ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THANH THỦY NGHIÊN CỨU TẠO APTAMER ĐẶC HIỆU VI KHUẨN Escherichia coli O157:H7 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2013
i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THANH THỦY NGHIÊN CỨU TẠO APTAMER ĐẶC HIỆU VI KHUẨN Escherichia coli O157:H7
Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ THỊ HUYỀN GS.TS PHẠM VĂN TY
Hà Nội – 2013
ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, giúp đỡ
rất tận tình của Phòng Công nghệ Tế bào động vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ môn Vi sinh vật học - Khoa Sinh
học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.
Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS.
Phạm Văn Ty, TS. Lã Thị Huyền đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn, Trƣởng
phòng Phòng Công nghệ Tế bào động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện
trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Thu Thủy và ThS. Lê Thị Kim
Xuân và các cán bộ tại phòng Công nghệ Tế bào động vật đã giúp đỡ rất nhiệt tình và
tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình tôi học tập tại đây.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giảng dạy tại Khoa Sinh học - Trƣờng
Đại học Khoa học Tự nhiên đã dạy bảo tôi trong suốt quá trình học tập, trang bị cho
tôi nền tảng kiến thức khoa học, phƣơng pháp học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè luôn động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài.
Hà Nội, ngày tháng năm
Học viên
Nguyễn Thanh Thuỷ
iii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................ivi
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................... viiii
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................... viii
MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3
1.1. Escherichia coli O157:H7 ...................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7 .............................................. 3
1.1.2. Đặc tính của E. coli O157:H7 .......................................................... 5
1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 ................. 6
1.1.4. Bệnh do E. coli O157:H7 gây ra ..................................................... 10
1.1.5. Tình hình nghiên cứu E. coli O157:H7 trong và ngoài nƣớc ........ 13
1.2. Aptamer ...............................................................................................14
1.2.1. Giới thiệu chung về aptamer ......................................................14
1.2.2. Ƣu điểm của aptamer so với kháng thể .......................................16
1.2.3. Phƣơng pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử cấp số mũ
(SELEX) sàng lọc aptamer ............................................................................. 17
1.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng aptamer ........................................ 20
1.2.5. Hạt nano vàng .............................................................................22
1.2.6. Chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ....................... 24
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........... 26
2.1. Vật liệu .................................................................................................26
2.1.1. Chủng vi vật và plasmid .................................................................. 26
2.1.2. Hoá chất ......................................................................................26
2.1.3. Thiết bị, máy móc .......................................................................26
2.1.4. Môi trƣờng và dung dịch ................................................................. 27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................27
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 27
2.2.2. Phƣơng pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E. coli 0157:H7... .... 28
iv
2.2.3. Phƣơng pháp PCR .......................................................................31
2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR ........................................... 35
2.2.5. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose ............................................. 35
2.2.6. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng ................................... 37
2.2.7. Phƣơng pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli ......................... 38
2.2.8. Phƣơng pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli ..................... 40
2.2.9. Phƣơng pháp giải trình tự acid nucleic tự động ............................. 42
2.2.10. Phƣơng pháp tạo phức hệ aptamer – hạt nano vàng .................... 44
2.2.11. Phƣơng pháp lai Dot blot ............................................................... 44
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ............................................... .46
3.1. Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7 ..............46
3.1.1.Chuẩn bị thƣ viện. ........................................................................36
3.1.2. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7 ............................. 50
3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7 ..............52
3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli
O157:H7...........................................................................................................…….53
3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 – TOPO........54
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α.......56
3.2.4. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli.......................................57
3.3. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7..............58
3.3.1. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7....58
3.3.2. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano
vàng với E. coli O157:H7.........................................................................................60
3.4. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli O157:H7............61
3.4.1. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli.......................................61
3.4.2. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli
O157:H7...................................................................................................................62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................... ......................79
v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp Base pair Cặp base
Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát và phòng CDC Prevention ngừa bệnh dịch Hoa Kỳ
Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNA
Deoxyribonuclease Enzyme DNase DNase
Ethyenediaminetetraacetic acid Axit ethyenediaminetetraacetic EDTA
Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli E. coli
Vi khuẩn Escherichia coli E. coli Escherichia coli O157:H7 O157:H7 O157:H7
Hour Giờ H
Hemolytic uremic syndrome Hội chứng huyết niệu HUS
Hemorrhagic colitis Viêm kết tràng xuất huyết HC
Kilo base Kb Kb
Luria Bertani Môi trƣờng LB LB
PCR Polymerase chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
Reverse transcriptase Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp thời RT – PCR chain reaction gian thực
RNase Ribonuclease Enzyme Rnase
Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNA
Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Shiga toxigenic E. coli
Escherichia coli sinh độc tố Shiga STEC
ssDNA Single strand DNA Sợi đơn DNA
dsDNA Double strand DNA Sợi đôi DNA
Sodium dodecyl sulphate Natri dodexyl sulphat SDS
Tris – acetate – EDTA Tris – acetate – EDTA TAE
Taq Polymerase Thermus aquaticus Enzyme polymerase chịu nhiệt polymerase
vi
5 – Bromo – Clorua 3 – indodyl – 5 – Bromo – Clorua 3 – indodyl – X – gal β – D – galactoside β – D – galactoside
v/ph Round/minute Vòng/phút
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7 ..................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của hệ gen vi khuẩn E. coli O157:H7 ............................. 4
Hình 1.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trƣờng Endo agar và trên môi trƣờng
Fluorocult....................................................................................................................5
Hình 1.4. Cấu trúc của Shiga – like – toxin và cơ chế gây bệnh của vi khuẩn
E. coli O157:H7.................................................................................................... 10
Hình 1.5. Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và
neomycin...................................................................................................................15
Hình 1.6. Quy trình phƣơng pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử cấp số
mũ (SELEX) ........................................................................................................ 18
Hình 1.7. Sơ đồ aptamer ssDNA ................................................................ 18
Hình 1.8. Cấu tạo kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).............................25
Hình 2.1. Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR ..................................... 33
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một
chu kỳ của PCR.........................................................................................................33
Hình 2.3. PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân. ........................ 34
Hình 2.4. Sơ đồ cấu tạo vector tách dòng PCR2.1 – TOPO (Invitrogen) ... 37
Hình 2.5. Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp của F.Sanger. ............ 43
Hình 3.1. Kết quả PCR làm giàu thƣ viện. ................................................. 46
Hình 3.2. Quá trình tạo sợi đơn DNA sử dụng enzym lamda exonuclease.. 48
Hình 3.3. Kết quả tạo ssDNA từ sản phẩm PCR sử dụng enzyme lamda
exonuclease............................................................................................................. 48
Hình 3.4. Kết quả PCR sản phẩm sau cắt tạo sợi đơn ................................. 49
Hình 3.5. Kết quả PCR làm giàu sau mỗi vòng sàng lọc với cặp mồi
ApF2/ApR2............................................................................................................ 50
Hình 3.6. Quá trình tách dòng sản phẩm sau sàng lọc...................................52
Hình 3.7. Quy trình tách dòng và giải trình tự aptamer ssDNA nhận biết
đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. ...................................................................... 53
viii
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR ................................................... 54
Hình 3.9. Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit......................................... 55
Hình 3.10. Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế
bào E. coli DH5α………………….…………………………………………...….. 56
Hình 3.11. Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2 .... 57
Hình 3.12. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang apamer liên kết
E. coli O157:H7.. ................................................................................................ 58
Hình 3.13. Kết quả Dot blot giữa phức hợp aptamer 8 - nano vàng với
kháng nguyên đích E. coli O157:H7. .................................................................... 59
Hình 3.14. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) phức hệ
aptamer-hạt vàng .................................................................................................. 61
Hình 3.15. Kết quả tra sản phẩm tách dòng của aptamer ssDNA 8 ........... 62
Hình 3.16. Trình tự aptamer ssDNA 8. ...................................................... 63
Hình 3.17. Mô hình cấu trúc bậc 2 của aptamer ssDNA 8 đƣợc dự đoán bằng
công cụ Mfold........................................................................................................... 64
Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự của aptamer ssDNA 8 với các trình tự
aptamer trong ngân hàng gen bằng công cụ FASTA................................................ 64
ix
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7............................ 4
Bảng 1.2. So sánh ƣu điểm của aptamer và kháng thể ................................ 17
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợpPCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu
thƣ viện......................................................................................................................29
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ
viện........... ............................................................................................................ 29
Bảng 2.3. Thành phần hỗn hợp phản ứng tạo ssDNA ................................. 30
Bảng 2.4. Thành phần hỗn hợp PCR khuếch đại các trình tự gen ............... 34
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ
viện..... ................................................................................................................. 34
Bảng 3.1. Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho mỗi vòng sàng
lọc..............................................................................................................................51
x
MỞ ĐẦU
Ngộ độc thực phẩm là vấn đề rất đƣợc quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà
còn trên toàn thế giới. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là vi sinh vật,
thƣờng gặp nhƣ Escherichia coli (E. coli), Salmonella spp., Campylobacter
jejuni…. Trong đó, vi sinh vật gây ngộ độc nguy hiểm và thƣờng gặp nhất là E. coli
O157:H7. Theo báo cáo số 18 năm 2011 trong chuỗi báo cáo đánh giá nguy cơ
nhiễm vi sinh vật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Nông lƣơng thế
giới (FAO) đã thống kê tỉ lệ ngƣời nhiễm E. coli O157:H7/100.000 dân: Tại Liên
minh Châu Âu 1,3 ngƣời; tại Mỹ 1,9 ngƣời; tại Newzeland và Australia 2 ngƣời; tại
Argentina 22 ngƣời...
E. coli O157:H7 thuộc loài E. coli gây xuất huyết ruột (EHEC -
Enterohaemorrhagic E. coli), sinh độc tố Shiga. E. coli O157:H7 là đối tƣợng gây
ngộ độc thực phẩm cực kỳ nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu. Chúng gây tiêu chảy
phân máu, viêm đại tràng xuất huyết. Những trƣờng hợp hoại tử nặng có thể dẫn tới
thủng ruột. Độc tố Shiga còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu, suy thận
(HUS - haemorrhagic uremic syndrome) dẫn tới tử vong. E. coli O157:H7 là tác
nhân gây bệnh nguy hiểm nhƣng dễ dàng bị lây nhiễm ở nhiều thực phẩm thiết yếu
nhƣ nƣớc, rau, thịt sống, thịt chƣa nấu kỹ…Mối nguy E. coli O157:H7 rất lớn do
chủng này có liều gây độc thấp (10 – 100 tế bào), gây dịch tiêu chảy, tốc độ lây lan
nhanh, sinh độc tố Shiga, tỷ lệ gây tan huyết và suy thận cao, dẫn tới tử vong. Hàng
năm, khoảng 15% trẻ em và một tỷ lệ thấp hơn ngƣời lớn nhiễm E. coli O157:H7 và
dẫn tới hội chứng tán huyết, suy thận, trong đó 50% số bệnh nhân phải chạy thận và
5% tử vong. Kể từ khi đƣợc xác định năm 1982 tại Hoa Kỳ, E. coli O157:H7 đã trở
thành mầm bệnh quan trọng nhất trong nhóm các bệnh lây lan qua thực phẩm tại
Hoa Kỳ cũng nhƣ các nƣớc đã phát triển ở Châu Âu và Nhật Bản.
Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An toàn thực phẩm –
Bộ Y tế: Năm 2013 có 5.200 trƣờng hợp bị ngộ độc. Trong đó, E. coli là nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm quan trọng nên rất đƣợc quan tâm nghiên cứu. Tuy đã
có nhiều nghiên cứu về phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm E. coli nói chung nhƣng
1
về E. coli O157:H7 nói riêng chỉ có một số nghiên cứu nhỏ, phân tán, chƣa thỏa
đáng với mức độ nguy hiểm của nó. Để xác định nhanh E. coli O157:H7 còn gặp
nhiều khó khăn, mất nhiều thời gian, đòi hỏi các trang thiết bị, máy móc hiện đại,
phân tích viên có trình độ chuyên môn cao. Do đó, việc phân tích chính xác E. coli
O157:H7 ở nƣớc ta còn hạn chế.
Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp
meros – phần) đƣợc phát hiện từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập của
Ellington và Szostak; Tuerk và Gold). Aptamer có bản chất là acid oligonucleic
hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ với một phân tử đích cụ thể
nhờ sự tƣơng tác cấu trúc trong không gian 3 chiều. Phổ đích của aptamer rất đa
dạng từ ion, phân tử, đại phân tử tới tế bào. Aptamer đã đƣợc ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, tạo cảm biến sinh học,
nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, nghiên
cứu dịch tễ học… Trong một số trƣờng hợp với vai trò nhƣ đầu dò nhận biết phân
tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn dòng.
Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc, xác định E. coli O157:H7 một cách nhanh
chóng, hạ giá thành nên chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo aptamer
đặc hiệu vi khuẩn Escherichia coli O157:H7”.
Mục tiêu của đề tài nhằm xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc và sàng lọc
đƣợc phân tử aptamer có khả năng nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7.
Nội dung nghiên cứu:
- Xây dựng thƣ viện ssDNA và sàng lọc các aptamer liên kết với vi khuẩn E.
coli O157:H7.
- Tách dòng và xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli
O157:H7.
2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Escherichia coli O157:H7
1.1.1. Giới thiệu chung về E. coli O157:H7
Escherichia coli O157:H7 thuộc họ Enterobacteriaceae, chi Escherichia [5].
Chúng là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng di động (hình 1.1). Kích thƣớc:
dài từ 2 - 4 µm, rộng 0.8 - 1µm, có nhiều lông toàn thân và có roi dài khoảng 20
nm. E. coli O157:H7 là sinh vật nhân sơ, DNA có cấu trúc siêu xoắn nằm giữa tế
bào, không có màng nhân bao bọc. E. coli O157:H7 có cấu tạo đơn giản bao gồm:
Lớp ngoài là thành tế bào,có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS). Lớp trong là
màng sinh chất (gồm 1 lớp lipid nằm giữa 2 lớp phospho) bao quanh tế bào chất. Tế
bào chất là phần vật chất dạng keo chứa protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid,
các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lƣợng phân tử thấp [7,8].
Hình 1.1: Cấu tạo tế bào vi khuẩn E. coli O157:H7
DNA của vi khuẩn E. coli O157:H7 gồm hệ gen nhân dài sấp xỉ 5,5 triệu bp,
gồm khoảng 5483 gen và 2 plasmid có chiều dài lần lƣợt là 93 kb và 3,3 kb (hình
1.2 và bảng 1.1). Trong hệ gen nhân chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của vi
khuẩn này là stx1 và stx2 [5,25].
Ở E. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H, trong đó O là kháng
nguyên bề mặt, còn H là kháng nguyên lông roi [5,6].
3
Bảng 1.1: Thông số hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7
Hệ gen pO157 pOSAK1
5,498,450 bp 92,721 bp 3,306 bp Độ dài
50.5 % 47.6 % 43.4 % Tỉ lệ G+C
5,361 83 3 Khung đọc mở (ORF):
88.1 % 82.5 % 52.8 % Vùng mã hóa protein
904 bp 922 bp 579 bp Chiều dài trung bình của các ORF
0 0 7 rRNA (16S-23S-5S)
0 0 103 tRNA và tmRNA
Hình 1.2: Cấu trúc hệ gen của vi khuẩn E. coli O157:H7
4
1.1.2. Đặc tính của E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 là vi sinh vật hiếu kị khí tùy tiện, có khả năng hô hấp và lên
men để trao đổi chất. Chúng không sinh bào tử, tế bào tồn tại dạng đơn lẻ hoặc theo cặp đôi. Vi khuẩn này có thể sinh trƣởng ở dải nhiệt độ rộng từ 80C đến 460C, nhiệt độ tối ƣu là 370C, bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 700C. E. coli O157:H7 sinh truởng đƣợc trên môi trƣờng có pH từ 4,4 đến 9,0; thậm chí ở 370C trong 2 - 7h, nó vẫn có
thể tồn tại đƣợc ở pH = 2,5 [43]; pH tối ƣu khoảng 6 - 7. Vi khuẩn này bị ức chế ở
môi trƣờng có nồng độ muối là 8,5%, chậm phát triển ở nồng độ trên 2,5%. E. coli
O157:H7 sống kí sinh trong hệ tiêu hóa của ngƣời và động vật. Tuy nhiên khi bị phóng thích ra ngoài môi trƣờng chúng vẫn tiếp tục tồn tại 2 - 3 ngày ở 250C, 10 - 31 ngày ở 80C. Điều này càng làm cho chúng có khả năng lan rộng và xâm nhiễm
vào các tế bào vật chủ mới [14].
E. coli O157:H7 có khả năng lên men đƣờng lactose. Trên môi trƣờng Endo
agar khuẩn lạc E. coli O157:H7 tròn, lồi, có ánh kim (hình 1.3).
Hình 1.3: Hình ảnh khuẩn lạc của E. coli O157:H7 trên môi trƣờng Endo agar
và trên môi trƣờng Fluorocult®
E. coli O157:H7 không có khả năng lên men đƣờng sorbitol và cellobise.
Vi khuẩn này không tạo ra -D-glucuronidase do đó không chuyển hóa 4-
methylumbelliferyl--D-glucuronid (MUG) thành 4-methylumbelliferonenên khi
chiếu dƣới đèn UV khuẩn lạc không phát huỳnh quang. Khi nuôi cấy trên môi
trƣờng Fluorocult® có bổ sung sorbitol và 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronid
(MUG), do không có khả năng lên men đƣờng sorbitol, khuẩn lạc có màu xanh nhạt
5
phân biệt với các E. coli khác có màu vàng do lên men đƣợc đƣờng sorbitol. Đây là
đặc điểm đƣợc sử dụng trong xét nghiệm để phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này
[26].
E. coli O157:H7 là loại vi khuẩn có khả năng sinh độc tố. Chúng có khả năng
sinh độc tố Shiga hay còn gọi độc tố Vero. Loại độc tố này không gây hại đối với
động vật nhƣng lại gây nguy hiểm cho ngƣời nhƣ gây tán huyết, suy thận, thậm chí
tử vong [38].
E. coli O157:H7 có hai loại kháng nguyên là O và H. Kháng nguyên thân O
(somatic antigen) là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi lipopolysaccharide,
có trên 150 loại khác nhau. Đặc tính của kháng nguyên O:
- Bền nhiệt, không bị hủy khi đun nóng 100oC trong 2h.
- Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%.
- Bị hủy bởi formol 5%.
- Rất độc, chỉ cần 0,05 mg đủ để giết chuột nhắt sau 24h.
Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng
ngƣng kết O. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của
dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ [7].
Kháng nguyên lông roi H (flagellar antigen): có trên 50 loại khác nhau, cấu
tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các
proteinase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng
ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H [7,20].
