luận văn: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SANH TRÌNH TỰ VUNG ĐIÊU KHIÊN D-LOOP DNA TY ́ ̣ ̀ ̀ ̉ THÊ CUA GA RI, GÀ ÁC, GÀ TRE ̉ ̉ ̀

ĐẠ I HỌ C THÁ I NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ

SO SÁ NH TRÌ NH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀ U KHIỂ N D-LOOP DNA TY

THỂ CỦ A GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN, 2009

ĐẠ I HỌ C THÁ I NGUYÊN TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M ................ ................... VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO

SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦ A

GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Chuyên ngà nh : SINH HỌ C THƢ̣ C NGHIỆ M

Mã số: 60.42.30

LUẬ N VĂN THẠ C SĨ SINH HỌ C

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Ngƣờ i hƣớ ng dẫ n khoa họ c : PGS. TS Nguyễ n Trọ ng lạ ng THÁI NGUYÊN, 2009

Lờ i cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trì nh nghiên cứ u củ a tôi . Các kết quả, số

liệ u nêu trong luậ n văn là trung thự c và chưa từ ng đượ c công bố trong bấ t kỳ

công trì nh nà o khá c .

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Vũ Thị Nhƣ Trang

LỜ I CẢ M ƠN

Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS .TS Nguyễ n

Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này .

Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa

Sinh trườ ng Đạ i họ c Sư phạ m Thá i Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa

an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm

công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam và mộ t số gia đì nh ở Cao Thượ ng - Tân Yên - Bắ c

Giang đã tạ o điề u kiệ n giú p đỡ tậ n tì nh trong việ c nghiên cứ u t hự c nghiệ m

của đề tài.

Cuố i cù ng tá c giả xin chân thà nh cả m ơn sự giú p đỡ củ a Ban giá m

hiệ u, Khoa Sau đạ i họ c , Ban chủ nhiệ m Khoa Sinh trườ ng Đạ i họ c Sư phạ m

Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản

luậ n văn nà y .

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Vũ Thị Nhƣ Trang

Nhƣ̃ ng tƣ̀ viế t tắ t

Deoxyribonucleotide acid DNA

Ribonucleotide acid RNA

Deoxynucleoside triphosphate dNTP

Dideoxynucleoside triphosphate ddNTP

Base pair bp

Ethylene diamine tetra – acetic acid EDTA

Ethidium bromide EtBr

Kilo base Kb

Polymerase Chain Reaction PCR

Ribonuclease RNase

Sodium Dodecyl Sulphate SDS

Tris- acetate-EDTA TAE

Cytochrome oxidase I COI

Phosphate Buffer Saline PBS

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

eppendorf epp

Danh mụ c cá c bả ng

Trang Bảng Tên bả ng

20 2.1 Kế t quả c hiề u cao và diệ n tí ch peak cholesterol chuẩ n ở

các nồng độ khác nhau

32 3.1 Kế t quả chiề u cao và diệ n tí ch peak cholesterol trong trứ ng

của các mẫu nghiên cứu

33 3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫ u nghiên cứ u

43 3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so

với gà Ri

43 3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với

gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus

gallus gố c Nhậ t mã số AB114078

ình tự nucleotide vùng D -loop ở 45 3.5 Hệ số tương đồ ng về tr

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

mẫ u nghiên cứ u vớ i mộ t số mẫ u trên GenBank

Danh mụ c cá c hì nh

Tên hì nh Trang Hình

Cấu trúc hoá học của cholesterol 6 1.1

Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 12 1.2

Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak 20 2.1

chuẩn cholesterol

2.2 Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak 21

chuẩn cholesterol

3.1 Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫ u 33

nghiên cứ u

Kết quả điện di DNA tổng số 35 3.2

Kế t quả điện di sản phẩm PCR 36 3.3

So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre 41 3.4

với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà

Gallus gallus gố c Nhậ t mã số AB114078

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46

MỤC LỤC

Lờ i cam đoan

Lờ i cả m ơn

Danh mụ c cá c bả ng

Danh mụ c cá c hì nh

Mở đầu .......................................................................................................... 1

1.Đặt vấn đề .................................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 2

3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc gia cầm ................................................................................. 3

1.1.1 Gà Á ............................................................................................. 4

1.1.2 Gà Ri............................................................................................. 5

1.1.3 Gà Tre. .......................................................................................... 6

1.2 Cholesterol .............................................................................................. 6

1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà ............................. 6

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người ......................................................... 7

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể ..................................................... 7

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình

thường. .......................................................................................................... 8

1.3 Đặc điểm DNA ty thể .............................................................................. 10

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể ............................... 10

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể ...................................... 11

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà....................................... 12

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới ........................ 14

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ........................ 16

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu .................................................................................................. 18

2.1.1 Nguồn gốc mẫu ........................................................................... 18

2.1.2 Đị a điểm thí nghiệm .................................................................... 18

2.2 Hoá chất và thiết bị ................................................................................. 18

2.2.1 Hóa chất ....................................................................................... 18

2.2.2 Thiết bị sử dụng .................................................................... 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 19

2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol ................ 19

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử ..................................................... 22

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật ......... 22

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................. 25

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR ............... 26

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................... 29

2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA. ................................... 31

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 31

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu .................. 33

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng

di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu ............................................................... 35

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ........................... 35

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ............................. 36

3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể ........... 37

KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận .................................................................................................... 48

2. Đề nghị ..................................................................................................... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................. 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

PHỤ LỤC .............................................. 54

Mở đầu

1. Đặt vấn đề

Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu

hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá. Đặc biệt, ngành chăn nuôi

gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng

lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với

nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân.

Sự phát triển nhanh chó ng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã

tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại

hình...chăn nuôi. Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung

với quy mô lớn tăng lên. Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm

chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao

với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu

khắc nghiệt.

Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất

và tinh thần của con người được nâng cao. Chất lượng bữa ăn trong gia đình

đã được cải thiện rất nhiều. Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã

mắc rất nhiều bệnh khác nhau. Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi

chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết

áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não...

Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước

phát triển thuộc thế giới tây phương. Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới

nhưng căn bệ nh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do

hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao. Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm

lượng cholesterol cũng thay đổi theo. Những nguồn thực phẩm giàu

cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục,

não, tim, lòng đỏ trứng... Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình. Trong

trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao. Có nhiều loại

trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt... Mỗi giống gà khác

nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau. Như vậy việc lựa

chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của

mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng.

Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi

muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua

nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định

hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-

loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà.

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của

3 giống gà.

- Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà.

3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre.

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác,

gà Tre.

+ Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên.

+ Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR.

+ Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà

trên.

- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số

giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguồn gốc gia cầm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết

luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà

rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ

sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm

hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập

tính hoạt động.

Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu:

Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi

cong và nhọn.

Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ,

mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ.

Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu

đỏ, mỏ tương đối ngắn.

Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các

giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay.

Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ

thống giới động vật như sau:

Giới động vật (Animal)

Ngành động vật có xương sống (Chordata)

Lớp chim (Aves)

Bộ gà (Galliformes)

Họ Trĩ (Fasianidea)

Chủng Gallus (giố ng gà Bankip )

Loài Gallus gallus.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba

Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của

châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước

Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có

năng suất cao hơn.

Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú,

Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay

nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà

Đông Tảo, gà Vàng …

1.1.1 Gà Ác

Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson. Đây là loại gà cỡ

nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng

mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón.

Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và

miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa

nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà

giá thành lại cao. Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới

được biết hết giá trị của nó. Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền

Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng

Yên...Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm

chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao. Như thế

có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi

chuồng) đều được cả. Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit

amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit. Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ

khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12].

Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không

độc, có tác dụng bổ dưỡng cao. Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và

sau khi sinh.

Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà

cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất. Theo PGS.TS Trịnh Công Thành,

Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp

dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông

chân và dòng gà Ác không có lông chân. Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo

dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và

gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà

trước kia là 29/100 con cho trứng).

1.1.2 Gà Ri

Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà

trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus

gallus. Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi

rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng. Cổ thanh dài vừa

phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen

lẫn màu đỏ tươi. Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống. Màu

lông khác nhau ở con mái và con trống. Con mái có màu lông màu vàng rơm,

vàng đất, nâu nhạt và đốm. Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh

và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất. Ngoài ra còn có màu lông

khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng...

Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có

khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh. Gà Ri đẻ trứng

sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi. Sản lượng trứng của gà mái trong một

năm từ 80-120 quả. Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g. Gà Ri có khối

lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g,

con mái từ 1,300 g đến 1,800 g.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng

canh ở nước ta. Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong

vườn hay ngoài đồng. Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài

nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ

khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8].

1.1.3 Gà Tre

Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam.

Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen. Gà

mái màu vàng, thấp chân. Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri. Gà Tre có tập

tính là hay bay và đậu trên hàng rào. Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh.

Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn

quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta.

1.2 Cholesterol

1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà

Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều

trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển

ở dạng tự do ở trong máu. Cholesterol có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol

Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là

nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử

của cholesterol là rượi cồn (alcohol). Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan... và đặc biệt trứng gà là loại thực

phẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đó chủ yế u là lòng đỏ trứng gà còn

lòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28].

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở ngƣời

Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bào

của tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi

động vật cũng như cơ thể người. Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồn

gốc:

- Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còn

gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol).

- Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh

(endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28].

Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượng

nhỏ cholesterol. Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào. Khi lượng

cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độ

cholesterol huyết tương. Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ức

chế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội

sinh. Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độ

cholesterol trong máu. Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao động

khoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn. Sự thay đổi lớn của

hàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độ

cholesterol trong máu tới 30%. Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩu

phần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%.

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể

Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic

axit tại gan. Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối

mật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:

+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến

thượng thận.

+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng.

+ Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone.

+ Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào.

+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da. Cùng với các

chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:

+) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước

+) Kháng tác động của nhiều hoá chất.

+) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28].

Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượng

của nó trong cơ thể ở mức phù hợp. Ở người trưởng thành, cholesterol toàn

phần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít. Những người có mức

cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau.

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vƣợt quá mức bình thƣờng

Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim

mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim,

tai biến mạch máu não... Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim

mạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước.

Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà. Ở Mỹ, hàng năm có khoảng

6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và

trong số này có khoảng 1/3 bị chết. Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau

tim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước. Tần suất đàn ông Mỹ bị chết

vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số. Ở Anh, tỉ suất này là khoảng

250/100.000 dân số [16], [21].

*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớp

nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các

mảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu

và ngăn cản sự lưu thông của dòng máu . Các biểu hiện bệnh lý trong giai

đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc. Sự tổn

thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lực của

động mạch nên vùng tổn thương.

Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phân

chia. Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự. Tại

thành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của các

tế bào bình thường đến vùng tổn thương. Ngay sau đó, các thành phần lipit

trong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phân

chia, hình thành các mảnh xơ. Vì các mảnh này chứa một lượng lớn

cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng.

Tiếp theo sau của quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn

thương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu.

Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ. Đến

giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô

tả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứng

mạch máu”

Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kích

thước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng . Các phần tử

mảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy

cơ hình thành các cục máu và huyết khối. Khi các huyết khối có mặt trong

động mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc động

mạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thể

thậm chí gây tử vong. Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi,

động mạch dạ dày, ruột... [16], [21].

*Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu

Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau

như sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay

các loại thuốc có chứa Statin. Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh

cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý.

Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại

thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực

phẩm có chứ a nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất

béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng. Có những người ăn thường

xuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả

mà nó sẽ gây ra. Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể. Tuy nhiên, chúng

ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng và giảm lượng

cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch.

1.3 Đặc điểm DNA ty thể

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể

DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng. Kích thước

của bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên.

Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác định

được trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kích

thước khoảng 16,5 kb. Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể. Mỗi ty thể

có nhiều bản sao của DNA. Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84

kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ

giữa các vùng exon. Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộ

gen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb. Chức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng,

nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá.

Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặt

chẽ. mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau và

hầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D-

loop. D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quá

trình sao chép và phiên mã của mtDNA [25].

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể

DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng

mẹ. Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800

nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA

và vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để tái

bản và phiên mã mtDNA. DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm như

(1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so với

bất kỳ một gen nhân nào.

(2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp.

Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA:

chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các gen

khác của mtDNA. Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một

công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến

hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29].

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà

* Đặc điểm cấu trúc ty thể gà

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13

protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank). Các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong ty

thể. Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là:

một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa

hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sống

đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này.

Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì

ATG.

Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều công

trình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các loài thuộc bộ gà

(Galliormes). Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau:

Hình 1.2. Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus

(Desjadins và Morais, 1990)

ND: NADH đehidrogenaza

CO: cytocrom oxidaza

H (Heavy strand): chuỗi nặng

L (Light strand): chuỗi nhẹ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

* Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo

dòng mẹ. Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tế

bào mẹ. Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữa

trứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếu

tế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùng

khi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vào

ubiquitin. Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt hai

dòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bào

chất. DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp. Tốc

độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể

là do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA. Tốc độ đột biến cao dẫn đến

nhiều biến dị trong ty thể. Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA là

vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ

cao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA. Trình tự nucleotit của

vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng

di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài

[29].

* Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà

Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn:

đoạn I, II và III. Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị

cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân

loại họ. Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III.

Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóa

nhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể. Vì vậy mà trình tự

nucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di

truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài.

