MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN
PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
ễ ế ị ầ GVHD: Tr n Th Dung SVTH: Nguy n Th Hoàng Y n 61103239
ễ ị ư 61103020
ỳ Nguy n Văn C ị Hu nh Th Mai Thy 61103315
ệ ề ươ
ụ ụ M c l c: ớ § I. Gi
i thi u v ph
ng pháp Southern blot.
§ II. Nguyên lý và nguyên t c.ắ
• 1.Nguyên lý.
• 2.Nguyên t c.ắ
ạ
ẫ
§ III. T o m u dò.
• 1.T o m u dò nh Plasmid
ạ ẫ ờ
• 2.T o Probe nh ng d ng PCR
ờ ứ ụ ạ
• 3.Đánh d u Probe
ấ
ủ
ươ
§ IV. Quy trình c a ph
ng pháp Southern Blot.
• 1.Giai đo n 1.ạ
• 2.Giai đo n 2.
ạ
• 3.Giai đo n 3.
ạ
Ứ
ụ
§ V. ng d ng.
ớ
ệ ề ươ
I. Gi
i thi u v ph
ng pháp
Southern blot
Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào.
phát
Edwin genome động
Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được triển vào giữa thập niên 1970 do Southern ở MRC một bộ phân của vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975).
Edwin Southern
Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như:
Ø Tách chiết gen
Ø PCR
Ø Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai
Ø Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu)
Ø …
Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu bao gồm:
Ø Tăng độ nhạy
Ø Giảm một số bước trong quá trình lai
Ø Giảm thời gian thực hiện
Ø Vẽ kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn rất nhiều.
II. Nguyên lý và Nguyên t cắ
ạ
ẫ III. T o m u dò (probe)
Tạo mẫu dò nhờ Plasmid
Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR
§ Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi.
§ Cắt plasmid và DNA đã tách chiết từ tế bào bởi cùng một loại enzyme. § Gắn DNA vào plasmid trong điều kiện môi trường phù hợp.
§ Biến tính mẫu DNA thành các sợi đơn. § Gắn mồi vào các sợi
đơn.
§ Thực hiện biến nạp vào trong tề bào vi khuẩn. § Nhân các tế bào vi kuẩn
§ Tổng hợp các sợi
và chọn lọc.
DNA mới.
§ Tách plasmid từ các tế
bào chọn lọc.
§ Tách mẫu dò (đoạn
DNA).
§
§ Đánh dấu mẫu dò.
§ Biến tính để tách các chuỗi mới vừa tổng hợp thành các sợi đơn. tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn.
Đánh dấu mẫu dò
Gồm có 4 phương pháp:
1. Phương pháp Nick-translation
2. Phương pháp random priming
3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide
4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)
1. Phương pháp Nick-translation
§. DNAse I tạo các khía trên DNA ở nhiều vị trí ngẫu nhiên
§. DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch DNA theo chiều 5’-3’ theo các khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide đánh dấu (thường là dATP)
§. Kết quả là DNA được đánh dấu.
khác nhau.
2. Phương pháp random priming
§. DNA kép được biến tính bằng nhiệt thành 2 mạch đơn.
§. Hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở thành mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung.
§. Một trong 4 loại nucleotide bổ sung vào được đánh dấu,
nên 2 mạch mới tổng hợp cũng được đánh dấu.
3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide
Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi được đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện diện của một nucleotide đánh dấu. Sau phản ứng các nuclotide tự do cũng được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, sắc kí lỏng cao áp (HPLC),…
4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)
§ Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải được đưa vào một vector có mang các promoter.
§ Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA polymerase thích hợp được thêm vào phản ứng cùng với các nucleotide đánh dấu.
§ RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ
§ Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị
promoter, tạo ra một lượng lớn RNA đánh dấu.
DNase I phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng phenol và RNA được tinh sạch trên sắc kí lọc gel.
ủ
ươ
ng pháp
IV. Quy trình c a ph Southern blot
Giai đoạn 1
Giai đo n 2ạ
Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai (màng nylon hoặc nitrocellulose).
Nguyên tắc của quá trình:
Là sự mao dẫn của dung môi (thường là NaOH/NaCl)qua lớp gel từ nơi có thế nước cao sang nơi có thế nước thấp, mang theo DNA đính lên màng lai được sắp xếp ngay trên lớp gel.
Quá trình này diễn ra trong vài giờ hoặc có thể dùng thiết bị thấm hút chân không.
Tương tác ion giữa màng lai (tích điện dương) và DNA (tích điện âm) tạo lực hút, gắn kết các DNA lên màng lai.
Trong quá trình chuyển, vị trí các DNA không thay đổi.
Màng lai sau quá trình trên, được xử lý nhiệt (800 trong 2 giờ) hoặc chiếu tia UV (vài phút) để cố định
DNA trên màng.
ế Cách ti n hành:
§ Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển
nguyên vẹn các sợi DNA biến tính
§ Dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4M
§ Màng lai sẽ giữ cố dịnh các đoạn DNA được chuyển
lên từ gel điện li
Giai đo n 3ạ
Ứ
IV.
ụ ng d ng
ü Southern blot được sử dụng để đánh giá bản copy của gen trong genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn…
ü Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có
ü Southern blot – RFLP : giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫ đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ RE đó. Đòng thời RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bản đồ giới hạn gene.
ü Truy tìm tội phạm dựa vào dấu vết hiện trường.
ü Chuẩn đoán bệnh thai nhi.
thể phân biệt được các loài, các loài đồng hình.
• Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương
• www.Wikipedia.org
Tài liệu tham khảo:
