ợ ữ ượ ẩ ấ ạ ế ế ả ẩ ộ ữ ữ ặ ả ộ ố ồ ả ồ các n ng đ mu i cao h n thì không đ ớ i ệ 100mM) đã làm tăng hi u qu ph n ng multiplex PCR (hình 4d và hình 3, d-f), hi u qu này ả ứ ả c ki m tra (DMSO, đang tr nên quan tr ng h n vi c s d ng b t kỳ các hoá ch t ph tr đã đ ệ ử ụ ng, các c p m i khu ch đ i nh ng s n ph m dài làm vi c t t glycerol ho c BSA). Thông th ệ ố ặ ồ ả ườ c l ắ i nh ng c p m i khu ch đ i các s n ph m ng n h n đi u ki n n ng đ mu i th p, ng ồ ấ ượ ạ ồ ạ ố ệ ơ ở ề ng g p khó khăn h n t h n làm vi c t ơ n ng đ mu i cao, n i mà nh ng s n ph m dài th ặ ẩ ườ ơ ệ ố ơ ở ồ t đ nóng ch y hình 4d). Ví d , c p m i sY94 (nhi trong vi c bi n tính (so sánh 0.4x v i 2.8x ả ệ ộ ụ ặ ế ệ ớ ở 0C) và c p m i sY151 (nhi 580C) đ t đ nóng ch y c c p m i sY88 (nhi ả t đ nóng ch y 58 ệ ộ ượ ặ ồ ặ ệ ộ 520C) h tr ộ ệ c. N ng đ đ m đ m 0.8x nh ng ồ ượ ố ư ỗ ợ ở ệ ộ ồ ở thích h p có th giúp đ kh c ph c các nhân t c s n ph m, thành ph n GC...) khác (kích th ầ ụ ỡ ể ợ ơ ướ ả ắ ẩ ố

. Chúng tôi đã ti n hành so sánh m t lo i đ m PCR đã đ ộ ế ạ ệ ớ ộ ọ ơ ả c đây [6], ớ ượ ứ ạ ứ ệ

ạ ố ỗ ượ ử ụ ượ ớ ồ ể ệ ồ ợ ườ ỗ t h n đ m “DMD” (s n ph m thu đ ượ ả ứ ơ ẫ ệ ơ ở ồ ề ộ ủ Taq ADN polymerase cao h n ạ ệ ng KCl c b n (lo i đ m đòi h i r t ít dNTP) có th có ích trong tr ỏ ấ ơ ả ườ ể c ượ So sánh các lo i đ m PCR ạ ệ ấ c g i là “DMD” cho m c đích c a bài báo này, v i đ ph c t p th p đ tr mô t ụ ủ ượ ả ướ nh t, đ m v i l ng KCl c b n trong ph n ng multiplex. Đ m “DMD” 5x ch a 83mM ả ứ ệ ấ (NH4)2SO4, 335mM Tris-HCl (pH 8.8), 33.5mM MgCl2, 50mM b -mercaptoethanol, 850ug/ml BSA c s d ng v i n ng đ cu i cùng 1x cùng v i 10% DMSO và 1.5mM m i lo i dNTP [1, và đ ộ ớ ứ c ki m tra v i c p m i nhân lên đo n gen DMD (h n h p X-1) đ m PCR ch a 2, 4]. Khi đ ớ ặ ạ c nhi u KCl thông th ề ng v i n ng đ 1.6x làm vi c t ớ ồ ả ẩ ượ ệ ố ơ ệ ộ i b nh đ i trên hàng tá m u ADN ng c l p l h n) (hình 4e). Các k t qu đã đ c ki m tra. ế ơ ể ườ ệ ượ ặ ạ i u hoá. Ngoài ra, Đ m ch a KCl c b n ít ph c t p và d dàng h n trong vi c đi u ch nh và t ố ư ỉ ễ ứ ạ ơ ả ệ ệ ử ụ khi đ chính xác c a n ng đ dNTP th p [9], vi c s d ng ấ ộ đ mệ ch a l ng h p các ợ ứ ượ s n ph m PCR c n ph i có các phân tích thêm v đ t bi n. ả ề ộ ế ẩ ầ ả

L ng ADN khuôn và Taq ADN polymerase (b ượ m ả c 5, A và D). ướ ấ ợ ủ l ph n ng, h n h p Y-3* cho th y không có s khác bi ệ ả ứ i 30ng, s n l ố ả ẫ ả ạ ặ ấ ỗ ng c a m t vài s n ph m PCR b gi m xu ng. Khi l ả ượ ệ t đ g n m i, đôi khi xu ng t l ở ượ ự ị ả ệ 10-12 ng ADN khuôn vào t đáng k nào kho ng 30 và 500ng/25 ể ượ (hình 4f); tuy nhiên, d ng ộ ướ ADN khuôn r t nh (tính b ng pg), vi c khuy ch đ i đ c hi u và có hi u qu v n có th thu ể ế ỏ 0C (không minh h a)ọ c b ng cách h th p h n n a nhi đ ạ ấ ượ ằ ằ ơ ữ ệ ộ ắ ẩ ệ ố ừ ồ

