HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
MÃ SỐ: 62 62 01 11
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
HÀ NỘI - 2016
Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Ngƣời hƣớng dẫn: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH
2. TS. RAMONA THIEME
Viện Công nghệ Sinh học
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Viện Di truyền Nông nghiệp
Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC THÀNH Phản biện 2: PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG Phản biện 3: PGS.TS. ĐẶNG TRỌNG LƢƠNG
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sương do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra được coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trường vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhưng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sương có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sương được coi là một biện pháp hiệu quả. Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sương từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R được chuyển vào khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhưng tính kháng ở các giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vượt qua vì nấm mốc sương có khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lược khác nhau được xem xét để sử dụng nhiều gen kháng để tạo ra khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009; Darsow, 2014) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác nhau được tích tụ nhờ phương pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao (Szczerbakowa et al., 2005, Thieme et al., 2008, 2010). Tuy nhiên, rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đường lai hữu tính giữa các loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lượng nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010). Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhưng vẫn bảo toàn được hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010). 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định được các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương và các giống khoai tây
1
trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương.
Tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng.
Tạo được các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trên cơ sở thu thập được nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện được khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời tổ hợp được những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền đa dạng di truyền đã tạo ra tiền hành đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc sương và mang các đặc tính nông sinh học quý. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đã xác định được các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sương và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trường VKMII lỏng; môi trường Cul-medium để tạo callus và môi trường RJM để tái sinh chồi.
Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sương (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh mốc sương (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhưng có năng suất và chất lượng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam.
Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo được 11 tổ hợp lai và chọn được 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sương đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nước ta.
2
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn giống cây trồng. Đề tài cũng là một bước phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nước và quốc tế. Đề tài đã góp phần chứng minh khả năng chuyển được tính kháng bệnh mốc sương từ các loài khoai tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các loại bệnh quan trọng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đã chọn tạo được thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm 51,68% tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới, Việt Nam có diện tích trồng khoai tây năm 2013 là 23.077 ha). Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó năng suất bình quân thực tế của Việt Nam chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha. Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan… 2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI
Có rất nhiều các loài dại đã được phát hiện mang các đặc tính kháng sâu bệnh và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã được phát hiện và khai thác vào nguồn gen khoai tây trồng. Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại được khai thác cho các giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc sương, PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu sương giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc sương, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart, Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lượng tinh bột cao). Theo thời gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã được khai thác và chuyển vào nguồn gen khoai tây trồng.
3
2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma. Để tách được tế bào trần người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Trong đó phương pháp enzyme hiện nay được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.Tế bào trần sau khi được tách được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp có khả năng tái tạo thành tế bào, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh. Những yêu cầu về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy mô tế bào. Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 105 tế bào trần /ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et al. (1974).
Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố: giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào được tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không còn giữ nguyên hình dạng như ban đầu. (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào goi là microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sau 3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 8- 12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh.
Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào. Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này
4
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).
Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70% (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là không đơn giản, cần phải có các phương pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách được các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta có thể sử dụng cả “bố”, “mẹ” có đặc trưng rất khác nhau để dễ dàng thanh lọc ra các thể lai trên môi trường chọn lọc. Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và mẹ dung hợp. 2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY
Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất cho cây khoai tây, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh. Một nguồn gen kháng mốc sương mới được phát hiện gần đây và hiện đang được tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nước biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện và nhân dòng được 4 gen kháng bệnh mốc sương có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn được biết đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpi- blb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) được phát hiện từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum. 2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY 2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống Các phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985). Nhược điểm của phương pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). 2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen trên cây khoai tây đã được ứng dụng để chuyển gen kháng bệnh virus, kháng bệnh mốc sương, bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) và rệp. Tuy nhiên phương pháp chuyển gen còn nhiều hạn chế: nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các
5
tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; nhiều gen rất khó để tách ra được và nhân dòng thành công; ngoài ra do khoai tây là cây lương thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO). 2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần
Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính (Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995). Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S. tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sương và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Thieme et al. (2010) cũng đã tạo được các con lai không chỉ đa dạng về hình thái, các tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng được cả bệnh và sâu hại.
Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã được áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013). Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT (Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai soma của tổ hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài 4x mch (những con lai có tính kháng bệnh mốc sương). Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị phân tử từ genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các con lai soma. Ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Gần đây, nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được bắt đầu tiến hành ở Việt Nam (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012; Đỗ
6
Thị Thu Hà và cs., 2012, Đinh Thị Thu Lê và cs, 2012, Vũ Thị Thu hằng và cs., 2012). Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam.
PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI- CHLB Đức) trong thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sương: S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank).
Các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi
với điều kiện khí hậu ở Việt Nam. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng
- Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic - Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây
trồng thu thập được
- Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
3.3.2. Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
- Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội Flow cytometry - Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR
3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
- Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm
nhân tạo và chỉ thị phân tử
- Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma 3.3.4. Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc
- Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng - Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về khả năng
kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
7
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 3.4.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào
trần thu được
Vật liệu được nhân 10-20 cây in vitro/mỗi kiểu gen bố mẹ trong bình thủy tinh từ 3-4 tuần tuổi, trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 22oC, để các nguyên liệu này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp. Phương pháp tách tế bào trần (Theo quy trình Cooking et al. (1960), có cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme et al. (1997)).
Tiến hành tách tế bào trần ở 4 nồng độ enzym khác nhau: E1 = Dung dịch enzym 1: có 0,2% Macerozym, 0,8% Cellulase; E2 = Dung dịch enzym 2: có 0,1% Macerozym, 0,6% Cellulase, E3 = Dung dịch enzym 3:có 0,1% Macerozym, 0,8% Cellulase; E4 = Dung dịch enzym 4: có 0,1% Macerozym, 1% Cellulase.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến
mật độ tế bào trần thu được
Tiến hành ủ các mẫu lá của các dòng/giống khoai tây (đã được cắt nhỏ và xử lý qua dung dịch gây co nguyên sinh) ở các thời gian ủ khác nhau trong dung dịch enzym: 13 giờ; 14 giờ; 15 giờ và 16 giờ. 3.4.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được (Theo Thieme et al., 2008)
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất
lượng tế bào sau dung hợp
Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 2 x 105 tế bào/ml trong dung dịch dung hợp với các thông số dung hợp khác nhau: CT1: AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al., 1994), CT2: 800 kHz+ 2 lần xung, CT3: 900 kHz+2 lần xung, CT4: 1000KHz+1 lần xung.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Tiến hành thí nghiệm dung hợp với các thông số dung hợp tối ưu đã tìm ra ở thí nghiệm trên với các mật độ khác nhau: 1x 105 tế bào trần/ml ; 2x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml, 4 x 105 tế bào trần/ml, 3 x 105 tế bào trần/ml
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế
bào sau dung hợp
Theo dõi ảnh hưởng của các tổ hợp lai khác nhau đến kết quả tái sinh sau
dung hợp 3.4.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân
chia của tế bào trần sau khi dung hợp
8
Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên 3 nền môi trường: VKM II lỏng (không chứa agar); VKM II bán lỏng (nhỏ giọt agar) và VKM II rắn (bổ sung 5g agar/lít môi trường).