1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 là vi khuẩn sinh độc tố. Trong hệ gen nhân của vi khuẩn này
chứa 2 gen mã hóa cho độc tố đặc trƣng của chúng là stx1 và stx2. Trong đó, stx viết
tắt của Shiga – like – toxin [8]. Stx là một ngoại độc tố không bền nhiệt, tác động
lên cả ruột và hệ thần kinh trung ƣơng của ngƣời. Ở ruột, E. coli O157:H7 gây tiêu
chảy, xuất huyết, đồng thời ức chế hấp thu đƣờng và các acid amin ở ruột non. Theo
kết quả nghiên cứu của Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dƣợc Tp. Hồ Chí
6
Minh, năm 1996: Độc tố theo đƣờng máu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến hệ thần
kinh, có thể dẫn đến mê sảng, biến chứng thần kinh trầm trọng: co giật, tê liệt.
Stx1 và Stx2 đều có tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tiểu đơn vị B gắn
với thụ thể đặc hiệu là một glycolipid kí hiệu Gb3 (thụ thể đặc hiệu của Stx2 là
Gb4). Các Gb3 thƣờng thấy ở các tế bào biểu mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào
biểu mô mạch [8]. Stx là một protein có tính kháng nguyên mạnh, mang tính chất
của một ngoại độc tố, các gen mã hóa nằm trên chromosome. stx1 có tính bảo tồn
cao trong khi stx2 rất hay thay đổi về trình tự [19,25].
Tất cả các loại Stx đều có chung một cấu trúc AB5, trong đó một tiểu đơn vị
A kết hợp với năm tiểu đơn vị B. Tiểu đơn vị A có hoạt tính N – Glycosidase xúc
tác cắt một gốc adenin từ 28S rRNA của tiểu đơn vị ribisome 60S trong các tế bào
bị độc tố tác động. Đây là một yếu tố quan trọng trong việc dừng tổng hợp protein
trong tế bào đích. Do không tổng hợp đƣợc protein, những tế bào bị Stx tác động (tế
bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela... hay bất cứ tế bào
nào có thụ thể là Gb3, Gb4) sẽ chết. Tiểu đơn vị A gồm hai phần peptit A1 (27,5
kDa) và A2 (4,5 kDa) liên kết với nhau qua liên kết disulfua. Peptit A1 có hoạt tính
enzyme và peptit A2 có chức năng gắn tiểu đơn vị A vào 5 tiểu đơn vị B [33].
Năm tiểu phần B của các Stx chứa các vị trí liên kết với glycolipid đặc hiệu
trên bề mặt tế bào đích [42]. Cấu trúc phân tử của pentamer Stx1 – B lần đầu tiên
đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chụp ảnh X-ray. Qua đó cho thấy một cấu trúc
gồm năm tiểu đơn vị trong cách sắp xếp pentameric – tƣơng tự nhƣ cách sắp xếp
của các tiểu đơn vị B của enterotoxin không bền nhiệt. Trong một enterotoxin
không bền nhiệt, năm tiểu đơn vị bao quanh một ống mà qua đó các dƣ lƣợng
cacbon của tiểu đơn vị A có thể đi qua. Khi cấu trúc của Stx hoàn thiện, đầu cuối
đuôi cacboxyl của tiểu đơn vị A sẽ đƣợc bao quanh bởi năm tiểu đơn vị B. Trong
khi đó, phần còn lại của tiểu đơn vị A nằm tên một mặt của pentamer tiểu đơn vị B.
7
Cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7:
Cơ chế gây bệnh của E. coli O157:H7 là một quá trình gồm nhiều bƣớc (hình
1.4), liên quan đến sự tƣơng tác phức tạp giữa số lƣợng vi khuẩn, khả năng bám vào
tế bào, khả năng sinh độc tố của vi khuẩn... và các yếu tố của vật chủ [20].
- E. coli O157:H7 xâm nhập qua đƣờng miệng (chỉ cần liều rất thấp), vi
khuẩn phải sống sót trong điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt của dạ dày và phải cạnh
tranh với các vi khuẩn khác ở đƣờng ruột để thiết lập sự định cƣ.
- Định cƣ vào ống tiêu hoá: E. coli O157:H7 có khả năng bám vào tế bào biểu
mô ruột và định cƣ trong ống tiêu hoá ngƣời là một trong những yếu tố quyết định
độc lực. Ngƣời ta ƣớc tính liều gây nhiễm của E. coli O157:H7 khoảng 1–100 CFU
(colony forming unit) [54].
- Sức đề kháng acid của E. coli O157:H7: Nét đặc trƣng của E. coli O157:H7
là khả năng định cƣ ở ống tiêu hóa ngƣời với số lƣợng cảm nhiễm thấp. E. coli
O157:H7 đề kháng đƣợc pH acid của dạ dày. Do đó, chúng vẫn còn sống sót trong
các thực phẩm pH thấp [43]. Tính trạng này đƣợc điều hòa bởi gen rpoS [71]. Gen
này có khả năng giúp vi khuẩn E. coli O157:H7 kéo dài thời gian sống sót ở pH
dƣới 2,5 [54]. Gần đây, đã có nghiên cứu báo cáo tình trạng đột biến của gen này
[71].
- Kiểu bám vào tế bào biểu mô ruột: E. coli O157:H7 phải thiết lập sự định cƣ
này bằng cách bám vào các tế bào biểu mô ruột. Ngƣời ta đã chứng minh rằng yếu
tố bám dính của E. coli O157:H7 đóng vai trò quan trọng trong sự định vị vi khuẩn
ở ruột. Đó là intimin, một protein màng ngoài có trọng lƣợng phân tử 94-97 kDa.
Intimin đƣợc mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching and effacing). Intimin bám dính
vào tế bào và gây tổn thƣơng, phá hủy, gọi là bệnh tích A/E (attaching and
effacing)[20]. Ở E. coli O157:H7 thƣờng gặp dạng -intimin. Có sự liên quan chặt
chẽ giữa gen eae và khả năng gây bệnh trầm trọng của E. coli O157:H7 trên ngƣời,
nhƣ gây hội chứng HC và HUS. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tỉ lệ của các dòng
mang gen eae ở bệnh phẩm ngƣời cao hơn hẳn ở bệnh phẩm của gia súc. Ngoài ra
còn có các yếu tố liên quan đến sự bám dính của các tác nhân khác gây bệnh đƣờng
8
ruột bao gồm fimbriae, OMPs (outer membrance proteins) và LPS
(lipopolysaccharide).
- Vai trò của plasmid 60 MDa (pO157) trong sự bám dính của E. coli
O157:H7: Vi khuẩn này chứa pO157. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện sự hiện diện
của plasmid liên quan đến yếu tố bám (fimbriae) và sự bám dính với tế bào Henle
407 nhƣng không bám vào tế bào HEp-2. Các kết quả nghiên cứu khẳng định rằng
có hiện diện plasmid hay không đều không ảnh hƣởng đến khả năng định cƣ ở kết
tràng của STEC và khả năng gây bệnh tích A/E làm tăng tiết nƣớc vào lòng ruột dẫn
tới tiêu chảy phân nƣớc [68].
Vi khuẩn E. coli O157:H7 sống sót trong đƣờng ruột, nhân lên và sản sinh
Stx. Stx đƣợc hấp thu qua tế bào biểu mô ruột, dẫn truyền vào dòng máu. Điều này
cho phép Stx di chuyển đến bề mặt tế bào đích gồm cả tế bào ruột lẫn các nội quan
khác mà có thụ thể của chúng [54].
Cơ chế gây bệnh củaStx :
Để gây bệnh, trƣớc tiên Stx phải đƣợc tiếp nhận bởi các thụ thể đặc hiệu. Các
nghiên cứu cho thấy Stx có tính gây độc trực tiếp lên tế bào ruột do chúng nhắm
đến thụ thể Gb3 (globotriaosylceramide), dạng thụ thể glycolipid, trên nhung mao
của tế bào biểu mô ruột ở ngƣời (Stx2 có thụ thể là Gb4). Gb3 hoặc Gb4 còn tìm thấy
ở tế bào nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela... [44].
Sau khi làm tổn thƣơng các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô,
xâm nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể
glycolipid, gây tổn thƣơng tế bào nội mạch, tế bào thận (hình 1.4)… Cụ thể là
những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố kết hợp với các thụ thể đặc hiệu này. Sau khi
đƣợc chuyển vào bên trong tế bào, tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu
phần 60S của ribosome, cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó
gây trở ngại cho sự tổng hợp protein. Vì không tổng hợp đƣợc protein, những tế bào
bị Stx tác động sẽ chết [33]. Hậu quả là gây tiêu chảy, viêm kết tràng xuất huyết và
hội chứng huyết niệu.
9
Hình 1.4: Cấu trúc của Shiga – like –toxin và cơ chế gây bệnh
của E. coli O157:H7
Ảnh hƣởng của các loại Stx trong sinh bệnh: Các nghiên cứu dịch tễ đã chỉ ra
rằng những dòng STEC chỉ sản sinh Stx2 thì gây bệnh trầm trọng hơn so với những
dòng STEC chỉ sản sinh Stx1, bệnh càng nặng hơn nếu dòng STEC sản sinh cả Stx1
lẫn Stx2, chẳng hạn nhƣ có thể dẫn tới hội chứng HUS [54].
1.1.4. Bệnh do E. coli O157: H7 gây ra
E. coli O157:H7 là nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng. Chúng
chính thức đƣợc xác định lần đầu tiên năm 1982 tại Michigan, Hoa Kỳ [72]. Từ đó
10
đến nay, E. coli O157:H7 liên tục gây ngộ độc trên toàn cầu: Điển hình nhƣ ở Mĩ,
theo số liệu CDC công bố, hơn 70.000 ngƣời bị ngộ độc mỗi năm do vi khuẩn này
và có gần 60 ngƣời tử vong [86]. Năm 1997, công ty thực phẩm Hudson ở tiểu bang
Nebraska, Hoa Kỳ, phải cho thu hồi khẩn cấp, hủy bỏ 25 triệu cân thịt hamburger
đã bị nhiễm khuẩn E. coli 0157:H7. Tháng 7/1996, tại thành phố Osaka - Nhật bản,
một sự cố nghiêm trọng về ngộ độc đồ ăn, nƣớc uống đƣờng phố do vi khuẩn E.
coli O157:H7 gây nên đã làm trên 8.000 ngƣời bị bệnh, đa số là trẻ em, học sinh
[86]. Năm 2012, 99 nạn nhân tại thành phố Sapporo bị ngộ độc do ăn bắp cải muối
chua bị nhiễm E. coli O157:H7 và có 6 ngƣời tử vong [86]. Theo tạp chí Health
Canada, tháng 5/2000, thành phố Walkerton, Ontario Canada đã có trên 2.000 cƣ
dân ngộ độc nƣớc uống do nhiễm E. coli O157:H7, hậu quả có 7 ngƣời đã thiệt
mạng. Ngày 6/6/2011, nhiễm khuẩn E. coli 0157:H7 tại Đức đã khiến 21 ngƣời
chết, 1.700 ngƣời khác phải nhập viện, nhiều ngƣời trong số này có dấu hiệu rối
loạn chức năng thận nghiêm trọng. Ít nhất 500 ngƣời mắc hội chứng tan huyết urê
(HUS). Đến nay, tại Đức đã ghi nhận 470 ca bị biến chứng nghiêm trọng, trong đó
16 ngƣời đã tử vong. Giới chức Canada đã công bố rau xà lách của hãng đồ ăn
nhanh KFC và Taco Bell bị nhiễm E. coli O157:H7 gây ngộ độc cho 26 trƣờng hợp
trong cuối tháng 12/2012 và đầu tháng 1/2013. Theo CDC đánh giá: 85% các vụ
ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng ở Mỹ là do E. coli O157:H7 gây ra [86].
Ngƣời bị lây nhiễm E. coli O157:H7 là do sử dụng thức ăn hay nƣớc uống đã
bị nhiễm vi khuẩn. Một số ít các trƣờng hợp khác bị lây nhiễm là do tiếp xúc với
động vật mang vi khuẩn này. Triệu chứng điển hình nhất khi bị nhiễm vi khuẩn E.
coli O157:H7 là: tiêu chảy, ói mửa, đau quặn thắt bụng và sốt nhẹ hoặc không sốt,
ngƣời bệnh cảm thấy mệt mỏi, nặng hơn có thể có hiện tƣợng tiêu chảy kèm theo ra
máu. Nguyên nhân: do vi khuẩn E. coli O157:H7 bám vào lớp biểu mô ruột, tiết ra
độc tố verotoxin làm xung huyết, hủy hoại niêm mạc ruột. Triệu chứng này thƣờng
xuất hiện 1-2 ngày sau khi ăn, uống hay tiếp xúc phải nguồn nhiễm khuẩn. Đa số
bệnh nhân sẽ bình phục trong thời gian từ 5 - 10 ngày, từ 3 - 5% trƣờng hợp bệnh
có thể biến chứng sau vài ba tuần lễ và để lại hậu quả nghiêm trọng. Những biến
11
chứng này thƣờng bắt gặp ở ngƣời có hệ miễn dịch yếu, nhất là trẻ em từ 1 - 10 tuổi
và ngƣời cao tuổi [44].
Biến chứng điển hình, nghiêm trọng nhất là hội chứng tan huyết và suy thận;
có khoảng 5 - 10% bệnh nhân bị biến chứng mắc phải hội chứng này. Ngƣời bệnh
bị đi ngoài phân lỏng nhiều lần (tiêu chảy), nặng có kèm theo máu rồi dẫn đến suy
thận, thậm chí có thể tử vong. Bệnh nhân sẽ có những triệu chứng điển hình nhƣ:
bồn chồn, mỏi mệt, da tái, thiếu máu, sƣng phù nề quanh mắt và ở cổ chân cũng nhƣ
lƣợng nƣớc tiểu bài tiết bị suy giảm rất nhiều [53,58]. Ở trẻ em, các triệu chứng trên
vẫn có thể thấy xuất hiện ngay khi triệu chứng tiêu chảy đã bắt đầu chấm dứt và vi
khuẩn E. coli O157:H7 vẫn có thể đƣợc tiếp tục thải ra trong 1 – 2 tuần sau đó [24].
Mặc dù đã đƣợc điều trị nhƣng có đến 30% trong số những bệnh nhân bị biến chứng
nên phải lọc thận suốt đời. Ngoài biến chứng suy thận, khoảng 8% bệnh nhân có thể
bị các biến chứng khác trong một thời gian dài nhƣ áp huyết tăng cao, co giật, tai
biến mạch máu não, mù lòa và bại liệt. Trƣờng hợp xấu nhất sẽ dẫn đến tử vong
[42].
Hiện nay, vẫn chƣa có một loại thuốc đặc trị nào ngăn chặn đƣợc độc tố của
vi khuẩn E. coli O157:H7. Thuốc kháng sinh không những tỏ ra vô hiệu mà còn làm
biến chứng suy thận dễ bộc phát. Hội chứng HUS rất nguy hiểm và cần đƣợc chữa
trị kịp thời bằng cách tiếp dịch truyền, tiếp máu và lọc thận, không nên uống các
loại thuốc điều trị tiêu chảy [54]. Biện pháp tốt nhất để phòng ngừa và ngăn chặn
dịch bùng phát là mọi ngƣời hãy tự giác giữ gìn vệ sinh trong ăn uống, sinh hoạt và
chủ động phòng ngừa:
- Không ăn các loại thức ăn sống, bị ôi, thiu hay nghi ngờ đã nhiễm khuẩn.
- Không dùng sữa chƣa đƣợc tiệt trùng, rau quả chƣa đƣợc rửa sạch.
- Rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng sát khuẩn trƣớc khi ăn và sau khi đi vệ sinh.
- Chú ý vệ sinh nhà bếp và đồ dùng chế biến thức ăn, không để thức ăn sống
lẫn thức ăn chín.
- Sử dụng thức ăn, nƣớc uống đã đƣợc nấu chín kĩ, đun sôi, đƣợc tiệt trùng,
nên bảo quản thức ăn ở trong tủ lạnh nếu không dùng đến.
12
- Cần có biện pháp kiểm tra và đƣa ra những quy chuẩn cho nơi giết mổ chế
biến thịt gia xúc, gia cầm.
1.1.5. Tình hình nghiên cứu E. coli O157: H7 trong và ngoài nước
Từ khi đƣợc xác định năm 1982, nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm
nghiên cứu E. coli O157:H7 do mức độ nguy hiểm và khả năng lây lan của chúng.
Các nghiên cứu đƣợc tiến hành đã xây dựng phần nào bức tranh toàn cảnh về E. coli
O157:H7 từ cấu trúc, hệ gen, protein, độc tố, kháng nguyên, điều kiện tồn tại và
phát triển, cơ chế gây bệnh... Theo nghiên cứu của Doyle và các cộng sự năm 1987,
các loài gia súc (trâu, bò, heo, chó, dê...), gia cầm, các loại thịt tƣơi giết mổ là
nguồn lây nhiễm chính E. coli O157:H7. Động vật nhai lại nhƣ trâu, bò đƣợc xem là
vật mang và phát tán chủ yếu vi khuẩn này ra môi trƣờng xung quanh [7]. Cấu trúc
hệ gen và các gen độc lực stx1, stx2 của E. coli O157:H7 đã đƣợc giải trình tự,
trong đó vi khuẩn mang gen stx2 và các biến thể của chúng, stx2c, có mức độ gây
độc càng nghiêm trọng, dễ dẫn tới hội chứng HUS [8,19,33]. Vi khuẩn E. coli
O157:H7 gây bệnh nghiêm trọng do chúng sản sinh độc tố Shiga [11]. Các nghiên
cứu dịch tễ học về ngộ độc thực phẩm do E. coli O157:H7 gây ra đƣợc chú ý, thống
kê, nghiên cứu, xác định đƣợc con đƣờng lây nhiễm, cơ chế gây bệnh, làm rõ các
hội chứng HC, HUS và cách điều trị [7,25,57]. Các phƣơng pháp phát hiện E. coli
O157:H7 bao gồm: phƣơng pháp vi sinh truyền thống [26]; các kỹ thuật sinh học
phân tử nhƣ multiplex – PCR phát hiện các gen độc lực stx1, stx2 [17,24]; xác định
và phân biệt các gen biến thể stx2c, stx2d, stx2 bằng phƣơng pháp PCR-RFLP [60]
và gen biến thể stx2g bằng phƣơng pháp PCR; sử dụng đầu dò DNA để xác định
độc tố ruột của E. coli O157:H7 [42]; sử dụng phản ứng kháng nguyên – kháng thể
để xác định E. coli O157:H7 [39]. Và các kit phát hiện E. coli O157:H7 đƣợc bán
trên thị trƣờng gồm: Kit của hãng Gibco BRL Life Technology, Mỹ; Kit IQ – Test
E. coli O157:H7 (Kit #357-8114) của BioRad; Kit TaqMan® E. coli O157:H7 và
MicroSEQ® phát hiện E. coli O157:H7 của Applied Biosystems Pathogen
Detection System; Kit phát hiện E. coli O157:H7 PCR của Norgen...