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả về

số lượng và chất lượng. Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi gia

cầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản. Sau Mỹ là Pháp,

Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầm

cũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari.

Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà:

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp. Với trình tự này, các nhà

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa

các đối tượng thuộc bộ gà.

Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệ

chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, ... dựa trên phân tích đoạn điều

khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP)

trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân

loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400

nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA. Kết quả nhận được đã

chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của

mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus.

Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạn

điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đã

chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này.

Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ

của gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiển

mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai

cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn

gen cho thấy sự khác nhau là rất ít.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu

tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus)

Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus

gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố

trên ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của

chúng dựa trên trình tự vùng D-loop.

Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tự

vùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa

phương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ

(Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại.

Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng

Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng

3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái

bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ

các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc

và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả

thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi

các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á. Như vậy có

thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để

đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa

các quần thể địa lý.

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử

trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu. Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng

sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên

vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi

trắng (L. hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi hông tía (L. diardi).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của

mtDNA của 3 loài gà Lôi. Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn

đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên.

Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn

gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector

pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide

vùng D-loop.

Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình

tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương

Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện

trên.

Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình

tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện

Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo

dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm

1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác

biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so

sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao

nuôi tại Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop

gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí

khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguồn gốc mẫu

Các mẫu trứng, máu đượ c lấ y từ cá c giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được

nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đì nh Giã , Cao Thượ ng , Tân

Yên, Bắ c Giang.

2.1.2 Đị a điểm thí nghiệm

Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của

Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam.

Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công

nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam.

2.2 Hoá chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ,

Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein

K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol:

chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1),

agarose 0,8%...

2.2.2 Thiết bị sử dụng

Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20oC

Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc (Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyser

(Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc

110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác.

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Phƣơng pháp hoá sinh xác định hàm lƣợng cholesterol

* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)

được chiết bằng chloroform. Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn,

cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether. Dịch chiết được cô cạn bằng

máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol. Cholesterol

trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng

cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện

tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005)

[22].

* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng

ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác

nhau trong cùng một giống. Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả

trứng vào cốc thủy tinh. Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng. Tiếp theo là

các bước:

+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml.

+ Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút.

+ Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút.

+ Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml.

+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút.

+ Gộp dịch chiết vào bình gạn.

+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp.

+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay. + Cô quay đến khô ở 300C.

+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C.

+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt

độ phòng.

+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão

hòa, 10 ml nước.

+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether.

+ Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất. + Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 300C đến khô.

+ Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol.

+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng. Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút,

lượng mẫu bơm 10 l. Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở

bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các

peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng

cholesterol của mỗi mẫu [22].

Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau :

X =

Trong đó:

X: Hàm lượng cholesterol (mg/ 100 g)

Am: Diện tích pic mẫu

As: Diện tích pic chuẩn

Cs: Nồng độ chuẩn

D: Độ pha loãng

m: khối lượng mẫu cân (g)

100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí

nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ

khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml. Để xây dựng

được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của

các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó.

Kế t quả về chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở các

nồng độ khác nhau được thể hiệ n qua bả ng 2.1.

Bảng 2.1. Kế t quả chiề u cao và diệ n tí ch peak cholesterol chuẩ n ở

các nồng độ khác nhau

Nồ ng độ cholesterol Thờ i gian chạ y má y Diệ n tí ch Chiề u cao

(ppm) (phút)

2,04 33,159 19502 543

20,4 33,190 69573 1946

204 33,178 715249 17001

1000 33,054 3309741 91236

2040 33,329 7396448 181428

Từ các kết quả về chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn

chúng ta có thể xây dựng đường chuẩn cholesterol theo diện tích hoặc theo

chiều cao như sau:

Hình 2.1. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak chuẩn

cholesterol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak chuẩn

cholesterol

Như vậy, dựa vào đường chuẩn cholesterol chúng ta có thể xác định

được lượng cholesterol có trong các mẫu nghiên cứ u cần xác định.

2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật

* Nguyên tắc chung

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện

pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein.

Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp

phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp. Cuối cùng DNA được

kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm.

* Quy trì nh tá ch chiế t

Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA

là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Các phân tử DNA có

thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa

học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế

bào bị phá vỡ). Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một

phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên

cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và

Russell [30].

Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ. Trong

điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ

được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein

như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng.

Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer

saline (PBS) và ly tâm. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu.

Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và

SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà

hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các

nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết

peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy. Hơn nữa pH kiềm

của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất

tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với

protein histon.

Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp

phenol: chloroform: isoamyl alcohol. Chloroform làm tăng cường hoạt động

của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu

trúc của DNA. Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha

nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá

trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3

pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính

và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol. Pha nước

được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

hợp chloroform: isoamyl alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong

dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bước này có thể lặp lại 1-2 lần.

Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50l CH3COONa3M,

pH=5,2 và 1 ml ethanol 100%. Ethanol có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA, để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ

kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẫy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -200C trong 15 giờ

thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Rửa tủa bằng ethanol 70%, làm khô tủa

trong máy sấy và hòa tan tủa trong nước cất 2 lần. Trong dung dịch này có nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã loại bỏ RNA bằng RNAase, ủ ở 370C trong 2-

3 giờ.

Quy trình tách chiết DNA tổng số theo Sambrook và Russell [30] có

thể đượ c tó m tắ t như sau:

(1): Ủ máu đông lạnh trong 37oC trong 1 giờ cho máu tan.

(2): Hút vào mỗi eppendorf (epp, loại 1,5 ml) 500 l máu.

(3): Bổ sung 500 l dung dịch PBS 1X, sau đó vortex và li tâm 6000

vòng/phút trong 15 - 20 phút, 40C, đổ dịch và thu cặn.

(4): Bổ sung 1ml dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 l protease K (20

mg/ml). Mẫu được ủ ở 650C trong 1 giờ, sau đó để ở nhiệt độ phòng.

(5): Chia vào mỗi epp 500 l dịch.

(6): Bổ sung một lượng tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút

pha trên cùng sang ống mới.

(7): Thêm một thể tích tương đương chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/ phút, 15 phút, 40C. Hút pha trên

cùng sang ống mới.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ

qua đêm ở - 20oC.

(9): Thu tủa bằng cách li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15-20 phút, 4oC.

Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào mỗi epp.

(10): Li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Bỏ dịch và thu cặn.

(11): Làm khô tủa trong máy sấy và hò a tủa vào 50 l nước khử ion vô

trùng, búng nhẹ.

Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA trên gel agarose 0,8%.

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose

* Nguyên tắc chung

Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước

và hàm lượng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit 3- trên bề nucleic là các đại phân tử tích điện âm do có sự có mặt của gốc PO4

mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng điện và

hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được

sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích

thước lớn) hoặc polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ).

