Thuyết trình Kỹ thuật di truyển: Phương pháp Southern blot

Chia sẻ: Ngô Thị Thảo Ngân | Ngày: | Loại File: PPTX | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

430
lượt xem 80
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thuyết trình Kỹ thuật di truyển: Phương pháp Southern blot giới thiệu về phương pháp Southern blot; nguyên lý và nguyên tắc; tạo mẫu dò; quy trình của phương pháp Southern Blot và ứng dụng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thuyết trình Kỹ thuật di truyển: Phương pháp Southern blot

MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀN PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT GVHD: Trần Thị Dung SVTH: Nguyễn Thị Hoàng Yến 61103239 Nguyễn Văn Cư 61103020 Huỳnh Thị Mai Thy61103315
Mục lục: § I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot. § II. Nguyên lý và nguyên tắc. • 1.Nguyên lý. • 2.Nguyên tắc. § III. Tạo mẫu dò. • 1.Tạo mẫu dò nhờ Plasmid • 2.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR • 3.Đánh dấu Probe § IV. Quy trình của phương pháp Southern Blot. • 1.Giai đoạn 1.
I. Giới thiệu về phương pháp Southern blot Phương pháp lai Southern blot là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc kiểm tra sự có mặt của một gen nào đó trong bộ gen của tế bào. Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Edwin Southern ở MRC một bộ phân của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975).
Phương pháp Southern Blot được triển khai nhờ một số kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: Ø Tách chiết gen Ø PCR Ø Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai Ø Lai phân tử (lai với mẫu dò đặc hiệu) Ø… Đến nay, kỹ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất nhiều, chủ yếu bao gồm: Ø Tăng độ nhạy Ø Giảm một số bước trong quá trình lai
II. Nguyên lý và Nguyên tắc
III. Tạo mẫu dò (probe) Tạo mẫu dò nhờ Plasmid Tạo Probe nhờ ứng dụng § Cắt plasmid và DNA đã PCR tách chiết từ tế bào bởi § Thiết lập mồi và đánh cùng một loại enzyme. dấu phóng xạ vào các § Gắn DNA vào plasmid mồi. trong điều kiện môi § Biến tính mẫu DNA trường phù hợp. thành các sợi đơn. § Thực hiện biến nạp vào § Gắn mồi vào các sợi trong tề bào vi khuẩn. đơn. § Nhân các tế bào vi kuẩn § Tổng hợp các sợi và chọn lọc. DNA mới. § Tách plasmid từ các tế § Biến tính để tách các bào chọn lọc. chuỗi mới vừa tổng § Tách mẫu dò (đoạn hợp thành các sợi DNA). đơn. § Đánh dấu mẫu dò. § tiếp tục quay về gắn mồi vào các sợi đơn.
Đánh dấu mẫu dò Gồm có 4 phương pháp: 1. Phương pháp Nick-translation 2. Phương pháp random priming 3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide 4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)
1. Phương pháp Nick-translation §. DNAse I tạo các khía trên DNA ở nhiều vị trí ngẫu nhiên khác nhau. §. DNA polymerase với hoạt tính exonuclease 5’-3’, cắt mạch DNA theo chiều 5’-3’ theo các khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide đánh dấu (thường là dATP) §. Kết quả là DNA được đánh dấu.
2. Phương pháp random priming §. DNA kép được biến tính bằng nhiệt thành 2 mạch đơn. §. Hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở thành mồi (primer) cho DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung. §. Một trong 4 loại nucleotide bổ sung vào được đánh dấu, nên 2 mạch mới tổng hợp cũng được đánh dấu. 3. Phương pháp đánh dấu các oligonucleotide Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi được đánh dấu ở đầu 5’ nhờ enzyme T4 polynucleotide kinase với sự hiện diện của một nucleotide đánh dấu. Sau phản ứng các nuclotide tự do cũng được loại bỏ bằng sắc
4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe) § Trước hết, trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải được đưa vào một vector có mang các promoter. § Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA polymerase thích hợp được thêm vào phản ứng cùng với các nucleotide đánh dấu. § RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ promoter, tạo ra một lượng lớn RNA đánh dấu. § Sau phản ứng, vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, các enzyme được loại bỏ qua tách chiết bằng phenol và RNA được tinh sạch trên sắc kí lọc gel.
IV. Quy trình của phương pháp Southern blot
Giai đoạn 1
Giai đoạn 2 Chuyển DNA vừa biến tính lên màng lai (màng nylon hoặc nitrocellulose). Nguyên tắc của quá trình: Là sự mao dẫn của dung môi (thường là NaOH/NaCl)qua lớp gel từ nơi có thế nước cao sang nơi có thế nước thấp, mang theo DNA đính lên màng lai được sắp xếp ngay trên lớp gel. Quá trình này diễn ra trong vài giờ hoặc có thể dùng thiết bị thấm hút chân không. Tương tác ion giữa màng lai (tích điện dương) và DNA (tích điện âm) tạo lực hút, gắn kết các DNA lên màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí các DNA không thay đổi. Màng lai sau quá trình trên, được xử lý nhiệt (800
Cách tiến hành: § Đặt gel lên giá chuyển máy Bloting để chuyển nguyên vẹn các sợi DNA biến tính § Dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4M § Màng lai sẽ giữ cố dịnh các đoạn DNA được chuyển lên từ gel điện li
Giai đoạn 3
IV. Ứng dụng ü Southern blot được sử dụng để đánh giá bản copy của gen trong genome, xác định các intron, exon, các đoạn bị đột biến thêm hoặc mất đoạn… ü Khi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân biệt được các loài, các loài đồng hình. ü Southern blot – RFLP : giúp phát hiện sự đa dạng chiều dài các đoạn cắt bởi RE, qua đó, nhận biết sai biệt di truyền ở vị trí nhận biết của các RE dẫ đến sai biệt trong chiều dài của các đoạn DNA tạo ra từ RE đó. Đòng thời RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bản đồ giới hạn gene. ü Truy tìm tội phạm dựa vào dấu vết hiện trường. ü Chuẩn đoán bệnh thai nhi.
Tài liệu tham khảo: • Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương • www.Wikipedia.org