ộ Taq ADN polymerase khác nhau (Perkin-Elmer) đ ử ụ ể ượ ấ ệ ả ả ộ ư ồ ề ả ứ ẽ ở ồ ộ ệ ế ạ ộ ự ồ m c ti n hành th nghi m nh nhau trong h n h p Y-4 v i 1.6x đ m PCR, s d ng 2U/25 ằ ạ Taq ADN polymerase t ư năm ngu n khác nhau, ừ ệ nhiên, t ớ ử ụ ệ ỗ ợ c ki m tra s d ng h n ỗ Các n ng đ ồ ặ h pợ m i Y-3 (hình 5a). D ng nh n ng đ enzyme hi u qu nh t vào kho ng 0.4ul ho c ườ ồ 2U/25m b i vì n ng đ glycerol cao trong dung d ch l th tích ph n ng. Quá nhi u enzyme, có l ị ể i vi c khuy ch đ i không cân b ng các locus khác nhau và s gia tăng m t chút các g c đã d n t ẫ ớ ố ự đã ng xung quanh. Năm lo i nh h ưở ả l đ ử ế ượ ph n ng (hình 5b). ả ứ

Nhi u tác gi ả ề ấ ử ụ S d ng các hoá ch t ph tr : DMSO, glycerol, BSA (b ụ ợ ạ ế ể c 5E). ẩ ượ ả ướ ả ả ứ ủ ệ ộ ặ ớ ồ ệ ể ể i mang đ n các k t qu trái ng ữ ế ạ ấ ả ả ế ả ả ộ ế ẩ m t vài locus thì hoàn toàn không có tác d ng (hình 5c). Các k t qu ở ộ ụ ng t ư ậ ượ ự ự c ki m tra trong t ng tr ườ ừ ể tr ả ướ ợ ệ ộ ứ ấ ơ đã g i ý ợ ơ s d ng DMSO và glycerol đ nâng cao hi u qu khuy ch đ i (s n ph m thu đ c nhi u h n) ả ề ệ ử ụ ượ ử và c tính đ c hi u (không có s n ph m không đ c hi u) c a ph n ng PCR, khi chúng đ c s ẩ ặ ả ả d ng v i n ng đ thay đ i trong kho ng 5%-10% (th tích/th tích) [9]. Tuy nhiên, trong ph n ả ụ ổ c. Ví d , 5% ng multiplex PCR, nh ng hoá ch t ph tr này l ứ ụ ượ ụ ợ ả ng các s n DMSO nâng cao kh năng khuy ch đ i c a m t vài s n ph m và làm gi m đi s l ố ượ ạ ủ ả ph m khác, trong khi ế ẩ t c khi dùng v i glycerol 5% (không minh h a). Nh v y, s ích ớ ư ậ ọ ươ ng h p c th . BSA, l i c a các hoá ch t ph tr này c n ph i đ ụ ể ả ượ ợ ủ c đây) đã làm tăng hi u qu c a ph n v i n ng đ lên t ả ả ủ ớ ớ ồ ọ ng PCR lên r t nhi u l n h n c DMSO l n glycerol. BSA không có tác đ ng c ch lên m i ứ ế ộ ẫ locus đ nh v y cũng thu đ ầ ụ ợ ấ i 0.8ug/ul (cao h n so v i mô t ơ ớ ả ề ầ c nhân lên (không minh h a). ọ ượ

3.4- Gel Agarose và Gel Polyacrylamide

30-40bp có th đ c phân tách d ả ể ượ ẩ multiplex PCR khác nhau t Agarose. Các s n ph m ừ ặ ườ ể ộ ắ ế ấ ư ệ ủ t, nh t là đ i v i các s n ph m có kích th ễ ệ ng s d ng nh SeaKem ho c NuSieve (FMC BioProducts). Vi c dàng trên gel agarose 3% th ử ụ phân tách qua đêm các s n ph m hi u đi n th th p làm gi m đáng k đ s c nét c a các ả ẩ ở ệ c nh h n 400-500bp. băng PCR riêng bi ố ớ ả ấ ỏ ơ ướ ệ ả ẩ

