Tài liệu thực tập Vi sinh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

78
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu thực tập Vi sinh gồm một số nội dung chính sau: nhuộm gram – kháng sinh đồ; cầu khuẩn gram dương; trực khuẩn gram âm; lấy và chuyển bệnh phẩm; các phương pháp thanh trùng;...Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tài liệu thực tập Vi sinh

KHOA Y – ĐẠI HỌC TRÀ VINH TÀI LIỆU THỰC TẬP VI SINH DÀNH CHO Y2 BỘ MÔN VI SINH HỌC TÀI LIỆU LƯU HÀNH NỘI BỘ - 2020
MỤC LỤC NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM......................................................................... 2 SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN .................................. 3 CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM .......................... 5 VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN ........ 6 BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ .................................................... 7 BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG .............................................................. 10 BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM.................................................................... 14 BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM ......................................................... 17 BÀI 5: CÁC PHƢƠNG PHÁP THANH TRÙNG .............................................. 23 BÀI 6: PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN ...................................... 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 27 NGƢỜI BIÊN SOẠN PGS, TS, BS Võ Thị Chi Mai 1
NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM  Sinh viên đến thực tập tại phòng thí nghiệm vi sinh phải: - Cắt móng tay ngắn. - Cắt tóc ngắn hoặc kẹp tóc thật gọn gàng. - Trước khi vào phòng thí nghiệm, mặc áo choàng sạch theo qui định của Khoa. - Đúng giờ. Trễ quá 10 phút, xem như vắng không phép. Vắng học phải được sự cho phép của người quản lý lab hoặc điều phối viên. - Không tự ý chuyển nhóm học, nếu có việc bận cần chuyển nhóm với sinh viên khác để tránh quá tải sinh viên – dụng cụ.  Khi đến thực tập, sinh viên chịu trách nhiệm về các dụng cụ đã sử dụng buổi học. Hễ bị mất hay làm hư hỏng thì phải mua trả lại.  Các đồ dùng mang theo: - Vở thực tập, bút viết, khăn giấy.  Để tránh sự lây nhiễm nguy hiểm: - Không để cặp-ba lô lên bàn thực tập. - Không ăn uống trong giờ học. Không đùa giỡn trong phòng thí nghiệm. - Đặt đồ dùng đúng chỗ qui định (thí dụ: pipette để vào bình đựng thuốc sát trùng; lam kính đã dùng để vào thố đựng nước sát trùng; vòng cấy, kim cấy cắm trong giá; các lọ thuốc nhuộm để ngay đúng các vị trí trong giá nhuộm). - Phải đốt vòng/kim cấy trước và sau khi dùng. Không bao giờ để vòng/kim cấy chưa đốt lên mặt bàn. - Phải cẩn thận khi cầm lam kính đã làm phết vì vi khuẩn ở đây có thể còn sống. - Không được mang dụng cụ ra khỏi phòng thí nghiệm. - Nếu đánh rơi vãi bất cứ vật gì nhiễm trùng phải lập tức đổ dung dịch sát trùng lên. Nếu bị tai nạn phải báo ngay cho cán bộ phụ trách. - Giữ gìn phòng thí nghiệm sạch sẽ. - Không được: vẽ, viết lên tường/lên bàn, nhổ lên sàn, nhổ vào bồn rửa, vứt rác bừa bãi. - Phải theo đúng chỉ dẫn của giảng viên.  Sau mỗi buổi thực tập, sinh viên phải kiểm tra dụng cụ, cất kính hiển vi, phun cồn 70o khử khuẩn mặt bàn thực tập. Rửa tay bằng nước xà phòng.  Sinh viên phải đọc kỹ bài thực tập trước mỗi buổi thực tập để khỏi mất thì giờ và thu được kết quả tốt.  Vắng một buổi thực tập sinh viên không được thi cuối khóa. PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH 2
SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ KHẢO SÁT VI KHUẨN I. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC 1. Cách tìm vi trường:  Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, đặt lam kính lên giá để vật.  Xoay vật kính dầu (vật kính 100X) về đúng nấc.  Nhẹ nhàng hạ vật kính xuống sao cho vật kính xuống sát tiêu bản và nhúng vào trong giọt dầu. Tránh hạ vật kính xuống quá thấp làm vỡ tiêu bản.  Điều chỉnh để có ánh sáng thích hợp: - Nâng kính tụ quang lên hết mức. - Mở hết chắn sáng. - Bỏ lọc sáng (nếu có).  Nhìn vào thị kính, dùng tay xoay ốc sơ cấp (ốc lớn) cho tới khi thấy được vi trường thì dừng ngay.  Chuyển sang điều chỉnh bằng ốc thứ cấp (ốc nhỏ) cho tới khi hình ảnh rõ nét. 2. Cách quan sát tiêu bản:  Mắt nhìn vào thị kính.  Một tay điều chỉnh ốc thứ cấp để cho hình ảnh luôn rõ nét.  Một tay điều chỉnh hai ốc chỉnh biên độ để di chuyển vị trí quan sát.  Cần quan sát một mẫu vật trên tiêu bản một cách tuần tự theo đường zig-zag.  