13
Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về E. coli O157:H7. Các nghiên
cứu về các gen độc lực để phục vụ việc phát hiện E. coli O157:H7 nhƣ: Sử dụng kỹ
thuật multiplex – PCR phát hiện gen độc lực của E. coli O157:H7 đƣợc phân lập từ
phân và thịt bò [5]; xác định các gen độc tố stx và eae gây bệnh của E. coli
O157:H7 phân lập đƣợc từ thịt bò khu vực Hà Nội và thử nghiệm khả năng gây
bệnh tích trên tế bào Vero để xác định các chủng có khả năng sinh độc tố [6]. Thiết
lập quy trình phản ứng Sandwich - ELISA phát hiện kháng nguyên lông roi của E.
coli O157:H7 trong thịt bò dựa trên kháng thể đa dòng (tạo từ thỏ) và hai kháng thể
đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7 [6]. Nghiên cứu xác định các điều kiện tối
ƣu trong quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên H7 của
vi khuẩn E. coli O157:H7[6]. Xác định và phân tích một số gen kháng kháng sinh
của 34 chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc phân lập từ trâu, bò khỏe mạnh tại
một số tỉnh Nam Trung Bộ [3]. Các nghiên cứu về hệ gen của E. coli O157:H7 cũng
đƣợc tiến hành: Tách dòng và xác định trình tự gen stx1 và stx2 của vi khuẩn E. coli
O157:H7 ở Việt Nam, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi
khuẩn E. coli O157:H7 [4].
1.2. Tổng quan về aptamer
1.2.1. Giới thiệu về aptamer
Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp
meros – phần) có bản chất là acid oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả
năng liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với một phân tử đích cụ thể (hình 1.5). Aptamer
đƣợc phát hiện từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập Ellington và Szostak;
Tuerk và Gold [22,67].
14
Hình 1.5: Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và
neomycin
Aptamer đƣợc tạo ra theo con đƣờng nhân tạo. Aptamer đƣợc sàng lọc bằng
phƣơng pháp SELEX – Systematic Evolution of Ligans by Exponential enrichment
[67]. Quá trình sàng lọc bắt đầu với thƣ viện oligonucleotide lớn ngẫu nhiên. Các
chuỗi oligonucleotit đƣợc ủ với phân tử đích và qua nhiều vòng sàng lọc để lựa
chọn những phân tử có ái lực cao với phân tử đích. Sau đó, sử dụng PCR để
khuếch đại aptamer mong muốn. Đƣợc tổng hợp từ những năm 1990 đến nay,
aptamer đã đƣợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán
các mối nguy, tạo cảm biến sinh học, nghiên cứu y dƣợc, điều trị ung thƣ, tạo
thuốc phân tử, điều trị lâm sàng… Phổ đích của aptamer rất đa dạng: từ các ion,
các phân tử, các chất, thậm chí cả tế bào [9,14,35,46,47,48,51,70]. Aptamer còn có
khả năng phát hiện các chất độc hoặc các chất không có hoạt tính miễn dịch. Một
số aptamer đã đƣợc nghiên cứu có hằng số phân ly (Kd) trong phạm vi nanomol
hoặc picomol [2]. Trong một số nghiên cứu về đầu dò nhận biết các phân tử đã
chứng minh rằng aptamer có ái lực liên kết thậm chí vƣợt qua các kháng thể đơn
dòng [18,30,51,81]. Đã có Kit thƣơng phẩm của aptamer để nhận biết các phân tử:
EGFR (ErbB1), INSR (Isulin Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-
MET)…[85] và một số thuốc thƣơng phẩm đƣợc xây dựng trên nền tảng aptamer.
Hơn thế, aptamer còn có nhiều ƣu điểm so với các kháng thể (Bảng 1.2). Do đó,
aptamer nhân tạo đang rất đƣợc kỳ vọng là một công cụ đa năng, góp phần giải
15
quyết nhiều vấn đề: những căn bệnh nan y nhƣ HIV, ung thƣ… với giá thành ngày
càng giảm.
1.2.2. Ưu điểm của aptamer so với kháng thể
Sử dụng aptamer có nhiều ƣu điểm hơn so với sử dụng các kháng thể (bảng
1.2) [85]. Thứ nhất, aptamer dễ tổng hợp và tinh sạch hơn kháng thể. Sản xuất
kháng thể khó hơn, đòi hỏi phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và
quá trình tinh sạch phức tạp hơn. Trong một số trƣờng hợp sử dụng aptamer sẽ
tránh đƣợc quá trình nhận biết nhầm các protein đích có cấu trúc tƣơng tự nhƣ
protein nội sinh, hoặc các hợp chất độc hại, dẫn đến gây sốc hoặc chết đối tƣợng xử
lý. Thứ hai, giá thành sản xuất aptamer thấp hơn, thời gian sàng lọc ngắn hơn so với
việc sản xuất các kháng thể. Thứ ba, phổ phân tử đích của aptamer rất rộng so với kháng thể, từ những phân tử nhỏ nhƣ ion kim loại Na+, Zn2+ [66], lysozyme [55],
thrombin [46,47], yếu tố đáp ứng miễn dịch truyền của virus HIV (HIV TAR)
[14], hemin [61], interferon γ [35],yếu tố tăng trƣởng nội mô mạch máu (VEGF),
[70], kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt (PSA) [61], dopamine [9]…đến những
đại phân tử, thậm chí tế bào [16,45,46,]. Thứ tƣ, aptamer nhân tạo ổn định hơn
trong hầu hết các điều kiện môi trƣờng so với kháng thể. Thứ năm, aptamer có hạn
sử dụng dài hơn và có thể biến tính thuận nghịch mà không mất đặc tính so với
kháng thể. Thứ sáu, aptamer có khả năng liên kết với các phân tử không có tính
miễn dịch hoặc các cơ chất có tính độc hại, độc tố. Thứ bảy, aptamer có thể dễ dàng
thay đổi với thuốc nhuộm, nhãn đánh dấu và các nhóm bề mặt mà không ảnh hƣởng
ái lực của chúng. Cuối cùng, aptamer có khả năng cải biến hóa học linh hoạt để ứng
dụng cho những mục đích sử dụng khác nhau.
16
Bảng 1.2: So sánh ƣu điểm của aptamer và kháng thể
Đặc điểm so sánh Aptamer Kháng thể
Có Không Tổng hợp hóa học
Cao hơn Thấp hơn Chất lƣợng
Thấp hơn Cao hơn Giá thành sản xuất
Dài hơn Ngắn hơn Thời gian sử dụng
Mức độ ổn định trong các Cao hơn Thấp hơn điều kiện môi trƣờng
Nhận biết phân tử đích là
Có Không các chất, phân tử độc, không
có hoạt tính miễn dịch
Khả năng biến tính thuận Cao hơn Thấp hơn nghịch
Dễ dàng mà không Khó, dễ ảnh hƣởng Thay đổi chất đánh dấu,
ảnh hƣởng hoạt tính hoạt tính sinh học của nhóm bề mặt
của aptamer kháng thể
1.2.3. Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment) để sàng lọc aptamer
Phƣơng pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment) là phƣơng sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng
hợp in vitro oligonucleotit (có thể là ssDNA, dsDNA, RNA, các đoạn peptit) có khả
năng liên kết với phối tử, mục tiêu phối tử (phân tử đích) (hình 1.6) [22]. Trong quá
trình sàng lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3
quá trình: chọn lọc những trình tự oligonucleotit (aptamer) gắn với phân tử đích từ
thƣ viện oligonucletit ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả
năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích [22,67].
17
Hình 1.6: Quy trình Phƣơng pháp Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment (SELEX)
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bắt đầu từ một thƣ viện oligonucleotit
DNA [22, 67] ngẫu nhiên.
5’ 3’
Vùng cố định Vùng ngẫu nhiên Vùng cố định
Hình 1.7: Sơ đồ aptamer ssDNA Thƣ viện này gồm ssDNA có độ đa dạng cao (khoảng 1015 phân tử). Mỗi
ssDNA có một vùng trung tâm là các trình tự ngẫu nhiên có n = 20 - 80 nucleotit
đƣợc gắn với hai đầu là những trình tự cố định (vùng cố định này là vị trí gắn mồi
18
cho PCR) gồm khoảng 18 – 21 nucleotit (hình 1.7). Kích thƣớc của vùng ngẫu
nhiên gồm n nucleotit quyết định sự phức tạp của thƣ viện, có thể tính đơn giản là 4n phân tử. Ví dụ, khi lựa chọn vùng ngẫu nhiên gồm 40 nucleotit sẽ tạo ra 440 phân
tử khác nhau. Việc lựa chọn số lƣợng nucleotit thích hợp trong vùng ngẫu nhiên
giúp tăng khả năng sàng lọc đƣợc những phân tử aptamer có ái lực cao, bền vững
với phân tử đích. Trong các thí nghiệm đã đƣợc tiến hành về aptamer, sử dụng phƣơng pháp SELEX chọn lọc trong thƣ viện ban đầu có 109 đến 1014, 1015 phân tử,
đồng nghĩa với việc lựa chọn vùng ngẫu nhiên có số nucleotit khoảng 20 – 80 [16].
Để tăng tính phức tạp của thƣ viện oligonucleotit, ta có thể sử dụng thƣ viện
oligonucleotit đƣợc cải biến hóa học, cung cấp những khả năng mới cho sự tƣơng
tác với những phân tử đích, nhƣ tăng cƣờng sự bền vững của cấu hình
oligonucleotit. Cải biến đƣợc sử dụng khá phổ biến ở đây là thay thế nhóm 2’ – OH
của nucleotit prymidine thành nhóm 2’ – NH2. Sự cải biến này giúp bảo vệ các
RNA không bị thoái hóa do các enzyme nuclease phân hủy. Hàng loạt các dUTP
mang acid amin đƣợc cải biến ở vị trí cacbon số 5 sẽ giúp tăng cƣờng quá trình cải
biến của DNA. Những cải biến này đã đƣợc ứng dụng cho quá trình chọn lọc
aptamer nhƣ sử dụng cho các thí nghiệm chọn lọc in vitro sàng lọc aptamer gắn với
phân tử đích dạng anion [9].
Quá trình sàng lọc, dung dịch aptamer đƣợc ủ với những phân tử đích trong
đệm, nhiệt độ phù hợp. Sau đó, sử dụng các kỹ thuật khác nhau để tách các phức
hợp aptamer – đích ra khỏi những phân tử không gắn đặc hiệu. Sử dụng màng
nitrocellulose là phƣơng pháp phổ biến để tách những phân tử protein. Ngoài ra,
một số phƣơng pháp nhƣ cố định các phân tử đích vào một phức hệ đặc biệt nhƣ
sepharose, agarose hay hạt từ tính cũng là những phƣơng pháp đƣợc sử dụng cho
giai đoạn tách. Những trình tự gắn đặc hiệu đã thu đƣợc sau giai đoạn phân tách
đƣợc giải hấp và khuếch đại để cung cấp thƣ viện cho vòng sàng lọc sau [18]. Quá
trình chọn lọc và khuếch đại này đƣợc lặp lại cho đến khi sàng lọc đƣợc aptamer có
ái lực cao nhất với phân tử đích. Phân tử aptamer đƣợc lựa chọn sẽ đƣợc chuyển
sang quá trình tách dòng và giải trình tự [16,22,67].
19
1.2.4. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước
Tình hình nghiên cứu chung về aptamer trong và ngoài nƣớc
Với những ƣu điểm vƣợt trội nhƣ trên, aptamer đã và đang trở thành nhóm
chất có nhiều tiềm năng đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: tạo
cảm biến sinh học, phát hiện các tác nhân mong muốn, phát hiện độc tố, tạo thuốc,
vận chuyển thuốc, điều trị bệnh, nghiên cứu dịch tễ học…
Hiện nay có nhiều nghiên cứu tập trung vào khả năng ứng dụng của aptamer.
Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: aptamer đƣợc sử dụng để phát hiện
kháng sinh tồn dƣ trong sản phẩm nhƣ streptomycin, tobramycin, neomycin [12].
Aptamer đƣợc sử dụng để phát hiện độc tố nấm ở nồng độ nano gram: mycotoxin
[10], ochratoxin A (OTA), fumonisin B1 (FB1), nephrotoxin [10,13], các kết quả
nghiên cứu đã đƣợc dùng tạo các kit thƣơng phẩm. Chúng còn đƣợc sử dụng để
phát hiện các kim loại nặng có trong nƣớc uống nhƣ arsen [38], thủy ngân trong cá,
sữa [69]. Aptamer RNA đƣợc sử dụng làm nền tảng để phát hiện các chất độc nhƣ
bisphenol A (BPA) tồn tại trong giấy gói thực phẩm, hộp bảo quản thức ăn, bình
sữa (theo FDA 2010), melamin [72], thuốc trừ sâu: dƣ lƣợng melachite green (MG)
trong cá, trứng, sữa [27,63].
Các kit thƣơng phẩm của aptamer trên thị trƣờng để nhận biết các phân tử:
EGFR (ErbB1), INSR (Isulin Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-
MET)...[85].
Aptamer đƣợc sử dụng cho việc sản xuất thuốc thƣơng phẩm. Thuốc thƣơng
phẩm đầu tiên là natri pegaptanib dạng tiêm với tên lƣu hành là Macugen của công
ty Eyetech/Pfizer đƣợc cấp phép sản xuất năm 2000. Đây là thuốc kháng VEGF –
165 (yếu tố nội mô tăng trƣởng mạch máu), giúp điều trị các bệnh lý ở mắt và tính
thấm thành mạch để điều trị neovascularization liên quan đến thoái hóa điểm vàng
do tuổi tác [50]. Chúng có bản chất là aptamer RNA kháng VEGF – 165 và các
đồng vị chủ yếu của VEGF – 165. Từ đó, đã có nhiều thuốc dựa trên các nghiên cứu
về aptamer đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh nhƣ: AS1411, aptamer DNA liên kết
đặc hiệu với necleolin, dùng cho bệnh bạch cầu. ASRC1779, aptamer DNA liên kết
20
đặc hiệu với willebrand, dùng cho hội chứng nghẽn động mạch vành cấp tính.
NU172, DNA aptamer liên kết đặc hiệu thrombin, dùng để hạn chế hình thành máu
đông trong quá trình phẫu thuật tim mạch [45]. Aptamer đƣợc nghiên cứu để sử
dụng trong điều trị HIV [74]. Các tác nhân gây bệnh AIDS là một retrovirus mà sử
dụng vỏ glycoprotein (MT) gp160 để ràng buộc và lây nhiễm sang các tế bào T.
Gp120 liên kết với các thụ thể tế bào T CD4 và một trong những chemokine đồng
thụ là CCR5 hoặc CXCR4 và làm trung gian kết hợp giữa các hạt virus và máy chủ
T-tế bào. Aptamer liên kết siRNAs hạn chế sự liên kết của gp120 với thụ thể của tế
bào ngƣời để ngăn cản sự xâm nhập của virus [84].
Ngoài ra, aptamer có rất nhiều ứng dụng trong điều trị ung thƣ: Aptamer
kháng Tenascin – C (TN – C) có thể hạn chế phát triển khối u thần kinh đệm, u vú.
TN – C là một protein ngoại bào liên quan trong quá trình sửa chữa mô. Nó đƣợc
biểu hiện quá mức trong chất nền của khối u tăng cƣờng sự hình thành mạchtăng
cƣờng xâm lấn của khối u [77]. PSMA là một loại metallopeptidase màng liên quan
đến biểu hiện quá mức trên bề mặt của tế bào ung thƣ. PSMA cũng đƣợc biểu hiện
trong các mạch máu của nhiều khối u rắn khác. Các nghiên cứu sử dụng aptamer để
ức chế hoạt động enzyme (N-acetyl-αliên kết dipeptidase) của PSMA bằng cách
aptamer sẽ mang siRNA gắn với các tế bào biểu hiện PSMA. Do đó, khối u sẽ bị ức
chế biểu hiện và phát triển [41].
Trong khi đó, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới ở Việt Nam. Ban đầu đã
có một số nghiên cứu, ứng dụng: Nghiên cứu tạo aptamer tái tổ hợp đặc hiệu tế bào
ung thƣ máu dạng Lơ xê mi cấp dòng lympho (ALL) ứng dụng trong chẩn đoán và
điều trị. Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế tạo và sử dụng bộ kit phát hiện
kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano (sử dụng aptamer). Nghiên cứu tổng hợp
các aptamer ức chế protease HIV của Đại học Khoa học Tự nhiên. Trƣờng Đại học
Nông nghiệp Hà Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật
liệu nano để phát hiện tồn dƣ của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các ion kim
21
loại nặng... trong sản phẩm nông nghiệp và môi trƣờng. Và các nghiên cứu để phát
hiện các loại virus gây bệnh trên động và thực vật.
Tình hình nghiên cứu aptamer nhận biết đặc hiệu vi khuẩn E. coli
O157: H7 trong và ngoài nƣớc
Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về aptamer nhận biết đặc hiệu vi
khuẩn E. coli O157:H7. Một cảm biến sinh học dựa trên aptamer để phát hiện E.
coli O157:H7 bằng phản ứng đo màu có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Các aptamer
nucleic liên kết với polydiacetylene kích thƣớc nano, sau đó đƣợc sử dụng để phát
hiện E. coli O157:H7. Các aptasensor có thể phát hiện nồng độ tế bào trong phạm vi 104 - 108 CFU/ml trong vòng 2h và độ đặc hiệu là 100% trên 237 mẫu thử nghiệm
[80]. Phát triển các xét nghiệm PCR Real time và huỳnh quang có độ nhạy cao dựa
trên aptamer DNA để xác định một cách nhanh chóng và hiệu quả E. coli O157:H7
[40]. Trong một nghiên cứu dựa trên một phối tử RNA aptamer có thể xác định tác
nhân gây bệnh E. coli O157:H7 bằng phƣơng pháp SELEX [76,82]. Trƣớc hết,
aptamer đƣợc sàng lọc loại trừ với E. coli K12, sau đó sàng lọc với E. coli
O157:H7, aptamer liên kết với các type huyết thanh O157:H7. Nghiên cứu cảm biến
sinh học dựa trên aptamer (aptasensors) đƣợc gắn đánh dấu. Hạt nano vàng gắn với
aptamer liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7. Nhận biết sự liên kết đƣợc phát hiện qua
vệt màu đỏ – tím phụ thuộc theo nồng độ muối [73].
Tại nƣớc ta, quá trình nghiên cứu về aptamer mới chỉ bắt đầu. Hiện nay,
chƣa có công bố nào về việc nghiên cứu, sử dụng aptamer để nhận biết đặc hiệu vi
khuẩn E. coli O157:H7.
1.2.5. Hạt nano vàng
Hạt nano vàng là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thƣớc nano đƣợc tạo
thành từ kim loại vàng. Phải đến năm 1857, khi Michael Faraday nghiên cứu một
cách hệ thống các hạt nano vàng thì các nghiên cứu về phƣơng pháp chế tạo, tính
chất và ứng dụng của các hạt nano kim loại mới thực sự đƣợc bắt đầu.