Gel Polyacrylamide (PAA). Đ phân tách các s n ph m PCR ch khác nhau vài bp (ví d ả ể ẩ ỉ ỏ ệ ấ ố ố ớ ạ ấ ượ ạ bào lai, m i lo i mang m t b n sao chép t ộ ả ừ ừ NST 12 ế ạ ệ ấ ọ ỗ ấ 6% PAA/7M urea thông th ẩ ụ ế các marker microsatellite), đòi h i có gel PAA 6%-10%. Trong khi các lo i gel PAA không bi n ạ xu t hi n khi các t đ i v i các locus không có đa hình, thì các băng l tính làm vi c r t t ệ c phân tách trên các gel d ng này. Ví d , trong phân tích m t vài locus đa hình microsatellite đ ộ ụ ở đ c hi u trên NST 12 t ặ ệ c ki m tra th y xu t hi n 2 băng trên gel PAA không bi n tính (ví i, đ i v i m i locus đ ng ố ớ ườ ượ c d : hình 5d). Trên gel gi ả ụ đánh d u phóng x đã ch ra m t alen trên m i locus (so sánh các s n ph m ỉ ng, các s n ph m PCR đ ả ườ hình 5, d và e). ẩ ở ả hai kh i t ố ế ể ượ i trình t ự ộ ấ ạ ỗ

ộ ể ư ậ ụ ề ệ i u ph n ng multiplex PCR. Vi c k t h p t ỗ ệ Nh v y, chúng tôi đã trình bày ằ ọ ầ ế ả ứ ồ t đ g n m i và n ng đ KCl (mu i) là c n thi ộ ồ ặ ạ ố ệ c đ nh cho ố ư ồ ế ớ ượ ế ợ ố ư t trong m i ph n ng PCR đ thu đ ả ứ ộ ng dNTP, và các giá tr này có th đ ể ượ ị

ộ trên d ữ ố ị ộ ề c gi ể ơ ư ọ ườ ả ứ ệ ề ồ t. Hình 1 đã ch ra m t ph ươ ế ộ ợ ỉ khác nhau nh h ồ ầ ầ c đ c p ề ậ ở ượ ệ ặ ấ ầ ộ c hoàn thành t ố ệ ố ư ượ ươ ng pháp c b n đ ti p c n, gi ộ ồ ể ể ng t ớ ưở ả i u các thông s đ ố ượ ế ể ế ậ ả ố ầ ấ m t ph ộ ủ ươ ơ ả ả ứ ng trong ph n ng multiplex PCR. m t chu i các ví d v vi c ki m tra các thông s khác ố ố ồ i u hai trong các thông s g m nhau nh m t c các nhi ể ượ ệ ộ ắ t đ làm s n ph m khuy ch đ i có tính đ c hi u cao. N ng đ Magnesium chloride ch c n thi ỉ ầ ế ể ẩ ả m i ph n ng. M c ặ cân b ng v i l ả ứ ọ ằ ố dù, vi c tăng d n d n n ng đ magnesium chloride có th tác đ ng vào ph n ng, hai thông s ả ứ ệ ả ng nh quan tr ng h n nhi u trong vi c nhân lên các s n còn l i đã đ ệ ạ ph m PCR đ c hi u. Trong ph n ng multiplex PCR, vi c đi u ch nh n ng đ m i phù h p cho ợ ỉ ẩ ả ứ ng pháp h p lý đ phát tri n các ph n ng t ng locus là r t c n thi ừ i ph n ng multiplex PCR m t cách có hi u qu . Danh sách các nhân t ả ứ ệ c trình bày này đã đ ng đ i đ y đ . Tuy nhiên, vi c t trong nghiên c u này đã cung c p ộ ố ấ i quy t m t s v n đ thông th ề ả ứ ườ

B ng 1 . Danh sách các m i đ ả ồ ượ ử ụ c s d ng trong ph n ng multiplex PCR ả ứ

cướ cướ cướ Kích th (bp) Tên (locus) Tên (locus) Tên (locus) Kích th (bp) Tên (locus) Kích th (bp) Kích cướ th (bp)

Y-1 Y-2 Y-3 Y-4

326 311 320 472

sY84 DYS273 sY 143 DYS231 sY86 DYS148 sY14 SRY

301 285 301 303

262 209 264 274

218 125 226 233

183 100 166 132

150 sY157 DYS240 sY81 DYS271 sY182 KALY sY147 DYS232 139 sY95 DYS280 sY127 DYS218 sY109 DYF43S1 sY149 DYS1

123 104

sY134 DYS224 sY117 DS209 sY102 DYS198 sY151 KALY sY94 DYS279 sY88 DYS276 DMD Kích th Tên Kích th sY105 DYS201 sY82 DYS272 Y6HP35 DYS274 Y6PHc54 n.a. sY153 DYS237 sY97 DYS281 cướ cướ DMD exon Kích th cướ

cướ cướ cướ Kích th (bp) Tên (locus) Tên (locus) Tên (locus) Kích th (bp) Tên (locus) Kích th (bp) Kích cướ th (bp)