Nhận xét chi tiết quan sát được: - Chọn nơi vi khuẩn không quá dày. - Xác định hình thể của vi khuẩn. - Cách bắt màu nhuộm. - Cách sắp xếp của vi khuẩn. - Đối với tiêu bản nhuộm từ bệnh phẩm, cần chú ý đến các tế bào khác ngoài vi khuẩn: bạch cầu đa nhân, bạch cầu đơn nhân, tế bào biểu mô... Vi khuẩn nằm trong hay ngoài các tế bào? tế bào còn nguyên vẹn hay bị biến dạng? 3. Giữ gìn và bảo quản kính hiển vi: Sau khi sử dụng: - Nâng vật kính lên để tách vật kính ra khỏi tiêu bản. Lấy tiêu bản ra khỏi giá để vật. - Xoay vật kính dầu tới vị trí dễ lau nhất. Dùng giấy lau kính đặc biệt do phòng thí nghiệm phát lau sạch dầu ở vật kính đã nhúng dầu. Lưu ý: không sử dụng bất kỳ một loại giấy nào khác để lau vật kính dầu. - Xoay vật kính 10x vào nấc và điều chỉnh cho đến khi vật kính này xuống mức thấp nhất. - Điều chỉnh các ốc chỉnh biên độ về vị trí giữa. - Cầm kính hiển vi bằng hai tay: một tay cầm thân kính, một tay đỡ bệ kính, và đem cất vào đúng vị trí trong tủ kính. 3
4
CÁCH LẤY VI KHUẨN ĐỂ CẤY VÀ LÀM PHẾT NHUỘM Hình 1: Cách cầm và mở ống nghiệm - Cầm ống nghiệm có vi khuẩn ở tay trái; giữ ống nằm ngang hoặc nghiêng 450. Tay phải cầm vòng cấy như cầm bút. Hơ đầu vòng cấy nóng đỏ trên ngọn đèn cồn. - Mở nút gòn/nắp ống nghiệm bằng cách cặp vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải. - Sát trùng miệng ống nghiệm đã mở nút bằng cách xoay trên ngọn lửa. Đưa vòng cấy vào, lấy ra một lượng nhỏ vi khuẩn để cấy hoặc làm phết nhuộm. - Hơ nóng lại đầu ống nghiệm rồi đậy lại và đặt lên giá ống nghiệm. - Sau khi làm phết, đốt đầu vòng cấy để diệt hết vi khuẩn còn sót lại. Đặt thẳng đứng vòng cấy đã vô trùng vào giá. 5
Hình 2: Cách lấy vi khuẩn từ canh thang VÀI ĐIỀU CƠ BẢN CẦN BIẾT KHI LẤY/CẤY CHUYỂN VI KHUẨN 1. Kim cấy và vòng cấy: - Kim cấy và vòng cấy làm bằng sợi dây kim loại chrome/platin. - Phải đốt vòng/kim cấy trước và sau khi lấy vi khuẩn. Phải để vòng/kim cấy đứng thẳng trong ngọn lửa đèn cồn, từ phần nguội kéo dần ra phần nóng của ngọn lửa. 2. Các ống môi trường: - Phải hơ nóng miệng ống sau khi mở và trước khi đậy nút ống nghiệm. Nút phải được kẹp ở ngón tay út, tránh chạm vào vật khác. Khi mở nút ống nghiệm, nghiêng đi một góc khoảng 450 để tránh các vi khuẩn từ môi trường bên ngoài rơi thẳng vào ống nghiệm. - Việc lấy vi khuẩn từ ống môi trường luôn thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. 3. Đĩa Petri: Môi trường thạch cấy đựng trong đĩa Petri. Khi cấy chỉ hé nắp, không được mở toang hết nắp đĩa Petri. 6
BÀI 1: NHUỘM GRAM – KHÁNG SINH ĐỒ I. Mục tiêu: 1) Nhuộm Gram: Thực hiện được kỹ thuật. Lý giải được kết quả. 2) Chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn: Quán triệt tầm quan trọng của việc rửa tay. 3) Kháng sinh đồ: Thực hiện kỹ thuật định tính và đo được sự nhạy cảm kháng sinh. II. CHUẨN BỊ TIÊU BẢN VI KHUẨN ĐỂ NHUỘM 1. Chuẩn bị lam kính: Miếng lam kính dùng để phết vi khuẩn phải sạch và khô. Hơ qua ngọn đèn cồn và để nguội. Tránh chạm các ngón tay vào mặt kính. 2. Cách gắn vi khuẩn vào miếng lam: - Vẽ trên lam kính một vòng tròn đường kính 2 cm. - Lấy một vòng cấy vi khuẩn từ môi trường lỏng rồi trải mỏng trong diện tích của vòng đã vẽ. Nếu lấy vi khuẩn từ môi trường đặc thì phải nhỏ 1 giọt nước lên lam trước khi cho vi khuẩn vào và trải đều. - Để khô ở ngoài không khí. - Cố định phết vi khuẩn bằng cách hơ qua ngọn lửa. III. PHƢƠNG PHÁP NHUỘM GRAM Đây là phương pháp nhuộm cơ bản trong vi khuẩn học. Nhuộm Gram còn gọi là phương pháp nhuộm kép vì cách nhuộm này dùng 2 loại phẩm nhuộm tương phản màu sắc, đó là tím Gentian và đỏ Safranin. Giúp phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm. 1. Nguyên tắc: Dùng cồn ethanol tẩy màu hợp chất “Tím Gentian – Iode”. Vi khuẩn Gram dương không bị mất màu tím. Vi khuẩn Gram âm bị cồn tẩy màu nên bắt màu nhuộm thứ nhì là đỏ Safranin. 2. Vật liệu: 2.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli. 2.2. Lam kính 2.3. Bộ thuốc nhuộm Gram gồm: * Tím gentian * Lugol * Ethanol 950 * Đỏ Safranin 3. Kỹ thuật: Làm phết vi khuẩn theo hướng dẫn trên. - Phủ phẩm tím Gentian lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa. - Phủ dung dịch Lugol lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước. - Tẩy ethanol 10 giây. - Rửa nước. - Phủ Safranin lên phết vi khuẩn 30 giây. - Rửa nước. Thấm khô lam tiêu bản. - Nhỏ một giọt dầu soi lên phết nhuộm. Quan sát qua kinh hiển vi với vật kính dầu. Ghi nhận kết quả quan sát vi thể. Sau khi xem, cho lam tiêu bản vào thố đựng nước sát trùng. IV. CHỨNG MINH SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN 1. Vật liệu: Đĩa thạch dinh dưỡng (Nutrient agar, NA); bút lông. 2. Kỹ thuật: Ghi tên nhóm, tổ, ngày tháng ở mặt ngoài đáy đĩa thạch. 2.1. Mở nắp 1 đĩa NA. Đặt ở trên bậu cửa sổ / mặt bàn / bồn rửa, trong vòng 15 phút. 7