Có hai phƣơng pháp để tạo vật liệu nano, phƣơng pháp từ dƣới lên và
phƣơng pháp từ trên xuống. Phƣơng pháp từ trên xuống là phƣơng pháp tạo vật liệu
22
nano từ vật liệu khối ban đầu. Phƣơng pháp từ dƣới lên là tạo hạt nano từ các ion
hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau. Đối với hạt nano kim loại nhƣ hạt nano
vàng thì phƣơng pháp thƣờng đƣợc áp dụng là phƣơng pháp từ dƣới lên. Nguyên tắc là khử các ion kim loại nhƣ Au+ để tạo thành các nguyên tử Au0. Các nguyên tử
sẽ liên kết với nhau tạo ra hạt nano vàng.
Để tổng hợp các hạt nano vàng, các nhà vật lý sử dụngphƣơng pháp khử hóa
học. Đây là phƣơng pháp dùng các tác nhân hóa học để khử ion kim loại thành kim
loại. Thông thƣờng các tác nhân hóa học ở dạng dung dịch lỏng. Dung dịch ban đầu có chứa muối kim loại nhƣ HAuCl4. Tác nhân khử ion kimloại Au+ thành Au0 ở đây
là các chất hóa học nhƣ Citric acid, vitamin C, Sodium Borohydride NaBH4,
Ethanol (cồn), Ethylene Glycol (phƣơng pháp sử dụng các nhóm rƣợu đa chức còn
gọi là phƣơng pháp polyol). Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết
tụ thành đám, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt
nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc dùng phƣơng pháp bao bọc chất hoạt hóa
bề mặt. Phƣơng pháp tĩnh điện đơn giản nhƣng bị giới hạn bởi một số chất khử.
Phƣơng pháp bao phủ phức tạp nhƣng vạn năng hơn, hơn nữa phƣơng pháp này có
thể làm cho bề mặt hạt nano có các tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt
nano vàng kích thƣớc từ 10 – 100nm có thể đƣợc chế tạo từ phƣơng pháp này.
Hạt nano kim loại có hai tính chất khác biệt so với vật liệu khối đó là hiệu
ứng bề mặt và hiệu ứng kích thƣớc. Tuy nhiên, do đặc điểm các hạt nano có tính
kim loại, tức là có mật độ điện tử tự do lớn thì các tính chất thể hiện có những đặc
trƣng riêng khác với các hạt không có mật độ điện tử tự do cao.
Một trong những tính chất vật lý của các hạt nano vàng đƣợc quan tâm nhất
là tính chất quang học: Hiện tƣợng cộng hƣởng Plasmon bề mặt (surface plasmon
resonance) do điện tử tự do trong hạt nano hấp thụ ánh sáng chiếu vào. Kim loại có
nhiều điện tử tự do, các điện tử tự do này sẽ dao động dƣới tác dụng của điện từ
trƣờng bên ngoài nhƣ ánh sáng. Thông thƣờng các dao động bị dập tắt nhanh chóng
bởi các sai hỏng mạng hay bởi chính các nút mạng tinh thể trong kim loại khi quãng
đƣờng tự do trung bình của điện tử nhỏ hơn kích thƣớc. Nhƣng khi kích thƣớc của
23
kim loại nhỏ hơn quãng đƣờng tự do trung bình thì hiện tƣợng dập tắt không còn
nữa mà điện tử sẽ dao động cộng hƣởng với ánh sáng kích thích. Do vậy, tính chất
quang của hạt nano đƣợc có đƣợc do sự dao động tập thể của các điện tử dẫn đến từ
quá trình tƣơng tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động nhƣ vậy, các điện tử sẽ
phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực điện tạo thành một lƣỡng
cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hƣởng phụ thuộc vào nhiều yếu tố
nhƣng các yếu tố về hình dáng, độ lớn của hạt nano và môi trƣờng xung quanh là
các yếu tố ảnh hƣởng nhiều nhất. Ngoài ra, mật độ hạt nano cũng ảnh hƣởng đến
tính chất quang. Nếu mật độ loãng thì có thể coi nhƣ gần đúng hạt tự do, nếu nồng
độ cao thì phải tính đến ảnh hƣởng của quá trình tƣơng tác giữa các hạt.
1.2.6. Chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, viết tắt:
TEM) là một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng
lƣợng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo
ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn
huỳnh quang, hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
Cấu tạo và nguyên lý làm việc của kính hiển vi điện tử truyền qua:
Trong TEM, điện tử đƣợc sử dụng thay cho ánh sáng (trong kính hiển vi
quang học). Điện tử đƣợc phát ra từ súng phóng điện tử. Có hai cách để tạo ra chùm
điện tử là sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử và sử dụng súng phát xạ trƣờng.
24
Hình 1.8: Cấu tạo của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Vì trong TEM sử dụng chùm tia điện tử thay cho ánh sáng khả kiến nên việc
điều khiển sự tạo ảnh không còn là thấu kính thủy tinh nữa mà thay vào đó là các
thấu kính từ. Thấu kính từ thực chất là một nam châm điện có cấu trúc là một cuộn
dây cuốn trên lõi làm bằng vật liệu từ mềm. Từ trƣờng sinh ra ở khe từ sẽ đƣợc tính
toán để có sự phân bố sao cho chùm tia điện tử truyền qua sẽ có độ lệch thích hợp
với từng loại thấu kính. Tiêu cự của thấu kính đƣợc điều chỉnh thông qua từ trƣờng
ở khe từ, có nghĩa là điều khiển cƣờng độ dòng điện chạy qua cuộn dây. Vì có dòng
điện chạy qua, cuộn dây sẽ bị nóng lên do đó cần đƣợc làm lạnh bằng nƣớc hoặc
nitơ lỏng.
Sự tạo ảnh trong TEM: Xét trên nguyên lý, ảnh của TEM vẫn đƣợc tạo theo
các cơ chế quang học, nhƣng tính chất ảnh tùy thuộc vào từng chế độ ghi ảnh. Điểm
khác cơ bản của ảnh TEM so với ảnh quang học là độ tƣơng phản khác so với ảnh
trong kính hiển vi quang học và các loại kính hiển vi khác. Nếu nhƣ ảnh trong kính
hiển vi quang học có độ tƣơng phản chủ yếu đem lại do hiệu ứng hấp thụ ánh sáng
thì độ tƣơng phản của ảnh TEM lại chủ yếu xuất phát từ khả năng tán xạ điện tử.
25
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid
- E. coli ATCC 25922, E. coli DH5α, E. coli O157:H7 ATCC 43895 đƣợc
cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào động vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam
- Vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen)
- Cặp mồi
- Thƣ viện ssDNA
2.1.2. Hóa chất
- Cao nấm men, tryptone, agar, ampicilin, kanamycin, chloroform,
isoamylalcohol, agarose, SDS, Etbt, nƣớc khử ion 2 lần, nƣớc đã xử lý RNA và
DNA, methanol, Tween 20%, sữa, MgCl2, dung dịch gốc của dNTPs (Hybaid,
Germany)…
- Enzyme λ exonuclease, Taq Polymerase (Promega, Germany)
- Màng PVDF – Polyvilidene Fluoride (Pall, Mexico)
- BSA – Bovine Serum Albumin (Sigma)
- Bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose (QIA gen), kit tách dòng TOPO – TA
(Invitrogen)
- Hạt nano vàng đƣợc cung cấp bởi Viện Vật lý – Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.1.3. Thiết bị và máy móc
- Tủ cấy vô trùng
- Lò vi sóng
- Máy Vortex
- Máy ly tâm
- Cân điện tử, cân phân tích
- Tủ lạnh sâu (-20ºC, - 80ºC)
- Máy đo pH
26
- Máy soi gel
- Máy lắc, ổn nhiệt
- Bể ổn nhiệt
- Máy điện di
- Máy Nano drop
- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
- Pipetman và các đầu côn các loại.
- Các loại cốc đong, bình định mức, đĩa peptri, que cấy, ống facol, ống
eppendrof...
- Và các thiết bị khác của Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen,
Phòng Công nghệ Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
họcvà Công nghệ Việt Nam
2.1.4 . Môi trường và dung dịch
- Dung dịch I: Tris – HCl 50mM; pH=8,0; EDTA 10nM; pH=8,0; Glucose
50mM
- Dung dịch II: NaOH 0,2M; SDS 1%
- Dung dịch III: Đệm acetate kali 3M, pH 5,5; Acid acetic băng 11,5%
- Dung dịch phenol:chloroform:isomylalcohol (25:24:1)
- TE: Tris – HCl 1M, pH=8,0; EDTA 0,5M; pH=8,0
- TAE 50X: Tris – base 121g; Acid acetic băng 28,6ml; EDTA 0,5M ;
pH=8,0, nƣớc cất vừa đủ 500ml
- PBS 10X: Na2HPO4 80,6mM; KH2PO4 19mM; KCl 27nM; NaCl 1,37M;
pH=7,4; nƣớc khử ion
- Gel agarose 0,8% pha trong TAE
- Ethidium bromide dung dịch gốc: (10mg/ml) 1g ethidium bromide; 100ml
H2O. Quấy vài giờ bằng máy khuấy từ cho tan đều. Giữ dung dịch trong lọ tối ở
nhiệt độ phòng. Khi dùng pha 20µl dung dịch gốc trong 100 ml đệm TAE 1X
- Đệm tra mẫu DNA (loading Buffer): Tris HCl 1M, pH=8,0, 1ml; EDTA
0,5M, pH=8,0, 0,2 ml; Glycerol 2ml; Bromphenol blue 1% , 2ml
27
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB lỏng: Cao nấm men 0,5%; Trypton 1%;
Nacl 0,5%
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB đặc: Môi trƣờng nuôi cấy LB lỏng bổ
sung 1,5% agar
- Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn LB đặc + karamycin: Môi trƣờng nuôi cấy
LB đặc bổ sung 50µg/ml karamycin
Các môi trƣờng trên đƣợc khử trùng ở 121ºC, 1atm, 15 phút. Kháng sinh
đƣợc bổ sung sau khi khử trùng môi trƣờng và nhiệt độ giảm xuống còn 50ºC.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Chuẩn bị vi khuẩn: E. coli DH5α, E. coli O157:H7 ATCC, E. coli ATCC
25922.
- Chuẩn bị môi trƣờng, dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn vô trùng.
- Sử dụng tủ cấy vi sinh đã vô trùng:
+ Chuyển môi trƣờng LB lỏng đã đƣợc khử trùng ra ống nuôi.
+ Bổ sung dịch vi khuẩn (đã chuẩn bị) vào ống nuôi theo tỉ lệ 1-2% so
với thể tích môi trƣờng trong ống.
- Ống nuôi đƣợc nuôi lắc trên máy lắc 200v/ph ở 37ºC qua đêm.
2.2.2. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu E. coli 0157:H7
Chuẩn bị thƣ viện
Chuẩn bị một thƣ viện ssDNA có trình tự 5’- ATC CGT CAC ACC TGC
TCT CAT ATG – N36– ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTTC - 3’ nhận từ
phòng Công nghệ Tế bào động vật đƣợc sử dụng để làm nguyên liệu cho quá trình
sàng lọc. Trƣớc tiên, tiến hành PCR thƣ viện để tạo lƣợng phân tử đủ lớn cho quá
trình sàng lọc.
Cặp mồi đã cải biến sau đây đƣợc gắn vào đầu 5’ và 3’ của các phân tử
ssDNA trong thƣ viện để sử dụng cho quá trình khuếch đại:
- Mồi ApF2 : 5’ - ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG - 3’
28
- Mồi ApR2 Ph: 5’ Photphoryl – ATA CGG GAGA CCA ACA CCA AAG
CTTC – 3’.
PCR đƣợc thực hiện với thành phần và chu kỳ đƣợc trình bày trong bảng 2.1 và
chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen làm giàu thƣ viện trong bảng 2.2.
Bảng 2.1: Thành phần hỗn hợp PCR khuếch đại các trình tự gen
làm giàu thƣ viện
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
10X Dung dịch đệm 2,5
10nM dNTPs 2,5
25mM 1,25 MgCl2
10pmol/µl Mồi xuôi 1
10pmol/µl Mồi ngƣợc 1
10 – 100 ng/µl DNA khuôn 2
Taq- polymease 5 unit/µl 0,3
14,45 H2O
Tổng thể tích 25
Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen
làm giàu thƣ viện
Nhiệt độ 94 94 55 72 72 8 (ºC)
3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞ Thời gian
20 chu kỳ
Sau quá trình khuếch đại, thu đƣợc một lƣợng lớn các oligonucletit sợi đôi.
Tuy nhiên, chỉ có ssDNA mới có thể cuộn gấp tạo cấu trúc không gian để liên kết
với vi khuẩn E. coli O157:H7. Do đó, trƣớc mỗi vòng sàng lọc, sản phẩm PCR cần
29
đƣợc xử lý để tạo ssDNA. Enzyme lamda exonuclease đƣợc sử dụng cho quá trình
tạo sợi đơn.
Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn:
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tạo ssDNA
Thành phần Thể tích (μl)
Sản phẩm PCR 20
Dung dịch đệm 4
Enzyme 2
14 H2O
Tổng thể tích 40
Trộn đều các hợp phần phản ứng (bảng 2.3), ủ 4h, nhệt độ 37ºC. Cuối cùng,
ssDNA sẽ đƣợc thu lại bằng cách tủa. Cách thực hiện nhƣ sau:
Bƣớc 1: 0,475µl EDTA 0,5M và 150µl ethanol 10% đƣợc thêm vào mỗi ống
mẫu, giữ ở - 20ºC, trong 2,5h.
Bƣớc 2: Ly tâm 12000 v/ph, 20 phút. Loại dịch nổi, thu cặn.
Bƣớc 3: Bổ sung 30µl H2O vào mỗi ống.
Bƣớc 4: Sau khi thu đƣợc sản phẩm ssDNA, tiến hành xử lý biến tính ở 95ºC
trong 5 phút, sau đó đƣợc đƣa xuống 4ºC giữ 15 phút rồi ủ ở 25ºC trong 7 phút để
ssDNA cuộn xoắn theo cấu trúc thứ cấp đặc thù.
Sàng lọc:
Việc lựa chọn một aptamer đặc hiệu E. coli O157:H7 đƣợc thực hiện bằng
cách ủ tế bào đích với ssDNA và ly tâm loại bỏ những thành phần không mong
muốn. Tế bào E. coli O157:H7 và tế bào E. coli thƣờng đƣợc nuôi trong môi trƣờng
LB cho tới khi đạt pha log, ly tâm thu tế bào và rửa tế bào bằng dung dịch đệm. Sau
đó sử dụng các tế bào này để tiến hành các vòng sàng lọc. Chúng tôi thực hiện 8
vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ.
Dung dịch thƣ viện ssDNA (500 pmole) đƣợc xử lý trong 3 phút ở 85oC và sau đó giữ ở 4oC trong 1h. Dung dịch thƣ viện ssDNA sau đó sẽ đƣợc trộn với vi
30
khuẩn đích và ủ trong 1h ở nhiệt độ phòng, ly tâm 3000v/p, loại bỏ dịch. Phức hợp
đƣợc rửa hai lần bằng đệm rửa (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM
MgCl 2, và 0,01% Tween 20, pH 8,0) và tách DNA bằng đệm giải hấp (20 mM
Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 8,0). Các ssDNA thu đƣợc
đƣợc tủa với ethanol sau đó làm khuôn cho PCR nhân bản lƣợng lớn cho vòng sàng
lọc sau. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc xử lý với enzyme lamda eoxonuclease cắt tạo
ssDNA và dùng cho vòng chọn lọc tiếp theo. Cứ nhƣ vậy, sau 8 vòng sàng lọc với
vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ với vi khuẩn E. coli thƣờng. Ở vòng sàng
lọc với E. coli thƣờng, chúng tôi thu nhận ssDNA không bám dính, tủa lại với
ethanol và dùng làm khuôn thực hiện PCR nhân bản các aptamer sau các vòng chọn
lọc.
Để theo dõi quá trình làm giàu của các phân tử gắn đặc hiệu với E. coli
O157:H7 trong suốt quá trình sàng lọc, dung dịch thƣ viện đƣa vào và sản phẩm thu
đƣợc sau giải hấp của mỗi vòng đƣợc đo nồng độ trên máy NanoDrop. Quá trình
sàng lọc sẽ dừng lại khi % của sản phẩm giải hấp của những DNA đặc hiệu E. coli
O157:H7 đạt 55% so với dung dịch thƣ viện đƣa vào. Hỗn hợp trình tự gắn thu
đƣợc sau vòng sàng lọc cuối cùng đƣợc sử dụng để tách dòng và giải trình tự.
2.2.3. Phương pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp)
là một trong những phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong lĩnh vực sinh học
phân tử. Phƣơng pháp do Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Phƣơng pháp PCR
cho phép tổng hợp nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây là phƣơng
pháp thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ
chính xác cao. Phƣơng pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ
cao của DNA polymerase đƣợc tìm thấy trong các sinh vật ƣa nhiệt (vi khuẩn sống
trong các suối nƣớc nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ
thấp. Nhƣng ở nhiệt độ thấp, DNA tồn tại ở dạng cuộn xoắn chặt vì vậy DNA
polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử
DNA. Nhƣng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên
31
đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính và DNA polymerase có
điều kiện hoạt động.
Các hợp phần chủ yếu của PCR:
DNA mẫu, mồi, enzyme polymerase chịu nhiệt, các loại nucleotit, nƣớc,
dung dịch đệm, Mg2+
Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR (hình 2.1, hình 2.2): Có 3 giai đoạn
chính trong PCR và chúng đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thƣờng từ 25 đến
75 chu kỳ).
- Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu
bị biến tính ở nhiệt độ cao (thƣờng là từ 94-95ºC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của
phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của
phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các ssDNA.
- Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thƣờng từ 40-70ºC)
cho phép các mồi bám vào các phân tử ssDNA, đánh dấu phần DNA cần đƣợc
khuyếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn đƣợc gọi là giai
đoạn ủ). Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả sẽ tạo
nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả.
Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy (Tm) một cách tƣơng đối là Tm=4(G+C)
+ 2(A+T).
- Giai đoạn kéo dài (elongation): Nhiệt độ đƣợc tăng lên đến 72ºC giúp cho
DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là
di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA
mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã đƣợc đánh dấu bởi các
mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thƣớc của DNA mẫu, thƣờng
kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
32
Hình 2.1: Ba giai đoạn trong một chu kỳ của PCR
Hình 2.2: Ðồ thị biễu diễn mối quan hệ giữa thời gian và nhiệt độ
trong một chu kỳ của PCR
Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian đƣợc tăng thêm vài phút để
các sợi DNA chƣa đƣợc sao chép xong hoàn thành quá trình tổng hợp. Sau mỗi chu
kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại đƣợc tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Nhƣ vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản
sao phân tử DNA (hình 2.3).
Ƣu điểm của phƣơng pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số
lƣợng DNA theo mong muốn. Sản phẩm của PCR đƣợc phân tách trên gel agarose
nhuộm ethimidium bromide (EtBr) và quan sát dƣới máy chiếu tia UV.