(bp) (bp) (locus) (bp) Số

exon Số

X-1 X-3 12-1

547 PM 535 317-341 S 45ố

PM 535 410 271-291 S 3ố

459 271 243-253 S 19ố S 50ố

416 202 228-238 S 17ố S 6ố

388 139 183-201 S 51ố S 60ố

360 165-181 S 8ố

331 142-168 S 12ố

268 105-125 S 44ố

AFM263zd1 D12S332 AFM205ve5 D12S93 AFM205xg3 D12S310 AFM211wb6 D12S98 AFM206ze5 D12S94 AFM299zd5 D12S349 AFM135xe3 D12S87 AFM122xf6 D12S85

ị ỉ PM = khu v c promoter ự n.a. = locus không ch đ nh;

B ng 2 t/Các quy trình PCR ả . Các đi u ki n chu trình nhi ệ ề ệ

Quy trình A Quy trình B Quy trình C

ề ế ắ

940C, 4 phút 940C, 30 giây 54-560C, 30 giây* 650C, 1 phút 32 chu kỳ 650C, 3 phút 940C, 4 phút 940C, 30 giây 540C, 1 phút 720C, 1 phút, 20 giây 32 chu kỳ 720C, 3 phút 940C, 4 phút 940C, 30 giây 540C, 45 giây 650C, 2 phút 32 chu kỳ 650C, 3 phút ỉ

Quy trình D Quy trình E Quy trình F

ề ế ắ

Ti n bi n tính ế Bi n tính G n m i ồ Kéo dài Hoàn ch nh Ti n bi n tính ế Bi n tính G n m i ồ Kéo dài Hoàn ch nh 940C, 4 phút 940C, 30 giây 550C, 30 giây 650C, 4 phút 32 chu kỳ 650C, 3 phút 940C, 4 phút 940C, 30 giây 540C, 45 giây 650C, 2 phút 45 chu kỳ 650C, 5 phút không 940C, 30-45 giây 56-580C, 45 giây 680C, 2 phút, 30 giây 35 chu kỳ không ỉ

Quy trình A Quy trình B Quy trình C

Ph n bôi đ m ch ra nh ng thay đ i quan tr ng nh t khi so sánh các quy trình ữ ầ ậ ấ ọ ổ ỉ

c s d ng v i 2 nhi t đ g n m i khác nhau (xem ph n K t qu và ượ ử ụ ớ ệ ộ ắ ế ầ ả ồ * Quy trình A đ Th o lu n) ậ ả

Hình 2.

Ph n bôi đ m ch ra nh ng thay đ i quan tr ng nh t khi so sánh các quy trình ữ ấ ầ ậ ổ ọ ỉ

* Quy trình A đ c s d ng v i 2 nhi t đ g n m i khác nhau (xem ph n K t qu và Th o lu n) ượ ử ụ ớ ệ ộ ắ ế ả ậ ầ ả ồ

ế ả ứ ử ụ c s p x p theo th t ả ừ ẩ ơ ượ ắ ế ầ

ề ả ẩ ẩ ả ấ ệ a- Ph n ng PCR t ng locus đ n. Khu ch đ i các locus sY s d ng 1x đ m PCR và quy trình A. ệ ạ Trên gel, các s n ph m đ tăng d n các locus sY (1=sY14, 2=sY81, 3=sY82, ứ ự 4=sY84, 5=sY86, 6=sY88, 7=sY94, 8=sY95, 9=sY97, 10=sY102, 11=sY105, 12=sY109, 13=sY117, 14=sY127, 15=sY134, 16=sY143, 17=sY147, 18=sY149, 19=sY151, 20=sY153, 21=sY157 và ặ c hoàn h o, và không có s n ph m không đ c 22=sY182). T t c các s n ph m đ u có kích th ướ ấ ả ẩ ả hi u. Trên t c đánh d u là các marker chu n (1-kb; Life t c các gel, các băng không đ ượ ả ấ Technologies).

ố ư ả ứ ả ứ ỗ ồ ợ ớ

ứ ệ ỗ ồ b- T i u hoá các ph n ng multiplex. Ph n ng multiplex PCR v i các h n h p m i Y-1 (sY84, sY134, sY117, sY102, sY151, sY94 và sY88), Y-2 (sY143, sY157, sY81, sY182 và sY147), Y-3 (sY86, sY105, sY82, Y6HP35, Y6Phc54, sY153 và sY97), Y-4 (sY14, sY95, sY127, sY109, và sY149) trong đ m PCR 1.6x (quy trình E). Y-3* là h n h p Y-3 không ch a m i Y6HP35 và Y6Phc54. Các mũi tên ch các s n ph m khuy ch đ i hoàn h o. ả ợ ả ế ẩ ạ ỉ