2.2. Ở 1 đĩa NA khác, vạch 1 đường bên ngoài mặt đáy đĩa để chia đôi thành 2 phần A và B. Ấn nhẹ 1 ngón tay lên mặt thạch: phần A là dấu ngón trước khi rửa tay; phần B là dấu của cùng ngón ấy sau khi rửa tay. 2.3. Đậy nắp đĩa NA. Đặt ngược đĩa thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ 370C. 24 giờ sau đọc kết quả. 3. Đọc kết quả: Quan sát vi khuẩn mọc trên NA bằng mắt trần. Đếm số khúm vi khuẩn mọc. Ghi kết quả đĩa NA đặt trong không khí và đĩa NA cấy dấu ngón tay. Các loài vi khuẩn thường tạo nên loại khuẩn lạc khác nhau về: - Hình dạng: bờ viền, bề mặt. - Kích thước: đường kính (mm). - Màu sắc; độ trong/đục. Sự khác nhau có thể tượng trưng cho những loài vi khuẩn khác nhau. Kết luận: có bao nhiêu loài vi khuẩn hiện diện trên đĩa thạch? V. KHÁNG SINH ĐỒ Kháng sinh đồ là phương pháp tìm độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với các loại kháng sinh. Có 2 phương pháp chính: - Định tính: phương pháp đĩa giấy tẩm kháng sinh khuếch tán trên thạch theo Kirby-Bauer. - Định lượng: tìm nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh đối với vi khuẩn (MIC, minimum inhibitory concentration). Kháng sinh đồ theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch 1. Nguyên tắc: Kháng sinh tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch tán ra mặt thạch ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Vòng vô khuẩn (không có vi khuẩn mọc) thể hiện vi khuẩn bị ức chế bởi thuốc kháng sinh. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn khác nhau tùy thuộc loại vi khuẩn và loại kháng sinh, phản ánh 3 mức độ: nhạy cảm, trung gian, đề kháng. Trường hợp không có vòng ức chế, vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. 2. Vật liệu: 2.1. Đĩa kháng sinh: Là những đĩa giấy đường kính 6mm được tẩm một hàm lượng dung dịch kháng sinh theo tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh được cất giữ trong các ống có chứa chất chống ẩm, ở nhiệt độ từ 2 – 80C. Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút. Có rất nhiều loại kháng sinh. Các tiêu chí lựa chọn kháng sinh thử nghiệm được hướng dẫn chi tiết. Các tiêu chí chính là: - Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có cùng hoạt phổ. - Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm. - Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn. - Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh từng vùng miền. 2.2. Môi trường: Thường dùng môi trường Muller Hinton Agar (MHA). Chỉnh pH của môi trường từ 7,2 đến 7,4. Môi trường được chế vào đĩa Petri với bề dày của thạch là 4 mm. 2.3. Dung dịch chuẩn độ đục: Kích thước mầm cấy phải đạt được là từ 1x108 CFU/mL đến 2x108 CFU/mL (Colony Forming Unit). Ta có thể dùng quang phổ kế hoặc so sánh độ đục của ống vi khuẩn với độ đục 0,5 của ống McFarland để chuẩn hóa kích thước mầm cấy. Dung dịch chuẩn độ đục McFarland là dung dịch muối BaSO4. 2.4. Chuẩn bị mầm cấy: Vi khuẩn thử nghiệm là Staphylococcus aureus hoặc Escherichia coli đã được thuần khiết. Chọn 3 – 4 khúm cấy vào ống có chứa 2 – 5 ml môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) hoặc BHI (Brain Heart Infusion). Chỉnh độ đục của ống vi khuẩn. Dùng ngay trong vòng 15 phút sau khi chuẩn độ đục. 2.5. Vật liệu khác: que gòn vô khuẩn, kẹp nhỏ, thố nước sát trùng. 8
3. Kỹ thuật: 3.1. Dùng que gòn tẩm canh cấy khuẩn, ép que lên thành trong ống nghiệm cho ráo. 3.2. Hé nắp đĩa thạch MHA, trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách vừa đánh nhẹ vừa xoay que gòn lên khắp mặt thạch 3 lần. Để đảm bảo trải đều vi khuẩn, xoay đĩa thạch mỗi lần 600, đánh và xoay que gòn khắp mặt thạch từ trái qua, từ trên xuống. Bước cuối là kéo que gòn vòng theo rìa mặt thạch. Bỏ que gòn vào thố nước sát trùng. 3.3. Chờ mặt thạch khô (khoảng 10 phút). 3.4. Hơ kẹp qua lửa, để nguội rồi gắp một đĩa kháng sinh, đặt nhẹ lên mặt thạch. Các đĩa kháng sinh phải cách mép hộp thạch khoảng 1,5 cm và cách nhau khoảng 2 cm. Ấn nhẹ cho đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch. Không chạm kẹp vào thạch. 3.5. Đậy nắp và đem đĩa MHA ủ ở 350C trong 18-24 giờ. 3.6. Thực hành: - Nhóm làm kháng sinh đồ với S aureus: đặt đĩa kháng sinh Penicillin, Cefoxitin, Imipenem, Amikacin, Azithromycin, Cotrim. - Nhóm làm kháng sinh đồ với E coli: đặt Ampicillin, Amoxicillin-clavulanate, Imipenem, Ceftriaxone, Amikacin, Cotrim (= trimethoprim-sulfamethoxazole). 4. Đọc kết quả kháng sinh đồ: 4.1. Xung quanh đĩa kháng sinh không có vòng vô khuẩn. Kết luận: Vi khuẩn đề kháng với loại kháng sinh đó. 4.2. Xung quanh đĩa kháng sinh có một vòng vô khuẩn, là nơi dưới tác động của kháng sinh vi khuẩn không mọc được. Trong trường hợp này, ta đo đường kính vòng vô khuẩn rồi so sánh với đường kính chuẩn theo bảng hướng dẫn. Có 3 mức độ ảnh hưởng của kháng sinh đối với vi khuẩn thử nghiệm:  Nhạy cảm (S, susceptible); Trung gian (I, intermediate); Đề kháng (R, resitant). 4.3. Bảng hướng dẫn theo Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm của Mỹ (CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute 2017): - Đối với Staphylococcus aureus: Tên kháng sinh S I R Penicillin 10 IU ≥ 29 mm - ≤ 28 mm Cefoxitin 30 mcg ≥ 22 - ≤ 21 Ciprofloxacin 5mcg ≥ 21 16-20 ≤ 15 Azithromycin 15 mcg ≥ 18 14-17 ≤ 13 Amikacin 30 mcg ≥ 17 15-16 ≤ 14 Cotrim 1,25/23,75 mcg ≥ 16 11-15 ≤ 10 - Đối với Escherichia coli: Tên kháng sinh S I R Ampicillin 10 mcg ≥ 17 mm 14-16 ≤ 13 mm Amox-clav 20/10 mcg ≥ 18 14-17 ≤ 13 Imipenem 10 mcg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Ceftriaxone 30 mcg ≥ 23 20-22 ≤ 19 Amikacin 30 mcg ≥ 17 15-16 ≤ 14 Cotrim 1,25/23,75 mcg ≥ 16 11-15 ≤ 10 9