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia
của các tổ hợp lai sau dung hợp
Tiến hành nuôi cấy các tổ hợp lai trên các loại môi trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Davey et al. 1994).
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh
chồi của các tổ hợp lai
Cấy chuyển các callus trên các môi trường tái sinh khác nhau: RIM (Masson et al.,
1988), MSO (Pan et al., 2004), K8P (Wei et al., 1994). 3.4.2. Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
Thí nghiệm 9. Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội
Flow cytometry (Theo Thieme et al., 2008)
Sử dụng nguyên liệu lá cây in vitro của các kiểu gen khác nhau bao gồm các dòng đối chứng (nhị bội), con lai sau dung hợp, giống khoai tây trồng tứ bội. Sử dụng máy xác định độ bội Cell Lab QuantaTM Flow cytometry (Beckman Counter).
Thí nghiệm 10. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR Các con lai ngẫu nhiên được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Theo Dinu and Thieme, 2001) sử dụng cặp mồi (theo Song et al., 2005). Các con lai ngẫu nhiên được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001). 3.4.3. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 3.4.3.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử
Thí nghiệm 11. Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây
nhiễm (theo Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009)
Phân lập nấm ở các vùng sinh thái khác nhau (Trong thí nghiệm này tiến hành thu thập ở 2 vùng trồng khoai tây là Hà Nội và Lạng Sơn). Tiến hành nuôi nguồn nấm bệnh phân lập được trên lát cắt củ. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số giữa các lần lặp lại. Thí nghiệm 12. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời – Detached Leaflet Assay (Theo Darsow et al., 2004, 2008; Hammann et al., 2009)
Mẫu lá khoai tây được lấy từ các cây trồng trong chậu vại hoặc trên đồng
9
ruộng ở giai đoạn cây chuẩn bị ra hoa. Mỗi kiểu gen lặp lại 5 lần (lấy 5 lá). Nhỏ dung dịch lây nhiễm với nồng độ 1,5x104 bọc động bào tử/ml (mỗi giọt khoảng 20 - 30µl) lên chính giữa bề mặt lá, đặt trong điều kiện 12h tối/12h sáng, nhiệt độ 18 – 200C, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 5-6 ngày sau khi lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh theo Darsow et al., 2004, 2008 và Hammann et al., 2009. Đo kích thước vết hoại tử bề mặt trước của lá theo điểm từ 1-9: Điểm 1: không có vết bệnh ở cả mặt trước và mặt sau lá; điểm 2: có 1 điểm ở bề mặt sau lá; không có vết bệnh ở bề mặt trước lá; điểm 3: 1-4 % vùng lá bị nhiễm bệnh, khoảng 4 cm2; điểm 4: 5-12% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 5: 13-30% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 6: 31-55% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 7: 56-78% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 8: 79-96% diện tích lá bị nhiễm bệnh; điểm 9: 97-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Đo sự hình thành bào tử nấm ở bề mặt sau của lá: điểm 1: từ không có triệu chúng vết bệnh hoạc vết hoại tử 2- 4mm; điểm 2: nhiễm trung bình 5-55% diện tích bề mặt lá; điểm 3: 56-100% diện tích lá bị nhiễm bệnh. Thí nghiệm 13. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ (Tuber slice test) (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009)
Củ mới được thu hoạch (trong vòng 24h) hoặc cho các củ được bảo quản trong kho lạnh từ 1 – 2 tháng ở nhiệt độ 8 – 90C. Mỗi kiểu gen được lặp lại 5 lần (5 lát củ). Nhỏ lên mỗi lát củ 1 giọt dung dịch dịnh lây nhiễm (20 - 30µl) với nồng độ 1,5x104túi bào tử/ml, trong điều kiện tối, nhiệt độ 18 – 20oC, độ ẩm cần đảm bảo ở mức 90% đến bão hòa. Triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7-10 ngày. Đánh giá và cho điểm dựa vào kích thước vết hoại tử trên lát cắt củ (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) theo điểm từ 1-9: điểm 1: không có vết bệnh; điểm 2: 1% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (20mm2); điểm 3: 0,5-5% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (150mm2); điểm 4: 6-12% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh (300mm2); điểm 5: 25% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 6: 43% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 7: 62% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 8: 85% diện tích lát củ bị nhiễm bệnh; điểm 9: 96- 100% diện tích củ bị nhiễm bệnh.
Thí nghiệm 14. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma
bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)
Thí nghiệm trên đồng ruộng được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại có 15 cây trên 3 luống (bao gồm cả các giống đối chứng và các dòng mang gen kháng R). Nồng độ dung dịch lâu nhiễm là 20 x 103 bọc động bào tử/ml. Tiến hành lây nhiễm tại thời điểm khi cây bắt đầu hoặc kết thúc có hoa vào lúc tối muộn khi trời ẩm ướt (lây nhiễm theo kiểu dạng dạng phun mù). Triệu chứng sẽ bắt đầu
10
xuất hiện sau 1 tuần lây nhiễm. Tiến hành đo vết bệnh ít nhất 5 lần khi sự nhiễm bệnh bắt đầu từ 0,1% - 100%. Đánh giá phản ứng của bệnh trong toàn bộ quá trình phát triển của bệnh theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (Area Under Disease Progress Curve - AUDPC) và chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian tương đối (r) AUDPC; Phân tích sự sai khác (variance) được sử dụng để đánh giá tất cả các giống. Kết quả có thể được so sánh với giống đối chứng) (Truberg et al., 2008). Thí nghiệm 15. Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử
Xác định các gen kháng Rpi-blb ở các con lai soma có sử dụng các mồi đặc hiệu
Thí nghiệm 16. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học
của các gen: Rpi-blb1, (Wang et al., 2008) và Rpi-blb3 (Lokossou et al., 2010). 3.4.3.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma của các con lai soma
Thí nghiệm 17. Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu được về
Các dòng con lai soma và các dòng bố mẹ sau nuôi cấy in vitro 4 tuần được trồng vào vụ Đông – Xuân năm 2013-2014 tại cánh đồng thực nghiệm- Viện Sinh học Nông nghiệp để đánh giá các tính trạng về hình thái, sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất cũng như khả năng kháng bệnh. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp cho mỗi dòng, mỗi lần lặp lại 10 cây. Phương pháp đánh giá: theo tiêu chuẩn ngành (số 32-1998/QĐ-BNN-KHCN ngày 24 tháng 2 năm 1998) và quy chuẩn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT). 3.4.4. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
Các hạt lai khoai tây được xử lý ngủ nghỉ bằng dung dịch Gibberelic Acid Solution (GA3 nồng độ 1mg/l). Khi hạt nảy mầm đến giai đoạn 2 lá thật thì phun dịch lây nhiễm bệnh mốc sương (nồng độ dịch lây nhiễm là 6000 túi bào tử/ml), Triệu chứng sẽ xất hiện sau 3 ngày, giữ lại cây khỏe và loại bỏ những cây bệnh. Dùng thuốc trừ nấm phun phòng cho những cây khỏe sau lây nhiễm. Tiếp tục chăm sóc cho đến khi thu hoạch củ. 3.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
+ Số liệu trong các thí nghiệm tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần
được xử lý theo chương trình EXCEL (thí nghiệm 1; 2; 3; 4 và 5)
+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá cho điểm bệnh mốc sương được xử lý theo chương trình EXCEL, dùng hàm “standard deviation” (= stdev) để xác định sai số giữa các lần lặp lại (thí nghiệm 11; 12 và 13).