c- Nhi t đ kéo dài. Ph n ng multiplex PCR v i các h n h p Y-1 t ớ ợ ớ ỗ 4 băng đ u tiên (nhi ầ ấ ở ả ứ ẩ ả t đ kéo dài 72 ệ ộ ệ ộ ả ạ ề ấ i Y-4 và quy trình A và B (b ng ả 0C). ở 4 t đ kéo dài 65 ẩ không đ cặ t c các ấ ả Y-1, Y-2 và các s n ph m ẩ ệ ở ấ ả nh, quá trình đi n di theo h trên xu ng d ng t i. ệ ộ 2). T t c các s n ph m khuy ch đ i đ u nhìn th y ấ ả băng cu i (nhi ố ề hi u Y-1 và Y-3*. T t c các marker s d ng trong nh là thang chu n 1-kb. Trong t ả ế 0C), xu t hi n nhi u băng l i ỗ ở ệ ử ụ ả ố ướ ướ ừ ệ

Hình 3

a. Th i gian kéo dài. Các h n h p ph n ng multiplex PCR Y-1 t i Y-4, so sánh ờ ả ứ ở t đ g n m i 54 ờ ớ ệ ộ ắ ợ ờ ồ 2 quy trình C 0C). Khi so sánh các th i gian kéo dài 2 phút. M t s băng không c t t h n ượ ố ơ ở ờ ộ ố ả ỗ (th i gian kéo dài 2 phút) và A (th i gian kéo dài 1 phút, nhi băng ta th y r ng các s n ph m thu đ ẩ đ c hi u xu t hi n y u, có kh năng là do n ng đ đ m th p (1x). ả ặ ấ ằ ấ ộ ệ ệ ệ ế ấ ồ

ờ ồ ế ạ ồ b. Th i gian kéo dài. Ph n ng multiplex PCR v i h n h p ả ứ ẩ ố ợ m i X-3 (m i khuy ch đ i các exon mũi tên phía trên). Nh ngữ th i gian kéo dài ng n (1 phút, quy trình A). gen DMD s PM, 3, 50, 6, 60) và c p m i Y6BaH34 (s n ph m 910bp, ặ ồ c nhân lên m i khuy ch đ i các s n ph m ng n đ ắ ượ ớ ỗ ả ở ờ ế ạ ả ẩ ồ ắ

c. H n h p m i có n ng đ t ng đ ợ ỗ ồ ươ ỗ ồ c s p x p trên gel theo kích th ớ ượ ắ ẩ c. Khi m t l ộ ươ ử ụ ẩ ệ ả ả ộ ằ ng. Ph n ng PCR v i các c p m i riêng trong h n h p ợ ặ ồ ướ 12-1 (phân chia và tr n l n), s d ng quy trình F. S n ph m đ c ế ộ ẫ ộ ượ ng t có đ nét và d dàng phân bi gi m d n c a chúng. Các s n ph m riêng bi ễ ầ ủ cân b ng các m i đ ộ ố ả c tr n trong cùng m t ph n ng multiplex PCR (băng đ u tiên), m t s s n ộ ph m không đu c nhân lên hi u qu nh ng các s n ph m không đ c hi u đã bi n m t. ả ứ ả ộ ả ứ ả t đ ệ ượ ầ ế ồ ượ ợ ả ư ệ ệ ẩ ặ ẩ ấ