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% bởi gel

agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn

DNA cần phân tích (1- 20kb) [2].

* Quy trình kỹ thuật

- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X. Đun trong lò vi sóng đến tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng 50 – 60oC,

đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau 30 phút, khi gel

đông cứng thì rút răng lược ra và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE

1X sao cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ 1 – 2 mm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với một lượng thích hợp (3 - 8 l) được

trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ trên gel. Chạy điện di

với dòng điện một chiều có cường độ dòng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế

100-120 V. Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc

nào cần ngừng điện di.

Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm bản gel

trong dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml. Sau khi

ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa trong nước sạch và chụp ảnh dưới ánh

sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad).

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR

Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh ra phương pháp đơn giản khuếch

đại nhanh nhiều bản sao (amplification) của các đoạn DNA mà không qua tạo

dòng. Kỹ thuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR,

được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền. Kỹ thuật này được ứng dụng

nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển của sinh học phân tử và

kỹ thuật di truyền [26].

* Nguyên tắc chung

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro

do sự xúc tác của enzyme DNA taq polymerase. Enzyme này được chiết từ vi

khuẩn Thermus aquaticus. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (950C), làm nguội (37- 650C) và ủ lâu ở 720C. Trong dung dịch có chứa 4 loại deoxynucleotide

(dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các

oligonucleotide, mỗi mồi sẽ bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn của DNA

khuôn tương ứng, từ đó mạch được tổng hợp kéo dài.

* Nguyên liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- DNA khuôn phả i được tinh sạch và ít bị đứt gãy , có chứ a trì nh tự đí ch

cầ n nhân lên . Nồng độ DNA khuôn trong mỗ i hỗ n hợ p phả n ứ ng là 10 - 100

ng/phản ứng.

- Mồi: là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR bởi việc điều chỉnh nhiệt

độ gắn mồi và nồng độ mồi có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất

lượng sản phẩm PCR. Nồng độ mồi xuôi và mồi ngược sử dụng trong thí

nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l). Cặ p mồ i đượ c sử dụ ng đó là :

+ Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’.

+ Mồi ngượ c L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’.

H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ

số là vị trí nucleotide trên mtDNA trong trình tự đầy đủ của gà mà đầu 3’ của

mồ i tiế p hợ p và o (Desjadins và Morais, 1990) [17]. Cặp mồi H1255- L16725

được lựa chọn vì đây là cặp mồi “bảo thủ”, nó có thể được dùng cho nhiều

loài, giống khác nhau trong bộ gà.

- Dung dịch đệm: PCR được thực hiện trong môi trường đệm phù hợp với

hoạt động của enzyme và nó có giá trị pH là 7,2. Trong thí nghiệm này, chúng

tôi sử dụng đệm là buffer dream taq. Nó phù hợp với hoạt động của emzyme taq polymerase và trong dung dịch đệm này có chứa Mg2+. Vai trò của ion Mg2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng cường sự kết hợp giữa mồi và khuôn. Nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm

hoạt tính của enzyme. Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao sẽ ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi khảo sát chúng tôi sử dụng nồng độ Mg2+ là 10 mM cho

kết quả PCR tốt nhất.

- 4 loại dNTPs: nồng độ của 4 loại dNTPs phải bằng nhau và phụ thuộc

nhiều vào kích thước của đoạn DNA đích, nồng độ của mồi và MgCl2. Nồng độ các dNTPs lớn hơn 4mM sẽ ức chế phản ứng PCR do ion Mg2+ bị cô lập,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

dễ dẫn đến sự nhân lên của các đoạn không cần thiết. Qua thử nghiệm, chúng

tôi thấy, nồng độ của các dNTPs là 1mM là phù hợp.

- Taq DNA polymeaza của hãng Fermentas

- Nước khử ion vô trùng.

Thông thường phản ứng PCR cho một mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm

các thành phần sau:

Nước 14,8 l

Buffer dream taq 2,5 l

dNTPs 2,5 l

H1255 (mồ i xuôi ) 1 l

L16725 (mồ i ngượ c) 1 l

Taq DNA polymeraza 0,2 l

DNA khuôn 3 l

Tổng thể tích 25 l

PCR là một quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng

tôi tiến hành là 35 chu kì), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94-950C trong

khoảng một phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sẽ trở

thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Thời gian biến tính tùy thuộc vào

hàm lượng G-C và chiều dài của phân tử DNA. Chúng tôi chọn nhiệt độ biến tính là 940C trong một phút. Trước khi bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ biến tính được đặt ở 940C trong 4 phút để đảm bảo phân tử DNA được biến

tính hoàn toàn.

- Giai đoạn gắn mồi: ở giai đoạn này, nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn. Nhiệt độ và

thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi. Chúng tôi đã thử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chạy phản ứng ở một số giá trị nhiệt độ khác nhau trong khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 550C.

- Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 720C để cho enzyme Taq

polymerase hoạt động tốt nhất. Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài

đoạn DNA cần khuếch đại. Tốc độ tổng hợp của phản ứng khoảng 1000

nuleotide/ phút. Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoả ng 1,3 kb

nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là 1 phút 20 giây.

Sản phẩm cuối cùng của chu kỳ trước sẽ là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp

theo. Sau mỗi chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi. Sau một thời

gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ đó mà có đủ lượng

DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi kết thúc 35 chu kì, chúng tôi đặt nhiệt độ ở 720C trong mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn. Sản phẩm PCR được giữ 40C.

* Quy trình nhiệt của phản ứng PCR có thể được tóm tắt như sau:

Bước 1: 94oC - 4 phút Bước 2: 94oC - 1 phút Bước 3: 55oC - 1 phút Bước 4: 72oC - 1 phút 20 giây

Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 34 lần. Bước 5: 72oC - 10 phút. Sản phẩm PCR được giữ ở 4oC.

Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 l sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên

gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR.

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tôi tiến

hành tinh sạch sản phẩm PCR. Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến

hành điện di toàn bộ sản phẩm PCR thu được ở mỗi mẫu. Sau đó chúng tôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

tiến hành thôi gel theo protocol củ a hã ng Promega để thu sản phẩm PCR tinh

sạch. Quy trình được tiến hành như sau:

- Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR.

- Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml.

- Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân.

- Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng

của băng gel ta vừa cắt).

- Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ 1 mg gel:

1 l dung dịch 1.

- Ngâm trong nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết.

- Chuyển sang cột và để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong 1 phút, sau đó loại bỏ dịch phí a

dưới.

- Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/

phút, 40C, trong một phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.

- Bổ sung thêm 500 l dung dịch 2 và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C,

trong 5 phút, sau đó cũng loại bỏ dịch phía dưới.

- Ly tâm lại một phút, 12000 vòng/ phút, 40C.