11
+ Số liệu trong các thí nghiệm đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai (các chỉ tiêu: chiều cao cây, số củ trung bình/khóm, khối lượng củ trung bình/khóm trong thí nghiệm 16) được xử lý thông kê đánh giá sự sai khác có ý nghĩa ở mức α = 0,05 theo phần mềm SAS 9.1.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng 4.1.1.1. Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic a. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch enzym đến mật độ tế bào trần thu được
Các loại dung dịch enzym khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng/giống khoai tây cần một loại dung dịch enzyme phù hợp: dung dịch E1 (0,2% Macerozym và 0,8% Cellulase) sử dụng để tách tế bào trần của các dòng/giống blb2G, trn3G, Rasant, Agave; dung dịch E2 (0,1% Macerozym và 0,6% dùng để tách tế bào trần của các dòng/giống pnt2G và Delikat; dung dịch E3 (0,1% Macerozym và 0,8% Cellulase); dung dịch E4 (0,1% Macerozym và 1% Cellulase) dùng để tách tế bào trần của giống Atlantic b. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tách tế bào trần
Thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả tách tế bào trần. Thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của thời gian ủ của mô lá trong dung dịch enzym đến hiệu suất tế bào trần thu đƣợc
Thời gian ủ (giờ) (số tế bào trần/ml)
Tên dòng/giống pnt2G blb2G trn3G Delikat Quatar Rasant Agave Atlantic 13 giờ 0,9 x 105 1,4 x 105 1,1 x 105 1,2 x 105 1,2 x 105 2,4 x 105 2,1 x 105 2,1 x 105 15 giờ 3,0 x 105 3, 4 x 105 4,0x 105 3,6 x 105 3,4 x 105 3,8 x 105 3,9 x 105 3, 1 x 105 16 giờ 3,9 x 105 2, 6 x 105 3,4 x 105 2,8 x 105 3,3x 105 2,8 x 105 2,5 x 105 2,1 x 105 14 giờ 2,5 x 105 2,9 x 105 2,9 x 105 2,8 x 105 2,9 x 105 4,6 x 105 4,4 x 105 3,5 x 105
12
4.1.1.2. Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được a. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lượng tế bào sau dung hợp
Tế bào được dung hợp ở các thông số của CT2 (tần số 800kHz và 2 lần xung), tế bào có tỷ lệ nguyên vẹn cao, thời gian xuất hiện hiện phân chia sớm (sau 2 ngày nuôi cấy), các microcallus hình thành sau 18 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, số macrocallus hình thành/đĩa nhiều nhất (trung bình 85,4 macrocallus/đĩa) (bảng 4.2). Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của tần số dung hợp và số lần xung đến chất lƣợng tế bào sau dung hợp của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat
STT CT
Thời gian tế bào phân chia (ngày) 3 2 4 4 Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) 21 18 28 24 Số lƣợng macrocallus/đĩa 49,5 65,4 27,6 38,2
CT1 1 2 CT2 3 CT3 4 CT4 Chú thích: CT1- AC=700 kHz+ 3 lần xung (Rokka et al, 1994), CT2- 800 kHz+ 2 lần xung, CT3- 900 kHz+2 lần xung, CT4- 1000KHz+1 lần xung
b. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp
Mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai lục bội tạo thành. Mật độ tế bào tham gia dung hợp càng cao thì tế bào phân chia sớm và tỷ lệ con lai con lai lục bội (6x) càng tăng (bảng 4.3). Dung hợp ở mật độ 4 x 105 tế bào/ml, tế bào cảm ứng nhanh và phân chia chỉ sau 2 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ con lai 6x ở mật độ dung hợp này là 65,6% con lai là con lai 6x . Như vậy mật độ xung cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 6x cao nhất là 4 x 105 tế bào/ml (bảng 4.3). Bảng 4.3. Kết quả tái sinh và độ bội của các con lai tái sinh sau dung hợp ở các mật độ tế bào dung hợp khác nhau của tổ hợp Solanum bulbocastanum và Delikat
Số macrocallus/đĩa Sau 4 ngày Tỷ lệ cây 2x (%) Tỷ lệ cây 4x (%) Tỷ lệ cây 6x (%)
Thời gian xuất hiện phân chia (ngày) 3 2 2 2 2 Số cây tái sinh (cây) Sau 8 tuần 16 35 46 47 29 28,5 75,7 85,6 68,3 62,6 56,3 37,1 13,9 14,9 10,3 25,0 34,3 45,6 31,9 24,1 18,7 28,6 40,5 53,2 65,6 Mật độ xung hợp (tế bào/ ml) 1x 105 2 x 105 3 x 105 4x 105 5 x 105
Chú thích: dung hợp với các thông số AC= 800 kHz, DC=120V và 2 lần xung c. Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của kiểu gen khác nhau đến khả năng tái sinh tế bào sau dung hợp
Toàn bộ các tổ hợp dung hợp phân chia tế bào xảy ra sau 2-3 ngày nuôi cấy. Khả năng tạo macrocallus và tái sinh chồi phụ thuộc vào tổ hợp dung hợp hay phụ thuộc vào
13
bản chất di truyền của dòng cây nghiên cứu. Tổng cộng đã tạo được 7 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng (bảng 4.4). Bảng 4.4. Kết quả dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội bằng phƣơng pháp xung điện
STT Tên tổ hợp lai
1 2 3 4 5 6 7 Tổng Số lƣợng callus tái sinh 120 97 250 250 193 307 395 1612 Số lƣợng chồi tái sinh 39 25 31 64 23 4 2 188 Tỷ lệ tái sinh (%) 32,5 25,8 12,4 25,6 11,9 1,3 0,5 trn3G + Agave trn3G + Rasant blb2G + Delikat trn3G + Delikat Pnt2G + Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic
4.1.2. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp a. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phân chia của tế bào trần sau khi dung hợp
Trên môi trường lỏng VKMII, thời gian bắt đầu phân chia của tế bào trần của các các tổ hợp lai từ sau 2-3 ngày đã bắt đầu phân chia phục thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau khoảng 2 tuần nuôi cấy. Trên môi trường lỏng, hầu như các tế bào phân chia tạo hạt microcallus sau khoảng 10-14 ngày với chất lượng microcallus trắng sáng, kích thước hạt to như hạt tấm. Trong khi đó các tế bào trần trên môi trường bán lỏng (nhỏ giọt agar) có thời gian xuất hiện phân chia lâu hơn (sau từ 4-7 ngày). Trên môi trường rắn, các tế bào hầu như không có khả năng phân chia hoặc chỉ có rất ít tổ hợp có xuất hiện phân chia tế bào (blb2G + Delikat; trn3G + Delikat; blb2G + Atlantic) nhưng sau thời gian lâu hơn rất nhiều (trên 9 ngày) (bảng 4.5). Bảng 4.5. Sự phân chia của các tổ hợp lai sau khi dung hợp trên các điều kiện môi trƣờng khác nhau*
Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Tổ hợp lai
Bán lỏng Rắn
Thời gian xuất hiện tế bào phân chia (ngày) Lỏng Bán lỏng Rắn 4 3 5 6 6 5 4 - - 15 9 - 11 - 3 3 2 3 2 3 3 21 21 26 25 22 23 24 - - - - - - - Lỏng 12 14 11 12 10 12 14
trn3G + Agave trn3G + Rasant blb2G + Delikat trn3G + Delikat pnt2G + Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic Chú thích: (*) 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường VKM II trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia.
14
b. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của các tổ hợp lai sau dung hợp
Các tế bào trần nuôi cấy trên môi trường VKMII bắt đầu phân chia chỉ sau 2- 3 ngày nuôi cấy tùy thuộc vào dòng khoai tây nuôi cấy. Sau 3 ngày nuôi cấy, toàn bộ các dòng đều phân chia và tạo microcallus sau 2 tuần nuôi cấy. Các tổ hợp lai khác nhau cũng có sự phân chia và sự hình thành microcallus khác nhau trên môi trường VKMII. Như vậy: môi trường VKMII lỏng là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp (bảng 4.6).
Bảng 4.6. Sự phân chia của các tổ hợp lai trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau
Thời gian xuất hiện tế bào phân chia (ngày) Thời gian xuất hiện microcallus (ngày) Số lƣợng microcallus trung bình/đĩa petri Tổ hợp lai
A* A* A* VK MII KM8P * VKM II KM8 P* KM8 P* VK MII
trn3G + Agave 3 5 6 12 - - 22,7 - -
trn3G + Rasant 3 4 5 14 21 - 13,3 4,4 -
blb2G + Delikat 2 7 5 11 - - 29,6 - -
trn3G + Delikat 3 9 4 12 21 - 35,7 - 5,8
Pnt2G + Atlantic 2 6 6 10 - 22 48,3 - 1,3
blb2G + Atlantic 3 9 4 12 - - 5,1 - -
trn3G + Atlantic 3 7 8 14 21 - 9,4 5,9 -
Chú thích: 10 đĩa petri/tổ hợp dung hợp được theo dõi sự phân chia tế bào nuôi cấy trên môi trường lỏng trong điều kiện tối, nhiệt độ 20-220C; (-) tế bào không phân chia
c. Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai
Trên môi trường RJM, hầu như các tổ hợp lai đều có khả năng tái sinh tạo chồi với số chồi trung bình/đĩa dao động từ 1,3-9,1 chồi/đĩa. Khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai khác nhau cũng khác nhau rõ rệt. Các tổ hợp lai trn3G + Delikat, pnt3G +Atlantic có khả năng tái sinh cao với số chồi trung bình/đĩa lần lượt là 8,8 và 6,4. Các chồi này phát triển tốt, màu xanh. Tổ hợp lai blb2G +Atlantic; trn3G +Atlantic có khả năng tái sinh kém, chất lượng chồi kém, màu trắng xốp (bảng 4.8). Tổng hợp các kết quả nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp thì thấy đã tái sinh được tổng số 1612 callus và tạo được 188 chồi trong đó tỷ lệ tái sinh chồi của các tổ hợp lai khác nhau rõ rệt (bảng 4.7).
15
Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai
Tổ hợp lai Môi trƣờng K8P
trn3G + Agave trn3G + Rasant blb2G + Delikat trn3G + Delikat pnt2G + Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic Số lƣợng chồi tái sinh/chất lƣợng chồi Môi trƣờng MSO 0,8/+ 1,6/+ 0/- 0/- 1,65/+ 0/- 0/- Môi trƣờng RJM 3,3/++ 5,5/++ 6,5/++ 8,8/++ 6,4/++ 1,7/+ 2,3/- 2,5/+ 1,3/+ 2,4/+ 0,8/- 0/- 0/- 0/-
(-): Chồi yếu, màu trắng; +: Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; ++: chồi tốt, mập, xanh 4.1.3. Xác định con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR 4.1.3.1. Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội thể (Flow cytometry) Thí nghiệm 9: Xác định con lai soma bằng phương pháp đo độ bội
Từ kết quả dung hợp tế bào trần đã tạo được 07 tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng tứ bội. Các tổ hợp lai được nuôi cấy tái sinh để tạo microcallus, macrocallus và tái sinh chồi. Sử dụng phương pháp phân tích độ bội Flow cyometry để đo độ bội thể của các con lai.
Từ 188 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 82 cây có độ bội thể 2n=6x (chiếm tỷ lệ 43,6 %). Tỷ lệ cây lục bội (2n=6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 7 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai Delikat (+) trn3G cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội thể 6x là cao nhất trong khi đó tổ hợp lai giữa Atlantic (+) trn 3G không cho kết quả tạo con lai lục bội (bảng 4.8). Bảng 4.8. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai sau dung hợp
STT Tên tổ hợp lai
Số lƣợng callus tái sinh 120 97 250 250 193 307 395 1612 Số lƣợng chồi tái sinh 39 25 31 64 23 4 2 188 Số dòng lục bội (2n= 6x) 15 12 15 28 9 3 0 82 1 2 3 4 5 6 7 Tổng trn3G + Agave trn3G + Rasant blb2G +Delikat trn3G + Delikat pnt2G +Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic
16
4.1.3.2. Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử Thí nghiệm 10: Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử
Trong số 188 con lai tái sinh có 82 con có độ bội 6x nhưng chỉ có 69 con có kiểu gen dị hợp nhân. Tùy thuộc vào các tổ hợp lai khác nhau, tỷ lệ con lai soma của các tổ hợp dung hợp là rất khác nhau (2/11 tổ hợp dung hợp không có con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân).
Bảng 4.9. Kết quả chọn lọc con lai soma bằng phân tích độ bội thể và chỉ thị phân tử SSR
Tổ hợp lai
Số dòng lục bội (2n= 6x) Số dòng lai soma (Hetezygous) Tên mồi xác định con lai
trn3G + Agave trn3G + Rasant Số cây xác định độ bội 39 25 15 12 Tỷ lệ con lai soma/ dòng tái sinh (%) 38,5 24,0 15 6
blb2G + Delikat trn3G + Delikat pnt2G +Atlantic blb2G + Atlantic trn3G + Atlantic Tống 31 64 23 4 2 1612 15 28 9 3 0 82 45,2 43,7 26,1 0,0 0,0 STM2022 STM2022, STIIKA STM2022 STM2022 STM3023 STM1106 STM1104 14 28 6 0 0 69
4.1.4. Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử 4.1.4.1. Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử a. Thí nghiệm 11: Phân lập nấm Phytophthora infestans và chuẩn bị dịch lây nhiễm
Mẫu nấm mốc sương được phân lập từ mẫu lá bệnh thu thập ở các vùng trồng khoai tây tại Hà Nội và Lạng Sơn. Nguồn nấm được nuôi trên các lát củ, sau 6 – 7 ngày triệu chứng của nấm xuất hiện trên lát cắt củ. Nguồn nấm bệnh phân lập được từ 2 vùng sinh thái khác nhau đều thể hiện tính độc trên các giống khoai tây trồng tại Việt Nam, thể hiện mức độ gây bệnh khá cao trên các đối tượng khảo sát. Sau khi xử lý số liệu thống kê chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác về tính độc giữa 2 chủng nấm được phân lập. Nguồn nấm bệnh này hoàn toàn có thể sử dụng cho các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo. b. Thí nghiệm 12: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời
Kết quả đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo cho thấy các dòng khoai tây dại sử dụng để dung hợp S.bulbocastanum; S. tarnii và S. pinnatisectum đều có đặc tính kháng tốt với bệnh mốc sương (điểm đánh giá kích thước vết hoại tử nằm trong
17
khoảng từ 1,0 – 1,8), trong khi các giống khoai tây trồng Delikat, Agave, Atlantic, Quarta, Rasant có tính kháng bệnh mốc sương khá thấp (điểm đánh giá vết hoại tử nằm trong khoảng từ 3,6-4,6). Các tổ hợp lai soma giữa S. tarnii; S. pinnatisectum với các giống khoai tây trồng Delikat, Atlantic, Rasant và Agave hầu như không làm thay đổi khả năng kháng bệnh mốc sương. Chỉ có tổ hợp lai giữa loài dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có tính kháng rất cao với bệnh mốc sương. Điều này chứng tỏ dòng dại S.bulbocastanum có khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương của nó cho các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp. c. Thí nghiệm 13: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lát cắt củ
Tất cả các dòng giống đều có biểu hiện kháng mốc sương trên củ với nguồn mốc sương đã phân lập. Mức độ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sương trên củ của các con lai soma rất tốt trong đó nổi bật là 4 con lai soma của tổ hợp lai S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat. Một số con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng dại S. tarnii với khoai tây trồng cũng có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sương trên củ.
Tổng hợp các kết quả lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời và trên lát cắt củ cho thấy các con lai soma của tổ hợp lai giữa S.bulbocastanum và Delikat có tính kháng bệnh mốc sương rất cao. Các con lai này tiếp tục được kiểm tra khả năng có mặt của gen kháng bệnh mốc sương. d. Thí nghiệm 14: Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên đồng ruộng (Field test)
Các vật liệu sẽ tiếp tục được đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương trên đồng ruộng, sử dụng dung dịch lây nhiễm với nồng độ 20.000 bọc động bào tử/ml. Thí nghiệm lây nhiễm được tiến hành vào chiều tối mát, duy trì nhiệt độ khoảng 180C- 250C, ẩm độ khoảng 70-80%. Triệu chứng bệnh sẽ bắt đầu xuất hiện khoảng 1 tuần sau lây nhiễm. Tiến hành đo đếm mỗi tuần 1 lần trong suốt quá trình diễn biến của bệnh (7 lần). Kết quả được tính theo chỉ số tích lũy bệnh theo thời gian (bảng 4.17). Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục (∆)rAUDPC > 0 cho thấy giống rất mẫn cảm với bệnh, (∆)rAUDPC < 0 nghĩa là giống có khả năng kháng cao với bệnh trong đó giá trị tuyệt đối của (∆)rAUDPC càng nhỏ thì khả năng kháng bệnh càng cao.
Giống khoai tây trồng Delikat rất mẫn cảm với bệnh trong khi các con lai soma của dòng giống này với dòng dại S. bulbocastanum có khả năng kháng bệnh cao. Thông qua đánh giá về sự thành thục trên đồng ruộng cũng cho thấy có sự tương quan giữa tính kháng bệnh mốc sương với sự thành thục của các kiểu gen khác nhau. Các kiểu gen có tính kháng bệnh cao thì thường là chín muộn và ngược lại. Con lai SH 2292/4 có độ chín muộn trong khi các con lai khác có độ chín trung bình. Như vậy có
18
sự tương quan chặt chẽ giữa tính kháng bệnh mốc sương và độ chín của cây. Điều này nói nên rằng diễn biến của bệnh trên đồng ruộng khá phức tạp, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố của tự nhiên, do nhiều gen kiểm soát và được cho là tính kháng có ý nghĩa quan trọng nhất (tính kháng về số lượng- Quantatitive resistance) (bảng 4.10).