ợ ế ộ ệ ạ ỗ ố ượ ỗ ệ ồ ặ ồ ợ ệ ộ ắ ỗ t đ g n m i, n ng đ đ m và s l ồ ồ ề ử ụ ệ ộ ắ d. (d, e, f) Nhi ầ ặ ặ ả ứ ỗ ệ ệ ả ệ ẩ ằ ỉ ỗ ợ ả ẩ ủ ả ứ ậ ả ẩ ả ồ ữ ấ ỗ ồ ỏ ệ ẩ ầ ấ ẩ ỉ ặ ộ ả ỗ ặ ố ả ẩ ộ ố ả ổ ụ ủ ầ ỗ 48 ả ứ ẩ ệ ệ ặ ấ ỗ ở ế ề ỗ ớ ẩ ượ ạ ợ ỗ ợ ng các locus đ ượ ệ ẩ ỉ ể ả ằ ưở ủ ặ ồ ộ ệ ệ ặ ẩ ơ ệ ằ ặ ướ ấ ướ ệ ệ ộ ồ ặ ớ c lo i b b ng cách thay đ i t ả ử ụ ồ ể ặ ẩ ng các m i. Khuy ch đ i h n h p Y-3* (3 băng đ u tiên trên m i gel), c p m i sY153 (băng 4-6) và h n h p Y-3 (băng 7-12 trong đ m PCR ồ 1x ho c 2x) trên 3 ADN khuôn khác nhau s d ng 3 quy trình PCR khác nhau v nhi t đ g n m i 0C). Băng 1-9 trên m i gel là các ph n ng trong đ m PCR 1x. Băng 10-12 trên (480C, 540C ho c 59 ỗ ộ m i gel là các ph n ng trong đ m PCR 2x. Băng 7-12 trên m i gel (c đ m PCR 1x và 2x) là b Các mũi tên n m ngang m i Y-3. Băng t n cùng trong hình 3, d và f là marker (thang chu n 1kb). ặ nh ch nh ng s n ph m hoàn h o c a h n h p Y-3* (năm s n ph m) bao g m s n ph m đ c ả hi u dài nh t trên gel. Mũi tên chéo (hình 3e) cho th y m t s n ph m không đ c hi u. Các đ u mũi ệ ớ c mong đ i trong h n h p Y-3 (t ng s 7 s n ph m) so v i tên đen đ c ch ra thêm 2 s n ph m đ ả ợ ợ ượ ẩ i (ví d , hình 3e, băng đ u tiên). Y-3*. Các đ u mũi tên r ng ch ra v trí c a m t s s n ph m l ị ỉ ầ 0C, r t nhi u băng không đ c hi u xu t hi n. Trong đ m PCR 1x, s n ả V i ph n ng multiplex ệ ấ c khuy ch đ i trong h n h p Y-3* (5 c p m i) m nh h n trong h n h p Y-3 (7 ph m sY153 đ ơ ồ ặ ạ c nhân c p m i), đi u này ch ra r ng ít ra trong m t s s n ph m, vi c tăng s l ề ộ ố ả ố ượ ồ ặ ng c a m t vài locus đ c hi u. Vi c tăng n ng đ đ m i s n l ng t lên đ ng th i có th nh h ộ ệ ồ ờ ệ ớ ả ượ i 2x cho phép khuy ch đ i cân b ng h n nhi u s n ph m đ c hi u và giúp làm gi m PCR t ả 1x t ề ả ạ ế ớ ừ c dài (so sánh các băng 7-9 và 10- đ t p trung cho r t nhi u s n ph m không đ c hi u có kích th ẩ ề ả ộ ậ c kho ng 470-480bp (mũi tên đen đ c) đã 12). Trong đ m 2x, băng không đ c hi u có kích th ặ ả các n ng đ m i khác nhau trong ph n ng (so sánh v i Y-3, đ l ả ứ ổ ỷ ệ ượ 0C, s n ph m sY153 ch có th quan sát th y khi s d ng đ m 2x ho c khi locus này hình 2b). ệ ấ ỉ đ ượ ạ ỏ ằ 59ở ế c khuy ch đ i m t mình. ạ ộ

Hình 4.

ố ạ ớ ử ụ ệ ế ợ ồ ỗ PCR 1.4x cùng v i vi c tăng d n s chu kỳ lên t ng đ n v là 3 chu kỳ. a- S chu kỳ. Vi c khuy ch đ i v i 2 khuôn ADN khác nhau s d ng h n h p m i Y-3* trong đ m ệ ừ ầ ố ệ ớ ơ ị

2 đ

2) và tăng ở ệ nguyên không đ i, vi c tăng thêm ổ

ộ ồ ả ứ ử ụ ệ ỗ ợ b- N ng đ dNTP. Ph n ng PCR s d ng h n h p Y-4 trong đ m PCR 2x (3mM MgCl ả ế ấ ạ ộ 200-400uM. Khi n ng đ MgCl c gi ệ ữ ượ ệ ộ ồ d n n ng đ dNTP (50, 100, 200, 400, 600 và 1200uM). Vi c khuy ch đ i hi u qu nh t là ầ ồ n ng đ dNTP t ừ ộ ồ n ng đ dNTP s c ch ph n ng. ẽ ứ ộ ồ ả ứ ế

2. Ph n ng multiplex PCR đ ồ

c- N ng đ MgCl ồ ả ứ ượ ự ớ ỗ ệ ồ ợ 1.4x, s d ng quy trình E và tăng d n d n n ng đ MgCl ệ 2. ầ ầ c th c hi n v i h n h p m i Y-3 trong đ m PCR ộ ộ ử ụ

ồ ộ ệ ạ ủ ỗ ế ẩ ố ợ ồ c khuy ch đ i đ c hi u h n, ng ệ ẩ ắ ả ợ ơ ả ử ụ ả ầ ế ố ớ ỗ ầ ạ ặ ợ c l ượ ạ ộ ệ ả ẩ ầ ả ồ ồ d- N ng đ đ m PCR. Các s n ph m khuy ch đ i c a h n h p X-1 (các exon gen DMD s 45, PM, ẽ 19, 17, 51, 8, 12, 44 và 4) s d ng các n ng đ đ m PCR tăng d n và quy trình E. Khi tính ch t ch ộ ệ ặ i, đ t p trong h n h p gi m đi, các s n ph m ng n đ ộ ậ ỗ ựơ trung c a các s n ph m dài d n d n gi m xu ng. Đ i v i h n h p m i riêng, n ng đ đ m t ố ư i u ố ủ là 1.2x-1.6x.