33
Hình 2.3: PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân
Trong đề tài, phƣơng pháp PCR khuếch đại các trình tự gắn sử dụng cặp mồi
ApF2/ApR2, thành phần và chu kỳ phản ứng nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4: Thành phần PCR khuếch đại các trình tự gen
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl)
Dung dịch đệm 10X 2,5
dNTPs 10nM 2,5
25mM 1,25 MgCl2
Mồi xuôi 10pmol/µl 1
Mồi ngƣợc 10pmol/µl 1
DNA khuôn 10 – 100 ng/µl 5
0,3 Taq- polymease 5 unit/µl
11,45 H2O
Tổng thể tích 25
Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt của PCR khuếch đại các trình tự gen
94 94 55 72 72 8 Nhiệt độ (ºC)
3 phút 45 giây 45 giây 45 giây 8 phút ∞ Thời gian
10 chu kỳ
34
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Trong trƣờng hợp lý tƣởng, kết thúc PCR, ta thu đƣợc 1 sản phẩm duy nhất
tuy nhiên thƣờng sản phẩm vẫn lẫn tạp với một lƣợng mồi, dNTPs dƣ, enzyme,
DNA polymease. Nếu không tinh sạch sản phẩm PCR, những hợp phần tạp có thể
ảnh hƣởng đến phản ứng giải trình tự sau này. Do đó, cần tiến hành tinh sạch sản
phẩm PCR theo các bƣớc sau (sử dụng kit của hãng QIAgen):
Bƣớc 1: Bổ sung 5 lần thể tích buffer 1 vào sản phẩm PCR, trộn đều
Bƣớc 2: Chuyển dịch vào cột gắn DNA và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 3: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 4: Bổ sung 500µl buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 5: Giữ nguyên cột, loại dịch phía dƣới cột
Bƣớc 6: Lặp lại bƣớc 4 và 5
Bƣớc 7: Ly tâm 12000 v/ph, 1 phút để làm khô
Bƣớc 8: Bổ sung 30µl nƣớc vào cột ly tâm 12000 v/ph, 1 phút
Bƣớc 9: Chuyển dịch sau ly tấm sang ống eppendorf mới và bảo quản sản
phẩm sau tinh sạch để tiến hành giải trình tự
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose
Nguyên tắc:
Điện di là hiện tƣợng dịch chuyển của các phân tử tích điện dƣới tác động
của điện trƣờng. Kỹ thuật này giúp phân tách các phân tử DNA, RNA, protein dựa
trên các đặc điểm vật lý nhƣ khối lƣợng hay điện tích thực của chúng.
Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch
chuyển về các cực dƣơng hoặc âm tùy theo điện tích của chúng. Protein có điện tích
thực dƣơng hoặc âm, còn các nucleic acid có điện tích âm nhờ khung phosphate của
mình và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng [11].
Các phân tử protein và nucleic acid có thể đƣợc chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) nhƣ giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc
polyacrylamide gel. Tuy nhiên, kỹ thuật điện di trên giá rắn (agarose hoặc
polyacrylamide) đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch
35
đệm để dẫn điện và tạo điện trƣờng đều, một bản gel để phân tách các phân tử và
các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.
Trong đó, polyacrylamide gel đƣợc dùng để phân tách các phân tử protein và các
phân tử DNA có chiều dài <1 kb, còn agarose gel phân tách hiệu quả các phân tử
DNA hoặc RNA có kích thƣớc từ 20 bp-20 kb.
Điện di agarose gel đƣợc xem là phƣơng pháp tối ƣu nhất dùng để phân tích,
xác định và tinh sạch các đoạn DNA.
Nguyên tắc: Các phân tử nucleic acid có khối lƣợng và điện tích khác nhau
đƣợc tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng của hệ điện di trong một điện
trƣờng có điện thế và cƣờng độ thích hợp. Tốc độ dịch chuyển của các phân tử
trong gel phụ thuộc vào kích thƣớc, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện
trƣờng... Vị trí của DNA trong gel đƣợc xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel
đƣợc nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr và có thể phát
hiện dƣới ánh sáng tử ngoại.
Các yếu tố ảnh hƣởng: Kích thƣớc của phân tử, nồng độ agarose, cấu hình
của DNA, thành phần base và nhiệt độ.
Nhuộm DNA bằng EtBr và chụp ảnh, quan sát.
Các ứng dụng của điện di agarose gel:
- Ƣớc lƣợng kích thƣớc của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt
hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA đƣợc tạo dòng…)
- Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc
in dấu di truyền…)
- Phân tách DNA hệ gen đã đƣợc cắt hạn chế trƣớc khi thẩm tích Southern
hoặc RNA trƣớc khi thẩm tích Northern
Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử
tuyến tính với quãng đƣờng dịch chuyển của DNA trên gel agarose. Thƣờng các
đoạn gen có kích thƣớc từ 300 - 10.000 bp có thể đƣợc phân tách trên gel agarose
0.8%. Nồng độ gel thƣờng phụ thuộc vào kích thƣớc sản phẩm DNA cần phân tách.
36
2.2.6. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
Nguyên tắc:
Chèn một đoạn DNA ngoại lai vào một phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ
(vector tách dòng) thƣờng có dạng vòng với mục đích nhân bản đoạn DNA ngoại
lai với số lƣợng lớn. Vector tách dòng có các đặc điểm sau:
- Kích thƣớc tƣơng đối nhỏ so với nhiễm sắc thể của tế bàovật chủ
- Có thể nhân đôi độc lập trong tế bào vật chủ
- Có vùng nhận biết enzym giới hạn
- Có thể nhận biết bằng gen chỉ thị hoặc gen đánh dấu
- Trình tự nucleotit đã xác định
- Phải thích hợp với tế bào vật chủ
- Có vị trí gắn phân tử DNA ngoại lai(polycloning site)
Hình 2.4: Sơ đồ cấu tạo vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen)
37
Trong đề tài sử dụng vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen) (hình
2.4) đƣợc sử dụng để gắn trực tiếp sản phẩm của PCR. Trên sản phẩm enzyme sẽ
tạo một gốc adenin tự do đầu 3’ mà không phụ thuộc vào trình tự khuôn, trong khi
đó một gốc Thymine tự do đƣợc thiết kế trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này
cho phép sản phẩm PCR có thể dễ dàng gắn vào vector khi có mặt enzyme xúc tác.
Cách tiến hành:
Sử dụng bộ kit theo vector pCR2.1 (Invitrogen) để tách dòng. Trộn các thành
phần của phản ứng và ủ ở 22º trong 30 phút.
2.2.7. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli DH5α
Nguyên tắc:
Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép
vector tái tổ hợp thành một số lƣợng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào
tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến (có khả năng thấm vector
tái tổ hợp). Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc đƣợc cảm ứng. Tuy
nhiên, tùy theo vào loại plasmid sử dụng làm vector và tùy theo sự định vị của vùng
cài lắp chứa bên trong vector mà ngƣời nghiên cứu sẽ chọn phƣơng pháp biến nạp
hoặc tải nạp.
Biến nạp là hiện tƣợng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D
(Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào
hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp đƣợc thực hiện với vector
chuyển gen là plasmid. Có nhiều phƣơng pháp biến nạp nhƣ hóa biến nạp, điện biến
nạp, biến nạp tế bào trần, phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp vi tiêm. Trong đề
tài nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp hóa biến nạp: dựa vào tác dụng của CaCl2
khiến thành tế bào thời kỳ sinh trƣởng trở nên xốp hơn, tạo điều kiện cho DNA có
thể chui qua lỗ màng khi tiến hành sốc nhiệt. Sau 30 phút, tế bào sẽ biểu hiện gen
kháng kháng sinh có trong plasmid ngoại lai.
Cách tiến hành:
* Chuẩn bị tế bào khả biến:
38
Bƣớc 1: Tế bào E. coli chủng DH5αđƣợc nuôi lắc 200v/ph, 37ºC, qua đêm
trong môi trƣờng LB lỏng.
Bƣớc 2: Pha loãng dịch nuôi theo tỷ lệ 10% trong môi trƣờng lỏng, nuôi lắc
200v/ph, 37ºC. Sau 2h thì tiến hành kiểm tra mật độ tế bào phƣơng pháp đo OD600,
đạt từ 0,6 đến 1,0 là đạt yêu cầu.
Bƣớc 3: Chuyển 1ml dịch nuôi sang ống eppendorf vô trùng, giữ trên đá 10
phút.
Bƣớc 4: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế
bào.
Bƣớc 5: Hòa cặn tế bào trong 300µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền
dịch.
Bƣớc 6: Ly tâm 3000 v/ph, 4ºC trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn tế
bào.
Bƣớc 7: Hòa lại cặn tế bào trong 60µl CaCl2 100mM, 4ºC thành dạng huyền
dịch, giữ trong đá ít nhất 1h trƣớc khi biến nạp hoặc bảo quản ở - 85ºC, trong
glycerol 15-30% để sử dụng sau.
* Biến nạp:
Bƣớc 1: Các ống tế bào khả biến bảo quản ở - 85ºC đƣợc để trên đá ít nhất
30 phút.
Bƣớc 2: Trộn DNA plasmid 10-50ng với tế bào của ống tế bào khả biến sau
đó để trên đá 30 phút.
Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bể ổn nhiệt, tiến hành sốc nhiệt ở
42ºC trong 60 giây.
Bƣớc 4: Chuyển nhanh eppendorf vừa sốc nhiệt trên giữ trên đá 2 phút.
Bƣớc 5: Bổ sung 200µl môi trƣờng LB lỏng ở nhiệt độ phòng, nuôi lắc ở
37ºC, 1h.
Bƣớc 6: Cấy trải 100µl mẫu trên môi trƣờng LB đặc trên đĩa peptri bổ sung
karamycin (50µg/ml), X-gal đến khi bề mặt đĩa khô.
Bƣớc 7: Ủ đĩa pepetri trong tủ ấm 37ºC, ít nhất 18-20h.
39
Chọn dòng tế bào tái tổ hợp:
Đây là bƣớc kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Các đĩa peptri sau
khi ủ 18-20h để chọn lọc các dòng vi khuẩn tái tổ hợp. Có 3 trƣờng hợp có thể xảy
ra:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen
kháng kháng sinh.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện
gen kháng kháng sinh.
Chỉ có tế bào nhận đƣợc plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới
phát triển đƣợc trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh kanamycin. Chọn các khuẩn
lạc màu xanh mọc riêng biệt trên đĩa thạch. Sau đó, tiếp tục cấy các các khuẩn lạc
đó trong các ống môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp lắc trong máy lắc ổn nhiệt 200v/ph, 37◦C trong 10-20h để các tế bào sinh trƣởng và nhân lên số lƣợng
lớn để tiến hành tách DNA plasmid.
2.2.8. Phương pháp tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Nguyên tắc:
Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những hợp phần tạp nhiễm, mà quan
trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của
mỗi loại phân tử (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol,
chloroform/nƣớc). Mục đích là thu đƣợc các phân tử nucleic acid ở trạng thái
nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các
nucleic acid cần đƣợc tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động
của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid
tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép
thu nhận nucleic acid dƣới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong
nƣớc theo nồng độ mong muốn.
Tách chiết DNA gồm các bƣớc:
- Bƣớc 1: Phá màng tế bào, màng nhân.
40
- Bƣớc 2: Loại protein.
- Bƣớc 3: Thu hồi nucleic acid.
Sau khi thu hồi, làm sạch các tế bào có chứa plasmid. Phá màng tế bào, màng
nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, EDTA hoặc NaOH) và
proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng
thời phân hủy các protein liên kết với DNA, dsDNA biến tính thành ssDNA nằm
cạnh nhau. Chất tẩy là phân tử lƣỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân
tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng
mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn.
Loại protein: Lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để làm biến tính
protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biến tính không hòa tan
trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa
pha nƣớc và pha phenol:chloroform.
Thu hồi nucleic acid trong pha nƣớc. Đƣa về môi trƣờng trung tính để
ssDNA đƣợc hồi tính trở lại. Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dƣới
dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể
hòa lại trong nƣớc theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa trong ethanol hoặc
isopropanol. Sau đó li tâm để thu nhận lại nucleic acid. Cặn tủa đƣợc rửa trong
ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol.
Cách tiến hành:
Bƣớc 1: Hút 1ml dịch nuôi tế bào vi khuẩn trong môi trƣờng LB lỏng bổ
sung Amp đã đƣợc nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 1,5ml, ly tâm 600 v/ph
trong 5 phút, loại dịch nổi, thu cặn tế bào.
Bƣớc 2: Bổ sung 150µl Sol I, vortex để hòa tan tế bào.
Bƣớc 3: Bổ sung 150µl Sol II, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bƣớc 4: Bổ sung 150µl Sol III, đảo nhẹ 4-6 lần.
Bƣớc 5: Thêm 450µl dung dịch phenol:chloroform:isoamylalalcohol
(25:24:1), đảo nhẹ.
41
Bƣớc 6: Ly tâm với tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 15 phút để dịch trong
ống eppendorf phân tách thành 3 lớp.
Bƣớc 7: Hút dịch nổi ở pha trên sang ống eppendorf 1,5ml mới.
Bƣớc 8: Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1 so với mẫu, để tủa plasmid ở -
20oC trong 2h.
Bƣớc 9: Ly tâm tốc độ 12000 v/ph trong thời gian 30 phút, thu cặn.
Bƣớc 10: Rửa cặn bằng 500µl ethanol 70%.
Bƣớc 11: Ly tâm 12000 v/ph trong 10 phút, thu tủa.
Bƣớc 12: Làm khô DNA plasmid bằng máy Speed vac trong 3 phút.
Bƣớc 13: Hòa lại cặn trong 40µl trong H2O có bổ xung RNAse. Bƣớc 14: Ủ ở 37oC trong thời gian 1h để loại RNA .
Bƣớc 15: Điện di kiểm tra kết quả tách chiết trên gel agarose 1%. Bƣớc 16: Bảo quản ở - 20oC.
2.2.9. Phương pháp tự động giải trình tự acid nucleic
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này đƣợc Frederick Sanger và cộng sự phát minh vào năm
1977 (hình 2.5). Nguyên tắc của phƣơng pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch
bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Với
việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP)
thông thƣờng, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA
có kích thƣớc khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn
khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị
phóng xạ) và bổ sung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại
phản ứng. Khi mạch đơn DNA đang tổng hợp, các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở
vị trí C3 và C2 sẽ đƣợc gắn thêm một ddNTP và phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi
loại phản ứng đƣợc thực hiện riêng rẽ, có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại
dNTP, enzyme Taq DNA polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một
loại ddNTP. Kết quả của phản ứng là tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide dài
ngắn khác nhau một nucleotide và đƣợc nhận biết nhờ phƣơng pháp điện di (Hình
42
2.5). Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống, thu đƣợc trình tự các nucleotide của mạch
đơn, có thể biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen
Hình 2.5: Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp của Frederick Sanger
43
Cách tiến hành:
Sau khi có sản phẩm plasmid tinh sạch, chúng tôi xác định trình tự nucleic
acid theo phƣơng pháp nêu trên. Phƣơng pháp này sử dụng sản phẩm của PCR cùng
với ddNTP đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Các ddNTP chỉ khác các dNTP là chúng bị
mất nhóm OH ở vị trí 3, nên DNA polymerase không thể kéo dài mạch từ các phân
tử này nữa.
Bƣớc 1: Sau khi chuẩn bị thành phần phản ứng, bổ sung ddNTp, mồi, DNA
khuôn, enzyme hỗn hợp phản ứng sẽ đƣợc đƣa vào máy giải trình tự tự động.
Bƣớc 2: Nhờ bộ phận phát tín hiệu huỳnh quang từ các ddNTP, trong quá
trình thực hiện phản ứng trình tự của các gen sẽ đƣợc ghi lại.
Bƣớc 3: Sau khi thu đƣợc kết quả, trình tự đƣợc đăng ký trên các ngân hàng
dữ liệu trình tự hoặc so sánh với các trình tự đã đƣợc công bố trên các ngân hàng dữ
liệu quốc tế nhƣ EMBL, Genebank... để tìm ra các trình tự nucleotit tƣơng đồng.
2.2.10. Phương pháp tạo phức hệ aptamer – hạt nano vàng
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng hạt nano vàng đƣợc tổng hợp bằng
phƣơng pháp khử hóa học do Viện Vật lý – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam cung cấp.
Aptamer ssDNA đã thyol hóa 0,5 OD (260nm) đƣợc ủ với 1ml 10nM hạt nano
vàng. Sau 16h, dung dịch NaCl 2M đƣợc thêm từ từ vào hỗn hợp cho tới khi dung
dịch đạt nồng độ NaCl 0,1M ủ tiếp 8h. Sau đó bổ sung tiếp NaCl sao cho dung dịch
đạt nồng độ NaCl 0,2M, ủ tiếp 8h và bổ sung NaCl đạt nồng độ 0,3M. Sau 8h hỗn
hợp đƣợc ly tâm ở 12000 v/p trong 15 phút. Tủa đỏ thu đƣợc sau đó rửa sạch với
10mM phosphate (pH 7,0, 0,3 M NaCl) ba lần. Sau khi ly tâm, các dung dịch keo
đã đƣợc tái huyền phù hóa trong 10mM phosphate (pH 7,0) đệm (0,3 M NaCl). Hỗn hợp đƣợc lƣu trữ trong tủ lạnh ở 4oC.
2.2.11. Phương pháp lai Dot blot
Dot blot là phƣơng pháp cho phép định lƣợng tƣơng đối một DNA hay RNA
đặc trƣng trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra. Kỹ thuật Dot (dot là
khe) đơn giản hơn nhiều so với các phƣơng pháp khác vì:
44
- Không cần giai đoạn cắt bởi những enzyme cắt giới hạn.
- Không cần chạy điện di.
- Kỹ thuật dot blot đƣợc dùng trong nghiên cứu những đoạn DNA ngắn.
Kháng nguyên E. coli O157:H7đƣợc cố định trên màng nitrocellulose. Màng
sau đó đƣợc tiến hành block bằng BSA trong thời gian 1h, rửa hai lần với PBS 1X
và làm khô. Sau đó màng đƣợc nhúng vào dung dịch chứa phức hợp aptamer-nano
vàng, sau khoảng 10 phút quan sát, chúng ta sẽ nhận thấy sự thay đổi màu của vùng
đƣợc cố định kháng nguyên trên màng bởi màu đỏ đặc trƣng của các hạt nano vàng
trong dung dịch. Sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và aptamer khiến các hạt
nano vàng có gắn aptamer bị tụ tập lại trên một vùng cố định, sự thay đổi màu của
chấm này có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thƣờng.
45
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7 điển
hình gồm ba quá trình:
- Chọn lọc những trình tự oligonucleotit (aptamer) gắn với E. coli O157:H7
từ thƣ viện.
- Loại bỏ những aptamer không gắn hoặc gắn không đặc hiệu với E. coli
O157:H7.
- Thu nhận và khuếch đại những aptamer gắn đặc hiệu với vi khuẩn E. coli
O157:H7.
Trong đó, để bắt đầu một chu kỳ sàng lọc, chuẩn bị thƣ viện oligonucleotit là
một bƣớc rất quan trọng.