BÀI 2: CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG Mục tiêu học tập: 1) Phân biệt được tụ cầu khuẩn và liên cầu khuẩn. 2) Định danh được tụ cầu vàng và tụ cầu không sinh coagulase thường gặp. 3) Phân biệt được liên cầu A, liên cầu B, phế cầu. CẦU KHUẨN GRAM DƢƠNG GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP 1.1. STAPHYLOCOCCI (Tụ cầu khuẩn)  Vi thể: Staphylococci hình cầu, đường kính khoảng 1m, nhuộm màu Gram dương, xếp thành đám giống hình chùm nho.  Tăng trưởng: Mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng (NA: Nutrient Agar), canh thang dinh dưỡng (NB: Nutrient Broth).  Môi trường Mannitol Salt Agar (MSA) là môi trường chọn lọc của Staphylococci vì có chứa 7,5% NaCl ức chế các vi khuẩn thường trú khác.  Chủng Staphylococci gồm có ít nhất 30 loài, trong đó có 4 loài thường gặp trên lâm sàng là: S aureus, S epidermidis, S saprophyticus, S haemolyticus. 1.2. STREPTOCOCCI (Liên cầu khuẩn)  Vi thể: Streptococci có hình cầu hay hơi bầu dục, nhuộm màu Gram dương, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau. Ngoài ra vi khuẩn có thể đứng l hay thành đôi một.  Tăng trưởng: Streptococci mọc trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng như thạch máu cừu (BA: blood agar), thạch nâu (CA: chocolate agar), canh tim óc hầm (BHI: Brain Heart Infusion) trong điều kiện khí trường có 5 - 10% CO2.  Tiêu huyết β, hoặc α, hoặc . 1.3. Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus, phế cầu khuẩn)  Vi thể: Gram dương, hình mũi giáo, xếp thành đôi một, có khi xếp thành chuỗi ngắn.  Tăng trưởng: Điều kiện nuôi cấy tương tự các Streptococci. Gây tiêu huyết  trên thạch máu cừu. Dễ bị ly giải bởi các chất hoạt động bề mặt như muối mật. Nhạy cảm với optochin (Taxo P). 10
Mahon et al., 2013 THỰC HÀNH 1. THỬ NGHIỆM CATALASE 1.1 Nguyên tắc Enzyme catalase biến hydrogen peroxide thành nước và khí oxy.Thử nghiệm này giúp phân biệt Staphylococci với Streptococci. catalase H2O2 2H2O + O2 1.2 Cách tiến hành  Trên lame: Lấy vài khúm vi khuẩn đặt trên lame, sau đó nhỏ H2O2 3% lên vi khuẩn.  Đọc kết quả: Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H 2O2 tiếp xúc với vi khuẩn thử nghiệm catalase dương tính, cầu khuẩn này là Staphylococci. Nếu không có sủi bọt  thử nghiệm catalase âm tính, cầu khuẩn này là Streptococci.  Lưu ý: Vì hồng cầu có thể làm thử nghiệm catalase dương giả, do đó khi lấy vi khuẩn trên thạch máu nên tránh tiếp xúc với môi trường. 2. THỬ NGHIỆM COAGULASE 2.1 Nguyên tắc Enzyme coagulase hiện diện dưới hai dạng: dạng liên kết (clumping factor) và dạng tự do (free coagulase), khi tiếp xúc huyết tương gây hiện tượng đông huyết tương. Đây là thử nghiệm quan trọng để phân biệt Staphylococcus aureus với các loài Staphylococci khác. 2.2 Cách tiến hành  Trên lame: tìm coagulase liên kết. 11
 Nhỏ một giọt nước cất vô trùng trên lame, lấy vài khúm vi khuẩn trộn với giọt nước để tạo huyền dịch vi khuẩn. Sau đó nhỏ một giọt huyết tương bên cạnh rồi trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn.  Đọc kết quả: trong vòng 10 giây, nếu xuất hiện những hạt lợn cợn  thử nghiệm coagulase dương tính. Lưu ý:  Nếu để lâu trên 10 giây, phản ứng dương tính giả có thể xảy ra.  Làm thử nghiệm với vi khuẩn mọc ở môi trường có nồng độ muối cao như MSA có thể cho phản ứng dương tính giả.  Thử nghiệm coagulase trên lame âm tính đều phải tiến hành tìm coagulase tự do.  Trong ống nghiệm: tìm coagulase tự do.  Lấy hai ống nghiệm có chứa 0,5 mL canh cấy S aureus và S epidermidis. Nhỏ lần lượt 0,5 mL huyết tương người/thỏ (pha loãng 1:5) vào hai ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn. Đem ủ cách thủy 35oC/4 giờ.  Đọc kết quả: Sau 1-4 giờ nếu có hiện tượng đông huyết tương  thử nghiệm coagulase dương tính. - Staphylococcus aureus: làm đông đặc huyết tương. - Staphylococcus epidermidis: không làm đông đặc huyết tương. Lưu ý: Nếu sau 4 giờ không thấy huyết tương đông phải ủ tiếp ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và đọc kết quả sau 18 giờ. 3. THỬ NGHIỆM LÊN MEN MANNITOL 3.1 Nguyên tắc S aureus có khả năng lên men đường mannitol. Trên môi trường MSA (Mannitol Salt Agar), acid sinh ra sẽ làm đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng. 3.2 Cách tiến hành  Lấy vi khuẩn S aureus từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhất. Chú ý không làm rách mặt thạch.  