ệ ả ứ ệ ợ ỗ l ỷ ệ ứ các thành ph n s d ng nh nhau (ADN, ố ớ ủ ư ể e- So sánh các đ m PCR. So sánh ph n ng multiplex PCR c a h n h p X-1 trong đ m DMD và Taq ADN polymerase, ng s n ph m tăng lên khi ẩ ả c đ a vào gel và c trình bày, m c d u có nhi u m u đ c ki m tra, l ượ ề ượ ặ ầ ẫ ượ ư ọ ượ c quan sát th y. ng t đ m PCR 1.6x ch a KCl, t ầ ử ụ ệ n ng đ m i) và quy trình E. Đ i v i m i m u ADN đ ẫ ồ s d ng đ m PCR 1.6x. Ch có 4 băng đ ỉ ử ụ các k t qu t ế ộ ồ ệ ả ươ ự cũng đã đ ượ ấ

ng ADN khuôn. Các l ng ADN khuôn khác nhau đ ượ ạ ớ ượ ế ồ ự ể c khuy ch đ i v i m i sY153 và h n ỗ ệ t ế ượ ng ượ ả ứ ộ ố ệ ử ụ ể ế ở ơ f- L h p Y-3* trong đ m PCR 2x v i quy trình E. Th tích ph n ng là 25ul. Không có s khác bi ớ ợ đáng k nào khi s d ng 500 ho c 30ng ADN; tuy nhiên, m t s băng tr nên y u h n n u l ặ ADN khuôn ti p t c gi m xu ng t i 0.5ng/25ul ph n ng. ế ụ ả ứ ả ố ớ

Hình 5.

a. L ng enzyme. Các s n ph m khuy ch đ i c a h n h p Y-3* đ ượ ượ ế ả ỗ ợ ị ế ẩ ử ụ c trình bày sau khi s d ng ạ ủ 0.5, 1, 2, 4 và 8U/25ul ph n ng. Các mũi tên ch ra các v trí c a các s n ph m khuy ch đ i hoàn ạ ả ỉ h o. N ng đ enzyme phù h p nh t vào kho ng 1-2U/25ul ph n ng. ấ ả ẩ ả ứ ợ ủ ả ứ ả ồ ộ

b. Ngu n enzyme. Ph n ng multiplex PCR c a h n h p Y-4 trong đ m PCR 1.6x s d ng ủ ệ ợ băng 4 đ ả ứ ồ 5 ngu n. Băng 4* ch ra các s n ph m thu đ ỉ ả Taq ử ụ ượ ử ụ c s d ng ỗ ẩ ồ polymerase t ừ trong đ m cung c p b i ng i bán. M t s n ph m không đ c hi u xu t hi n. ệ ấ ở ườ ộ ả ẩ ượ ặ c khi enzyme ở ệ ệ ấ

ấ ụ ợ ỗ ợ ử ụ ệ ủ ử ụ ệ ả ứ ệ ớ h n h p Y-1 ợ ử ụ ơ ạ ỗ ứ ế ồ ặ c. S d ng các hoá ch t ph tr . Ph n ng multiplex PCR so sánh s d ng các h n h p m i đ c hi u c a NST Y v i 5% DMSO (kí hi u D) và không có DMSO, trong đ m 1x. Các locus sY151 và D (các mũi tên chéo) m nh h n khi không s d ng DMSO. Tuy nhiên DMSO sY88 t ừ ỗ h tr vi c khuy ch đ i locus sY81 trong h n h p Y-2 (các mũi tên đ ng) và locus sY95 trong h n ỗ ợ ạ ỗ ợ ệ h p Y-4. ợ

ế hai dòng t ệ ượ ng ạ ứ ế bào chu t-ng ế ủ ạ ở ỉ ư ặ ầ ườ ộ ạ ẩ ế ẩ ợ ỗ ỗ ả ạ ớ ả ả ả ậ ơ ạ ươ ự ẫ ẩ i v n còn t n t ồ ạ ở ợ ạ ủ ỗ ồ m t bên trái c a Pan-el e) trên hai khuôn ADN khác nhau. d. Phân tách trên gel PAA không bi n tính. Ph n ng PCR khuy ch đ i đ ng th i các locus D12S93 ờ ả ứ ạ ồ i. GM 10868 (A) và c tién hành trên ADN h gen t và D12S349 đ ườ ừ ộ i, và d ng k t h p GM 12072 (B), m i lo i ch a m t b n sao chép khác nhau c a NST 12 ế ợ ộ ả ỗ ụ c a chúng (A+B). M c d u trong băng A và B, m i locus nên ch đ a ra m t d ng allen (ví d : 1 ủ băng), trên gel polyacrylamide không bi n tính, m i s n ph m trong 2 s n ph m mong đ i (các mũi c ch y cùng v i s n ph m khác cái mà ch y ch m h n trên b n gel này (các băng chéo). tên) đ ượ băng A+B. Các băng đánh s 1 và 2 ch ra s phân chia các M t d ng t ỉ ộ ạ ự ố ng các locus này s n ph m khuy ch đ i c a h n h p 12-1 (bao g m 8 locus đa hình D12S, s l ố ượ ẩ ả c ch ra đ ỉ ượ ng t ế ở ặ ủ

i trình t e. Các gel PAA bi n tính. Phân tách gel gi nh ả ế ự ủ ạ ươ ế ả ứ c a các s n ph m khuy ch đ i t ẩ ế ng t ự ơ ủ ạ ả ự ỉ ạ ồ ự ế ươ ứ ỗ ỗ ợ ồ ỉ ng ng (D12S93 và D12S349). Băng A+B ch ra s khuy ch đ i đ ng th i c a c i m i locus. Băng 1 và 2 ch ra các k t qu s d ng h n h p m i 12-1 trên hai ADN h ả ử ụ ệ ở ộ ớ ự ế ả ỉ dòng t ế ế c s khuy ch đ i đ ng h p trên t c ki m tra. Các s t c các locus đ ỉ ế c phát hi n ượ ồ ợ ợ ấ ả ượ ế ể c ki m tra./. ư trong hình 4e, sau ph n ng PCR “nóng”. Băng A và B ch ra s khuy ch đ i các allen đ n c a các ờ ủ ả locus đa hình t ệ hai allen t m t vài locus. Băng 3 ch ra các k t qu sau gen ng ườ bào lai GM khi ph n ng multiplex PCR v i h n h p m i 12-1 ti n hành trên ADN t ừ ả ứ 10868 thu đ bên trái ố ở ượ ự hình này ch các locus D12S đ ỉ ạ i khác nhau, v i s đa hình đ ớ ỗ ạ ồ ể ượ

Tài li u tham kh o ệ ả

1. Abbs, S. and M. Bobrow. 1992. Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin gene. J. Med. Genet. 29:191-196. 2. Anonymous. 1992. Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction. A multicenter study. JAMA 267:2609-2615.

3. Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Struhl. 1994. The polymerase chain reaction, p. 15.1.1.-15.1.4. In K. Janssen (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2. Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York. 4. Beggs, A.H., M. Koenig, F.M. Boyce and L.M. Kunkel. 1990. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum. Genet. 86:45-48.

5. Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E. Ranier and C.T. Caskey. 1990. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy, p. 272-281. InM.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (Eds.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego. 6. Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E. Ranier, P.N. Nguyen and C.T. Caskey. 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16:11141- 11156. 7. Crisan, D.1994. Molecular diagnostic testing for determination of myeloid lineage in acute leukemias. Ann. Clin. Lab. Sci. 24:355-363.

8. Henegariu, O., P. Hirschmann, K. Kilian, S. Kirsch, C. Lengauer, R. Maiwald, K. Mielke and P. Vogt.1994. Rapid screening of the Y chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis. Andrologia 26:97-106.

9. Innis, M.A. and D.H. Gelfand. 1990. Optimization of PCRs, p 3-13. InM.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White (Eds.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego.

10. Mansfield, E.S., J.M. Robertson, R.V. Lebo, M.Y. Lucero, P.E. Mayrand, E. Rappaport, T. Parrella, M. Sartore, S. Surrey and P. Fortina. 1993. Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am. J. Med. Genet. 48:200-208. 11. Mutirangura, A., F. Greenberg, M.G. Butler, S. Malcolm, R.D. Nicholls, A. Chakravarti and D.H. Ledbetter. 1993. Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader- Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy. Hum. Mol. Genet. 2:143-151.

12. Saiki, R.K. 1989. Optimization of the polymerase chain reaction, p. 25-30. In H.A. Erlich, R. Gibbs and H.H. Kazazian Jr. (Eds.), Current Communications in Molecular Biology. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 13. Saiki, R.K. 1989. The design and optimization of the PCR, p. 7-16. In H.A. Erlich (Ed.), PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press, New York. 14. Shuber, A.P., J. Skoletsky, R. Stern and B.L. Handelin. 1993. Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis. Hum. Mol. Genet. 2:153-158. 15. Vandenvelde, C., M. Verstraete and D. Van Beers. 1990. Fast multiplex polymerase chain reaction on boiled clinical samples for rapid viral diagnosis. J. Virol. Methods 30:215-227.

ử

16. Vogt, P.H., A. Edelmann, S. Kirsch, O. Henegariu, P. Hirschmann, P. Kiesewetter, F.M. K hn, W.B. Schill et al. 1996. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum. Mol. Genet. 5:933-943. Received 6 June 1996; accepted 25 March 1997./.