3.1.1. Chuẩn bị thư viện
Quy trình SELEX sàng lọc aptamer bắt đầu từ một thƣ viện oligonucleotit DNA ngẫu nhiên có số phân tử lớn, đa dạng 1015 phân tử. Từ thƣ viện ssDNA có
trình tự 5’ – ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – N36 – ATA CGG GAG
CCA ACA CCA AGG CTTC – 3’ tiến hành làm giàu để chuẩn bị nguyên liệu khởi
đầu cho quá trình sàng lọc. Toàn bộ quy trình đƣợc trình bày ở mục 2.2. Kết quả
của quá trình này đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
100 bp
Sản phẩm PCR
Hình 3.1: Kết quả PCR làm giàu thƣ viện
Giếng M: thang DNA 100 bp (Fermentas).
Giếng 1: Sản phẩm PCR làm giàu thư viện.
46
Hình ảnh điện di cho thấy trên đƣờng chạy xuất hiện một băng sáng đậm có
kích thƣớc khoảng 70bp. Kết quả này đúng với tính toán lý thuyết về độ dài của
aptamer, chứng tỏ thƣ viện oligonucleotit đã đƣợc nhân lên thành công với số lƣợng
lớn, đủ đáp ứng cho quá trình sàng lọc.
Sau PCR, sản phẩm thu đƣợc là một hỗn hợp các trình tự oligonucleotit sợi
đôi có độ đa dạng cao và số lƣợng phân tử lớn. Tuy nhiên, chỉ có ssDNA mới có thể
cuộn gấp hình thành cấu trúc thứ cấp phức tạp để liên kết phân tử đích. Do đó, quá
trình xử lý cắt sợi đôi thành sợi đơn cần thiết đƣợc thực hiện.
Một số phƣơng pháp hiện đang đƣợc sử dụng để tạo sợi đơn sau PCR nhƣ
sau:
- Một lƣợng dƣ biotin đƣợc đƣa vào một trong hai mồi sử dụng trong PCR,
sau đó các sợi DNA sẽ đƣợc tách ra dƣới điều kiện biến tính trong một cột với
streptavidin [75].
- Sử dụng phản ứng khuếch đại PCR bất đối xứng, trong đó sự sao chép bắt
đầu bởi một mồi PCR rất kém hiệu quả, dẫn đến sự tích lũy của ssDNA đƣợc tổng
hợp từ những mồi khác [22].
- Một vùng đệm hexaethyleneglycol (HEGL) và một phần mởrộng của một
số nucleotit adenine (polyA) đƣợc thêm vào đầu 5’ của mồi ngƣợc. Vùng đệm
HEGL hoạt động nhƣ một dấu hiệu kết thúc cho Taq Polymerase. Sự kéo dài chuỗi
của sợi dƣơng dừng lại, trong khi sợi âm đƣợc tiếp tục. Sau đó, sử dụng điện di để
tách hai sợi đơn.
- Một nhóm photphat đƣợc gắn vào đầu 5’ của một mồi, sau đó sợi đôi DNA
thu đƣợc từ PCR sẽ đƣợc xử lý bằng enzyme lamda exonuclease. Enzyme này sẽ
cắt hoàn toàn những sợi có mồi phosphoryl hóa, giữ lại sợi bổ sung còn lại.
Trong các phƣơng pháp nêu trên, chúng tôi chọn phƣơng pháp thứ 4: sử
dụng enzyme lamda exonuclease nhƣ một enzyme cắt chọn lọc. Nó sẽ cắt vụn
những mạch đƣợc phosphoryl hóa của dsDNA từ đầu 5’ đến 3’. Hoạt tính của
enzyme này giảm đáng kể đối với ssDNA và những DNA mà không đƣợc
47
phosphoryl hóa. Trong nghiên cứu của chúng tôi, lamda exonuclease đƣợc sử dụng
để tạo sợi đơn sau khuếch đại sản phẩm của mỗi vòng sàng lọc (hình 3.2).
Hình 3.2: Quá trình tạo ssDNA sử dụng enzym lamda exonuclease
Sản phẩm của phản ứng cắt sợi đôi thành sợi đơn đƣợc điện di để kiểm tra
trên gel agarose 0,8%. Mục đích kiểm tra sản phẩm điện di trên gel agarose là để sơ
bộ dự đoán đƣợc sự thành công hay không của phản ứng cắt và dự đoán độ tinh
sạch của mẫu để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả điện di sợi đơn
DNA thu đƣợc sau phản ứng đƣợc trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3: Kết quả tạo ssDNA từ sản phẩm PCR sử dụng
enzyme lamda exonuclease
Giếng 1: Sản phẩm PCR được xử lý với enzyme lamda exonuclease
Giếng M: Thang DNA 100 bp
48
Trong quá trình điện di, EtBr đƣợc sử dụng là thuốc nhuộm để phát hiện
DNA dƣới tia UV. Cơ chế hoạt động của chúng là cài xen vào giữa các cặp base của
DNA và có tác dụng nhƣ một chất phát huỳnh quang. Chúng có ái lực và hiệu suất
huỳnh quang rất cao đối với các phân tử dsDNA. Tuy nhiên đối với những phân tử
sợi đơn, chúng có ái lực liên kết yếu và hiệu suất huỳnh quang không cao.
Theo kết quả điện di tại hình 3.3, có thể cho thấy không còn phân tử DNA ở
dạng sợi đôi. Tuy nhiên, chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm sau xử lý tạo sợi
đơn làm khuôn thực hiện PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 để chắc chắn hơn về độ tin
cậy của quá trình cắt, để chắc chắn rằng enzyme chỉ cắt 1 sợi. Kết quả PCR đƣợc
thể hiện ở hình 3.4.
Sản phẩm PCR 100 bp
Hình 3.4: Kết quả PCR sản phẩm sau quá trình cắt tạo sợi đơn
Giếng 1: Sản phẩm PCR sợi đơn với cặp mồi ApF2/ApR2
GiếngM: Thang DNA 100 bp
Hình ảnh điện di cho thấy có một băng sáng đậm có kích thƣớc gần băng
100bp của marker (chỉ thị phân tử) DNA. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR đƣợc
khuếch đại từ những trình tự có kích thƣớc tƣơng ứng, phù hợp với tính toán lý
thuyết của chiều dài aptamer (khoảng 70bp). Do vậy, có thể kết luận chắc chắn
rằng, phản ứng cắt tạo sợi đơn đã thành công và sản phẩm thu đƣợc là những trình
tự đơn chuỗi sẵn sàng cho vòng sàng lọc kế tiếp.
Nhƣ vây, chúng tôi đã tạo đƣợc thƣ viện aptamer ssDNA mong muốn.
49
3.1.2. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết E. coli O157:H7
Từ thƣ viện aptamer ssDNA tổng hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc aptamer
liên kết E. coli O157:H7 theo phƣơng pháp SELEX đã trình bày ở mục phƣơng
pháp. Quá trình sàng lọc gồm 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc
loại trừ (đã trình bày ở phần phƣơng pháp). Sau mỗi vòng sàng lọc, dịch giải hấp
đƣợc sử dụng làm khuôn cho PCR làm giàu và lặp lại vòng sàng lọc tiếp theo (hình
3.5). Trong quá trình sàng lọc với vi khuẩn đích, nồng độ chất tẩy rửa Tween tăng
dần để loại bỏ các aptamer liên kết lỏng lẻo.
100 bp Sản phẩm PCR
Hình 3.5: Kết quả PCR làm giàu sau mỗi vòng sàng lọc với cặp mồi ApF2/ApR2
1– 3: Sản phẩm PCR từ dịch giải hấp với cặp mồi của gen;
GiếngM: Thang DNA 100bp.
Kết quả điện di cho thấy: Trên đƣờng chạy xuất hiện vạch băng sáng đậm, so
với thang DNA chuẩn thì băng này có kích thƣớc khoảng 70 bp. Nhƣ vậy, có thể
khẳng định các bƣớc sàng lọc là ổn định.
Thƣ viện trƣớc khi đƣa vào sàng lọc và sản phẩm sau giải hấp đƣợc đo nồng
độ trên máy Nano Drop để kiểm soát tiến trình của sự làm giàu. Điều kiện phân tách
khắt khe với việc tăng nồng độ Tween 20% sau mỗi vòng đƣợc thực hiện để đảm
bảo tính chọn lọc cao của aptamer mong muốn (bảng 3.1). Trong ba vòng đầu tiên
50
của sàng lọc, phần trăm Tween 20% trong đệm rửa tăng từ 0,1% lên 0,2% rồi 0,5%
tƣơng ứng thu đƣợc phần trăm DNA giải hấp giảm từ 12% đến 5,1% và sau đó đến
0,22%. Từ vòng sàng lọc thứ 3 đến vòng sàng lọc thứ 6, phần trăm Tween 20%
trong đệm rửa tiếp tục tăng từ 0,7% đến 1,2%; sản phẩm của quá trình làm giàu tăng
13 lần từ 0,22% đến 2,9%. Một sự gia tăng ấn tƣợng đƣợc nhìn thấy ở vòng sàng
lọc thứ 7 và sự gia tăng đáng kể có ý nghĩa ở vòng thứ 8. Quá trình sàng lọc đƣợc
dừng lại khi phần trăm DNA đặc hiệu E. coli O157:H7 thu đƣợc sau giải hấp đạt
55% so với thƣ viện đƣa vào.
Bảng 3.1: Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho mỗi vòng sàng lọc
Vòng sàng lọc % Tween trong đệm rửa % sản phẩm giải hấp so với đầu vào
1 0,1 12
2 0,2 5,1
3 0,5 0,22
4 0,7 0,4
5 1 1,6
6 1,2 2,9
7 1,5 24
8 1,7 55
Để hạn chế tối đa những sản phẩm thu đƣợc sau giải hấp nhƣng không đặc
hiệu với E. coli O157:H7, chúng tôi thực hiện vòng sàng lọc loại trừ. Quy trình thực
hiện tƣơng tự nhƣ các vòng sàng lọc bình thƣờng, chỉ khác ở chỗ thay vì E. coli
O157:H7, là E. coli thƣờng và sau bƣớc ủ với ssDNA, dịch ủ chứ không phải sản
phẩm giải hấp đƣợc giữ lại cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau vòng này, những trình
tự có khả năng gắn trực tiếp vào E. coli thƣờng sẽ bị loại bỏ.
Sau 8 vòng sàng lọc với vi khuẩn đích và 1 vòng sàng lọc loại trừ, chúng tôi
thu đƣợc một hỗn hợp ssDNA có khả năng gắn kết với vi khuẩn đích. Trong hỗn
hợp ssDNA này bao gồm nhiều phân tử ssDNA có trình tự khác nhau cũng nhƣ khả
năng liên kết với vi khuẩn đích là khác nhau. Chính vì vậy, công việc tiếp theo của
51
chúng tôi là chọn ra đƣợc 1 vài aptamer có khả năng liên kết đặc hiệu nhất với vi
khuẩn đích. Để giải quyết vấn đề này, sản phẩm sau sàng lọc đã đƣợc tủa lại để
chuẩn bị cho quá trình tách dòng và chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn
E. coli O157:H7.
Nhƣ vậy, kết thúc quá trình sàng lọc 9 vòng, chúng tôi thu đƣợc hỗn hợp các
aptamer ssDNA có khả năng liên kết E. coli O157:H7.
3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
Để tìm đƣợc phân tử aptamer có khả năng gắn tốt nhất với E. coli O157:H7
trong hỗn hợp các aptamer ssDNA vừa thu đƣợc trên, chúng tôi tiến hành tách dòng
và chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu vi khuẩn E. coli O157:H7. Quá trình tách
dòng đƣợc tiến hành theo hình 3.6.
Hình 3.6: Quá trình tách dòng sản phẩm sau sàng lọc
52
Hỗn hợp Aptamer ssDNA liên kết E.coli O157:H7
Nhân bản Aptamer liên kết E.coli O157:H7
Phân tích điện di trên gel agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR
Gắn sản phẩm PCR vào vecto pCR 2.1 - TOPO
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α
Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli
Táchđƣợc các dòng Aptamer liên kếtvi khuẩn E.coli O157:H7
Hình 3.7: Quy trình tách dòng aptamer ssDNA liên kết
vi khuẩn E. coli O157:H7
3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli
O157:H7
Dịch sàng lọc sau vòng loại trừ đƣợc đƣa vào quy trình tách dòng (hình 3.7)
và xác định trình tự. Đầu tiên, cần tiến hành PCR để tăng số bản sao của aptamer
53
ssDNA gắn với vi khuẩn E. coli O157:H7. Sau đó phân tích điện di trên gel agarose,
chúng tôi thu đƣợc kết quả trên hình 3.8.
M 1
100 bp
Sản phẩm PCR
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR
Giếng 1: Sản phẩm PCR aptamer ssDNA liên kết vi khuẩn E. coli O157:H7
Giếng M: Thang DNA 100 bp
Sau khi hoàn thành bƣớc khuếch đại trình tự liên kết, chúng tôi tiến hành
tách dòng những đoạn gen này. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn
trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR2.1 – TOPO (Invitrogen), sau đó
biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α để chọn lọc dòng tái tổ hợp mang đoạn gen
gắn đặc hiệu với E. coli O157:H7.
3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 – TOPO
Sử dụng Vector pCR 2.1 – TOPO để tiến hành tách dòng. Vector pCR 2.1 –
TOPO có các đặc điểm sau:
- Có một vùng Ori giúp vector độc lập sao chép trong tế bào chủ. - Có chứa các gen kháng kháng sinh là ampr (ampicillin) và kar (kanamycin)
nhƣ là các dấu chuẩn chọc lọc, cho phép các dòng vi khuẩn mang vector mọc trên
môi trƣờng chứa các kháng sinh này. Ngoài ra, chúng còn chứa gen mã hóa cho
54
enzyme β – Galactosidase, có khả năng chuyển hóa cơ chất X – Gal, giúp chọn lọc
một cách dễ dàng do phản ứng tạo màu.
- Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzyme giới hạn. Vector
có 17 vị trí cắt cho các enzyme giới hạn nhƣ: E.coRI, HinIII, NsiI, KprI, SacI,
bamHI, SpeI, BstXI, E.coRV, NetI, AraI, PaeI, XhoI, XbaI, ApaI riêng E.coRI và
BstXI có hai vị trí cắt.
Trong phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1, enzyme
topoisomerase (có trong bộ TA Cloning Kit) sẽ bám vào chuỗi kép DNA tại một vị
trí đặc hiệu và cắt bỏ liên kết phosphodieste ở đầu 5’ – CCCTT trên một chuỗi đơn
của vector, đồng thời tạo nên liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3’ của
chuỗi vừa bị cắt với tyrosyl tại vị trí 274 của enzyme topoisomerase bằng chính
năng lƣợng liên kết phosphodieste. Trong khi đó, dƣới tác dụng của enzyme Taq
DNA polymerase một gốc adenin tự do đầu 3' đƣợc gắn trên sản phẩm của PCR mà
không phụ thuộc vào trình tự khuôn. Nhƣ vậy, sản phẩm có thể dễ dàng gắn vào
vector đã có sẵn một gốc thymine trên đầu 5’. Tiếp theo liên kết giữa gốc phosphat
của DNA và Tyrosyl của enzyme bị phá vỡ nhờ tác động của nhóm 5’ – OH của sợi
đơn đã bị cắt trƣớc đó, điều này sẽ làm chuyển hƣớng phản ứng và giải phóng
enzyme topoisomerase (hình 3.9).
Enzyme Topoisomeraza bám vào ví trí đặc hiệu
Phản ứng gắn hoàn thành
Ủ 25 phút
Sản phẩm PCR khuếch đại với Taq Polymeraza
Enzyme Topoisomeraza đƣợc giải phóng
Vector pCR2.1 - TOPO
Hình 3.9: Cơ chế hoạt động của TA Cloning kit. (Nguồn: Invitrogen)
55
3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α
Vi khuẩn E. Coli DH5α sau khi đƣợc xử lý bằng CaCl2 giúp màng tế bào trở
nên xốp, giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420C trong 60 giây) nhằm
kích thích sự biến nạp plasmid vào trong tế bào. Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi
trƣờng dƣỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp
trong tế bào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein
tƣơng ứng. Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt
những tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận.
Toàn bộ quá trình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong mục 2.2.7. Kết quả
biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR)vào
tế bào E. coli DH5α
Trong môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh nhƣ trên có thể xảy ra 3 trƣờng
hợp:
Trƣờng hợp 1: Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp nên không
sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 2: Tế bào vi khuẩn nhận plasmid nhƣng không biểu hiện gen
kháng kháng sinh nên không sinh trƣởng đƣợc.
Trƣờng hợp 3: Tế bào vi khuẩn nhận đƣợc plasmid tái tổ hợp và biểu hiện
gen kháng kháng sinh nên sinh trƣởng đƣợc.
Chỉ những tế bào nhận vector tái tổ hợp (đã gắn sản phẩm PCR) mới có thể
sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc bằng kháng sinh, do plasmid có chứa và
56
biểu hiện gen kháng kháng sinh. Chúng tôi tiến hành chọn dòng tế bào mang vector
tái tổ hợp chứa aptamer đích bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc. Kết quả
chúng tôi chọn đƣợc 8 khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp mang aptamer đích (hình
3.11).
Hình 3.11: Kết quả PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi ApF2/ApR2
Giếng 1 – 8: Sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 từ các khuẩn lạc số 1-8
tương ứng
GiếngM: Thang DNA 100 bp
3.2.4.Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Các dòng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar để qua đêm ở tủ lắc 370C, 200 v/ph để nhân lên với số
lƣợng lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi
lấy 5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên
gel agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.12.
57
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang Apamer liên kết
E. coli O157:H7
Giếng 1 – 8: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc số 1- 8
Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng
thái khác nhau của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch
DNA plasmid đã thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và plasmid .
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc 8 dòng aptamer ssDNA liên kết E. coli
O157:H7.
3.3. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
3.3.1. Kết quả tách dòng aptamer liên kết đặc hiệu E. coli O157:H7
Sau khi tách riêng rẽ 8 dòng aptamer nhƣ trên, chúng tôi tiến hành PCR thu
các dòng aptamer ssDNA thyol hóa.
8 dòng aptamer đã thyol hóa đƣợc tiến hành gắn với hạt vàng có kích thƣớc
40 nm theo quy trình đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Sau đó, chúng tôi sử dụng
các phức hợp aptamer – hạt nano vàng này để tiến hành chọn lọc dòng có khả năng
liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích thông qua phản ứng dot blot.
Chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli O157:H7 làm kháng nguyên đích và vi
khuẩn E. coli thƣờng làm đối chứng.
Kết quả kiểm tra bằng Dot blot cho thấy dòng số 8 đã chọn có sự liên kết đặc
hiệu giữa kháng nguyên của E. coli O157:H7 và aptamer ssDNA gắn trên bề mặt
hạt nano vàng. Các hạt nano vàng đóng vai trò nhƣ một sensor màu giúp cho có thể
quan sát kết quả kiểm tra bằng mắt thƣờng (hình 3.13). Các hạt nano vàng gắn
58
aptamer bị bắt lại bởi kháng nguyên và giữ cố định trên màng tạo ra một vùng chấm
tròn màu đỏ, các vùng khác không chứa kháng nguyên cố định nên chúng không tạo
ra màu đỏ do không có sự xuất hiện của các hạt nano vàng.