Lấy vi khuẩn S epidermidis từ ống NA, vạch zig-zag lên mặt nghiêng ống thạch MSA thứ nhì. Không làm rách mặt thạch.  Đem ủ 35oC/18 – 24 giờ. 3.3 Đọc kết quả  Ống MSA 1 chuyển sang màu vàng  S aureus lên men đường mannitol.  Ống MSA 2 vẫn giữ màu đỏ  S epidermidis không lên men đường mannitol. 4. THỬ NGHIỆM PHÂN LOẠI TIÊU HUYẾT CỦA STREPTOCOCCI 4.1 Cách tiến hành: Dùng vòng cấy lấy vi khuẩn Streptococci vạch 3 chiều lên hộp thạch máu, đem ủ 35oC/24 giờ trong bình nến. 4.2 Đọc kết quả  Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết sáng, trong, bao quanh khúm vi khuẩn trên thạch máu.  Tiêu huyết : hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết mờ, hơi ánh lên màu xanh.  Tiêu huyết : hồng cầu không bị ly giải nên không có vòng tiêu huyết. 5. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM VỚI BACITRACIN (TAXO A) 5.1 Nguyên tắc Streptococcus tiêu huyết  nhóm A (Streptococcus pyogenes) nhạy cảm với bacitracin. Thử nghiệm này phân biệt nhóm A với Streptococcus tiêu huyết  thuộc các nhóm khác. 12
5.2 Cách tiến hành Dùng que gòn vô trùng lấy vi khuẩn Streptococcus tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt lên đó đĩa Taxo A là đĩa giấy tẩm 0,04 đơn vị bacitracin. Ủ 35oC/18-24 giờ trong bình nến. 5.3 Đọc kết quả Xung quanh đĩa giấy tẩm kháng sinh bacitracin có vòng vô khuẩn  thử nghiệm Taxo A dương tính. Kết luận vi khuẩn là Streptococcus pyogenes. 6. THỬ NGHIỆM CAMP (Christie, Atkins và Munch – Peterson) 6.1 Nguyên tắc Streptococci tiêu huyết  nhóm B (Streptococcus agalactiae) tiết ra yếu tố CAMP có tác dụng hiệp đồng tiêu huyết với -lysin của S aureus. 6.2 Cách tiến hành  Cấy một đường thẳng dòng vi khuẩn S aureus có sinh -lysin.  Sau đó vạch một đường cấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  (không phải nhóm A) thẳng góc với đường cấy S aureus nhưng cách 1-2 mm.  Ủ 35oC/18 giờ. Hoặc 35oC/6 giờ trong bình nến. 6.3 Đọc kết quả Nếu thấy vùng tiêu huyết của S aureus ở nơi tiếp cận Streptococci rộng hơn, sáng hơn, có dạng cánh cung/vảy cá  thử nghiệm CAMP dương tính. Đó là do yếu tố CAMP của Streptococcus agalactiae làm gia tăng vùng tiêu huyết của S aureus. 7. THỬ NGHIỆM NHẠY CẢM OPTOCHIN (TAXO P) 7.1 Nguyên tắc Pneumococcus nhạy cảm với optochin, thử nghiệm này được áp dụng để phân biệt Pneumococcus với các Streptococci tiêu huyết  khác (ví dụ Streptococcus viridans). 7.2 Cách tiến hành Dùng que gòn lấy vi khuẩn Streptococci tiêu huyết  trong canh cấy trải đều lên mặt thạch máu. Chờ mặt thạch khô, đặt đĩa Taxo P là đĩa giấy tẩm 5 g optochin. Ủ 35oC/18 giờ trong bình nến. 7.3 Đọc kết quả Xung quanh đĩa optochin xuất hiện vòng vô khuẩn với đường kính  14 mm  thử nghiệm Taxo P dương tính. Kết luận: Streptococcus pneumoniae. Lưu ý: Nếu đường kính vòng vô khuẩn < 14 mm cần tiến hành làm thử nghiệm tan trong muối mật để xác định Pneumococcus. 13
BÀI 3: TRỰC KHUẨN GRAM ÂM Mục tiêu học tập: 1) Liệt kê được tính chất dùng phân biệt Họ Vi khuẩn đường ruột với những trực khuẩn Gram âm khác. 2) Nhận định được khúm lên men hoặc không lên men lactose trên thạch phân lập Mac Conkey. 3) Thực hiện được thử nghiệm oxidase, xác định tính di động, khả năng lên men đường, đọc phản ứng IMViC của trực khuẩn Gram âm. VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT (ENTEROBACTERIACEAE) A. ĐẠI CƢƠNG I. TÍNH CHẤT: Đây là những vi khuẩn tìm thấy trong ruột người và động vật, có ở trong đất và cây cối. Một số là ký sinh, số khác là hoại sinh. Vi khuẩn đường ruột có tính chất chung sau: - Trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. - Đa số di động nhờ tiên mao (flagella) xung quanh thân, một số không di động (Shigella, Klebsiella). - Lên men đường glucose (sinh hơi hoặc không). - Khử nitrate thành nitrite. - Không sản xuất enzyme oxidase. Những vi khuẩn đường ruột thường gây bệnh cho người là: 1. Các nhóm E coli gây tiêu chảy: - EPEC (enteropathogenic E coli): chủ yếu gây bệnh ở tr em. - ETEC (enterotoxigenic E coli): gây bệnh do tiết độc tố ruột loại dễ bị hủy bởi nhiệt (LT) và loại bền với nhiệt (ST). - EIEC (enteroinvasive E coli): gây bệnh do xâm lấn tế bào. - EHEC (enterohemorrhagic E coli): gây bệnh do tiết độc tố verotoxin. - EAEC (enteroadherent E coli): có khả năng bám dính bề mặt niêm mạc ruột. 2. Shigella: Gây bệnh lỵ trực khuẩn, có bốn nhóm: - Nhóm A: S dysenteriae: tiết độc tố shiga. - Nhóm B: S flexneri: tiết độc tố giống shiga (shiga-like toxin). - Nhóm C: S boydii: không tiết độc tố. - Nhóm D: S sonnei: tiết độc tố giống shiga. 