Tình trạng cây/ ký hiệu Tình trạng cây/ tổ hợp lai
Bảng 4.10. Kết quả đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về khả năng kháng bệnh mốc sƣơng trên đồng ruộng và đánh giá sự thành thục của cây Sự thành thục của cây 1- Chín sớm; 9-Chín muộn 4,8 - 6,0 6,5 6,0 7,4 Hệ số kháng bệnh điều chỉnh theo độ thành thục (ΔrAUDPC) 0,311 (2) - -0,352 -0,248 -0,324 -0,030 Cấp bệnh trung bình (leaflet assay) 5,0 (1) S 1,0 R 1,0 R 1,4 R 1,8 R 1,0 R Delikat S. bulbocastanum SH 2282/4 SH 2283/5 SH 2283/9 SH 2292/4 Cultivar Wild species Blb + Delikat
e. Thí nghiệm 15: đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương bằng chỉ thị phân tử
Sử dụng các mồi đặc hiệu để phát hiện gen kháng mốc sương Rpi-blb1 (Wang et al., 2008) và gen kháng Rpi-blb3 (Lokosou et al., 2009). Kết quả phát hiện sự có mặt của gen kháng trên các vật liệu có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum (gồm S. bulbocastanum và các con lai soma từ tổ hợp lai S. bulbocastanum + Delikat) là phù hợp với kết quả thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo. 4.1.4.2. Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học Thí nghiệm 16: Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học
Đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tương tự với khoai tây trồng (tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai cv. Atlantic + pnt2G; 3/7 của tổ hợp lai cv. Rasant + trn 3G; 4/12; 7/7; 4/4 của tổ hợp lai cv. Agave + trn 3G là có kiểu hình tương đối giống dạng dại (Wild type). Khả năng ra hoa của các con lai soma cũng rất khác nhau. Các con lai có khả năng ra hoa cao như 2044/1; 2281/10; 2295/1 và 2195/2. Đây sẽ là những con lai có triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ những con lai có khả năng ra hoa mới có thể tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo được những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn. Các con lai của tổ hợp lai trn 3G + cv. Rasant và trn 3G + cv.Agave không có khả năng ra hoa.
Nhiều con lai soma có số lượng củ trung bình trên khóm đạt từ 4-5 củ/khóm như các con lai 248/1 của tổ hợp Delikat; 838/11 và 851/2 của tổ hợp lai trn3G +cv.Delikat; 2044/1 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Rasant; 2292/4 của tổ hợp lai blb 2G + cv; 2196/4 của tổ hợp lai pnt2G + cv.Delikat. Đồng thời củ của chúng có hình dạng củ đẹp, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi hoặc chế biến.
19
Qua quá trình đánh giá chúng tôi nhận thấy có sự đa dạng về kiểu hình trong quần thể các dòng con lai soma tạo ra. Những biến dị cũng thể hiện ngay trên các dòng con lai soma của cùng một tổ hợp lai. Một số một số con lai soma có xuất hiện các biến dị ở thân, lá, hoa và củ và khác nhau trong cùng một tổ hợp lai. Các biến dị xuất hiện rất đa dạng và khác nhau giữa các tổ hợp lai khác nhau và khác nhau trong cùng một tổ hợp lai. Do các con lai soma được tạo ra thông qua phép lai xa giữa các loài khoai tây dại với khoai tây trồng (có bộ genome khác nhau) sẽ mang nhiều tính trạng khác xa với khoai tây trồng. Các biến dị này sẽ tiếp tục được chọn lọc thông qua các thế hệ lai backcross với khoai tây trồng nhằm chọn lọc được các dòng con vừa mang đặc tính của khoai tây trồng lại vừa có khả năng kháng bệnh. 4.1.5. Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc Thí nghiệm 17. Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai lại thu được về khả năng kháng mốc sương và các đặc tính nông sinh học
Kết quả đánh giá tính kháng bệnh trên cây con trồng từ hạt lai BC1 Các con lai của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat có khả năng kháng cao hơn những dòng khác. Con lai 13.1322 đạt tỷ lệ 60%; Con lai 13.1303 đạt 53,8%; Con lai 13.1311 đạt 55,8%. Các dòng con lai BC1 sau khi được thanh lọc tính kháng bệnh ở giai đoạn cây con được trồng trong điều kiện chậu vại.
Kết quả phân tích độ bội của các con lai BC1 Sử dụng máy flow cytometry để kiểm tra độ bội của các dòng con lai BC1 triển vọng. So sánh kết quả với mẫu chuẩn nhị bội (2n = 2x=24) để kết luận về mức đa bội của các mẫu cần đánh giá. Dựa vào sự bắt màu của mẫu và các đỉnh đo OD chúng ta thấy các dòng lai BC1 đều có độ bội 2n=5x, đã giảm bội so với con lai soma 2n=6x. Vì vậy theo lý thuyết, chúng tôi tiếp tục tiến hành lai lại các dòng này với các giống khoai tây trồng với mục đích giảm bội. Sao cho các dòng lai BC có độ bội giống với khoai tây trồng 2n=4x.
Kết quả đánh giá các đặc tính trồng trọt của các con lai BC1 Kết quả đánh giá cho thấy hầu hết con lai BC1 đã bảo toàn được đặc tính hình thái ở dạng khoai tây trồng và có sức sinh trưởng tương đối giống với khoai tây trồng. Ngoài ra khả năng ra hoa của các con lai và bố mẹ của chúng cũng được đánh giá bởi khả năng ra hoa sẽ quyết định cho việc có thể tiếp tục lai trở lại với khoai tây trồng để chọn tạo ra những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn được hay không. Các con lai có khả năng ra hoa như 13.1302; 13.1303; 13.1304 trong đó dòng 13.1304 có khả năng ra hoa cao. Các dòng con lai trong cùng một tổ hợp lai có biểu hiện tính đa dạng về kiểu hình một cách rõ rệt. Trong quần thể các con lai được đánh giá, đặc biệt lưu ý đến các dòng của tổ hợp lai Delikat + blb2G lai
20
trở lại với giống khoai tây trồng Delikat. Các dòng con lai BC1 1303.2; BC1 1303.11 và BC1 1303.3 có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng, khả năng sinh trưởng phát triển rất tốt và biểu hiện khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao dưới áp lực bệnh trong điều kiện tự nhiên. Kết quả đánh giá các tính trạng về củ của các con lai BC1 cho thấy nhiều con lai có tiềm năng năng suất cao (trên 30 tấn/ha) như các con lai 1303.2; 1303.4, 1303.6, 1303.11 và 1303.28 của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat x Delikat; con lai 1305.5 của tổ hợp lai pnt2G (+) Delikat x Delikat (bảng 4.22). Đồng thời qua đánh giá các tính trạng phẩm chất củ cũng cho thấy các con lai 1304.2, 1303.4, 1303.6 và 1303.11 có hình thái củ đẹp, mắt ngủ nông, chất lượng thử nếm rất ngon và hàm lượng chất khô cao, phù hợp với tiêu chuẩn ăn tươi và chế biến (bảng 14.23-A và B). Đây sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương của Việt Nam. 4.2. THẢO LUẬN
Các thí nghiệm được mô tả trong nghiên cứu này đã xác định được các thông số trong quy trình tách, dung hợp tế bào trần bằng xung điện, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai giữa các dòng khoai tây dại và các giống khoai tây trồng. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã đạt được một tỷ lệ khá cao các con lai tái sinh từ các tổ hợp lai dung hợp. Trong số 188 chồi tái sinh từ 1612 callus của 7 tổ hợp dung hợp, chúng tôi đã chọn lọc được 82 con lai lục bội (2n=6x=72), trong đó có 69 con lai có kiểu gen dị hợp nhân (hetezygous) được chọn lọc bằng chỉ thị phân tử SSR. Phân tích độ bội Flow cytometry đã chọn được 82/188 (43%) các con lai có độ bội mong muốn (4x tbr + 2x pnt, blb, trn). Ngoài ra kết quả phân tích độ bội thể cũng cho thấy phép dung hợp tế bào trần cũng tạo ra một tổ hợp các con lai có độ bội khá đa dạng. Các con lai có độ bội không mong muốn như con lai tứ bội (2x + 2x), con lai đa bội (polyploidy) hay con lai hỗn bội (multiploidy) là kết quả của nhiều lần dung hợp xung điện hoặc do đột biến dòng tế bào soma. Ramona Thiemei et al., (1997) đã tạo được 239 callus tái sinh từ các tổ hợp lai giữa dòng khoai tây nhị bội (T17) với dòng dại S. pinnatisectu (2n = 2x), trong số đó đã chọn lọc được 47-89% con lai có độ bội mong muốn, 7-16% con lai là hỗn bội.
Trong khi việc lai khác loài giữa khoai tây dại và khoai tây trồng rất khó thành công thông qua phép lai hữu tính, lai khác loài thông qua dung hợp tế bào trần đã trở thành công cụ hữu hiệu để chuyển các đặc tính mong muốn từ các loài khoai tây dại vào các giống khoai tây trồng, chẳng hạn như trong nghiên cứu của các tác giả Thieme et al. (2008) đã tạo thành công các con lai soma giữa loài dại S. tarnii với giống khoai tây trồng Delikat. Sau đó 1 năm, Jansky and Hamernik (2009) đã dung hợp giữa loài khoai tây dại Solanum cardiophilum với giống khoai tây trồng của Đức Agave và Delikat và tạo được một tỷ lệ rất thành công các con lai soma khác loài.
21
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên cây khoai tây cũng mới chỉ thành công trong việc tạo các con lai soma giữa các dòng khoai tây nhị bội kháng virus cùng loài (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012). Nghiên cứu của chúng tôi cũng đã tạo được 69 con lai khác loài giữa các loài khoai tây dại blb2G, pnt2G và trn3G với giống khoai tây trồng Delikat, Rasant, Agave và Atlantic. Đáng chú ý là lần đầu tiên chúng tôi tạo được con lai soma giữa loài khoai tây dại S. pinnatisectum với giống khoai tây trồng tứ bội Atlantic (một giống khoai tây chế biến nhất nhạy cảm với bệnh mốc sương đang được trồng phổ biến tại Việt Nam.). Thông qua kết quả đánh giá các đặc tính hình thái, chỉ những con lai có khả năng sinh trưởng tốt và mang nhiều đặc tính giống với khoai tây trồng, đồng thời có khả năng kháng bệnh thì mới được chọn lọc và tiếp tục lai lại với khoai tây trồng nhằm tổ hợp được các đặc tính quý từ khoai tây trồng vào các con lai. Những biến dị hình thái ở các con lai soma sẽ tiếp tục được chọn lọc, giữ lại những biến dị có lợi, loại bỏ những biến dị bất lợi cho chọn tạo giống. Trong hầu hết các con lai soma có biểu hiện tính kháng ở mức vừa hoặc thấp hơn một chút so với giống khoai tây trồng, hay nói cách khác là khả năng kháng bệnh ở các con lai soma đã được cải thiện rõ rệt. Các con lai soma giữa các loài khoai tây dại Mexico mang khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao sẽ là nguồn vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây. Các công bố đi trước đã thành công trong việc tạo các con lai soma giữa khoai tây trồng với loài dại S.pinnatisectum đã mang khả năng kháng cao với bệnh mốc sương (Orczyk et al., 2003). Con lai soma giữa loài dại S.bulbocastanum với S.tuberosum và các thể lai BC đã biểu hiện tính kháng cao khi lây nhiễm với các chủng mốc sương ngoài đồng ruộng (Helgeson et al., 1998). Thieme et al. (2008) đã chỉ ra rằng trong số 31 con lai soma tạo ra giữa loài khoai tây dại Solanum tarnii và giống khoai tây trồng Delikat có 24 con lai biểu hiện kháng bệnh mốc sương trong đó có 4 con lai có biểu hiện tính kháng cao với bệnh (điểm đánh giá khi lây nhiễm nhân tạo trên lá là 9), so với loài dại Solanum tarnii (điểm đánh giá là 8,7). Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên củ cũng cho thấy các con lai soma điều biểu hiện ở mức 3,7-6,1 điểm (kháng cao hơn so với giống Delikat có mức điểm là 3,2, trong khi loài dại Solanum tarnii có mức điểm là 7,0). Nhóm tác giả trên đã sử dụng thang điểm 1-9 để đánh giá trong đó 1 = Nhạy cảm; 9 = kháng bệnh. Trong nghiên cứu này, các con lai soma của tổ hợp lai giữa loài dại Solanum tarnii với giống Delikat (857/5, 851/2, 849/5, 849/4 và 838/11) đều biểu hiện nhiễm bệnh với mức điểm đánh giá trên lá từ 4,0 -5. Điều này cũng có thể lý giải là do chủng Phytophthora của Việt Nam tạo ra sự khác biệt so với chủng Phytophthora của Châu Âu.
Các thể lai này tiếp tục được backross nhiều thế hệ với khoai tây trồng nhằm chuyển được tính kháng bệnh vào các dòng vật liệu chọn tạo giống khoai tây.