8
7
6
5
4
2
1
3
Hình 3.13: Kết quả Dot blot giữa phức hợp aptamer ssDNA – hạt nano vàng
với kháng nguyên đích E. coli O157:H7
1-8: Hình ảnh dotbot của các aptamer-hạt vàng với E. coli O157:H7
Nhƣ vậy, kết quả dotblot chúng ta nhận thấy aptamer dòng số 8 liên kết với
E. coli O157:H7 mạnh nhất, tiếp theo là dòng số 6 và sự giảm màu sắc chấm đỏ ở
các mẫu aptamer còn lại thể hiện mức độ liên kết với E. coli O157:H7 giảm dần. Do
đó chúng tôi chọn dòng số 8 để tiến hành kiểm tra sự liên kết của phức hợp aptamer
8 - hạt nano vàng với E. coli O157:H7 thông qua chụp ảnh bằng TEM, so sánh sự
liên kết của aptamer-hạt vàng với E. coli thƣờng.
59
Nhƣ vậy, qua kết quả dotblot cho phép chúng tôi sơ bộ khẳng định: đã gắn
thành công aptamer ssDNA với hạt nano vàng, phức hệ sau khi gắn kết vẫn giữ hoạt
tính liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích. Và đã chọn đƣợc 1 dòng có ái lực cao
với E. coli O157:H7 trong số các dòng thí nghiệm.
3.3.2. Kết quả xác định sự liên kết của phức hợp aptamer - hạt nano vàng
với E. coli O157:H7
Vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đạt OD600 =
1. Tiến hành thu tế bào vi khuẩn, rửa bằng dung dịch PBS, sau đó hoà lại trong 1ml
PBS. Dùng 100µl dung dịch vi khuẩn ủ với 100µl phức hợp aptamer - hạt vàng, ủ
lắc ở nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000v/p trong 5
phút, rửa 3 lần với PBS và cuối cùng hòa lại trong 100µl PBS, dung dịch thu đƣợc
đƣợc mang xử lý và chụp ảnh TEM. Kết quả thu đƣợc trên hình 3.14 cho thấy phức
hợp aptamer - hạt nano vàng bám đặc hiệu trên bề mặt vi khuẩn E. coli O157:H7.
Nhƣ vậy, kết quả chụp ảnh dƣới kính hiển vi điện tử (hình 3.14) đã một lần
nữa khẳng định kết quả gắn các hạt nano vàng (đƣờng kích 30nm - 40 nm) với
aptamer bám đặc hiệu E. coli O157:H7. Còn đối với E. coli thƣờng, phức hệ không
liên kết.Các chấm đen là các hạt vàng; các sợi mảnh dài là lông roi của vi khuẩn E.
coli O157:H7.
Trên hình có một vài phức hợp aptamer – hạt nano vàng liên kết E. coli
thƣờng, có thể đó là do quá trình ủ màng trong quá trình sàng lọc chƣa khóa hết các
vị trí có thể liên kết với E. coli thƣờng.
60
a b
Hình 3.14:Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng
với E. coli O157:H7 và E. coli thƣờng
a, Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng với E. coli
O157:H7
b, Ảnh chụp TEM sự liên kết của phức hệ aptamer-hạt nano vàng với E. coli
thường
3.4. Xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli O157:H7
3.4.1. Tách DNA plasmid từ vi khuẩn E. coli
Dòng khuẩn lạc đã chọn ở trên đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh kar qua đêm ở tủ lắc 370C, 200 v/ph để nhân lên với số lƣợng
lớn. Sau khi tách chiết theo quy trình nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.8, chúng tôi lấy
5μl dịch plasmid tách từ mỗi khuẩn lạc hòa trong H2O để điện di kiểm tra trên gel
agarose 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở hình 3.15.
61
Hình 3.15: Kết quả tra sản phẩm tách dòng của aptamer ssDNA 8
Giếng 1-2: Plasmidtách chiết từ khuẩn lạc dòng số 8.
Kết quả điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện 3 trạng thái khác nhau
của plasmid. Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạch DNA plasmid đã
thành công, loại bỏ hoàn toàn RNA và plasmid.
Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách đƣợc dòng aptamer ssDNA 8 nhận biết đặc hiệu
E. coli O157:H7.
3.4.2. Kết quả xác định trình tự aptamer nhận biết đặc hiệu E. coli
O157:H7
Chúng tôi tiến hành xác định trình tự aptamer dòng số 8 bằng phƣơng pháp
giải trình tự acid nucleic tự động trình bày ở mục 2.2.9, kết quả thu đƣợc thể hiện ở
hình 3.16.
62
1 ATACGGGAGC CAACACCAAC CACACCAACC GGACGCTTAT GCCTTGCCAT
51 CTACAGAGCA GGTGTGACGG ATA
Hình 3.16: Trình tự aptamer ssDNA 8
Để dự đoán cấu trúc bậc 2 của aptamer - 8 có khả năng nhận biết đặc hiệu vi
khuẩn E. coli O157:H7 chúng tôi sử dụng công cụ Mfold dựa trên trình tự đã biết.
Đây là công cụ hỗ trợ tính toán phân tử sinh học đƣợc Đại học Washington of
Medicine, Mỹ xây dựng và đƣa vào sử dụng từ năm 1995. Sau khi cung cấp thông
tin dữ liệu đầu cho công cụ Mfold, chúng tôi thu đƣợc kết quả dự đoán cấu trúc
cuộn xoắn của aptamer (đã biết trình tự). Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.17.
Hình 3.17: Mô hình cấu trúc bậc 2 của aptamer ssDNA 8 đƣợc dự đoán
bằng công cụ Mfold
63
Từ kết quả phân tích cấu trúc bậc 2 của aptamer 8, sơ bộ dự đoán aptamer
này có 2 vùng hoạt động: vùng 1 trong khoảng nucleotit 1-28, vùng 2 trong khoảng
nucleotit 43-57. Tiếp theo, trình tự aptamer ssDNA 8 đƣợc đƣa vào công cụ FASTA
để so sánh với các trình tự aptamer trong ngân hàng gen. Kết quả đƣợc thể hiện trên
hình 3.18 cho thấy aptamer 8 có độ tƣơng đồng khá cao với các aptamer đã công bố
trong các patent (đa số độ tƣơng đồng đạt 88,9% và 90,3% đối với aptamer trong
patent số EM_PAT:GZ844111). Điều đặc biệt thú vị là aptamer 8 chỉ sai khác với
các aptamer đã công bố ở 2 vùng đƣợc dự đoán là 2 vùng hoạt động sau khi xử lý
cấu trúc bậc 2.
64
Algn. DB:ID
Source
Length
Score Identiti
E()
es
Positi ves
72
288
88.9
88.9
3.0E-
EM_PAT:JA04
Sequence 181 from Patent EP2255015.
10
1
1165
Literature Ontologies
Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041165 JA041165.1 Sequence 181 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
2
EM_PAT:GZ84 4086
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 44 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844086 GZ844086.1 Sequence 44 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
3
EM_PAT:GZ84 4099
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 57 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844099 GZ844099.1 Sequence 57 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60
65
EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
4
EM_PAT:GZ84 4098
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 56 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844098 GZ844098.1 Sequence 56 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
5
EM_PAT:GZ84 4264
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 222 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844264 GZ844264.1 Sequence 222 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
6
EM_PAT:JA04 0996
3.0E- 10
Sequence 12 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
66
Literature Ontologies
>>EM_PAT:JA040996 JA040996.1 Sequence 12 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
7
EM_PAT:GZ84 4079
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 37 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844079 GZ844079.1 Sequence 37 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
EM_PAT:GZ84
72
288
88.9
88.9
3.0E-
8
4090
10
Ontologies
Sequence 48 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844090 GZ844090.1 Sequence 48 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT
67
::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
9
EM_PAT:GZ84 4104
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 62 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844104 GZ844104.1 Sequence 62 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
10
EM_PAT:GZ84 4263
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 221 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844263 GZ844263.1 Sequence 221 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
11
EM_PAT:JA04 1139
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 155 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041139 JA041139.1 Sequence 155 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72)
68
10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
12
EM_PAT:JA04 1003
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 19 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041003 JA041003.1 Sequence 19 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
13
EM_PAT:JA04 1021
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 37 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041021 JA041021.1 Sequence 37 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
69
72
288
88.9
88.9
14
EM_PAT:JA04 1319
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 335 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041319 JA041319.1 Sequence 335 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
15
EM_PAT:GZ84 4103
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 61 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844103 GZ844103.1 Sequence 61 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
16
EM_PAT:JA04 1017
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 33 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041017 JA041017.1 Sequence 33 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : ::::::::::::::::::::::::::::::::
70
EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
17
EM_PAT:JA04 1008
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 24 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041008 JA041008.1 Sequence 24 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
18
EM_PAT:JA04 1009
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 25 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041009 JA041009.1 Sequence 25 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
19
EM_PAT:GZ84 4197
3.0E- 10
Sequence 155 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
71
Ontologies
>>EM_PAT:GZ844197 GZ844197.1 Sequence 155 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
72
288
88.9
88.9
20
EM_PAT:GZ84 4078
3.0E- 10
Ontologies
Sequence 36 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844078 GZ844078.1 Sequence 36 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
21
EM_PAT:JA04 1166
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 182 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041166 JA041166.1 Sequence 182 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT
72
::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
288
88.9
88.9
22
EM_PAT:JA04 1016
3.0E- 10
Literature Ontologies
Sequence 32 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041016 JA041016.1 Sequence 32 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 288 init1: 288 opt: 288 Z-score: 384.0 bits: 75.0 E(169318201): 3e-10 banded Smith-Waterman score: 288; 88.9% identity (88.9% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
71
283
90.3
90.3
23
EM_PAT:GZ84 4111
6.8E- 10
Ontologies
Sequence 69 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844111 GZ844111.1 Sequence 69 from patent US 8389710. (71 nt) initn: 288 init1: 220 opt: 283 Z-score: 377.9 bits: 73.8 E(169318201): 6.8e-10 banded Smith-Waterman score: 283; 90.3% identity (90.3% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-71) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATCTA-TCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 60 70
72
279
87.5
87.5
1.3E-9
24
EM_PAT:GZ84 4198
Ontologies
Sequence 156 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844198 GZ844198.1 Sequence 156 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 279 init1: 279 opt: 279 Z-score: 372.7 bits: 72.9 E(169318201): 1.3e- 09 banded Smith-Waterman score: 279; 87.5% identity (87.5% similar) in 72 nt overlap (72-
73
1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG ::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACTCCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
EM_PAT:JA04
72
279
87.5
87.5
1.3E-9
25
1140
Literature Ontologies
Sequence 156 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041140 JA041140.1 Sequence 156 from Patent EP2255015. (72 nt) rev-comp initn: 279 init1: 279 opt: 279 Z-score: 372.7 bits: 72.9 E(169318201): 1.3e- 09 banded Smith-Waterman score: 279; 87.5% identity (87.5% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG ::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACTCCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
279
87.5
87.5
1.3E-9
26
EM_PAT:JA04 1029
Literature Ontologies
Sequence 45 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041029 JA041029.1 Sequence 45 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 279 init1: 279 opt: 279 Z-score: 372.7 bits: 72.9 E(169318201): 1.3e-09 banded Smith-Waterman score: 279; 87.5% identity (87.5% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA : :::::::::: EM_PAT GTTGTGACGGAT 70
74
72
279
87.5
87.5
1.3E-9
27
EM_PAT:GZ84 4085
Ontologies
Sequence 43 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844085 GZ844085.1 Sequence 43 from patent US 8389710. (72 nt) initn: 279 init1: 279 opt: 279 Z-score: 372.7 bits: 72.9 E(169318201): 1.3e-09 banded Smith-Waterman score: 279; 87.5% identity (87.5% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : ::::::: :::::::::::::::::::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGGTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
73
270
87.7
87.7
5.6E-9
28
EM_PAT:JA04 1320
Literature Ontologies
Sequence 336 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041320 JA041320.1 Sequence 336 from Patent EP2255015. (73 nt) rev-comp initn: 288 init1: 220 opt: 270 Z-score: 361.2 bits: 70.8 E(169318201): 5.6e- 09 banded Smith-Waterman score: 270; 87.7% identity (87.7% similar) in 73 nt overlap (72- 1:1-73) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGG-TTGGTGTGGTTGGT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : :::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAAACGATAGAATGGT 10 20 30 40 50 10 EMBOS- GTTGGCTCCCGTAT :::::::::::::: EM_PAT GTTGGCTCCCGTAT 60 70
72
261
84.7
84.7
2.4E-8
29
EM_PAT:JA04 1004
Literature Ontologies
Sequence 20 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA041004 JA041004.1 Sequence 20 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 261 init1: 261 opt: 261 Z-score: 350.0 bits: 68.7 E(169318201): 2.4e-08 banded Smith-Waterman score: 261; 84.7% identity (84.7% similar) in 72 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 60
75
EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAGAGCA :::::::::::::::::: : : :::::::::::::::::::::::: ::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCATTCTATCGTTCCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTCACGAGCA 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS GGTGTGACGGATA :::::::::::: EM_PAT GGTGTGACGGAT 70
70
256
86.1
86.1
5.3E-8
30
EM_PAT:JA04 0997
Literature Ontologies
Sequence 13 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:JA040997 JA040997.1 Sequence 13 from Patent EP2255015. (70 nt) rev-comp initn: 256 init1: 170 opt: 256 Z-score: 343.9 bits: 67.5 E(169318201): 5.3e- 08 banded Smith-Waterman score: 256; 86.1% identity (86.1% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-70) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::: :::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCAT--GCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT ::::::::::::: EM_PAT TTGGCTCCCGTAT 60 70
72
252
83.3
83.3
1.0E-7
31
EM_PAT:GZ84 4091
Ontologies
Sequence 49 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844091 GZ844091.1 Sequence 49 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 252 init1: 252 opt: 252 Z-score: 338.6 bits: 66.6 E(169318201): 1e-07 banded Smith-Waterman score: 252; 83.3% identity (83.3% similar) in 72 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: : : ::::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTAGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGAACGATAGAATGGTG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TTGGCTCCCGTAT : : ::::::: EM_PAT TGGCTCCCCGTAT 60 70
72
184
76.7
76.7
0.0061
32
EM_PAT:JA04 1035
Sequence 51 from Patent EP2255015. Cross-references and related information in:
76
Literature Ontologies
>>EM_PAT:JA041035 JA041035.1 Sequence 51 from Patent EP2255015. (72 nt) initn: 153 init1: 153 opt: 184 Z-score: 252.8 bits: 50.7 E(169318201): 0.0061 banded Smith-Waterman score: 184; 76.7% identity (76.7% similar) in 73 nt overlap (1- 72:1-72) 10 20 30 40 50 EMBOS ATACGGGAGCCAACACCAACCACACCAACCGGACGCTTATGC-CTTGCCATCTACAGAGC :::::::::::::::::: :: : :: :: : :::: ::: : : : ::::::: EM_PAT ATACGGGAGCCAACACCACCCCCTCCCTCCTG-CGCTGCTGCTCATCATCGCGACAGAGC 10 20 30 40 50 60 70 EMBOS AGGTGTGACGGATA ::::::::::::: EM_PAT AGGTGTGACGGAT 60 70
72
184
78.4
78.4
0.0061
33
EM_PAT:GZ84 4109
Ontologies
Sequence 67 from patent US 8389710. Cross-references and related information in:
>>EM_PAT:GZ844109 GZ844109.1 Sequence 67 from patent US 8389710. (72 nt) rev-comp initn: 153 init1: 153 opt: 184 Z-score: 252.8 bits: 50.7 E(169318201): 0.0061 banded Smith-Waterman score: 184; 78.4% identity (78.4% similar) in 74 nt overlap (72- 1:1-72) 70 60 50 40 30 20 EMBOS- TATCCGTCACACCTGCTCTGT--AGATGGCAAGGCATAAGCGTCCGGTTGGTGTGGTTGG :::::::::::::::::::: :::: : ::: :::: : :: :: : :: ::: EM_PAT ATCCGTCACACCTGCTCTGTCGCGATGATGA-GCAGCAGCG-CAGGAGGGAGGGGGTGG 10 20 30 40 50 10 EMBOS- TGTTGGCTCCCGTAT ::::::::::::::: EM_PAT TGTTGGCTCCCGTAT 60 70
Hình 3.18: Kết quả so sánh trình tự của aptamer ssDNA 8 với
các trình tự aptamer trong ngân hàng gen bằng công cụ FASTA.
77
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Đã xây dựng đƣợc quy trình sàng lọc aptamer ssDNA đặc hiệu E. coli
O157:H7 và lựa chọn đƣợc một aptamer có ái lực liên kết khá cao với vi khuẩn E.
coli O157:H7.
- Đã tách dòng, xác định trình tự, dự đoán cấu trúc bậc 2 và phân tích cấu
trúc của aptamer ssDNA 8 . Kết quả cho thấy aptamer ssDNA 8 có chiều dài 72
nucleotid với 2 vùng hoạt động: vùng 1 trong khoảng nucleotid 1-28, vùng 2 trong
khoảng 43-57.
2. Kiến nghị
- Nghiên cứu tính đặc hiệu và chọn lọc của dòng aptamer ssDNA 8 với một
số vi khuẩn: E. coli O104:H4, E. coli O102, Salmonella spp., Shigella....
- Nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer ssDNA 8 đặc hiệu E. coli O157:H7
nhằm tạo kit xác định nhanh E. coli O157:H7.
78
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Hà Mai Dung, Trần Nhật Khoa (2011), ―Tình hình nhiễm E. coli O157:H7
ở bò ngoại ô thành phố Hồ Chí Minh ‖, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, tập
15, số 1.
2. Trần Thị Định, Vũ Thị Thƣ, Jeroen Lammertyn (2010),―Xác định hằng số
phân ly của DNA aptamer-im-munoglobuline nhờ phƣơng pháp huỳnh quang bất
đẳng hƣớng và điện di mao quản‖.Tạp chí Dinh Dưỡng và Thực phẩm/Journal of
Food and Nutrition Sciences,tập 6, số 3+4 .
3. Nguyễn Trọng Hải, Đào Hoài Thu, Phan Thị Hằng, Hồ Văn Hiệp, Nguyễn
Thị Kim Phụng, Đỗ Văn Tấn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng (2011), ―Xác định tỷ lệ
nhiễm và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Escherichia coli O157:H7 trên
trâu, bò khỏe mạnh ở một số tỉnh Nam Trung Bộ‖. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y,
tập XVIII, số 3: 31- 37.
4. Hoàng Phú Hiệp, Nguyễn Thị Giang, Lê Quang Huấn (2011), ―Tách dòng
và xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn Escherichia coliO157:H7‖.
Tạp chí Dinh dưỡng và Thực phẩm, tập 7, số 2, tháng 6/2011.