3. Salmonella: Có trên 2200 týp huyết thanh khác nhau. Việc xác định týp dựa vào công thức kháng nguyên O, H và K. Hiện nay, dựa vào nghiên cứu DNA, người ta chia Salmonella làm 2 loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori. Salmonella enterica có 6 phụ loài (subspecies). Phụ loài I, còn gọi là Salmonella enterica subsp. enterica, có 3 tác nhân gây bệnh quan trọng: - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhi gây sốt thương hàn. - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Choleraesuis gây nhiễm khuẩn huyết và áp-xe khu trú ở các cơ quan nội tạng. - Salmonella enterica subsp. enterica serotype Paratyphi gây sốt phó thương hàn. 4. Yersinia: - Y pestis: gây bệnh dịch hạch. - Y enterocolitica: nhiễm khuẩn tiêu hóa, triệu chứng giống Shigella. - Y pseudotuberculosis: nhiễm khuẩn huyết, viêm hạch màng treo ruột. 14
II. CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG CHO TRỰC KHUẨN GRAM ÂM 1. Môi trƣờng vận chuyển: Dùng để chuyên chở bệnh phẩm, chứa rất ít chất dinh dưỡng (chỉ có muối đệm) chỉ đủ để vi khuẩn sống nhưng không phát triển. Loại thường dùng là Cary- Blair. 2. Môi trƣờng phân lập: - Môi trường không ngăn chận: không chứa bất cứ chất ức chế nào. Ví dụ: thạch máu (BA), thạch dinh dưỡng (NA), canh thang BHI. - Môi trường phân biệt có chọn lọc: tùy theo thành phần ức chế có trong môi trường, được phân biệt thành:  Môi trường phân biệt - chọn lọc ít. Ví dụ: thạch MC (MacConkey), thạch EMB (Eosin Methylene Blue).  Môi trường phân biệt - chọn lọc vừa. Ví dụ: thạch SS (Salmonella-Shigella), thạch Deoxycholate-Citrate, Hektoen Enteric.  Môi trường phân biệt - chọn lọc cao. Ví dụ: thạch Brilliant Green Bile Lactose… 3. Môi trƣờng phong phú: Dùng để tăng sinh loại vi khuẩn cần tìm. Ví dụ: canh GN (Gram negative), canh Selenite F… 4. Môi trƣờng xác định tính chất sinh hóa cơ bản của vi khuẩn: Một số môi trường được sử dụng gồm: KIA (Kligler’s iron agar), TSI (triple sugar iron agar), SIM, MR-VP, citrate, … Phản ứng định danh đơn giản trực khuẩn Gram âm: IMViC = Indole, MR, VP, Citrate. Kết quả cấy trực khuẩn Gram âm vào KIA, TSI Kligler s iron agar (KIA) là môi trường có 2 đường: glucose và lactose. Môi trường còn chứa đỏ phenol làm chất chỉ thị pH để xem có sự lên men hay không, và sulfate sắt để tìm H2S làm đen môi trường. Nồng độ glucose bằng 1/10 nồng độ lactose. Nồng độ acid rất thấp được sinh ra bởi glucose, do đó, ở phần thạch nghiêng (slant) sẽ bị oxid hóa mau chóng, và nếu lactose không được lên men thì thạch nghiêng sẽ trở lại tính kiềm (đỏ). Trái lại, dưới trương lực oxygen thấp của phần thạch đứng (butt), tác dụng acid được duy trì và không trở lại tính kiềm. Do đó, một ống có phần thạch đứng acid (vàng) và phần thạch nghiêng kiềm (đỏ) là dấu hiệu chỉ có sự lên men glucose mà thôi. Nếu lactose được sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và nghiêng đều vàng cả. Sự sản xuất gas từ glucose được ghi nhận bởi bọt khí, hay đôi khi bởi sự bể nát cột thạch. Pseudomonas và những loài không lên men đường mọc được trên mặt thạch nhưng không làm biến màu ống môi trường. Môi trường TSI (Triple Sugar Iron) chỉ khác KIA ở chỗ có thêm đường saccharose (sucrose). Sucrose có nồng độ như lactose, nghĩa là gấp 10 glucose; sự sử dụng sucrose cũng giống lactose, được ghi nhận bởi sự acid hóa ở phần thạch đứng và thạch nghiêng. Môi trường này giúp ta tìm ra những vi khuẩn lên men lactose chậm (nhiều ngày), vì người ta thấy rằng đa số vi khuẩn đường ruột lên men lactose chậm đều lên men sucrose sau một ngày. Thử nghiệm tìm H2S, indole, di động Môi trường sử dụng là ống SIM, là 1 loại thạch mềm (bán lỏng, semisolid). - Sinh hydrogen sulfite (H2S): vi khuẩn nào khử được sulfite thì sử dụng hợp chất chứa lưu huỳnh (thiosulfate) tạo ra H2S. Chất này phản ứng với ion sắt trong môi trường thành kết tủa FeS màu đen. - Sinh indole: vi khuẩn có enzyme tryptophanase khử tryptophan trong peptone của môi trường tạo ra sản phẩm có gốc indole. Sản phẩm này kết hợp nhân benzene của thuốc thử thành phức chất quinone màu đỏ. - Tính di động: vi khuẩn di động làm đục hết môi trường; loài không di động chỉ mọc theo đường kim cấy. 15
