Phương pháp nhuộm Gram:
Đây là phương pháp thường được dùng trong thực
nghiệm vi sinh vật học.
Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan
mạch là Christian Gram và
những người cộng tác đưa ra năm 1884. Với phương
pháp nhuộm này người ta có
thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương
(G+) và Gram âm (G-).
Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh
vật Gram dương (bao
gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu
khí, nấm mốc, nấm men, cầu
khuẩn). Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là
Gram âm như trực khuẩn sinh
bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn,
não mô cầu khuẩn...
a. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào
chất và màng tế bào
với thuốc nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành
nên hai loại phức chất khác
nhau:
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của
thuốc nhuộm nên không
bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức
chất này thuộc loại gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của
thuốc nhuộm nên mất màu
khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ
sung. Vi sinh vật có phức
chất này thuộc loại gram âm.
b. Cách tiến hành:
- Làm vết bôi từ ống giống đã nuôi cấy 24 giờ. Để
khô và cố định tiêu bản
trên ngọn lửa đèn cồn.
- Đặt giấy lọc lên trên vết bôi.
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua
giấy lọc trong 1 phút.
- Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ 1 phút rồi
đổ đi.
- Rửa tiêu bản bằng nước rồi tẩy bằng cồn 950 trong
0,5 phút, để nghiêng tiêu
bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.
- Rửa tiêu bản bằng nước.
- Nhuộm bổ sung Fuchsin lên vết bôi 10 – 30 giây.
- Rửa bằng nước, để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn
lửa đèn cồn và đem
quan sát dưới kính hiển vi.
1. Thuốc nhuộm Fuchsin kiềm:
(1) Cồn 96o 10 ml Fuchsin kiềm
0,3 gam
(2) Phênol (axit phênic) 5 gam Nước cất
95 ml
Trộn dung dịch (1) với (2) và pha loãng 5 lần.
2. Thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001%
Xanh mêtylen 0,1 gam
Nước cất 1000ml
3. Thuốc nhuộm tím gentian (tím kết tinh):
(1) Gentian violet 1 gam Cồn 96o
10 ml
(2) Phenol 5 gam Nước cất
100 ml
Trộn (1) với (2) và lọc trong. Để dịch lọc trong lọ
màu.
4. Lugol:
KI 2 gam
I2 tinh thể 1 gam
Nước cất 300 ml
Hoà 2 gam KI vào 5 ml nước cất, sau đó thêm 1 gam
I2 vào chờ cho I2 tan
hết mới thêm nước cất đủ 300 ml.