- Cho vào máy sấy 5 phút.

- Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nướ c cấ t 2 lầ n, để ở nhiệt độ phòng

trong khoảng một phút.

- Ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, trong một phút.

Sau khi đã thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành điện di

để kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 0,8%. Nếu điện di xuất hiện

băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước

đoạn DNA cần nhân trong phản ứng PCR thì sản phẩm thôi gel đủ chất lượng

để tiến hành đọc trình tự.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA

*Nguyên tắc chung

Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của

phương pháp Sanger [2], [10] tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau

một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo

ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành phản

ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa

sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như: dNTPs,

ddNTPs, DNA polymerase... Do đó chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sử

dụng sản phẩm thôi gel của phản ứng PCR) và mồi phù hợp (cặp mồi H1255-

L16725). Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được

đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuyếch đại

gene để đọc trình tự bao gồm: mồi 3.2 pM, DNA của sản phẩm PCR và nước

với tổng thể tích 15l. Vì đoạn gen cần xác định có chiều dài khoảng 1,3 kb

nên chúng tôi đã xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn

DNA có trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần

mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu

được trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.

* Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt cho máy PCR trong máy luân nhiệt Genamp PCR System 9700 như sau: 940C- 1 phút; (960C- 10 giây, 500C- 5 giây, 600C- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4 0C.

2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Những số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học

trên máy vi tính bằng chương trình Excel theo hướng dẫn của Chu Văn Mẫn

[9] với các thông số:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Giá trị trung bình mẫu

Độ lệch chuẩn:

với n 30

với n < 30

m = ( với n 30)

m = ( với n < 30)

Trong đó:

: Độ lệch chuẩn.

: Là giá trị trung bình mẫu.

Xi: Là giá trị của từng mẫu.

n: Là số lần lặp lại thí nghiệm.

m : Sai số trung bình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hàm lƣợng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu

Chúng tôi thu thập mẫu trứng của các giống gà nghiên cứu đồng thời

chúng tôi cũng thu thập thêm trứng của vịt Bầu và trứng gà Tam Hoàng mà

chúng ta hay sử dụng hàng ngày. Mục đích là để có thể so sánh hàm lượng

cholesterol của các mẫu gà nghiên cứu vớ i hà m lượ ng cholesterol của các loại

trứng mà chúng ta hay sử dụng trong các bữa ăn hàng ngày để có thể rút ra kết

luận về việc sử dụng loại trứng mà không lo hàm lượng cholesterol cao. Sau

đó, chúng tôi tiến hành phân tích theo các bước trình bày ở chương 2 và cuối

cùng dung dịch chứa cholesterol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC)

bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol trong mẫu

với diện tích (hoặc chiều cao) của peak cholesterol chuẩn. Kế t quả c hiề u c ao

và diện tích của các peak cholesterol trong trứ ng củ a cá c mẫ u gà nghiên cứ u

đượ c thể hiện qua bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kế t quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứ ng củ a cá c

mẫ u nghiên cứ u

Mẫ u nghiên cứ u Thờ i gian chạ y má y Diệ n tí ch Chiề u cao

(phút)

gà Ri 31,508 1017035 25295

gà Ác 32,233 845304 20628

gà Tam Hoàng 31,836 819183 20477

gà Tre 32,418 1105818 26763

vịt Bầu 31,632 1195163 29586

Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần. Dựa vào công thức xác định hàm

lượng cholesterol đã trình bày ở chương 2 thì hàm lượng cholesterol tỷ lệ

thuận với diện tích (hoặc chiều cao) của peak mẫu nghiên cứ u . Nếu diện tích

(chiều cao) peak mẫu nghiên cứ u càng lớn thì hàm lượng cholesterol của mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

nghiên cứu càng cao. Chúng tôi đã xác định đượ c hàm lượng cholesterol ở

các mẫu thí nghiệm và được thể hiện qua bảng 3.2 và hình 3.1.

Bảng 3.2. Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫ u nghiên cứ u

Các mẫu nghiên cứ u Hàm lượng cholesterol

(mg/100 g)

Trứng gà Ri 438,1  0,09

Trứng gà Ác 340,6  0,11

Trứng gà Tre 465,9  0,15

Trứng gà Tam Hoàng 318,8  0,1

Trứng vịt Bầ u 477,7  0,13

) g 0 0 1 / g m

( l o r e t s e l o h c g n ợ ƣ

l

m à H

Mẫ u nghiên cƣ́ u

Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫ u nghiên

cứ u

Qua bảng 3.2 và hình 3.1, chúng tôi nhận thấy hàm lượng cholesterol

trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100 g, sau đó là trứng gà Tre 465,9

mg/100 g, trứng gà Ri 438 mg/100 g, trứng gà Ác 340 mg/100 g. Hàm lượng

cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100 g. Tuy nhiên, hàm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

lượng cholesterol trong một quả trứng thì chủ yếu tập trung ở lòng đỏ, còn ở

lòng trằng không đáng kể. Nhu cầu cholesterol tối đa của một người bình

thường/một ngày là 300 mg/một ngày. Như vậy, chúng ta thấy rằng hàm

lượng cholesterol trong trứng gà là khá cao. Chính vì vậy, ngườ i sử dụ ng cầ n

phải c ăn cứ và o tì nh hì nh sứ c khỏ e củ a bả n thân (có hay không có những

bệ nh về tim mạ ch liên quan đế n cholesterol ) và dựa vào hàm lượng

cholesterol củ a cá c loạ i trứ ng mà chúng tôi đã xác định để ch ọn loại trứng và

số lượ ng trứ ng phù hợp để đảm bảo một ngày cung cấp cho cơ thể tối đa 300

mg cholesterol/một ngày . Đồng thời những người mà có hàm lượng

cholesterol trong máu cao hơn 5,6 mmol/lít thì mỗi tuần chỉ nên ăn tối đa 4

quả trứng/một tuần và cũng nên lựa chọn trứng gà Tam Hoàng để ăn, hạn chế

ăn các loại trứng vịt Bầu, trứng gà Tre và gà Ri để đảm bảo sức khỏe , ngăn

ngừ a và hạ n chế cá c bệ nh về tim mạ ch .

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di

truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu

Để xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di

truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, chúng tôi tiến hành tách

chiết DNA tổng số, dùng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển trong ty thể

nhằm xác định trình tự của vùng D-loop. So sánh các trình tự này vớ i mộ t số

trình tự công bố trên GenBank để tìm ra sự đa dạ ng di truyề n củ a chú ng .

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà

Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu

nhận và tinh sạch DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các

thí nghiệm tiếp theo. Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật

tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng. Để đạt

hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có

nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp

tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]. Kiểm tra sản phẩm

21kb

5,1kb

tinh sạch trên gel agarose 0,8%. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2.

Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số

M: marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3. Gà Tre

Kết quả cho thấy, cả 3 băng DNA tổng số của mẫu gà Ri, Ác, Tre đều

sáng tập trung và tương đối rõ nét. Ba băng DNA thu được có kích thước

khoảng 21kb. Như vậy, có thể đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu

về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể

Bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã khuyếch đại được vùng điều khiển D-

loop. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8% với thể tích là 8 l.

Kết quả PCR được thể hiện trên hình 3.3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

M

1

2

3 1.3kb

1.5kb 1.0 kb

Hình 3.3. Kế t quả điện di sản phẩm PCR

M:Marker; 1. Gà Ri; 2. Gà Ác; 3.Gà Tre

Kết quả cho thấy, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA có kí ch thướ c khoả ng

1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung,

chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi đã nhân được vùng D-loop. Sản

phẩm PCR sẽ được sử dụng ở các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel sản phẩm PCR), chúng tôi

tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop trên máy đọc trình tự tự động trên cơ

sở của phương pháp Sanger. Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả

trong mục 2.3.2.5.

Xác định trình tự nucleotide từ hai chiều của tất cả các đoạn DNA có

trong sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 và nhờ máy xác định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau đó sử dụng các phần mềm

Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu của hai chiều đọc, chúng tôi thu được

trình tự hoàn chỉnh của vùng D-loop của 3 giống gà Ri, Ác, Tre.

Sau khi đã xác định được trình tự vùng D-loop của 3 mẫu gà nghiên

cứu là gà Ri, Ác ,Tre, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng D -loop của

chúng với nhau và với hai trì nh tự D-loop đã đượ c công bố trên GenBank là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

trình tự D-loop của gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gố c Nhậ t mã số AB114078

[24] và gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số

10 20 30 40 50 60

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

NC007236 [27], chúng tôi thu được kết quả hình 3.4.

AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg

AC -......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI C......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE C......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

70 80 90 100 110 120

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

130 140 150 160 170 180

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat

AC .......... .......... .......... .......... ......t... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... ......t... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... ......t... ..........

190 200 210 220 230 240

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac

AC .......... .......... .......... .a........ ....c..... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .a......T. ....c..... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... ....c..... ..........

250 260 270 280 290 300

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc

AC .....t.... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .....t.... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 ..c....... .....c.... t......... .......... g......... .....t....

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

310 320 330 340 350 360

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact

AC .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....

RI .......... .......... .......... .......... .......... ....T.....

TRE .......... ....t..... .......... .......... .......... ....T.....

NC007236 .....c...t .......... .......... .......... .......... ....T.....

370 380 390 400 410 420

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

430 440 450 460 470 480

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

490 500 510 520 530 540

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag

AC .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

RI .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... ...t...... .......... .......... ..........

550 560 570 580 590 600

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

610 620 630 640 650 660

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

670 680 690 700 710 720

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .....a.... .......... .......... ..........

730 740 750 760 770 780

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

790 800 810 820 830 840

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta

AC .......... .a........ .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

850 860 870 880 890 900

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt

AC .......... ........-. .......... .......... .......... ..........

RI .......... ........-. .......... .......... .......... ..........

TRE .......... ........c. .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... ........c. .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

910 920 930 940 950 960

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

970 980 990 1000 1010 1020

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt

AC .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

RI .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

TRE .-........ .......... .......... .T........ .......... ..........

NC007236 .t........ .......... .......... .T........ .......... ..........

1030 1040 1050 1060 1070 1080

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata

AC .......... .g........ .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1090 1100 1110 1120 1130 1140

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..........

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

1150 1160 1170 1180 1190 1200

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta

AC .......... .......... .......... .......... .......... ..........

RI .......... .......... .......... .......... .......... ..........

TRE .......... .......... .......... .......... .......... ..A.......

NC007236 .......... .......... .......... .......... .......... ..........

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1210 1220

....|....| ....|....| ...

AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt cta

AC .......... .....A.... ...

RI .......... .......... ...

TRE .......... .....A.... ...

NC007236 .......... .......... ...

Hình 3.4. So sánh trình tự đoạn D-loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà

Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gố c Nhậ t mã số

AB114078

* So sánh trình tự của gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với trình

tự tham khảo mã số NC007236, chúng tôi nhận thấy có 21 điểm đa hình/đột

biến (tức là khác biệt nucleotide). Mẫu gà Ác có 17 điểm (chiếm 1,39%), mẫu

gà Ri có 13 điểm (chiếm 1,06 %) và mẫu gà Tre có 15 điểm khác biệt so với

NC007236 (chiếm 1,23 %). Trong 21 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến

thay thế. Ngoài ra còn có đột biến mất nucleotid e tại 3 vị trí đó là : tại vị trí số

1 bị mất nucleotide A ở gà Á c , tại vị trí 859 mấ t nucleotid e C ở gà Á c và gà

Ri, tại vị trí 962 mấ t nucleotid e T ở gà Ri, Ác, Tre. Nhữ ng độ t biế n thay thế

làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu khác với NC007236

như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và

gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 167 ở gà Ri, ở vị trí 261, 296, 310

ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 của gà Ác và

gà Tre, tại vị trí 281 ở gà Ri , Ác, Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193

của mẫu gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 219 của gà Tre , tại vị trí

225 của gà Ri, tại vị trí 246, tại vị trí 315 của gà Ác và Tre, tại vị trí 243, tại vị

trí 306 ở gà Ri, Ác, Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 686 của gà Ác,

Ri, Tre, tại vị trí 1032 ở gà Ác.

* So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre với trình tự tham khảo mã số

AB114078 chúng tôi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến. Mẫu gà Ác có 11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

điểm (chiếm 0,9%), mẫu gà Ri có 4 điểm (chiếm 0,33%) và mẫu gà Tre có 13

điểm khác biệt so với trình tự tham khảo (chiếm 0,98%). Trong 15 điểm khác

biệt này, phần lớn là đột biến thay thế. Riêng ở mẫu gà Ác, tại vị trí

nucleotide số 1 bị mất nucleotide A so với trình tự tham khảo, đồng thời ở

mẫu gà Tre tại vị trí nucleotide số 859 có thêm nucleotide là C trong khi trình

tự tham khảo, mẫu gà Ri và mẫu gà Ác không có nucleotide này. Còn lại là

các đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide của các mẫu gà nghiên cứu

khác với trình tự tham khảo như sau: thay thế A bằng C (AC) tại vị trí

nucleotide số 1 của mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí

167, 246, 315 của mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 355 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác

và Tre, tại vị trí 219 của mẫu gà Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí

212, 1216 của 2 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 792 của mẫu gà Ác và 1193

của mẫu gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 225 của mẫu gà Ác và

Tre; thay thế A thành T (AT) tại vị trí 504, 992 của cả 3 mẫu gà Ri, Ác và

Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 1032 của mẫu gà Ác.

Ngoài ra giữa 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre còn khác biệt nhau ở 11 điểm đa

hình (chiếm 0,9%). Cụ thể : giữ a gà Á c và gà Tre khá c nhau 6 điể m, giữ a gà

Ác và gà Ri khác nhau 9 điể m và giữ a gà Tre và gà Ri khá c nhau 9 điể m đa

hình. Như vậ y , trình tự nucleotide của 2 mẫu gà Ác và Tre tương đối giống

nhau nhưng lại có nhiều điểm khác biệt so với mẫu gà Ri . Sự khá c biệ t

nucleotide giữ a 2 mẫ u gà Á c và gà Tre so vớ i gà Ri đượ c thể hiệ n trên bả ng

3.3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.3. Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà

Vị trí nucleotide trên ty thể gà Ri gà Ác và Tre

C T 167

G A 212

T C 225

C T 246

C T 315

G A 1216

Sự sai khá c nucleotid e giữ a 3 mẫ u gà Ri , Ác, Tre vớ i 2 trình tự tham

khảo là NC007236 và AB114078 đượ c thố ng kê ở bả ng 3.4.

Bảng 3.4. Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với gà

Gallus gallus gallus mã số NC007236 và gà Gallus gallus gố c Nhậ t mã số

AB114078

So với gà Gallus gallus gố c Nhậ t mã số AB114078

So với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 Vị

trí

Vị trí

STT

Mẫu

Thay đổi

Kiểu biến

Mẫu

Thay đổi

Kiểu biến

trên

gà

nucleotide

dị

gà

nucleotide

dị

ty

ty thể

thể

Ác

del A

Mất 1

Ác

del A

Mất 1

nucleotide

Tre, Ri

Dị hoán

Tre,

Dị hoán

AC

Ác,

167

Đồng

167

Đồng

TC

CT

Tre

hoán

Ác,

212

Đồng

212

Đồng

Ác,

GA

Tre

hoán

Tre

hoán

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tre

219

Đồng

Tre

219

Đồng

CT

hoán

225

Đồng

225

Đồng

Ác,

CT

TC

Tre

hoán

Ác,

243

Đồng

246

Đồng

Ác,

CT

Tre, Ri

Tre

hoán

Ác,

246

Đồng

315

Đồng

Ác,

CT

Tre

hoán

Ác,

256

Đồng

355

Đồng

Ác,

CT

Tre, Ri

hoán

Tre,

hoán

Ác,

261 Dị hoán

Ác,

504

Dị hoán

TC

AT

Tre, Ri

Tre,

Ác,

281

Đồng

Tre

Thêm C

859

Thêm 1

GA

Tre, Ri

nucleotide

hoán

Ác,

296

Đồng

Ác

792

Đồng

TC

GA

Tre, Ri

hoán

Ác,

306

Đồng

992

Đồng

Ác,

CT

TC

Tre, Ri

Tre,

hoán

Ác

Ác,

310

Đồng

1032

Đồng

TC

Tre, Ri

hoán

Ác,Tre

315

Đồng

Tre

1193

Đồng

CT

GA

hoán

Ác,

686

Đồng

AG

Tre, Ri

hoán

Ác

792

Đồng

GA

hoán

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Ác, Ri

del C

859 Mấ t 1

nucleotide

Ác,

del T

962 Mấ t 1

Tre, Ri

nucleotide

Ác

103

Đồng

AG

hoán

Tre

119

Đồng

GA

hoán

Để đá nh giá sự đa dạ ng di truyề n củ a vù ng D -loop nhằ m xá c đị nh mố i

quan hệ di truyề n giữ a cá c mẫ u gà nghi ên cứ u , chúng tôi đã sử dụ ng phần

mềm Mega để so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop của 3 mẫu gà nghiên

cứu với trình tự các chủng gà đã được công bố đó là: gà Gallus gallus gallus

(Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC 007236 [27] và Gallus gallus

(gà rừng đỏ) gố c Nhậ t lấy trình tự GenBank mang mã số AB114078 [24] để so

sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và đánh giá mối quan hệ di truyền

giữa chúng, kết quả đượ c thể hiệ n qua bảng 3.5 và hình 3.5.

Bảng 3.5. Hệ số tương đồ ng về trì nh tự nucleotide vùng D-loop ở mẫ u

nghiên cứ u vớ i mộ t số mẫ u trên GenBank

1 2 3 4 5 1 AB114078 2 Ri 3 Ác 4 Tre 5 NC007236 1 0,33 0,9 0,98 1,23 1 5 98,77 98,94 98,61 98,77 5 2 99,67 0,74 0,74 1,06 2 3 99,1 99,26 0,49 1,39 3

4 99,02 99,26 99,51 1,23 4 Qua bảng 3.5 thấy rằng, các mẫu nghiên cứu có độ tương đồng cao so

vớ i cá c mẫ u trên Ngân hà ng gen NCBI (98,61 - 99,67 %), mẫ u gà Ri có độ

tương đồ ng cao nhấ t vớ i mẫ u có mã số AB 114078 (99,67%), sau đó là mẫ u

gà Ác và mẫu gà Tre có độ tương đồng vớ i nhau là 99,51%, cặ p có hệ số

tương đồ ng thấ p nhấ t là mẫ u gà Á c so vớ i NC007236 (98,61 %).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Từ cá c kế t quả so sá nh trì nh tự nucleotid e vùng D -loop củ a cá c mẫ u gà

ở trên, chúng tôi thể hiệ n kế t quả trên biể u đồ hì nh cây (hình 3.5).

Hình 3.5. Quan hệ di truyền của một số giống gà

Kết quả thu được hình 3.5 cho thấy các giống gà trên được chia thành 2

nhánh lớ n: nhánh I gồm AB 114078, gà Ri, gà Ác, và gà Tre ; nhánh II chỉ có

gà NC 007236. Trong nhá nh I lạ i chia thà nh 2 nhánh: nhánh I 1 gồ m gà

AB114078 và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%.

Nhánh I2 gồm 2 giống gà Ác và gà Tre, mức độ đồng nhất về mặt di truyền

giữa chúng là 99,51 %. Nhìn chung, sự sai khác giữa các giống gà này không

nhiều.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

KẾ T LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng vịt Bầu là lớn nhất 477,7 mg/100g,

sau đó là trứng gà Tre 465,9 mg/100g, trứng gà Ri 438 mg/100g, trứng gà Ác

340 mg/100g. Hàm lượng cholesterol thấp nhất là trứng gà Tam Hoàng 318,8

mg/100g.

1.2 Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ máu gà thuộc 3 mẫu nghiên

cứu là gà Ri, Ác, Tre. Nhân bản thành công vùng D-loop của 3 mẫu gà này

với kích thước khoảng 1,3 kb bằng kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi chuyên biệt là

H1255-L16725.

1.3 Xác định được trình tự vùng điều khiển D-loop gồm 1223 nucleotide của

3 mẫu gà nghiên cứu Ri, Ác, Tre và phát hiện được 15 điểm đa hình về

nucleotide giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham khảo mang mã số

AB114078 và 21 điể m đa hì nh giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham

khảo mang mã số NC007236.

1.4 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa 3 mẫu gà nghiên cứu với một số

chủng gà đã được công bố đó là gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật Bản

(mã số AB114078) lấy trình tự GenBank quốc tế, Gallus gallus gallus

(Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 lấy trình tự GenBank và

thấy rằng giữa gà Gallus gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật Bản mã số AB114078

và gà Ri có mức độ đồng nhất về mặt di truyền rất cao là 99,67%. Hai mẫu gà

Ác và gà Tre có mức độ đồng nhất về mặt di truyền là 99,51%. Nhìn chung,

sự sai khác giữa các giống gà này không nhiều.

2. Đề nghị

2.1 Chúng tôi mới chỉ xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 5 mẫu

nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, vịt Bầu, Tam Hoàng trong cùng điều kiện nuôi

dưỡng. Vậy để đánh giá một cách toàn diện về hàm lượng cholesterol trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

các mẫu nghiên cứu trên, chúng tôi đề nghị xác định hàm lượng cholesterol

trong cá c mẫu nghiên cứu ở các điều kiện nuôi dưỡng khác nhau.

2.2 Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi mới chỉ lấy mẫu máu từ

một cá thể thuộc mỗi giống, do đó chúng tôi chỉ đưa ra được số liệu ban đầu

về các điểm đa hình của vùng D-loop trên ty thể của 3 mẫu nghiên cứu là gà

Ri, Ác, Tre thuộc loài Gallus gallus domesticus. Để có thể đánh giá được toàn

diện hơn về các điểm đa hình trên vùng D-loop hoặc có thể đưa ra các kết

luận đầy đủ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu, cần phải tiến

hành nghiên cứu và phân tích trên một số lượng mẫu lớn hơn.

CÔNG TRÌ NH KHOA HỌ C ĐÃ CÔNG BỐ

Vũ Thị Như Trang , Nguyễ n Trọ ng lạ ng : Xác định trình tự vùng điều khiển

D-loop DNA ty thể củ a gà Ri, gà Tre, gà Ác đƣợc nuôi tại Bắc Giang. Tạp

chí Khoa học và Công nghệ Đạ i họ c Thá i Nguyên , 2009 tậ p 58, số 10, trang

86-89.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.

3. Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể

của hai loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam, Khóa luận tốt nghiệp nghành công

nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

4. Nguyễn Duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao

học và nghiên cứu sinh), NXB Nông nghiệp Hà Nội.

5. Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định một số chủng gà nhà (Gallus

gallus domesticus) qua DNA ty thể, Khóa luận tốt nghiệp, Trường

ĐHKHTN Hà Nội.

6. Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần hóa

sinh thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái

Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái

Nguyên

7. Lê Viết Ly (2001), gà Ri-chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt

Nam, tập II phần gia cầm, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

8. Nguyễn Thị Mai (2007), Giáo trình chăn nuôi gia cầm dùng trong các

trường THCN, NXB Hà Nội.

9. Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học trong sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội.

10. Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB

ĐHSP.

11. Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học

phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà Lôi Việt

Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

12. Trần Thị Mai Phương (2004), Nghiên cứu khả năng sinh sản, sinh trưởng

và phẩm chất thịt của giống gà Ác Việt Nam, luận án tiến sĩ chuyên

nghành chăn nuôi, Viện Chăn nuôi, Hà Nội.

13. Tôn Thất Sơn, Đặng Vũ Bình, Nguyễn Quang Mai (2001), Chăn nuôi- tập

I, NXB Giáo dục.

14. Bùi Thị Kiều Vân (2008), So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự

vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại

Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái

Nguyên

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

15. Anderson RG., Joe Goldstein and Mike Brown (2003), “from cholesterol

13: 534-539, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 14507481.

homeostasis to new paradigms in membrane biology”, Trends cell Biol,

16. Ascherio A, Willett WC (1995), “New directions in dietary studies or

coronary heart disease”, Journal of Nutrition.

17. Desjardins P., Morais R., (1990), “Sequence and gene ogranization of the

chicken mitochondrial genome”, J. Mol. Biol, 212: 599-635.

18. E. Moyer (1998), Cholesterol, London: Thorston.

19. E.M.Roth (1995), Good cholesterol, bad cholesterol, New York: Prima

Publications.

20. Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T.,

Kondo N., Ohno S. (1996), Monophylectic origin DNA unique dispersal

patterns of domestic fowls, Pro. Natl. Acad. Sci.USA, 93 (13), pp.6792-

6795.

21. Hu FB, Manson JE, Willett WC (2001), “Types of dietary fat anh risk of

coronary heart: acritical review”, Journal of the American College of

Nutrition.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

22. John Wiley and Sons, Inc (2005), Ref. Current proticol in food analytical

chemistry, D1.3.

23. Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M. (1999), Ligon

J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggest that

these lineages are not monophyletic, Mol. Phylogenet. Evol., 11(1) tr.38-

54.

24. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of

long- crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks

disclosed by the mtDNA sequence analysis”, Gene 333, pp. 91-99,

GenBank, Accession AB114078.

25. Lewin B. (1997), Gene VI, Oxford University Press, 713-723& 1222.

26. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R. (1991), PCR – A Pratical

Approach, IRL Press at Oxford University Press.

27. Nishibori M., Shimogiri T., HayashiT. and Yasue H. (2005), “Molecular evidence for hybridization of species in the genus Gallus except for Gallus varius”, Anim. Genet. 36 (5), 367-375, GenBank, Accession NC007236, D-loop region: 1..1232.

28. Ockene IS, Chiriboga DE, Stanek EJ 3rd, Harmatz MG, Nicolosi R,

Saperia G, Well AD, Freedson P, Merriam PA, Reed G, Ma Y, Matthews

treatment implications and possible mechanisms”, Arch Intern Med Arch

CE, Hebert JR., (2004), “Seasonal variation in serum cholesterol levels:

Intern Med, 164: 863-870, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE):

15111372.

29. Randi E., Lucchini V., Hennache A . (1997), Searching for mtDNA

genetic diversity in captive Edwards’ pheasants, The Internation

Studybook For The Edwards’ Pheasant (Lophura edwardsi) And Its

Conservation, Paris: 117-120.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

30. Sambrook J., Russell D. W (2001), Molecular Cloning: A labroratory