Phản ứng MR (methyl red) Phân biệt mức độ lên men đường glucose của vi khuẩn. - Vi khuẩn lên men glucose mạnh tạo nên sản phẩm cuối cùng là phức hợp acid bền, làm môi trường chuyển sang pH acid < 4,4 khiến cho thuốc thử methyl red có màu đỏ. Kết luận: MR dương tính. - Vi khuẩn lên men glucose yếu thì tính acid không đủ làm đỏ thuốc thử; khi pH > 6 methyl red có màu vàng. Kết luận: MR âm tính. Phản ứng VP (Voges-Proskauer) Giúp phát hiện sản phẩm trung gian acetoin tạo ra trong quá trình lên men glucose. Với thuốc thử cho vào, acetoin bị oxid hóa thành diacetyl rồi kết hợp với thuốc thử thành phức hợp màu đỏ: phản ứng dương tính. Phản ứng VP âm tính nếu chỉ có màu thuốc thử. Thử nghiệm citrate Giúp nhận biết khả năng vi khuẩn sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất. Vi khuẩn sử dung citrate thì cũng sử dụng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Môi trường nuôi có chứa sodium citrate và muối ammonium. Cả 2 khả năng đều làm kiềm hóa môi trường, biến chất chỉ thị màu bromothymol blue từ xanh lục thành xanh dương. Phản ứng citrate dương tính: màu xanh dương. Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu xanh lục vì vi khuẩn không mọc. B. THỰC HÀNH 1. Nhuộm Gram 1 trực khuẩn đường ruột mọc trên đĩa thạch MC. 2. Thực hiện phản ứng oxidase. a. Nguyên tắc: thử nghiệm cytochrome oxidase dùng một số thuốc nhuộm như p- phenylenediamine dihydrochloride để làm chất tiếp nhận electron thay thế oxygen. Ở thế khử, thuốc nhuộm không màu, tuy nhiên, khi có sự hiện diện của cytochrome oxidase và oxygen khí trời thì p-phenylenediamine bị oxid hóa và thành lập indophenol blue. b. Cách làm: dùng vòng cấy lấy 1 khúm vi khuẩn rồi trải lên 1 đĩa giấy oxidase đã tẩm dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%. c. Đọc kết quả: Phản ứng dương: đĩa giấy có màu tím đen trong khoảng 10 - 20 giây. Phản ứng âm: không có sự đổi màu. 3. Lý giải phản ứng ống thạch KIA, ống SIM. 4. Đọc phản ứng dãy sinh hóa cơ bản của E coli, Shigella sonnei, Proteus mirabilis hoặc Salmonella enteritidis, Pseudomonas aeruginosa. 5. Cho biết chất ức chế trong thành phần môi trường phân biệt-chọn lọc thường dùng: MC, EMB, SS. 16
BÀI 4: LẤY VÀ CHUYỂN BỆNH PHẨM Mục tiêu: 1/ Mô tả kỹ thuật thích đáng để thu thập các loại bệnh phẩm khác nhau. 2/ Ghi nhớ những bệnh phẩm không dùng nuôi cấy kỵ khí. 3/ Biết cách bảo quản và chuyển các loại bệnh phẩm đến phòng xét nghiệm. 4/ Thực hiện đúng đắn các kỹ thuật đơn giản lấy và gởi bệnh phẩm máu, đàm, mủ, phân, nước tiểu đến xét nghiệm vi sinh. MỞ ĐẦU Phẩm chất của bệnh phẩm quyết định thông tin chẩn đoán. Hậu quả của việc thu thập và chuyển bệnh phẩm không đúng cách:  không phân lập được tác nhân gây bệnh  phân lập vi khuẩn tạp nhiễm hoặc vi khuẩn thường trú cho thuốc không đúng. HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM  Lấy bệnh phẩm lúc bệnh ở giai đoạn cấp tính và trước khi cho kháng sinh là tốt nhất.  Cẩn thận không làm nhiễm bề mặt vật chứa và phiếu xét nghiệm.  Vật chứa phải thích hợp, đã tiệt trùng, có nút/nắp đậy, không được rò rỉ.  Tránh tạp nhiễm vi khuẩn thường trú. Dùng dụng cụ và kỹ thuật vô khuẩn để không đưa vi sinh vật bên ngoài vào cơ quan khi làm những thủ thuật can thiệp. Vùng da lành: lau sạch trước với cồn 70o vùng da rộng, sau đó bôi povidone iodine khoảng 3cm tập trung ở chỗ chích rút bệnh phẩm (máu, ổ áp xe). Chờ khô thuốc sát trùng mới lấy bệnh phẩm. Lau lại với cồn sau khi lấy bệnh phẩm.  Lấy đủ chất thử.  Ghi nhãn lọ bệnh phẩm: họ tên, tuổi bệnh nhân; số nhập viện; ngày giờ lấy chất thử; khoa gửi bệnh phẩm. Ghi phiếu xét nghiệm: như trên + loại chất thử; chẩn đoán; yêu cầu xét nghiệm; tên bác sĩ yêu cầu. CHỌN LỰA CHẤT THỬ Vết phỏng, Loét do nằm lâu, Loét do dãn tĩnh mạch, Ap xe quanh hậu môn, Tổn thương hoại tử, Tổn thương nha chu: tốt nhất là mẫu mô/mẫu sinh thiết, dịch hút, nếu dùng que gòn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ. Không nuôi cấy: chất tiết mở thông đại tràng, sản dịch, chất nôn, đầu ống thông Foley. Không nuôi cấy kỵ khí: phết ngoáy mũi hầu, họng dịch súc rửa phế quản-phế nang (không bảo vệ) chất hút qua nội khí quản hay mở thông khí quản đàm ho khạc phết niệu đạo nước tiểu do tiểu bình thường hoặc đặt ống thông phân hay bệnh phẩm trong trực tràng sản dịch, phết âm hộ, phết cổ tử cung dịch tuyến tiền liệt, tinh dịch. Chọn vị trí thích hợp để lấy bệnh phẩm cấy kỵ khí. Tốt nhất là mẫu mô/mẫu sinh thiết, đặt trong môi trường chuyên chở kỵ khí. Hoặc dùng ống tiêm rút dịch, cho vào ống nghiệm chân không hay môi trường chuyên chở kỵ khí. Nếu dùng que gòn phải thấm đẫm dịch tiết/mủ rồi cắm ngay vào môi trường chuyên chở kỵ khí. 17
HƢỚNG DẪN LẤY BỆNH PHẨM 1. Máu : a. Thời gian và số lần: Sốt thường theo sau nhiễm khuẩn huyết 30 – 90 phút, vì thế thời gian lấy máu tốt nhất là lúc xuất hiện cơn lạnh run; hoặc ngay sau khi bắt đầu tăng thân nhiệt. Riêng đối với những trường hợp sốt liên tục (như viêm nội tâm mạc, viêm nội mạch, nhiễm trùng không kiểm soát được, giai đoạn sớm của sốt thương hàn, nhiễm brucella) thì thời điểm lấy máu không quan trọng. Cấy máu một lần hiếm khi là đủ. Ít nhất nên cấy máu 2 lần để loại trừ hay xác định chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Cấy máu nhiều hơn 3 lần không cung cấp thêm nhiều thông tin hơn. Nếu đủ điều kiện mỗi lần lấy máu nên cấy hiếu khí và kỵ khí. + Nhiễm khuẩn huyết cấp tính: 2-3 lần ở những vị trí khác nhau. + Viêm nội tâm mạc cấp tính: 3 lần cách nhau 1-2 giờ ở những vị trí khác nhau. + Viêm nội tâm mạc bán cấp: như viêm nội tâm mạc cấp tính. Nếu sau 24 giờ 3 mẫu đầu âm tính thì cấy thêm 3 mẫu khác. + Viêm nội tâm mạc đã dùng kháng sinh trước khi nhập viện 1–2 tuần: 2 mẫu máu mỗi ngày trong 3 ngày. b. Lượng máu: tỉ lệ máu/môi trưòng 1/5 – 1/10.  