22
Chúng tôi cũng đã sử dụng các cặp mồi đặc hiệu của gen kháng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 để kiểm tra sự có mặt của gen kháng ở các con lai soma. Kết quả đã phát hiện được 2 gen kháng kể trên ở các con lai soma giống như ở loài dại S. bulbocastanum. Điều này thêm một lần nữa khẳng định được đã chuyển được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại S.bulbocastanum vào các con lai.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, các dòng con lai soma 6x là kết quả của phép dung hợp tế bào trần giữa loài khoai tây dại (2x, 1 EBN) với khoai tây trồng (4x, 4 EBN), do đó có giá trị nội nhũ là 5 EBN. Backcorss các con lai lục bội với khoai tây trồng tứ bội sẽ cho các con lai BC ở thế hệ đầu tiên có độ bội 5x. Tiếp tục tiến hành lai backcross các con lai này qua nhiều thế hệ sẽ cho giống khoai tây trồng mang các đặc tính mong muốn. Kết quả này có ý nghĩa lớn cho sản xuất khoai tây của Việt Nam vì thực tế là chúng ta chưa tạo ra được giống khoai tây kháng bệnh mốc sương. Các giống hiện có chủ yếu là thông qua con đường nhập nội. Các vật liệu kháng bệnh tạo ra bằng con đường dung hợp tế bào trần, không phải là giống chuyển gen nên dễ dàng được sản xuất chấp nhận, đồng thời giảm thiểu việc dùng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trường.
Tuy nhiên do thời gian nghiên cứu có hạn, chúng tôi mới chỉ tạo được những con lai BC1. Việc tiếp tục lai trở lại các vật liệu này qua vài thế hệ để chọn lọc được các dòng vừa mang khả năng kháng bệnh của loài khoai tây dại, vừa mang các đặc tính nông sinh học quý của khoai tây trồng là hết sức cần thiết. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ sở lý thuyết của sự biểu hiện gen kháng bệnh ở các con lai cần phải được tiếp tục vì các con lai soma của các tổ hợp lai từ các loài khoai tây dại khác nhau có biểu hiện khả năng kháng bệnh rất khác nhau.
Trong khi cả 3 loài khoai tây dại được sử dụng trong nghiên cứu này đều có khả năng kháng bệnh mốc sương rất cao, nhưng chỉ những con lai soma của loài S.bulbocastanum là biểu hiện tính kháng bệnh rất cao, đa số những con lai soma còn lại chỉ biểu hiện tính kháng bệnh mốc sương ở mức vừa hoặc có cải thiện đôi chút so với giống khoai tây trồng. Vấn đề này cần phải tiếp tục được nghiên cứu.
Ngoài ra việc nghiên cứu thêm về cơ chế thay đổi số lượng nhiễm sắc thể, EBN và độ bội ở các thế hệ lai BC cũng rất cần thiết cho giai đoạn tiếp theo của nghiên cứu này.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1) Đã xác định được các thông số để xây dựng được quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần của các dòng khoai tây dại nhị bội và các giống khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống, thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các
23
dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ, dung hợp ở tần số 800 kHz với 2 lần xung và mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml, môi trường thích hợp để nuôi cấy tế bào trần sau dung hợp là môi trường VKMII lỏng và môi trường tái sinh tạo chồi từ callus của các tổ hợp lai là môi trường RJM.
2) Đã dung hợp thành công 07 tổ hợp dung hợp giữa các dòng khoai tây dại nhị bội (blb2G, pnt2G, trn3G) với các giống khoai tây trồng tứ bội (Atlantic, Delikat, Rasant và Agave); trong đó đã tái sinh được 1612 callus và 188 chồi từ các tổ hợp lai. 3) Đã xác định được 82/102 dòng là thể lục bội (6x) bằng phân tích độ bội Flow cytometry trong đó có 69 dòng con lai soma có kiểu gen dị hợp nhân khi phân tích bằng chỉ thị SSR bao gồm: 15 con lai soma của tổ hợp lai trn3G + Delikat, 6 con lai soma của tổ hợp lai trn3G+ Rasant, 14 con lai soma của tổ hợp lai blb2G+ Delikat, 28 con lai soma của tổ hợp lai trn3G+Delikat và 6 con lai soma của tổ hợp lai pnt2G+ Atlantic.
4) Đã đánh giá được tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo trên lá, trên củ và trên đồng ruộng. Kết quả đã chọn lọc được các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat có biểu hiện kháng cao với bệnh mốc sương (SH 2283/5; SH 2281/10, SH 2292/4 và SH 2295/1), đồng thời các con lai này có mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3.
5) Đã đánh giá được các đặc tính về hình thái, sinh trưởng, phát triển và các yếu tố cấu thành năng suất của các con lai soma. Các con lai thể hiện sự đa dạng về kiểu hình giữa các tổ hợp lai khác nhau và trong cùng một tổ hợp lai. Nhiều con lai của tổ hợp blb2G (+) Delikat có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng (Tuberosum), sinh trưởng tốt và có khả năng chống chịu mốc sương cao.
6) Đã lai tạo thành công 11 tổ hợp lai backcross giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng. Kết quả đánh giá quần thể chọn lọc đã lựa chọn ra được 4 dòng con lai của tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6, 13.1303.11) có khả năng kháng mốc sương cao, đồng thời mang nhiều tính trạng nông sinh học tốt. Đây sẽ là nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương. 5.2. KIẾN NGHỊ
Các dòng khoai tây lai kháng bệnh mốc sương cần phải được tiếp tục nghiên cứu cả về về mức độ kiểu gen và kiểu hình, đặc biệt là sự ổn định của tính kháng theo thời gian để có thể sử dụng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của nước ta.
24
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn
Quang Thạch, Ramona Thieme và Thilo Hammann (2013). Nghiên cứu tạo,
đánh giá con lai soma khác loài giữa các giống khoai tây trồng Solanum
tuberosum L. (2n=4x=48) và các dòng khoai tây dại Solanum bulbocastanum,
Solanum tarnli, Solanum pinatisectum (2n=2x=24) mang khả năng kháng bệnh
mốc sương bằng dung hợp tế bào trần. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn 22/2013, trang 3-10
2. Hoàng Thị Giang, Vũ Thị Hằng, Nguyễn Thị Thủy, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona
Thieme, Thilo Hammann và Nguyễn Quang Thạch (2014). Đánh giá khả năng
chuyển đặc tính kháng bệnh mốc sương từ khoai tây dại sang khoai tây trồng
thông qua dung hợp tế bào trần. Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 12, số
7/2014, trang 1149-1156.
3. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Thị Thủy, Vũ Thị Hằng, Đỗ Thị Thu Hà, Ramona
Thieme, Thilo Hammann và Nguyễn Quang Thạch (2014). Khả năng kháng
bệnh mốc sương và các đặc tính nông học của các dòng lai lại giữa con lai
soma và khoai tây trồng. Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 12, số 8-2014,
trang 1302-1313