5. Lê Thị Mai Khanh (2004), ―Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia
coli phân lập đƣợc từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR”. Luận
văn Thạc sỹ Nông nghiệp Trƣờng Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
6. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Tô Long Thành (2011), ―Nghiên cứu
xác định các điều kiện tối ƣu trong quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu
với kháng nguyên H7 của vi khuẩn Escherichia coliO157:H7‖. Tạp chí Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, số 10 (168), 2011.
Tài liệu tiếng Anh
7. Baker DR, Moxley RA, Steele MB, LeJeune JT, Christopher-Hennings J,
Chen DG, Hardwidge PR, Francis DH. (2007),―Differences in virulence among
79
Escherichia coli O157:H7 strains isolated from humans during disease outbreaks
and from healthy cattle.‖, Appl Environ Microbiol. 73(22): 7338-7346.
8. Barrett T. J., Kaper L. P., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K.
(1992),―Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated
from humans and cattle‖, J.Infect. Dis. 165: 970 - 980.
9. Baugh, C., D. Grate, C.Wilson (2000),―2.8 angstrom crystal structure of
the malachite green aptamer.‖, J. Mol. Biol. 301 : 117–128.
10. Bolger M., Coker R. D., DiNovi M., Gaylor D., Gelderblom W.,
OlsenM., Speijers G. J. A, Fumonisins (2001), ―WHO/IPCS safety evaluation of
certain mycotoxins in food‖. WHO Food Additives Series, 47, pp.557-680.
11. Cebula T. A., Payne W. L., and Feng P (1995),―Simultaneous
IdentificationofStrains ofEscherichia coli Serotype O157:H7 and Their Shiga –
Like toxin‖.
12. Cháfer-Pericás, C.; Maquieira, Á. & Puchades, R. (2010), ―Fast screening
methods to detect antibiotic residues in food samples.‖, TrAC Trends in Analytical
Chemistry, 29, 9 (10), pp.1038-1049, 0165-9936 .
13. Cheli F., Pinotti L., Campagnoli A., Fusi E., Rebucci R., Baldi A. (2008),
―Mycotoxin analysis, mycotoxin-producing fungi assays and mycotoxin toxicity
bioassays in food mycotoxin monitoring and surveillance‖, Italian Journal of Food
Science, 20, 4, pp.447-462, 1120-1770.
14. Clarke RC, Read SCMSA (1991), ―Isolation of verocytotoxin-producing
Escherichia coli from animal and food products. In: Workshop on Methods to
Isolate E. coli O157:H7 and Other Verotoxigenic E. coli”, From Foods: Ottawa,
Canada. Canada.
15. Darfeuille F., S. Reigadas, J. Hansen, H. Orum, C. Di Primo, J. Toulme
(2006), "aptamers targeted to an RNA hairpin show improved specificity compared
to that of complementary oligonucleotides.", Biochemistry 45 : 12076–12082.
80
16. David JH & Szostak JW (2002), ―Isolation of high – affinity GTP
aptamer from partially structured RNA libraries.‖, Proc. Nalt. Acad. Sci. USA. 99,
11616- 11621.
17. Deng M, Fratamico P. (1996),―A multiplex PCR for rapid identificaton of
shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7 isolated from foods.‖, Journal
of Food Protection. 1996;59;570-576.
18. Dieckmann T., E. Fujikawa, X. Xhao, J. Szostak, J. Feigon (1995),
―Structural Investigations of RNA and DNA aptamers in Solution‖, Journal of
Cellular Biochemistry : 56–56.
19. Ding H., Huang L., Mao X., Zou Q. (2011),―Characterization of stx2 and
its variants in Escherichia coli O157:H7 isolated from patients and animals.‖, AJB,
10: 2991-2998.
20. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O’Brien A. D., Alroy J.,
and Kaper J. B. (1993),―The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia
coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model.‖, J. Clin. Invest. 92:
1418 - 1424.
21. Doyle M. P. and J. L. Schoeni. (1987),―Isolation of Escherichia coli
O157:H7 from retail fresh meats and poultry‖, Appl. Environ. Microbiol, 53:2394-
2396.
22. Ellington AD & Szostak JW. (1992),―Selection In vitro of single – strand
DNA molecules that fold into specific ligand – binding structures.‖, Nature, 355,
850-852.
23. Esposito CL., Catuogno S., Franciscis V., Cerchia L. (2011),―New
insight into the clinical development of nucleic acid aptamers.‖, Discovery
Medicine; 11 (61): 487–496. PMid:21712014.
24. Feng P. and Monday S. (2000), ―Multiplex PCR for detection of trait and
virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes ‖, Molecular and
Cellular Probes. 14: 333 - 337.
81
25. Friedrich AW., Bielaszewska M., Zhang WL., Pulz M., Kuczius T.,
Ammon A., Karch H. (2002),―Escherichia coli harboring Shiga toxin 2 gene
variants: frequency and association with clinical symptoms.‖, J Infect Dis. 185: 74-
84.
26. Fujisawa T., Sata S., and Aikawa K. (2002), “Evaluation of sorbitol-
salicin MacConkey medium containing cefixime and tellurite (CT-SSMAC
medium) for isolation of Escherichia coli O157:H7 from raw vegetables.‖, J. Food
Mic. 74: 161 - 163.
27. Grate D., & Wilson C. (1999), ―Laser-mediated, site-specific inactivation
of RNA transcripts.‖, Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 96, 11, (May 25), pp.6131-6136, 0027-8424; 0027-8424.
28. Held D.M., Greathouse S.T., Agrawal A., Burke D.H. (2003),
―Evolutionary landscapes for the acquisition of new ligand recognition by RNA
aptamers.‖, J. Mol. Evol. 57, 299–308.
29. Hendry P., Hannan G. (1996),―Detection and quantitation of unlabeled
nucleic acids in polyacrylamide gels.‖, Biotechniques 20, 258–264.
30. Huang Z., Szostak J.W. (2003), ―Evolution of aptamers with
secondarystructures from a new specificity and new an ATP aptamer. RNA-A
9,1456–1463.
31. Jayasena SD (1999), ―aptamers: an emerging class of molecules that rival
antibodies in diagnostics.‖, Clin Chem, 45 (9): 1628–1650.
32. Jensen K.B., Atkinson B.L., WillisM.C., Koch T.H., Gold L. (1995),
―Using invitro selection to direct the covalent attachment of human immuno defi-
ciency virus type 1 Rev protein to high-affinity RNA ligands.‖, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 92, 12220–12224.
33. Jerse A. E., Yu J., Tall B. D., and Kaper J. B. (1990),―A genetic locus of
enteropathogenic Escherichia coli necessary for the production of attaching and
effacing lesions on tissue culture cells.‖ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 7839 –
7843.
82
34. Jeon S.H., Kayhan B., Ben-Yedidia T., RNA R. (2004),―A DNA aptamer
prevents influenza infection by blocking the receptor binding region of the iral
hemagglutinin.‖, J. Biol. Chem. 279, 48410–48419.
35. Jeong S., Eom T., Kim S., Lee S., Yu J. (2001), ―In vitro selection of the
RNA aptamer against the Sialyl Lewis X and its inhibition of the cell adhesion.
Biochem.‖, Biophys. Res. Commun. 281, 237–243.
36. Jeong S., SR Han, YJ Lee, SW Lee. (2010), ―Selection of RNA aptamers
specific to active prostate-specific antigen.‖, Biotechnology Letters 32 : 379–85.
37. Josefa M. Rangel, Phyllis H. Sparling, Collen Crowe, Patricia M.
Griffin, David L. Swerdlow(2005), ―Epidemiology of Escherichia coli O157:H7
Outbreaks, United States, 1982–2002‖, Emerg Infect Dis.11(4):603–609.
PMCID: PMC3320345.
38. Kim M., Um H. J., Bang S., Lee S. H., Oh S. J., Han J. H., Kim Y. H.
(2009), ―Arsenic removal from vietnamxsese groundwater using the arsenic-binding
DNA aptamer.‖, Environmental Science & Technology, 43, 24, (Dec 15), pp.9335-
9340, 0013-936X; 0013-936X .
39. Kim H. H. (1994), ―Characteristics of antibiotic-resistant Escherichia
coli0157:H7 in Washington State, 1984-1991.‖, J. Infect. Dis. 170: 1606-1609.
40. Kozyr, N. Luneva, A. Kolesnikov, A. Khlyntseva, I. Shemyakin
(Moscow, RU). (2013), ― Development of sensitive assays based on DNA-aptamers
selected against virulent strain E. coli O157:H7‖, European society of clinical
microbiology and infectious disases, 24/9/2013.
41. Kyung-Mi Song, Seonghwan Lee, and Changill Ban (2012), ―aptamer
and their biological applications‖, Sensors (Basel). 2012; 12(1): 612–631.
42. Levine M. M., Xu J., Kaper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J.,
Karch H., and Wachsmuth I. K. (1987), ―A DNA probe to identify
enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause
hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome.‖, J. Infect. Dis. 156: 175 –
182.
83
43. Leyer G. J., Wang L., and Johnson E. A. (1995), ―Acid adaptation of
Escherichiacoli O157:H7 increases survival in acidic foods‖, Appl. Environ.
Microbiol. 61:3752- 3755.
44. Lingwood C. A. (1996), ―Role of verotoxin receptors in pathogenesis.‖,
TrendsMicrobiol. 4: 147 - 153.
45. Liu M., T.Kagahara, H.Abe, Y.Ito. (2009), ―Direct In Vitro Selection of
Hemin-Binding DNA aptamer with Peroxidase Activity‖, Bulletin of the Chemical
Society of Japan 82 : 99–104.
46. Long S., M. Long, R. White, B. Sullenger. (2008), ―Crystal structure of
an RNA aptamer bound to thrombin‖. RNA 14 (2): 2504–2512.
47. Min K., M. Cho, S. Han, Y. Shim, J. Ku, C. Ban. (2008), ―A simple and
direct electrochemical detection of interferon-gamma using its RNA and DNA
aptamers.‖, Biosensors & Bioelectronics 23 : 1819–1824.
48. Murphy MB, Fuller ST, Richardson PM & Doyle SA (2003), ―An
improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein
detection and purification.‖. Nucleic Acids Res. 31, e110.
49. Myron M. Levine, Jian-guo Xu, James B. Kaper, Hermy Lior, Valeria
Prado, Ben Tall, James Nataro, Helge Karch and Kaye Wachsmuth(1987),―A DNA
Probe to Identify Enterohemorrhagic Escherichia coli of 0157:H7 and Other
Serotypes That Cause Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic Syndrome‖.
Oxford Joural, Volume 156 Issue 1, p.175-182.
50. Ng, EWM, DT Shima P., Calias, ET Cunningham, DR Guyer, AP
Adamis. (2006), ―Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular
disease.‖. Nature Reviews Drug Discovery 5 (2): 123–132.
51. O’Sullivan C.K. (2002), ―Aptasensors—the future of biosensing‖. Anal.
Bioanal.Chem. 372, 44–48.
52. Ohuchi S.P., Ohtsu T., Nakamura Y. (2006), ―Selection of RNA aptamers
against recombinant transforming growth factor-beta type III receptor displayed on
cell surface.‖, Biochimie 88, 897–904.
84
53. Patricia M. Griffin, MD, Stephen M. Ostroff, MD, Robert V. Tauxe, MD,
MPH, Katherine D. Greene, Joy G. Wells, MS, Jay H., Lewis BS., Paul A. Blake,
MD, MPH. (1988), ―Illnesses Associated with Escherichia coli 0157:H7
Infections: A Broad Clinical Spectrum‖, Ananals of Internal Medicine,109(9):705-
712.
54. Paton J. C. and Paton A. W. (1998), ―Pathogenesis and diagnosis of
Shiga toxin-producingEscherichia coli infection‖, Clin. Microbiol. Rev. 11: 450 –
479.
55. Potty, A.; K. Kourentzi, H. Fang, G. Jackson, X. Zhang, G. Legge, R.
Willson. (2009), ―Biophysical Characterization of DNA aptamer Interactions with
Vascular Endothelial Growth Factor.‖, Biopolymers 91 : 145–156.
56. Ray P et al. (2012), ―aptamer-mediated delivery of chemotherapy to
pancreatic cancer cells‖, Nucleic Acid Therapeutics, 22 (5): 295–305.
57. Regina Stoltenburg, Christine Reinemann, Beate Strehlitz. (2007),
―SELEX _ A(r)evolutionary method to generate high – afinity nucleic acid ligands‖,
Science Direct, Biomolecular Engineerung 24: 381-403.
58. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR,
Heber Rj, Olcott ES, Johnson LM, Hargrett NT. (1983), ―Hemorrhagis colitis
associated with a rare E. coli O157:H7 ‖. N Engl J Med, 308:681-685.
59. Roger P. Jonson, Rebecca J. Durham, Shelley T. Johnson, Leslie A.
Macdonal, Scott R. Jeffrey, and Bryan T.Butman. (1995), ―Detection of Escherichia
coli O157:H7 in Meat by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, EHEC-Tek‖,
Applied anh Environmental, p. 386–388.
60. Roland Lindqvist. (1997), ―Preparation of PCR samples from food by a
rapid and simple centrifugation technique evaluated by detection of E. coli
O157:H7‖, International Journal of Food Microbioly.
61. Savory N., K. Abe, K. Sode, K. Ikebukuro (2010),"Selection of DNA
aptamer against prostate specific antigen using a genetic algorithm and application
to sensing.", Biosensors & Bioelectronics 15 : 1386–91.
85
62. Shamah SM, Healy JM, Cload ST. (2008), ―Complex target SELEX.‖,
Acc Chem Res, 41 (1): 130–138.
63. Stead S. L., Ashwin H., Johnston B., Dallas A.; Kazakov S. A., Tarbin J.
A., Keely B. J. (2010), ―An RNA-aptamer-based assay for the detection and
analysis of malachite green and leucomalachite green residues in fish tissue.‖.
Analytical Chemistry, 82, 7, (Apr 1), pp.2652-2660, 1520-6882; 0003-2700
64. Tombelli S., Minunni A., Mascini A. (2005), ―Analytical applications of
aptamers. Biosens.‖, Bioelectron. 20, 2424–2434.
65. Toulme J.J., Darfeuille F., Kolb G.L., Chabas S., Staedel C. (2003),
―Mod-ulating viral gene expression by aptamers to RNA structures.‖, Biol. Cell.
95,229–238.
66. Tsai RYL, Reed RR. (1998), ―Identification of DNA recognition
sequnces and protein intreaction domains of the multiple – Zn – finger protein
Roaz.‖, Mol. Cell Biol. 18, 6447-6456.
67. Tuerk C & Gold L. (1990), ―Systematic evolution of lignads by
exponential enrichment: RNA lignads to bacteriophage T4 DNA polymerase.‖,
Science, 249, 505-510.
68. Tzipori S., Karch H., Wachsmuth I. K., Robins-Browne R. M., O’Brien
A. D., Lior H., Cohen M. L., Smithers J., and Levine M. M. (1987), ―Role of a 60-
MDa plasmid and Shiga-like toxins in the pathogenesis of infection caused by
enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in gnotobiotic piglets.‖, Infect.
Immun. 55: 3117 – 3125.
69. Xu J. P., Song Z. G., Fang Y., Mei J., Jia L., Qin A. J., Tang B. Z. (2010), ―Label-free fluorescence detection of mercury(II) and glutathione based on Hg2+-
DNA complexes stimulating aggregation-induced emission of a tetraphenylethene
derivative.‖, The Analyst, 135, 11, (Nov), pp.3002-3007, 1364-5528; 0003-2654.
70. Walsh R., M. DeRosa. (2009), ―Retention of function in the DNA
homolog of the RNA dopamine aptamer‖, Biochemical and Biophysical Research
Communications, 388 : 732–735.
86
71. Waterman S. R., and Small P. L. (1996), ―Characterization of the acid
resistance phenotype and rpoS alleles of Shiga-like toxin-producing Escherichia
coli.‖, Infect. Immun. 64: 2808 – 2811.
72. Wells J, Davis B, Wachsmuth I, Riley L, Remis RS, Sokolow R, Morris
G. (1983) ―Laboratory investigation of hemorrhagic colitis outbreaks associates
with a rare E. coli seotype‖, J Clin Microbiol, 18: 512.
73. Wen-he Wu, Min Li, Yue Wang, Hou-xian Ouyang, Lin Wang, Ci-xiu
Li, Yu-chen Cao, Qing-he Meng and Jian-xin Lu1. (2012), ―Aptasensors for rapid
detection of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhimurium.‖,PLoS One
(Public Library of Science), November 2012, Volume 7, Issue 11, e48999.
74. Williams K.P., Liu X.H., Schumacher T.N., Lin H.Y., Ausiello D.A.,
Kim P.S., Bartel D.P. (1999), ―Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of
vasopressin.‖, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 11285–11290.
75. Wilson C., Nix J., Szostak J. (1998), ―Functional requirements for
specific ligand recognition by a biotin-binding RNA pseudoknot.‖, Biochemistry
37,14410–14419.
76. Wilson, C., Szostak, J. (1999), ―In vitro evolution of a self-alkylating
ribozyme.‖, Nature 374, 777–782.
77. Wilson, C., Szostak, J.W. (1999), ―Isolation of a fluorophore-specific
DNA aptamer with weak redox activity.‖, Chem. Biol. 5, 609–617.
78. Wilson, D.S., Szostak J.W. (1999), ―In vitro selection of functional
nucleic acids.‖, Ann. Rev. Biochem. 68, 611–647.
79. Wong C.S, (2000) ―The Risk of the Hemolytic-Uremic Syndrome after
Antibiotic Treatment of E. coli 0157: H7‖, New Engl. Journ. Of Medicine, vol342,
no 26, June29.
80. Wu W, Zhang J, Zheng M, Zhong Y, Yang J, Zhao Y, Wu W, Ye
W, Wen J, Wang Q, Lu J.(2012), ―An aptamer-based biosensor for colorimetric
detection of Escherichia coli O157:H7.”, PLoS One.(Public Library of
Science) 2012;7(11).
87
81. Ying Lu, Xianchan Li, limin Zhang, Ping Yu, Lei Su, and Lanqun Mao
(2008), ―aptamer – Based Electrochemical Sensors with aptamer- Complementary
DNA Oligonucleotides as probe‖, Anal.Chem :1883-1890.
82. Young Ju Lee, Seung Ryul Han, Jin-Soo Maeng, Yong-Jin Cho, Seong-
Wook Lee. (2012), ―In vitro selection of Escherichia coli O157:H7-specific RNA
aptamer.‖, Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 417,
Issue 1, 6 January 2012, Pages 414–420.
83. Zhou J, Li H, Zhang J, Piotr S, Rossi J. (2011), ―Development of cell-
type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery.‖, J Vis Exp. 2011 Jun
23;(52). pii: 2954. doi: 10.3791/2954.
84. Zuker M., ―Mfold web server for nucleic acid folding, hybridization
prediction‖, Nucleic Acids Res. 31 (2003) 3406–3415.
85. http://www.aptagen.com/home.aspx
86. http://edition.cnn.com/2013/06/28/health/e-coli-outbreaks-fast-facts/
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