Tr nhỏ và tr em 1-5 mL  Người lớn 10-30 mL Có thể dùng canh cấy tự chế 50 mL mỗi chai (tryptic soy broth hay brain heart infusion, thêm 0,025% Sodium Polyanethol Sulfonate) hoặc chai cấy máu bán sẵn. Lưu ý: SPS có thể ức chế vài cầu khuẩn như meningococcus, gonococcus,… Chai cấy máu bán trên thị trường như Bactec, Bact/Alert ngoài môi trường nuôi cấy bổ dưỡng còn chứa chất hấp phụ kháng sinh đã dùng. c. Cách lấy máu: Sát trùng da chỗ lấy máu đúng cách. Sát trùng nắp cao su chai cấy máu. Chờ khô. Chích lấy máu tĩnh mạch hay động mạch. 2. Hệ thần kinh trung ƣơng: a. Dịch não tủy: Do bác sĩ chuyên khoa chọc hút giữa đốt sống lưng L3- L4 hoặc L4-L5. Đảm bảo thao tác vô trùng. Rút 5 mL dịch não tủy cho vào 3-4 lọ và gởi lọ đục nhất đến xét nghiệm vi sinh ngay. Các lọ kia để thử sinh hóa và tế bào. Nếu được lượng dịch không đủ, bác sĩ điều trị phải cân nhắc theo thứ tự ưu tiên của xét nghiệm. Xử lý mẫu quá ít thường dẫn đến kết quả âm giả và điều này có hại hơn là chọc hút lại cho có đủ thể tích.  1mL để cấy vi khuẩn, virus.  2 mL để cấy vi nấm và vi khuẩn lao. b. Áp xe não, mô sinh thiết: Lấy mẫu khi phẫu thuật. Phải có cấy kỵ khí. 3. Đƣờng tiêu hóa: a. Phân: Lấy khoảng 1mL phân hay cỡ hạt bắp vào lọ khô, sạch hay lọ vô trùng có nắp đậy. Chọn chỗ phân dính cả đàm nhầy lẫn máu, nếu có. Trường hợp không gửi ngay được: < 1 giờ, giữ ở nhiệt độ phòng. < 24 giờ, giữ ở 4oC. Nếu lâu hơn, cho phân vào môi trường chuyên chở để ở nhiệt độ phòng. Không gửi cấy phân nếu bệnh nhân đã nằm viện trên 3 ngày và không có chẩn đoán viêm dạ dày-ruột. Nên nghĩ đến viêm ruột do Clostridium difficile khi bệnh nhân nội trú tiêu lỏng hoặc phân mềm > 5 lần trong 24 giờ. b. Ngoáy trực tràng: Cho đầu que gòn vào qua khỏi cơ thắt hậu môn 1 cm, xoay que gòn để lấy mẫu ở các khe hậu môn. Không dùng ngoáy trực tràng để soi tươi tìm vi khuẩn dịch tả. 18
c. Hút dịch dạ dày. - Nước súc rửa dạ dày để tìm vi khuẩn lao: Làm thủ thuật sáng sớm sau khi thức dậy. Luồn ống thông dạ dày đã bôi trơn qua miệng hay mũi xuống tới dạ dày và rửa với 25– 50 mL nước cất vô trùng để lạnh. - Hút tá tràng tìm Giardia, ấu trùng giun đũa và ấu trùng giun lươn. e. Sinh thiết thực quản (Candida, CMV, HSV), dạ dày (H. pylori), tá tràng, ruột non (Giardia, Cryptosporidium, Microsporidium), trực tràng (E. histolytica, B. coli, HSV). 4. Sinh dục nữ: Chủ yếu để định bệnh lây qua đường tình dục, như N. gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, …, liên cầu nhóm B, nấm Candida. Nếu nghĩ nhiễm khuẩn không do những tác nhân trên thì cần phải cấy kỵ khí. a. Dịch ối: Hút qua thủ thuật chọc ối / mổ lấy thai / ống thông tử cung. b. Nang Bartholin: sát trùng da và hút qua ống tuyến. c. Cổ ngoài: Không dùng chất bôi trơn khi đặt mỏ vịt. Lau sạch chất tiết và chất nhày. Xoay que gòn vô trùng để lấy chất tiết từ cổ trong. Nếu không thấy chất tiết thì đưa que qua ống cổ trong tử cung. d. Nội mạc: Lấy chất hút qua cổ tử cung hay sinh thiết nội mạc bằng đường nội soi. Gửi cấy kỵ khí. e. Âm đạo: Dùng mỏ vịt không bôi trơn hoặc dùng nước cất vô trùng rửa sạch chất tiết, dùng 2 que vô trùng lấy chất tiết ở niêm mạc vòm âm đạo để cấy và soi. f. Niệu đạo: Chỉ lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu trên 1. 5. Sinh dục nam: a. Mào tinh hoàn: dùng kim và ống tiêm để chọc hút. b. Tuyến tiền liệt: Rửa quy đầu với xà bông và nước. Xoa tuyến qua đường trực tràng. Lấy chất tiết bằng ống nghiệm hoặc que gòn vô trùng. Đồng thời lấy nước tiểu ngay trước và sau khi xoa tuyến. c. Niệu đạo: Lấy bệnh phẩm sau khi bệnh nhân đi tiểu 2 giờ hay hơn. Đưa que lấy bệnh phẫm niệu-sinh dục vào trong niệu đạo 2-4 cm. Xoay và giữ trong 2 giây rồi rút ra. d. Tổn thương sinh dục: sang thương dương vật và âm hộ Rửa sạch bề mặt bằng nước muối sinh lý. Cạo sang thương cho đến khi xuất hiện thanh dịch. Dùng gạc lau dịch và chất cặn. An nền sang thương cho đến khi dịch trong chảy ra. Hút dịch với kim cỡ 25-27. Dùng que vô trùng chà mạnh nền sang thương (tìm Herpesvirus, Haemophilus ducreyi). 6. Mắt: có thể do bác sĩ chuyên khoa lấy mẫu. a. Lưu ý: Lấy mẫu tìm virus và Chlamydia trước khi bôi tê tại chỗ. Tìm Chlamydia, dùng que alginate calcium. Tìm virus, dùng que gòn/đầu Dacron (không dùng que có cán bằng gỗ). Cấy lên môi trường thích hợp và làm phết tại giừơng rồi gửi ngay đến phòng xét nghiệm. b. Kết mạc: Lấy mẫu cả bên lành để phân biệt vi khuẩn gây bệnh với vi khuẩn thường trú. 19